Способ создания конъюгатов на основе углеродных наноструктур Российский патент 2024 года по МПК C01B32/152 C01B32/158 C01B32/198 C01B32/25 

Изобретение относится к синтезу новых наноматериалов на основе оксида графена, фуллеренов, детонационных наноалмазов и углеродных нанотрубок, конъюгированных с цитостатическим агентом и вектором для адресной доставки.

Онкологические заболевания являются второй ведущей причиной смертности в мире и по данным мировой статистики были причиной 9,6 миллиона смертей в 2018 году. Во всем мире 1 из 6 смертей происходит в связи с развитием онкологического заболевания [F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, R.L. Siegel, L.A. Torre, A. Jemal, Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries, Cancer J Clin. 2018, 68, 394]. В 2019 году в Российской Федерации впервые в жизни было выявлено 640391 случаев злокачественных новообразований. Прирост данного показателя по сравнению с 2018 годом составил 2,5%. На конец 2019 года в онкологических учреждениях России состояли на учете почти 4 млн пациентов [А.Д. Каприн, В.В. Старинский, А.О. Шахзадова, Состояние онкологической помощи населению России в 2020 году. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2021. - илл. - 239 с]. Онкологическая заболеваемость и смертность продолжает расти. В этой связи разработка новых эффективных методов лечения онкологических заболеваний является актуальной проблемой. Актуальными задачами современной лекарственной терапии является снижение токсичности и повышение специфической противоопухолевой активности препаратов. Конъюгаты на основе углеродных наноструктур с векторами для адресной доставки и цитостатическими агентами могут быть использованы для лечения онкологических заболеваний.

Наноматериалы на основе углерода имеют большой потенциал применения в различных областях науки и техники благодаря электронному строению, а также уникальным физико-химическим и биологическим свойствам [Rauti et al., 2019]. Среди существующих углеродных наноструктур наиболее изучены углеродные нанотрубки, графен, наноалмазы и фуллерены, которые являются перспективными платформами для создания коньюгатов [S.K. Debnath, R. Srivastava, Drug Delivery With Carbon-Based Nanomaterials as Versatile Nanocarriers: Progress and Prospects, Frontiers in Nanotechnology. 2021, 3].

Графен - наноматериал толщиной в один атом, который представляет собой двумерную аллотропную модификацию углерода. Атомы углерода в графене находятся в состоянии sp²-гибридизации и соединены посредством σ- и π-связей в гексагональную двумерную кристаллическую решётку. Впервые графен был получен при помощи метода механической эксфолиации, а в дальнейшем были разработаны такие методы синтеза графена как химическое расслаивание, эпитаксия и химическое осаждение из газовой фазы. Оксид графена (GO) представляет собой окисленную форму графена, которая содержит кислородные функциональные группы на поверхности графенового листа (карбонильные, карбоксильные, лактольные, гидроксильные и эпоксидные группы). Использование окисленной формы графена имеет следующие преимущества: высокая биосовместимость, возможность получения стабильных водных дисперсий; возможность проведения дальнейшей функционализации поверхности GO с использованием различных функциональных групп, расположенных на поверхности оксида графена. GO имеет потенциал применения в различных областях биомедицины: в качестве носителя для адресной доставки лекарств, биовизуализации, в качестве основы для создания противовирусных, антибактериальных и противогрибковых препаратов. Благодаря большому разнообразию функциональных групп и возможности химического модифицирования GO, существует интерес создания композиционных материалов биомедицинского назначения. Особого внимания заслуживает направление исследований, в котором GO используется для создания конъюгатов для адресной доставки лекарств. Такие конъюгаты могут быть получены посредством ковалентной модификации GO, а также за счет невалентных взаимодействий.

Фуллерен - аллотропная модификация углерода, представляющая собой сфероидальную, каркасную молекулу, состоящую из четного числа ковалентно связанных атомов углерода в sp² гибридном состоянии, образующих пятиугольники и шестиугольники. Впервые фуллерены были получены в результате сжигания графитовых стержней высокоэнергетическими лазерными импульсами. В настоящее время фуллерены являются одним из наиболее востребованных продуктов углеродных нанотехнологий, так как они обладают широким спектром биологической активности.

