ПРИМЕНЕНИЕ ДИСУЛЬФИРАМА ПРИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КОРОНАВИРУСА Российский патент 2024 года по МПК A61K31/145 A61P31/14 

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент Китая № 2020101216884, поданной 26 февраля 2020 г., содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники

Настоящее изобретение принадлежит к технической области биомедицины, относится к применению дисульфирама в борьбе с коронавирусом и, в частности, относится к применению дисульфирама в получении лекарственного препарата для лечения и/или профилактики заболевания, вызываемого коронавирусом.

Предпосылки

Коронавирусы представляют собой группу вирусов, тесно связанных с людьми и домашним скотом. Коронавирусы HCoV-229E и HCoV-OC43 вызывают простуду (van der Hoek, L., Pyrc, K., Jebbink, M. et al., Identification of a new human coronavirus., Nat Med, 2004,10, 368–373). С 2002 г. по 2003 г. тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), вызываемым коронавирусом SARS, было инфицировано 8098 людей по всему миру (Stadler, K., Masignani, V., Eickmann, M. et al. SARS — beginning to understand a new virus., Nat Rev Microbiol, 2003, 1, 209–218). В 2004 г. было установлено, что HCoV-NL63 может также вызывать респираторное заболевание, подобное простуде (van der Hoek, L., Pyrc, K., Jebbink, M. et al., Identification of a new human coronavirus., Nat Med, 2004, 10, 368–373). Коронавирусом ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV), выявленным в 2012 г., по состоянию на 26 апреля 2016 г.было инфицировано 1728 людей в 27 странах (de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D. et al., SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nat Rev Microbiol, 2016, 14, 523–534.). Ставший широко известным вирус SARS-CoV-2 вызывает COVID-19 с клиническими проявлениями в виде лихорадки, сухого кашля и одышки (Jeannette Guarner, MD, Three Emerging Coronaviruses in Two Decades: The Story of SARS, MERS, and Now COVID-19, American Journal of Clinical Pathology, aqaa029). Коронавирусы оказывают большое влияние на животноводство: вирус эпидемической диареи свиней (PEDV), вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV) и дельта-коронавирус свиней (PDCoV, также называемый дельтавирусом) могут вызывать тяжелый энтерит, диарею, рвоту и обезвоживание у свиней, что приносит огромные потери свиноводческой отрасли (Akimkin V, Beer M, Blome S, et al. New Chimeric Porcine Coronavirus in Swine Feces, Germany, 2012., Emerg Infect Dis., 2016, 22(7):1314–1315). Вирус инфекционного перитонита кошачьих (FIPV) может вызывать смертельные заболевания у кошачьих. Вирус инфекционного бронхита птиц (IBV), являющийся широко распространенным заболеванием домашней птицы, поражает домашнюю птицу и оказывает огромное отрицательное влияние на птицеводческую промышленность.

Коронавирусы принадлежат к подсемейству Orthocoronavirinae семейства Coronaviridae из отряда Nidovirales. Была опубликована геномная последовательность коронавируса SARS-CoV-2, при этом сходство его нуклеотидной последовательности с SARS-CoV составляет приблизительно 90%, а сходство последовательности с белковой последовательностью SARS-CoV составляет приблизительно 80%. Геном коронавирусов представлен одноцепочечной РНК с положительной цепью длиной примерно 28 т. п. н. и кодирует преимущественно структурные белки, необходимые для упаковки вируса, и неструктурные белки, ассоциированные с репликацией и транскрипцией. Разработка лекарственных препаратов и вакцин для лечения заболеваний, связанных с коронавирусом, в основном направлена на два вышеуказанных типа белков. Две трети генов вирусного генома кодируют преимущественно неструктурные белки. Вирус кодирует два полимеразных белка, pp1a и pp1ab, которые участвуют в процессе репликации вируса. Pp1a и pp1ab могут быть разрезаны на 16 неструктурных белков (nsp1-16) посредством двух видов – кодируемой вирусом папаин-подобной протеазы и главной протеазы. Только когда эти функциональные субъединицы разрезаются на отдельные белковые единицы посредством кодируемой вирусом протеазы, вирус может выполнять нормальные функции транскрипции и репликации и далее собираться в репликационно-транскрипционные комплексы для завершения репликации и транскрипции вирусов. При этом папаин-подобная протеаза характеризуется 3 сайтами рестрикции; главная протеаза характеризуется 11 сайтами рестрикции pp1a и pp1ab. Можно увидеть, что главная протеаза выполняет ключевую регуляторную роль в транскрипции и репликации вируса, поэтому она стала предметом исследования (Ziebuhr, J.; Snijder, E. J.; Gorbalenya, A. E. Virus-encoded proteinases and proteolytic processing in the Nidovirales. J Gen Virol, 2000, 81, 853-79.; Ziebuhr, J. Molecular biology of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Curr Opin Microbiol, 2004, 7, 412-9.). Ввиду важности главной протеазы для амплификации и репликации коронавирусов, для разработки лекарственного препарата особенно важно найти ингибитора с высокой специфичностью и высокой безопасностью в отношении каталитического сайта главной протеазы.

