ЛИПОСОМАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ 5-ХЛОРПИРИДИН-3-ИЛ-1Н-ИНДОЛ-4-КАРБОКСИЛАТА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНОЕ СРЕДСТВО ЭКСТРЕННОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ КОРОНАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/405 A61K36/54 A61K47/14 A61K47/24 A61K9/127 A61P31/12 

Пандемия COVID-19, вызванная коронавирусом второго тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), считается самым серьезным глобальным кризисом в области здравоохранения со времен пандемии гриппа 1918 года. При этом коронавирусы тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV) и ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) не получили столь широкого распространения, но при этом обладали значительно более высокими показателями смертности: до 10% и 35%, соответственно. Другие коронавирусы (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-229E и HCoV-NL63) хоть и являются малопатогенными и вызывают у большинства людей лишь инфекции верхних дыхательных путей, но у лиц с ослабленным иммунитетом из-за этих вирусов могут возникать инфекции нижних дыхательных путей [1].

Традиционная стратегия противовирусной терапии - ингибирование протеаз, необходимых для протеолитического процессинга вирусных полипротеинов [2]. Однако непрерывная эволюция вируса и возрастающее селективное давление со стороны используемых противовирусных препаратов могут привести к формированию резистентных мутантов SARS-CoV-2 и определяют необходимость разработки новых терапевтических средств [3].

Во время вспышки атипичной пневмонии была разработана серия 5-хлорпиридинил индолкарбоксилатных ингибиторов основной протеазы SARS-CoV-1 [4]. При этом 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилат оказался наиболее мощным ингибитором ферментативной активности вируса. Структурная формула 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата, известного также под названием GRL-0920, приведена на рисунке 1.

Рисунок 1 - 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилат (GRL-0920)

Американские и японские исследователи в начале пандемии COVID-19 оценили активность 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата. В отношении Mpro SARS-CoV-2 полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC₅₀) составила 250 нМ, а противовирусная активность в культуре клеток VeroE6 (ЕС50) - 2,8 мкМ. При этом цитотоксичность (СС50) достигала более 100 мкМ [5].

В другой работе тех же авторов [6] ингибитор протеазы GRL-0920, проявил мощную активность против SARS-CoV-2 в клеточных анализах, выполненных с использованием клеток VeroE6 и VeroE6TMPRSS2. Результаты иммуноцитохимического анализа показали, что в концентрации 100 мкМ GRL-0920 полностью блокировал инфекционность, репликацию и цитопатический эффект SARS-CoV-2 (штамм WK-521) в монослое клеток VeroE6. В этих же условиях ремдесивир значительно блокировали инфекционность и репликацию SARS-CoV-2, но не обеспечил полного отсутствия инфицированных клеток в монослое.

Однако, несмотря на отличные результаты исследований, полученные in vitro, в опытах in vivo 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилат практически не проявил активность в подавлении SARS-CoV-2. Это обусловлено тем, что GRL-0920 отличается высокой липофильностью и практически не растворим в воде. Также высокая гидрофобность соединения приводит к повышенному связыванию с белками плазмы, что значительно снижает возможность его применения как терапевтического препарата.

В свою очередь, увеличение растворимости за счет структурной модификации активного вещества может сопровождаться потерей ингибирующей активности в отношении основной протеазы SARS-CoV-2 [7], снижением стабильности, проявлением токсических или нежелательных побочных свойств.

Кроме того, водорастворимые лекарства плохо проникают через плазматическую мембрану в цитоплазму клеток, что может существенно снизить терапевтический эффект.Во избежание негативных эффектов структурной перестройки соединений, для хранения и улучшенной доставки лекарственных веществ к мишени заболевания могут быть использованы молекулярные контейнеры, в частности, липосомы [8]. Липосомы считаются наиболее многообещающей системой доставки лекарств, отличающейся низкой токсичностью, простотой масштабирования производства, выраженной биосовместимостью и высокой эффективностью загрузки лекарств [9, 10].