Наноалмазы - это аллотропная модификация углерода, состоящая из атомов, находящихся в sp³-гибридном состоянии. Форма алмазных наночастиц может быть либо сферической, либо эллиптической. В их основе лежит алмазный кор (ядро) [O. A. Shenderova, G. E. McGuire, Science and engineering of nanodiamond particle surfaces for biological applications, Biointerphases. 2015, 10, 030802], поверхность которого содержит эпоксидные, карбоксильные, гидроксильные группы [J.T. Paci, H.B. Man, B. Sasha, D. Ho, G.C. Schatz, Understanding the Surfaces of Nanodiamonds, The Journal of Physical Chemistry C. 2013, 117, 17256]. В зависимости от методов синтеза существует два основных класса наноалмазов для биомедицинского применения: детонационные наноалмазы и высокотемпературные наноалмазы высокого давления. Детонационные наноалмазы химически стабильны и имеют размер одной частицы порядка 5 нм [V.Y. Dolmatov, Detonation synthesis ultradispersed diamonds: properties and applications, Russian Chemical Review. 2001, 70, 607]. При диспергировании в водном растворе наноалмазы имеют тенденцию к самоорганизации, что приводит к образованию агрегатов с размерами 50-200 нм [K.B. Holt, Diamond at the nanoscale: applications of diamond nanoparticles from cellular biomarkers to quantum computing, Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 2007, 365, 2845]. Первичные частицы детонационного наноалмаза обычно имеют сферическую форму. Данная форма и размеры делают их перспективными для применения в областях, где требуется высокая удельная поверхность (от 300 до 400 м²⋅г^-1), например, при загрузке лекарств [E.K. Chow, X.-Q. Zhang, M. Chen, R. Lam, E. Robinson, H. Huang, D. Schaffer, E. Osawa, A. Goga, D. Ho, Nanodiamond Therapeutic Delivery Agents Mediate Enhanced Chemoresistant Tumor Treatment, Sci Transl Med. 2011, 3, 73], биологически активных молекул [I. Neitzel, V. Molchanin, I. Knoke, G.R. Palmese, Y Gogotsi, Mechanical properties of epoxy composites with high contents of nanodiamond, Compos Sci Technol. 2011, 71, 710].

Углеродные нанотрубки (УНТ) представляют собой свернутые в трубчатые структуры графеновые слои. Благодаря своему строению УНТ обладают высокой площадью поверхности, механической прочностью, термической стабильностью, а также возможностью химического модифицирования [S. Rathinavel, K. Priyadharshini, D. Panda, A review on carbon nanotube: An overview of synthesis, properties, functionalization, characterization, and the application, Materials Science and Engineering: B. 2021, 268, 115095]. УНТ рассматриваются как перспективные наноплатформы для иммобилизации на их поверхность биологически активных молекул, цитостатических агентов, пептидов, белков, антител, малых интерферирующих РНК (миРНК), генетических конструкций.

Исследования в области синтеза конъюгатов на основе углеродных наноструктур подразделяются на несколько направлений.

1. Ковалентно модифицированный полигдроксилированный фуллерен (фуллеренол), на который невалентно загружен цитостатический агент.

В работе [P. Chaudhuri, A. Paraskar, S. Soni, R.A. Mashelkar, S. Sengupta, Fullerenol-cytotoxic conjugates for cancer chemotherapy, ACS Nano. 2009, 3, 2505] синтезировали полигидрокислированный фуллерен - фуллеренол, конъюгированный через карбаматный линкер с доксорубицином (DOX). Синтез осуществляли следующим образом: к раствору фуллерена С₆₀ в толуоле добавляли раствор NaOH, раствор перекиси водорода (ω = 30%) и гидроксида тетрабутиламмония (ω = 40%). Полученный раствор перемешивали в течение 5 дней при комнатной температуре, удаляли органический слой, после чего проводили осаждение и промывку фуллеренола этанолом. Полученный фуллеренол диспергировали в безводном диметилформамиде (ДМФА) и обрабатывали ультразвуком в течение 1 ч до образования гомогенной суспензии, к которой добавляли п-нитрофенилхлорформиат, безводный пиридин и N,N-диметиламинопиридин, после чего перемешивали в течение 48 ч при 0°C в атмосфере азота, каждые 8 ч обрабатывая ультразвуком в течение 1 ч. Полученное вещество осаждали и промывали диэтиловым эфиром, дихлорметаном и изопропиловым спиртом. Далее активированный фуллеренол растворяли в безводном ДМФА и обрабатывали ультразвуком в атмосфере азота в течение 30 мин, после чего к раствору добавляли DOX⋅HCl, N,N-диизопропилэтиламин и реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. Далее добавляли OMe-PEG-NH₂ и снова перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 30 ч, каждые 8 ч обрабатывая ультразвуком в течение 1 ч. Полученное вещество осаждали диэтиловым эфиром, а затем промывали метанолом и дихлорметаном. Затем полученный конъюгат растворяли в деионизированной воде и очищали диализом в течение 2 дней против деионизованной воды. Очищенный раствор центрифугировали при 8000 об⋅мин^-1 в течение 10 мин для удаления крупных агрегатов. Исследования, проведенные на клеточной линии меланомы крыс B16-F10 показали, что полученный конъюгат обладает цитостатической активностью: IC₅₀ = 12 μM.