Дисульфирам (CAS № 97-77-8) является специфическим ингибитором ацетальдегиддегидрогеназы (ALDH 1) (Liu, Xinwei, et al., «Targeting ALDH1A1 by disulfiram/copper complex inhibits non-small cell lung cancer recurrence driven by ALDH-positive cancer stem cells.» Oncotarget 7.36 (2016): 58516.), и его применяют для лечения хронического алкоголизма и острой непереносимости алкоголя. Дисульфирам также влияет на дофаминергическую систему, при этом как дисульфирам, так и его метаболит, сероуглерод, могут ингибировать дофамингидроксилазу (DBH) и повышать уровни дофамина. Это может привести к нейропсихиатрическим симптомам, таким как делирий, паранойя, расстройства памяти, атаксия, дизартрия и признаки поражения лобной доли. В дополнение к этому эффекту дисульфирам может также ингибировать дофамингидроксилазу, приводя к повышению концентрации дофамина и снижению концентрации норадреналина в головном мозге, что может свидетельствовать об антиаддиктивном эффекте дисульфирама при алкогольной зависимости.

В Nature 2017 г. (Skrott, Zdenek, et al. «Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.» Nature 552.7684 (2017): 194-199.]) было опубликовано о противоопухолевой активности дисульфирама, и при этом было обнаружено, что дисульфирам может метаболизироваться в малые молекулы in vivo, тем самым способствуя коагуляции нативного белка NPL4 и связыванию с его ферментом-партнером p97, что ингибирует функцию комплекса NPL4-p97, способствующего росту опухоли, и дополнительно индуцирует гибель раковых клеток. Кроме того, также было обнаружено, что дисульфирам обладает специфичной активностью в отношении Е3-убиквитинлигаз «цинковый палец» и «палец ring-типа», которые играют важную роль в развитии рака (R Kona, F., D. A. M. B. Buac, and A. M Burger. «Disulfiram, and disulfiram derivatives as novel potential anticancer drugs targeting the ubiquitin proteasome system in both preclinical and clinical studies.» Current cancer drug targets 11.3 (2011): 338-346.). Родственной заявкой на патент является WO2017077336A1.

В предшествующем уровне техники дисульфирам еще не был изучен в лечении заболеваний, связанных с коронавирусами.

Сущность изобретения

Для решения технической задачи, связанной с отсутствием в предшествующем уровне техники лекарственного препарата для эффективного лечения и/или профилактики заболевания, вызываемого коронавирусом, предложено настоящее изобретение, которое связано с применением дисульфирама в борьбе с коронавирусом и, в частности, относится к применению дисульфирама в получении лекарственного препарата для лечения и/или профилактики заболевания, вызываемого коронавирусом.

Настоящее изобретение главным образом решает техническую задачу посредством следующих технических решений.

В настоящем изобретении предусмотрено применение дисульфирама (CAS № 97-77-8) в получении лекарственного препарата для лечения и/или профилактики заболевания, вызываемого коронавирусом.