Принципиальная возможность безопасного и эффективного использования пероральных липосомальных препаратов для профилактики и лечения COVID-19 была показана в клиническом испытании липосомальной формы бычьего лактоферрина (Lactyferrin™), который зарегистрирован в качестве пищевой добавки [11]. Также идея применения для профилактики COVID-19 липосомальных форм пищевых добавок и продуктов, которые повышают иммунитет, была высказана специалистами из Ирана и Австралии [12]. Также разработан экспериментальный образец липосомальной формы ремдесивира, предназначенный для ингаляционного введения при COVID-19 и других коронавирусных инфекциях [13].

Таким образом, задачей заявляемого изобретения является получение водорастворимой формы 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата, инкапсулированного в липосомы, с целью улучшения биодоступности при пероральном приеме, снижения цитотоксичности и улучшения терапевтической эффективности.

Разработанная липосомальная композиция содержит в качестве активного компонента 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилат, а также фосфатидилэтаноламин, масло авокадо и смесь метилпарабена и пропил парабена в качестве консерванта при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Вода 95,0÷97,0 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилат 0,15÷0,2 Масло авокадо 1,0÷3,0 Фосфолипиды 0,6÷0,8 Метилпарабен 0,04÷0,05 Пропилпарабен 0,04÷0,05

Состав предлагаемой композиции ранее не был описан в доступной литературе и обладает установленной активностью в отношении SARS-CoV-2. Эффективность изобретения иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Образец наноразмерного липосомального препарата 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата был изготовлен в соответствии с техническими условиями на производство препаратов липосомальных «БИОНТОС» (ТУ 9154-002-77972392-05) по следующей технологической схеме:

2,0 г 5-Хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата растворяли в 10 мл масла авокадо при комнатной температуре. Также 8,0 г фосфолипидов растворяли в 20 мл масла авокадо при комнатной температуре. Необходимую массу фосфолипидов рассчитывали исходя из итоговой концентрации фосфолипидов в конечном растворе, содержащем липосомы, 7 мг/мл. В раствор фосфолипидов на перемешивающем устройстве Biosan MMS 3000 струйно вводили раствор 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата при скорости оборотов мешалки 2500 об/мин в течение 2 минут. Липосомальный образец изготавливали на Индукторе «Линейный электромагнитный преобразователь» (ЛЭМП) при скорости подачи органической фазы в рабочую ячейку 16 л/час и скорости подачи водной фазы 96 л/час. Время активной работы рабочей ячейки - 40 секунд. Из рабочей ячейки липосомальный препарат поступал в приемную емкость, куда вносился раствор консервантов из расчета: пропилпарабен 0,5 г/л, метилпарабен 0,5 г/л в конечном препарате.

В результате с учетом переходящих остатков был получен образец в количестве примерно 1,2 л с конечными характеристиками:

- массовая доля сухих веществ (СВ) по ГОСТ 29188.0-91 - 2,44%;

- содержание фосфолипидов (% от СВ) - 48,11%;

- водородный показатель, рН - 5,62;

- медианный размер липосом - 190 нм;

Полученный препарат характеризовался высокой стабильностью - более 3 месяцев при оценке по методике ускоренного хранения и более 1 года при температуре (5±2)°С.

Изобретение позволило получить липосомальную композицию для перорального введения противокоронавирусного химиопрепарата -необратимого ингибитора основной протеазы коронавирусов - 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата.

Эффективность в отношении SARS-CoV-2 была доказана in vivo на чувствительной лабораторной модели для COVID-19 (сирийские золотистые хомяки). При этом липосомальную форму 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата использовали в виде исходной суспензии (в 100 мкл 8 мг/кг). Препарат применяли перорально по следующим схемам:

- экстренная профилактика - через 1 час после инфицирования и далее 1 раз в сутки в течение 5 дней;

- лечение - через 8 часов (один цикл репродукции вируса) после инфицирования ударная (двойная) доза и далее 1 раз в сутки в течение 5 дней.