2. Многослойные углеродные нанотрубки, ковалентно модифицированные вектором для адресной доставки и цитостатическим агентом за счет невалентных взаимодействий.

Li и соавт. в работе [R. Li, R. Wu, L. Zhao, Z. Hu, S. Guo, X. Pan, H. Zou, Folate and iron difunctionalized multiwall carbon nanotubes as dual-targeted drug nanocarrier to cancer cells, Carbon. 2011, 49, 1797] синтезировали конъюгат на основе многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ), допированных наночастицами Fe, фолиевой кислоты (FA) и DOX. Конъюгат MWCNT@Fe-FA-DOX получали следующим образом: МУНТ обрабатывали смесью концентрированных HNO₃ и H₂SO₄ при 120°C на масляной бане в течение 30 мин. Окисленные МУНТ промывали, далее готовили водную дисперсию, далее проводили центрифугирование для удаления крупных и непрореагировавших МУНТ. После чего супернатант лиофилизировали. Полученные окисленные МУНТ добавляли к водному раствору Fe(NO₃)₃ с последующей обработкой ультразвуком в течение 2 ч. Затем осуществляли термообработку полученной дисперсии при 140°С на воздухе в течение 8 ч; образовавшуюся твердую фазу обрабатывали при 350°С в атмосфере гелия в течение 3 ч, после чего полученные o-MWCNT@Fe₂O₃ восстанавливали в токе водорода при 350°C. Далее проводили конъюгацию FA с гексаметилендиамином (FA-HMDA): FA, EDC и NHS добавляли к водному буферному раствору этансульфоновой кислоты (MES) и перемешивали в течение 2 ч, после чего добавляли HMDA, и полученную смесь дополнительно перемешивали в течение 12 ч и высушивали лиофилизацией. Конъюгат FA-MWCNT@Fe получали следующим образом: MWCNT@Fe, EDC и NHS растворяли в MES-буфере и перемешивали в течение 2 ч. Затем осадок отделяли от жидкой фазы фильтрованием и промывали буферным раствором MES, после чего к полученной смеси добавляли FA-HMDA, перемешивали в течение 12 ч, твердую фазу отделяли фильтрованием и промывали ацетонитрилом. Далее осуществляли загрузку DOX: FA-MWCNT@Fe добавляли к раствору DOX и перемешивали в течение 1 ч при 25°C, после чего полученный конъюгат выделяли с помощью фильтрования и очищали от непрореагировавших частиц Fe₃O₄ с использованием магнита. Исследования цитостатического эффекта на клеточной линии HeLa показали, что при С = 40 мкг⋅мл⁻¹ MWCNT@Fe-FA и 5 мкг⋅мл⁻¹ DOX (при обработке магнитным полем области клеток опухоли) ингибирование роста составило 85%.

3. Наноалмазы, модифицированные за счет невалентных взаимодействий цитостатическим агентом.

В работе [B. Guan, F. Zou, J. Zhi, Nanodiamond as the pH-Responsive Vehicle for an Anticancer Drug, Small. 2010, 19, 1514] представлен синтез наноалмазов, модифицированных цисплатином (CP). На первом этапе наноалмазы оксисляли по следующей методике: готовили гетерогенную смесь из наноалмазов и концентрированных H₂SO₄ и HNO₃ кислот (объемное соотношение 9:1), перемешивали в течение 3 суток при 75°C, после чего обрабатывали раствором NaOH при 90°C в течение 2 ч, раствором HCl при 90°С в течение 2 ч, и промывали водой. Далее окисленные наноалмазы диспергировали в фосфатном буфере (PBS, pH 7,4), добавляли водный раствор CP (1 мг⋅мл^-1) и перемешивали при 37°С в течение 48 ч, после чего центрифугировали и промывали.

4. Ковалентно модифицированный GO, на который с помощью невалентных взаимодействий загружен цитостатический агент.