Предпочтительно заболевание представляет собой заболевание млекопитающих или птиц.

Предпочтительно млекопитающее включает людей, свиных и кошачьих.

Коронавирусы, описанные в данном документе, определены как хорошо известные из уровня техники и принадлежат к подсемейству Orthocoronavirinae семейства Coronaviridae из отряда Nidovirales. Коронавирусы представляют собой обширный класс широко распространенных в природе вирусов, имеющих оболочку и геномом, представленный одноцепочечной РНК с положительной цепью.

Целью настоящего изобретения является обеспечение возможного плана лечения заболеваний, вызываемых коронавирусной инфекцией. Коронавирусы, описанные в данном документе, предпочтительно принадлежат к подсемейству Orthocoronavirinae и более предпочтительно принадлежат к родам альфа-коронавируса, бета-коронавируса, гамма-коронавируса или дельта-коронавируса.

В предпочтительном варианте осуществления по настоящему изобретению дисульфирам можно применять для лечения тяжелых инфекционных заболеваний, вызываемых другими коронавирусами, такими как SARS-CoV (род бета-коронавируса) и MERS-CoV, в дополнение к лечению заболеваний, вызываемых SARS-CoV-2 (род бета-коронавируса), а также его можно применять в качестве лекарственного препарата от простуды для лечения заболеваний, вызываемых такими коронавирусами, как HCoV-HKU1 (коронавирус человека, HKU1; род бета-коронавируса), HCoV-NL63 (коронавирус человека, NL63; род альфа-коронавируса), HCoV-OC43 (коронавирус человека, OC43) и HCoV-229E (коронавирус человека 22E; род альфа-коронавируса); также его можно применять в качестве ветеринарного лекарственного препарата для лечения заболеваний животных, вызываемых вирусом трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV; род альфа-коронавируса), вирусом эпизоотической диареи свиней (PEDV; род альфа-коронавируса), дельта-коронавирусом свиней (PDCoV; род дельта-коронавируса), вирусом инфекционного перитонита кошек (FIPV; род альфа-коронавируса) и вирусом инфекционного бронхита (IBV; род гамма-коронавируса).

Таким образом, коронавирусы, раскрытые в данном документе, предпочтительно выбраны из SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-229E, TGEV, PEDV, PDCoV, FIPV и IBV.

В определенных вариантах осуществления дисульфирам или его фармацевтически приемлемая соль, раскрытая в данном документе, присутствуют в форме фармацевтической композиции, содержащей их; предпочтительно кармофур и/или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой единственный активный ингредиент фармацевтической композиции; и/или фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, такой как фармацевтически приемлемый вспомогательный материал.

В определенных вариантах осуществления дисульфирам или его фармацевтически приемлемая соль, раскрытая в данном документе, присутствуют в форме набора, содержащего их, при этом набор дополнительно содержит лекарственный препарат для лечения заболевания, связанного с коронавирусом, и/или лекарственный препарат для лечения другого заболевания, вызываемого вирусом.

Фармацевтическую композицию, содержащую дисульфирам в качестве активного ингредиента, в настоящем изобретении можно получить в соответствии со способами, известными из уровня техники. Соединения, раскрытые в данном документе, могут быть получены в любой лекарственной форме, подходящей для применения на людях или животных. Соединения, раскрытые в данном документе, обычно присутствуют в фармацевтической композиции на их основе в количестве, составляющем от 0,1% до 99,0% по весу.

Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой носитель, общепринятый в данной области техники, при этом носитель может представлять собой любой подходящий физиологически или фармацевтически приемлемый вспомогательный материал. Фармацевтически приемлемый вспомогательный материал является общепринятым в данной области техники и предпочтительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, наполнитель, разбавитель или т. п. Более предпочтительно фармацевтическая композиция содержит от 0,01% до 99,99% белка и/или конъюгата антитело-лекарственное средство и от 0,01% до 99,99% фармацевтически приемлемого носителя, при этом процентное содержание является процентом по массе фармацевтической композиции.