Результаты сравнительной оценки противовирусной активности образца липосомальной формы 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата и применяемых в клинике лекарственных средств для этиотропного лечения и экстренной профилактики COVID-19 на модели заражения сирийских хомяков (таблица 1) свидетельствуют о более высокой лечебной и профилактической эффективности липосомальной формы - хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата.

Даже при применении один раз в сутки, начиная через 1 ч после заражения, липосомальная форма 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата в дозе 8 мг/кг полностью подавляет размножение вируса в легких сирийских хомяков на третий и шестой день после заражения. Вирус не обнаружен в пулах легких всех животных, коэффициент ингибирования - 100%. Данная суточная доза существенно меньше доз лекарственных препаратов для этиотропного лечения и экстренной профилактики COVID-19, которые в рамках доклинических исследований показали равную или меньшую эффективность на модели заражения сирийских хомяков. Фавипиравир - 99,99% в дозе 1000 мг/кг [14], молнупиравир - 98,85% в дозе 500 мг/кг [15]. В свою очередь, при пероральном введении самого 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата по схеме экстренной профилактики в суточной дозе 400 мг/кг, эффект отсутствует.

В результате изучения токсичности липосомальной композиции 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата для сирийских золотистых хомяков установлено, что при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 16 мг/кг (200 мкл исходной суспензии) препарат не проявляет токсического эффекта.

Таким образом, новая липосомальная композиция 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата может стать потенциальным средством экстренной профилактики и лечения коронавирусных инфекций.

Литература.

1 Cascella, М. Features, Evaluation, and Treatment of Coronavirus (COVID-19) / M. Cascella, M. Rajnik, A. Aleem [et al]. - Текст: электронный // In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing. - 2022. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK554776/ (дата обращения: 13.10.2022);

2 Agbowuro, A. A. Proteases and protease inhibitors in infectious diseases / A. A. Agbowuro, W. M. Huston, A. B. Gamble, J. D. A. Tyndall. - Текст: непосредственный // Med Res Rev. -2018. -№38(4). - p. 1295-1331;

3 Smith, E. High Throughput Screening for Drugs that Inhibit 3C-Like Protease in SARS-CoV-2 / E. Smith, M. E. Davis-Gardner, R. D. Garcia-Ordonez [et al]. -Текст: электронный // SLAS Discov. - 2023. - URL: https://doi: 10.1016/i.slasd.2023.01.001./ (дата обращения: 13.01.2023);

4 Ghosh, A. K. Design, synthesis and antiviral efficacy of a series of potent chloropyridyl ester-derived SARS-CoV 3CLpro inhibitors / A. K. Ghosh, G. Gong, V. Grum-Tokars [et al]. - Текст: непосредственный // J. Bioorg. & Med. Chem. - 2008. - №18. - p. 5684-5688;

5 Ghosh, A. K. Indole chloropyridinyl ester-derived SARS-CoV-2 3CLpro inhibitors: enzyme inhibition, antiviral efficacy, structure-activity relationship, and X-ray structural studies / A. K. Ghosh, J. Raghavaiah, D. Shahabi [et al]. - Текст: непосредственный // J. Med. Chem. - 2021. - №64. - p. 14702-14714;

6 Hattori, S-I. GRL-0920, an indole chloropyridinyl ester, completely blocks SARS-CoV-2 infection / S-I. Hattori, N. Higshi-Kuwata, J. Raghavaiah [et al]. - Текст: непосредственный // mBio. - 2020. - №11. - p. 1833-1853;

7 Zhang, L. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved alpha-ketoamide inhibitors / L. Zhang, D. Lin, X. Sun [et al]. - Текст: непосредственный // Science. - 2020. - №368. - p. 409-412;

8 Тараховский, Ю.С. Интеллектуальные липидные наноконтейнеры в адресной доставке лекарственных веществ. - М.: Издательство ЛКИ, 2011. - 280 с.