Fan и др. в работе [L. Fan, H. Ge, S. Zou, Y. Xiao, H. Wen, Y. Li, H. Feng, M. Nie, Sodium alginate conjugated graphene oxide as a new carrier for drug delivery system, Int. J. Biol. Macromol. 2016, 93, 582] синтезировали ковалентный конъюгат на основе GO с дигидразидом адипиновой кислоты и альгинатом натрия (SA), к которому затем был невалентно присоединён DOX. Максимальная загрузка DOX составила 1,8 мг⋅мг^-1 GO-SA. Наилучшая скорость высвобождения лекарства наблюдалась при pH 5.0. Исследования цитотоксичности показали, что конъюгат GO-SA не обладает токсичностью, в то время как GO-SA-DOX показал цитотоксичность в отношении линии HeLa благодаря специфическому взаимодействию с рецептором CD44. Pooresmaeil и др. в работе [M. Pooresmaeil, H. Namazi, β-Cyclodextrin grafted magnetic graphene oxide applicable as cancer drug delivery agent: synthesis and characterization, Mater. Chem. Phys. 2018, 218, 62] иммобилизовали на GO частицы магнетита (Fe₃O₄), бета-циклодекстрина (β-CD), DOX и метотрексата (MTX). Результаты исследования цитотоксичности на клетках линии K562 (клеточная линия хронического миелоидного лейкоза) показали снижение жизнеспособности клеток на 65% и 55% при концентрации 16 мкг⋅мл^-1 для конъюгатов GO-Fe₃O₄-β-CD-DOX (содержание DOX - 37,4 масс. %) и GO-Fe₃O₄-β-CD-MTX (содержание MTX - 23,4 масс. %), соответственно. Pei и др. показали, что одновременное присоединение CP и DOX к GO, функционализированному полиэтиленгликолем (PEG) pGO с образованием конъюгата pGO-CP-DOX (массовое соотношение компонентов: 1:0,376:0,376) приводит к усилению цитотоксичности по отношению к клеточным линиям Cal-27 (клеточная линия плоскоклеточной карциномы человека) и MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека). Авторы наблюдали более высокий цитотоксический эффект на клеточной линии MCF-7 для конъюгата pGO-CP-DOX по сравнению с конъюгатами GO с индивидуальными препаратами: IC₅₀ = 14,5 мкг/мл для pGO-CP-DOX, 22,5 мкг/мл для pGO-DOX и 22 мкг/мл для pGO-C [X. Pei, Z. Zhu, Z. Gan, J. Chen, X. Zhang, X. Cheng, Q. Wan, J. Wang, PEGylated nano-graphene oxide as a nanocarrier for delivering mixed anticancer drugs to improve anticancer activity, Sci. Rep. 2020, 10, 1]. Gong и др. продемонстрировали, что фторированный графен (FG) может использоваться для загрузки смеси DOX и камптотецина (CPT) после ковалентной функционализации с хитозаном (CS); загрузка DOX и CPT составляла 110% и 25%, соответственно. Полученный конъюгат FG-CS-DOX-CPT приводил к снижению жизнеспособности клеток линии HeLa на 60 % при С = 4,5 мкг⋅мл^-1 (в пересчете на содержание цитостатических препаратов); снижение жизнеспособности клеток при облучении (λ = 808 нм) при той же концентрации составило 75% [P. Gong, Q. Zhao, D. Dai, S. Zhang, Z. Tian, L. Sun, J. Ren, Z. Liu, Functionalized Ultrasmall Fluorinated Graphene with High NIR Absorbance for Controlled Delivery of Mixed Anticancer Drugs, Chem. - A Eur. J. 2017, 23, 17531].

5. GO, функционализированный цитостатическими агентами в результате невалентных взаимодействий.

Tiwari и др. [H. Tiwari, N. Karki, M. Pal, S. Basak, R.K. Verma, R. Bal, N.D. Kandpal, G. Bisht, N.G. Sahoo, Functionalized graphene oxide as a nanocarrier for dual drug delivery applications: The synergistic effect of quercetin and gefitinib against ovarian cancer cells, Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2019, 178, 452] использовали нековалентный конъюгат GO с поливинилпирролидоном (PVP) для невалентного присоединения кверцетина (QS) и гефитиниба (GF), и сравнили его с конъюгатами GO-PVP-QS и GO-PVP-GF. Авторы обнаружили, что одновременное конъюгированние GO-PVP с QS и GF позволило повысить цитотоксический эффект по отношению к клеткам PA (клеточная линия рака яичников человека) по сравнению с конъюгатами GO-PVP-QS и GO-PVP-GF и индивидуальными препаратами более, чем на 15%. Загрузка препаратов QS и GF в конъюгате GO-PVP-QS-GF составляла 20 и 46%, соответственно. Bullo и др. продемонстрировали возможность функционализации GO с помощью PEG, FA, а также протокатехиновой (23,5% PCA) и хлорогеновой (18,3% CA) кислотами. Авторы исследовали цитотоксичность конъюгата GO-PEG-FA-PCA-CA на двух линиях опухолевых клеток - HT29 (клетки рака толстой кишки) и HepG2 (клетки аденокарциномы печени человека). Эксперименты по цитотоксичности показали следующие результаты для GO-PEG-FA-PCA-CA: IC₅₀ (HT29) = 50,7 мкг⋅мл^-1, IC₅₀ (HepG2) = 40,4 мкг⋅мл^-1; для сравнения можно привести данные по цитотоксичности индивидуальных PCA и CA: IC₅₀ (HT29) = 45,7 мкг⋅мл^-1 и 58,5 мкг⋅мл^-1; IC₅₀ (HepG2) = 37,5 мкг⋅мл^-1 и 49,3 мкг⋅мл^-1_, соответственно [S. Bullo, K. Buskaran, R. Baby, D. Dorniani, S. Fakurazi, M.Z. Hussein, Dual Drugs Anticancer Nanoformulation using Graphene Oxide-PEG as Nanocarrier for Protocatechuic Acid and Chlorogenic Acid, Pharm. Res. 2019, 36, 91]. Gong и др. показали возможность осуществления нековалентной конъюгации FG с DOX (загрузка препарата составляла 200%). Конъюгат FG-DOX при С = 30 мкг⋅мл^-1 значительно снижал жизнеспособность клеток линии HeLa до 94% после 48 ч инкубации [P. Gong, J. Du, D. Wang, B. Cao, M. Tian, Y. Wang, L. Sun, S. Ji, Z. Liu, Fluorinated graphene as an anticancer nanocarrier: An experimental and DFT study, J. Mater. Chem. B. 2018, 6, 2769].