Раскрытые в данном документе дисульфирам или фармацевтическую композицию, содержащую его, можно вводить в единичной лекарственной форме, при этом способ введения может представлять собой интестинальное или парентеральное введение, как например, пероральное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, назальное, буккальное, офтальмическое, внутрилегочное и респираторное, кожное, вагинальное, ректальное.

Предназначенная для введения лекарственная форма может быть жидкой, твердой или полутвердой лекарственной формой. Жидкая лекарственная форма может представлять собой растворы (в том числе истинные растворы и коллоидные растворы), эмульсии (в том числе эмульсии типа «масло в воде», типа «вода в масле» и множественные эмульсии), суспензии, инъекционные растворы (в том числе водные инъекционные растворы, порошок для приготовления инъекционных растворов и инфузионных растворов), глазные капли, назальные капли, примочки, линименты и т. п.; твердая лекарственная форма может представлять собой таблетки (в том числе обычные таблетки, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, защечные таблетки, диспергируемые таблетки, жевательные таблетки, шипучие таблетки и таблетки, распадающиеся в полости рта), капсулы (в том числе твердые капсулы, мягкие капсулы и капсулы, покрытые кишечнорастворимой оболочкой), гранулы, порошки, пеллеты, микропилюли, суппозитории, пленки, пластыри, аэрозоли (порошковые спреи), спреи и т. п.; полутвердая лекарственная форма может представлять собой мази, гели, пасты и т. п.

Дисульфирам, раскрытый в данном документе, можно получить в виде обычных препаратов, а также можно получить в виде препаратов с замедленным высвобождением, препаратов с контролируемым высвобождением, нацеливающихся препаратов и различных систем доставки лекарственного средства в виде частиц.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает, что соли, растворители, вспомогательные материалы и т. д. являются в основном нетоксичными, безопасными и подходящими для применения у пациента. «Пациент» предпочтительно представляет собой млекопитающее и более предпочтительно человека.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли дисульфирама, раскрытой в данном документе и полученной с помощью относительно нетоксичных, фармацевтически приемлемых кислоты или основания.

На основании общих знаний в данной области техники вышеуказанные предпочтительные условия можно произвольно комбинировать с получением предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Реагенты и исходные материалы, применяемые в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными.

Положительные прогрессивные эффекты настоящего изобретения заключаются в следующем.

В настоящем изобретении было обнаружено, что дисульфирам может хорошо ингибировать активность главных протеаз коронавируса в эксперименте на ферментативную активностью in-vitro, и, таким образом, преодолевается недостаток предшествующего уровня техники, заключающийся в отсутствии лечения заболеваний, вызываемых коронавирусами. Дисульфирам можно дополнительно исследовать и модифицировать для применения.

Краткое описание графических материалов

ФИГ. 1: ингибирующая активность дисульфирама в отношении главной протеазы нового коронавируса; на фигуре 1 – DMSO (отрицательный контроль), 2 – молекула соединения и 3 – положительный контроль (ингибитор N3).

ФИГ. 2: кривая ингибирования дисульфирамом главной протеазы нового коронавируса.

ФИГ. 3: ингибирующая активность дисульфирама в отношении нового коронавируса на клеточном уровне.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством следующих примеров, которые не предназначены ограничивать настоящее изобретение. Методики эксперимента, которые не определяют конкретных условий в следующих примерах, проводили в соответствии с общепринятыми методиками и условиями или в соответствии с инструкциями.

Пример 1

В разных библиотеках соединений проводили скрининг с высокой пропускной способностью, и подвергшийся успешному скринингу дисульфирам демонстрировал довольно хороший эффект ингибирования в отношении главной протеазы нового коронавируса. Условия эксперимента на ферментативную активность являлись следующими.

Флуоресцентный субстрат для анализа на ферментативную активность: MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH₂, длина волны возбуждения и длина волны испускания составляли 320 нм и 405 нм соответственно.