9 He, Y. Liposomes and liposome-like nanoparticles: From anti-fungal infection to the COVID-19 pandemic treatment / Y. He, W. Zhang, Q. Xiao [et al]. - Текст: непосредственный // Asian J Pharm Sci. - 2022. - №17(6). - p. 817-837;

10 Plaza-Oliver, M. Current approaches in lipid-based nanocarriers for oral drug delivery / M. Plaza-Oliver, M. J. Santander-Ortega, M. V. Lozano. - Текст: непосредственный // Drug Deliv. Transl. Res. - 2021. - №11(2). - p. 471-497;

11 Serrano, G. Liposomal Lactoferrin as Potential Preventative and Cure for COVID-19 / G. Serrano, I. Kochergina, A. Albors [et al]. - Текст: непосредственный // Int J Res Health Sci. - 2020. - №8(1). - p. 8-15;

12 Hosseini, F. Prevention of SARS-CoV-2 Infection: A Liposomal Functional Food Approach / F. Hosseini, B. Bahramimeimandi, E. Raoufi, M. R. Mozafari. -Текст: непосредственный // Int. J. Prev. Med. - 2021. - p. 12-26;

13 Li, J. Liposomal remdesivir inhalation solution for targeted lung delivery as a novel therapeutic approach for COVID-19 / J. Li, K. Zhang, D. Wu [et al]. - Текст: непосредственный // Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2021;

14 Kaptein, S. J. F. Favipiravir at high doses has potent antiviral activity in SARS-CoV-2-infected hamsters, whereas hydroxychloroquine lacks activity / S. J. F. Kaptein, S. Jacobs, L. Langendries. - Текст: электронный // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2020. - №117. - p.26955-26965. - URL: https://doi:10.1073/pnas.2014441117/ (дата обращения: 10.06.2022);

15 Rosenke, K. Orally Delivered MK-4482 Inhibits SARS-CoV-2 Replication in the Syrian Hamster Model / K. Rosenke, F. Hansen, B. Schwarz. -Текст: электронный // Res. Sq. - 2020. - URL: https://doi: 10.21203/rs.3.rs-86289/vl/ (дата обращения: 10.06.2022)

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к липосомальной композиции с активностью в отношении SARS-CoV-2. Липосомальная композиция с активностью в отношении SARS-CoV-2 с улучшенными показателями биодоступности, цитотоксичности и терапевтической эффективности при пероральном приеме, содержащая в качестве активного компонента 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилат, а также фосфатидилэтаноламин, масло авокадо и смесь метилпарабена и пропил-парабена в качестве консерванта при следующем соотношении компонентов, масс. %: вода 95,0÷97,0; 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилат 0,15÷0,2; масло авокадо 1,0÷3,0; фосфолипиды 0,6÷0,8; метилпарабен 0,04÷0,05; пропилпарабен 0,04÷0,05. Вышеописанная композиция представляет собой водорастворимую форму 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилата, инкапсулированного в липосомы, с улучшенной биодоступностью при пероральном приеме, сниженной цитотоксичностью и улучшенной терапевтической эффективностью. 1 табл, 1 пр.

Липосомальная композиция с активностью в отношении SARS-CoV-2 с улучшенными показателями биодоступности, цитотоксичности и терапевтической эффективности при пероральном приеме, содержащая в качестве активного компонента 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилат, а также фосфатидилэтаноламин, масло авокадо и смесь метилпарабена и пропил-парабена в качестве консерванта при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Вода 95,0÷97,0 5-хлорпиридин-3-ил-1Н-индол-4-карбоксилат 0,15÷0,2 Масло авокадо 1,0÷3,0 Фосфолипиды 0,6÷0,8 Метилпарабен 0,04÷0,05 Пропилпарабен 0,04÷0,05