Shim и др. [G. Shim, J.Y. Kim, J. Han, S.W. Chung, S. Lee, Y. Byun, Y.K. Oh, Reduced graphene oxide nanosheets coated with an anti-angiogenic anticancer low-molecular-weight heparin derivative for delivery of anticancer drugs, J. Control. Release. 2014, 189, 80] показали в исследовании in vivo, что конъюгат восстановленного оксида графена (rGO), функционализированного низкомолекулярным гепарином (LHT7) и DOX, осуществляет адресную доставку DOX. Для получения rGO GO подвергали восстановлению с использованием раствора аммиака и гидразина, а затем конъюгировали за счет невалентных взаимодействий LHT7 и DOX. Конъюгат rGO-LHT7-DOX продемонстрировал высокий противоопухолевый эффект по отношению к клеткам KB (клетки карциномы полости рта человека) снижение - жизнеспособности клеток составило 61,1% при С = 10 μM при пересчете на индивидуальный DOX; также было продемонстрировано значительное уменьшение размера опухоли карциномы полости рта на 92,5±3,1% у мышей.

6. GO с ковалентно присоединённым вектором и нековалентно присоединённым цитостатическим агентом.

В работе [L. Zhang, J. Xia, Q. Zhao, L. Liu, Z. Zhang, Functional graphene oxide as a nanocarrier for controlled loading and targeted delivery of mixed anticancer drugs, Small. 2010, 6, 537] показано, что ковалентная функционализация GO группами SO₃H-, а также FA в качестве вектора (GO-SO₃H-FA) с последующей загрузкой противоопухолевых препаратов DOX и CPT посредством нековалентной функционализации (за счёт π-π стекинга и гидрофобных взаимодействий) значительно повышает терапевтическую эффективность по сравнению с индивидуальными препаратами (увеличивается специфичность по отношению к клеткам MCF-7). Конъюгат синтезировали следующим образом: 100 мг GO диспергировали в 100 мл дистиллированной воды, после чего добавили 5 г NaOH, 5 г ClCH₂COONa и обрабатывали ультразвуком в течение 2 ч. Далее твердую фазу промывали HCl, центрифугировали и очищали от примесей с использованием диализа в течение 48 ч, затем GO-COOH функционализировали сульфогруппами. Для проведения синтеза 200 мг сульфаниловой кислоты и 80 мг нитрита натрия растворяли в 20 мл NaOH (ω = 0,25%), и полученный раствор по каплям добавляли к 0,1 н раствору HCl на ледяной бане. Далее к дисперсии GO-COOH добавляли раствор соли диазония сульфаниловой кислоты, полученную смесь перемешивали на ледяной бане 2 ч и затем очищали с помощью диализа в течение 48 ч. Сульфированный GO-COOH конъюгировали с FA: к дисперсии GO-SO₃H (100 мг) добавляли 182,5 мг N-гидроксисукцинимида (NHS), 125 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и смесь обрабатывали ультразвуком в течение 2 ч, после чего добавляли 20 мл (ω = 0,5%) раствора FA и перемешивали в течение 8 ч; очистку синтезированного конъюгата проводили диализом. Загрузку цитостатиков осуществляли добавлением к GO-SO₃H-FA раствора DOX и CPT в диметилсульфоксиде (DMSO) при перемешивании в течение 24 ч. Загрузка цитостатических препаратов CPT и DOX в конъюгате GO-SO₃H-FA-CPT-DOX составила 4,5% и 400%, соответственно. Идентификацию конъюгата проводили с помощью методов АСМ, ПЭМ, ИК-, УФ-спектроскопии, элементного анализа. Исследования цитотоксичности показали снижение выживаемости клеток на 20% (C = 20 мкг/мл при пересчете на цитостатические препараты) при инкубации 48 ч.