Рабочий буфер для определения ферментативной активности содержал 50 мМ Tris-HCl (pH 7,3) и 1 мМ EDTA; температура реакции для определения ферментативной активности составляла 30°C. Реакцию инициировали посредством добавления протеазы до конечной концентрации, составляющей 0,2 мкМ, где концентрация субстрата составляла 20 мкМ, и концентрация дисульфирама составляла 1,5 мкМ (Xue X, Yang H, Shen W, et al. Production of authentic SARS-CoV Mpro with enhanced activity: application as a novel tag-cleavage endopeptidase for protein overproduction[J]. Journal of molecular biology, 2007, 366(3): 965-975.).

В качестве положительного контроля применяли ингибитор N3, который известен эффективной инактивацией главной протеазы коронавируса (Yang Haitao, Xie Weiqing, Xiaooyu X, et al., Design of wide-spectrum inhibitors targeting coronavirus main proteases [J]. Living organic chemistry, 2005, 3(10): 1742-1752); его структурная формула показана ниже:

В соответствии с ФИГ. 1 можно увидеть, что экспериментальная кривая ферментативной активности дисульфирама сильно отличается от кривой отрицательного контроля, а это означает, что дисульфирам характеризуется значительной ингибирующей активностью в отношении главной протеазы коронавируса.

Пример 2

Флуоресцентный субстрат для определения кривой ингибирования ферментативной активности: MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH₂, длина волны возбуждения и длина волны испускания составляли 320 нм и 405 нм соответственно.

Буфер для определения кривой ингибирования ферментативной активности представлял собой 50 мМ Tris-HCl (pH 7,3) и 1 мМ EDTA; температура реакции составляла 30°C. Реакцию инициировали посредством добавления протеазы до конечной концентрации, составляющей 0,2 мкМ, при этом концентрация субстрата составляла 20 мкМ; определение проводили с применением 11 разных концентраций дисульфирама, и результаты теста показали, что значение IC₅₀ составляло 9,35 мкМ (ФИГ. 2) (Jin Z, Du X, Xu Y, et al. Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors[J]. Nature, 2020, 582(7811):1-9).

Пример 3

qRT-PCR-метод выявления с проведением эксперимента на клетках in-vitro с использованием противовирусных препаратов. Клетки Vero высевали в 96-луночный планшет, инкубировали при 37°C в течение 20-24 ч, а затем обрабатывали клетки с помощью 10 мкМ дисульфирама в течение 1 ч. Затем добавляли SARS-CoV-2 для обработки клеток в течение 2 ч с целью их заражения; наблюдалась MOI (множественность заражения), составляющая 0,01. Затем смесь вирус-лекарственное средство удаляли, и после промывки клетки дополнительно культивировали в свежей среде, содержащей лекарственные средства. После 72 часов культивирования вирусную РНК выделяли из супернатанта культуры с использованием набора для выделения вирусной РНК QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen) и, наконец, проводили обнаружение посредством qRT-PCR (Jin Z, Du X, Xu Y, et al. Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors[J]. Nature, 2020, 582(7811):1-9).

В ходе эксперимента на клетках in-vitro с использованием противовирусных препаратов было установлено, что дисульфирам ингибирует репликацию SARS-CoV-2, поэтому дисульфирам можно применять для лечения заболеваний, вызываемых коронавирусом (ФИГ. 3).

Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны выше, специалистам в данной области техники будет понятно, что данные варианты осуществления являются только иллюстративными, и в данные варианты осуществления можно внести множество вариаций или модификаций без отклонения от принципов и сущности настоящего изобретения. Следовательно, объем охраны настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно раскрывается применение дисульфирама в получении лекарственного препарата для лечения заболевания, вызываемого SARS-CoV-2. Использование изобретения позволяет эффективно лечить заболевания, вызываемые SARS-CoV-2. 3 ил., 4 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Применение дисульфирама в получении лекарственного препарата для лечения заболевания, вызываемого SARS-CoV-2.

2. Применение по п. 1, где заболевание представляет собой заболевание млекопитающих или птиц.

3. Применение по п. 2, где млекопитающее включает людей, свиных и кошачьих.

4. Применение по п. 1, где дисульфирам представляет собой единственный активный ингредиент фармацевтической композиции.

5. Применение по п. 4, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, такой как фармацевтически приемлемый вспомогательный материал.