Qin и др. [X.C. Qin, Z.Y. Guo, Z.M. Liu, W. Zhang, M.M. Wan, B.W. Yang, Folic acid-conjugated graphene oxide for cancer targeted chemo-photothermal therapy, J. Photochem. Photobiol. B Biol. 2013, 120, 156] провели конъюгацию GO с поливинилпирролидоном (PVP, M = 30 кДа), FA и DOX. Перед проведением функционализации дисперсию GO подвергали ультразвуковой обработке в течение 2 ч (мощность 570 Вт). Карбоксилирование GO проводили следующим образом: NaOH (1,2 г) и ClCH₂COOH (1,0 г) добавляли к водной дисперсии GO (10 мл, 2 мг⋅мл^-1) и обрабатывали ультразвуком (500 Вт) в течение 3 ч, при этом происходило окисление -OH групп с образованием -COOH. Далее дисперсию GO-COOH нейтрализовали разбавленной соляной кислотой и очищали многократной промывкой водой. Синтез GO-PVP осуществляли следующим образом: 20 мг PVP добавляли к 10 мл водной дисперсии GO-COOH (С = 0,5 мг⋅мл^-1) и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин, затем полученную смесь перемешивали при 50°С в течение 18 ч. Конъюгацию GO-PVP с FA проводили карбодиимидным методом следующим образом: EDC и NHS добавляли к суспензии GO-PVP (10 мл, С = 1 мг⋅мл^-1) и обрабатывали ультразвуком в течение 2 ч, далее к реакционной смеси добавляли раствор FA (ω = 0,5 масс. %, 2 мл) при рН = 8,0 и полученную смесь перемешивали в течение 8 ч при комнатной температуре. Непрореагировавшие вещества отделяли диализом в растворе бикарбоната натрия (pH = 8,0) в течение 48 ч, далее проводили диализ в дистиллированной воде в течение 24 ч. Для загрузки цитостатического препарата раствор DOX в DMSO (С = 0,4 мг⋅мл^-1) смешивали с конъюгатом FA-GO-PVP (С = 0,2 мг⋅мл^-1) при рН = 8 в течение 8 ч. Загрузка DOX составила 107,5%. Для характеризации полученного конъюгата FA-GO-PVP использовали следующие физико-химические методы анализа: ПЭМ, КР-, УФ-, ИК-спектроскопия. Полученный конъюгат продемонстрировал высокую противоопухолевую активность по отношению к клеточной линии HeLa при облучении (скорость ингибирования возросла на 90% при С = 20 мкг⋅мл^-1 при пересчете на индивидуальный DOX).

В работе [A. Deb, N.G. Andrews, V. Raghavan, Natural polymer functionalized graphene oxide for co-delivery of anticancer drugs: In-vitro and in-vivo, Int. J. Biol. Macromol. 2018, 113, 515] GO был функционализирован природным полимером хитозаном (CS) и FA для доставки CPT и 3,3'-дииндолилметана (DIM). Для синтеза использовался полученный модифицированным методом Хаммерса GO, который предварительно диспергировали с помощью ультразвука. Далее CS добавляли к раствору CH₃COOH (ω = 10,0%) и оставляли при перемешивании в течение ночи с образованием раствора CS (ω = 1,0%). Затем к полученному раствору добавляли водную дисперсию GO (20 мл, ω = 0,5%) с последующей обработкой ультразвуком в течение 45 мин и оставляли при перемешивании на ночь. NHS и EDC добавляли к дисперсии GO-CS (С = 1 мг⋅мл^-1) и обрабатывали ультразвуком в течение 2 ч. Затем GO-CS конъюгировали с FA и получали конъюгат GO-CS-FA; непрореагировавшие вещества удаляли диализом в растворе NaHCO₃ в течение 24 ч. Загрузку противоопухолевых препаратов осуществляли путём добавления растворов DIM и CPT в DMSO к дисперсии GO-CS-FA с последующим перемешиванием в течение 8 ч, после чего непрореагировавшие вещества удаляли промывкой водой. Идентификацию конъюгатов проводили с помощью, ИК-, Рамановской и электронной спектроскопии, рентгенофазового анализа, АСМ, ПЭМ, СЭМ. Показано, что конъюгат GO-CS-FA-CPT-DIM приводил к снижению жизнеспособности клеток линии MCF-7 на 95,7%. В свою очередь, снижение жизнеспособности клеток под действием индивидуальных препаратов составило 42,4% и 52,6% для DIM и CPT, соответственно.

Таким образом, известные из литературы методы создания коньюгатов имеют ряд недостатков, а именно:

- не определена возможность масштабирования синтеза;

- недостаточно подробно проведена идентификация полученных конъюгатов, в том числе не указано процентное содержание функциональных групп на поверхности оксида графена, а также характеристики наночастиц: размеры, слоистость, межслоевые расстояния;

- отсутствуют экспериментальные данные по изучению стабильности водных дисперсий во времени, а также концентрационная зависимость дзета-потенциалов и размеров частиц.

Наиболее близким техническим решением является способ, описанный в работе авторов Wang и др. [H. Wang, W. Gu, N. Xiao, L. Ye, Q. Xu, Chlorotoxin-conjugated graphene oxide for targeted delivery of an anticancer drug, Int. J. Nanomedicine. 2014, 9, 1433], которые продемонстрировали, что ковалентная функционализация GO хлоротоксином (CTX) обеспечивает адресную доставку лекарства в клетки глиомы C6. В то же время, нековалентное присоединение DOX с загрузкой 0,57 г DOX на 1 г CTX-GO значительно повышает эффективность конъюгата. Конъюгат получали следующим образом: 150 мг карбоксилированного GO диспергировали в 20 мл PBS (0,1 М, рН 6,0) и затем добавляли 4 мг NHS и 6 мг EDC. После перемешивания в течение 30 мин добавляли 15 мг CTX и оставляли реакционную смесь при комнатной температуре на 48 ч в PBS. Далее конъюгат GO-CTX выделяли центрифугированием, промывали три раза деионизированной водой и лиофилизировали. Загрузку DOX осуществляли смешиванием 1 мг GO-CTX с 1 мг DOX в 5 мл дистиллированной воды в течение 12 ч, полученный конъюгат выделяли центрифугированием; загрузка составила 57%. Идентификацию полученного конъюгата проводили с помощью ПЭМ, рентгенофазового анализа, элементного анализа, методами ИК-, УФ-спектроскопии и спектрофлуориметрии. Конъюгат продемонстрировал противоопухолевую активность по отношению к С6 клеткам глиомы. Исследования по цитотоксичности показали, что выживаемость клеток в присутствие конъюгата (С = 5 мкг·мл^-1, при инкубации в течение 24 ч) снизилась примерно на 40% по сравнению с GO-COOH и на 20% по сравнению с индивидуальным DOX.

Несомненно, способ доказал свою эффективность, однако он не лишен ряда недостатков.

В способе-прототипе отсутствуют данные о выходе целевого продукта, а также характеристики исходного оксида графена, а, как известно, от химического состава наноматериала зависит стратегия дальнейшей функционализации.

Представленная методика не является универсальной. Предложенный подход не может быть перенесен на углеродные наночастицы различной природы, а также использован для ковалентного присоединения векторов, имеющих различный химический состав.

Недостаточная продолжительность обработки дисперсий ультразвуком не позволяет получить высокодисперсную и однородную систему, что приводит к пониженной конверсии наночастиц носителя и, следовательно, к более низкому выходу целевого продукта. Недостаточная продолжительность перемешивания реакционной смеси наночастиц носителя, вектора для адресной доставки и цитостатического препарата также приводит к понижению степени конверсии наночастиц носителя в целевой продукт.

В описанной авторами методике отсутствуют экспериментальные данные по изучению стабильности водных дисперсий во времени, а также концентрационная зависимость дзета-потенциалов и размеров частиц, что определяет возможности применения и длительности хранения данных препаратов. Также недостаточно подробно проведена идентификация полученных конъюгатов: не указаны процентное содержание и типы функциональных групп на поверхности оксида графена, степень чистоты конечного продукта.

Стоит отметить, что центрифугирование и промывка, согласно прототипу, не позволяет осуществить полную очистку от непрореагировавших веществ и побочных продуктов, в том числе высокотоксичных сшивающих агентов, что приводит к снижению биосовместимости.

Технический результат настоящего изобретения заключается в устранении указанных недостатков за счет создания нового метода, позволяющего получать коньюгаты на основе углеродных наноструктур, ковалентно модифицированных векторами для адресной доставки и обладающих высокой емкостью по отношению к цитостатическим агентам при их загрузке посредством невалентных взаимодействий.

Этот результат достигается тем, что в известном способе создания конъюгатов на основе углеродных наноструктур, включающем диспергирование углеродных наноструктур в растворителе, добавление к полученной дисперсии сшивающих агентов 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и N-гидроксисукцинимида, перемешивание реакционной смеси, добавление к полученной смеси раствора вектора для адресной доставки с последующим выделением конъюгатов на основе углеродных наноструктур с вектором для адресной доставки при помощи центрифугирования с последующей промывкой центрифугата и его высушиванием, далее диспергирование полученных коньюгатов в растворителе, добавление к полученной дисперсии цитостатического препарата при перемешивании. Согласно изобретению, использовались углеродные наноструктуры с высоким содержанием кислородсодержащих групп: оксид графена или углеродные нанотрубки, или наноалмазы, или аддукты фуллеренов, содержащие карбоксильные и/или гидроксильные и/или аминогруппы, при этом в качестве растворителя используют воду, или диметилсульфоксид или смешанный растворитель вода-диметилсульфоксид, затем полученную дисперсию обрабатывают ультразвуком в течение 15 мин, а в качестве сшивающих агентов дополнительно используют 1,3-дициклогексилкарбодиимид и 4-диметиламинопиридин, полученную смесь перемешивают в течение 90 мин, и добавляют раствор вектора для адресной доставки, затем полученную смесь перемешивают в течение 48 ч и центрифугируют, после чего полученный конъюгат промывают этанолом с последующим высушиванием, далее его диспергируют в фосфатно-солевом буфере, добавляют цитотастический агент и перемешивают полученную смесь в течение 72 ч, после чего проводят ее очистку диализом против дистиллированной воды с последующим высушиванием при температуре 45°С и давлении 0,8 бар в течение 24 ч.

В заявленном способе мы используем углеродные наноструктуры с высоким содержанием кислородсодержащих групп, что обеспечивает высокую совместимость наноматериалов с водой и водными растворами, а также повышенную емкость наноматериалов по отношению к цистостатическим препаратам [A.O.E. Abdelhalim, V.V. Sharoyko, S.V. Ageev, V.S. Farafonov, D.A. Nerukh, V.N. Postnov, A.V. Petrov, K.N. Semenov, Graphene Oxide of Extra High Oxidation: A Wafer for Loading Guest Molecules, J. Phys. Chem. Lett. 2021, 12, 10015].

Предварительная обработка УН ультразвуком в течение 15 мин позволяет более эффективно проводить функционализацию наноматериала и способствует образованию дисперсии с размерами частиц, не превышающим сотни нм, что имеет большое значение при разработке систем адресной доставки.

Применение в качестве сшивающих агентов 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) или 1,3-дициклогексилкарбодиимида (DCC) и 4-диметиламинопиридина (DMAP) позволяет осуществить одностадийную и количественную ковалентную конъюгацию между карбоксильными или гидроксильными группами УН и амино- или карбоксильными группами вектора.

Использование предложенного варианта очистки ковалентного конъюгата УН-вектор путем промывки осадка центрифугированием, позволяет получить биосовместимый конъюгат, не содержащий примеси токсичных реагентов, применяемых при проведении реакции ковалентной конъюгации.

Синтетический подход, направленный на получение невалентного конъюгата УН-вектор с цитостатическим препаратом, обеспечивает значительно большую загрузку молекул цитостатического агента (до 400 масс. %), а также его эффективное высвобождение в опухолевых клетках.

Векторами для адресной доставки (V) являются молекулы, обладающие тропностью к определенным соединениям, клеткам или молекулярным структурам и обеспечивающие адресный транспорт лекарственного средства к мишени, что позволяет ему сконцентрироваться в заданной области (опухоли, очаге воспаления и т.д.). В предлагаемом способе в качестве векторов для адресной доставки могут использоваться антитела, фолиевая кислота, хлоротоксин и др. В качестве цитостатических агентов могут быть использованы цитостатические препараты с различным механизмом действия.

Для лучшего понимания заявленного изобретения приводим методику синтеза:

УН диспергируют в воде (или в системе вода-DMSO) с использованием ультразвуковой бани в течение 15 мин. Затем к дисперсии добавляют раствор DCC в соотношении УН к DCC по массе 1:1,3 (либо EDC в соотношении УН к EDC по массе 2:1), DMAP в соотношении УН к DMAP по массе 1:0,1 (либо NHS в соотношении УН к NHS 2:1,5) в воде (либо в системе вода-DMSO). Реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч и добавляют раствор V (в соотношении УН к V по массе 1:0,00001 - 1:0,1) в воде (или в смешанном растворителе вода-DMSO). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в темноте в течение 48 ч, затем центрифугируют при 4000 об⋅мин^-1. Образовавшийся осадок промывают водой, смешанным растворителем вода-DMSO и этанолом несколько раз, сушат при 35-45°С в течение 48 ч и конъюгат УН-V диспергируют в PBS. Затем к полученной дисперсии добавляют раствор цитостатического агента в PBS в соотношении к исходным УН от 0,125:1 - 4:1 и оставляют при перемешивании в течение 72 ч в темноте при комнатной температуре. Полученную дисперсию центрифугируют при 4000 об⋅мин^-1 и несколько раз промывают дистиллированной водой. Осадок сушат в вакуумном центрифужном испарителе при 35-45°С в течение 48 ч.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1

0,5 г GO (процентное содержание карбоксильных групп составляет 1 масс. %) диспергировали в 100 мл дистиллированной воды и выдерживали на ультразвуковой бане (мощность 150 Вт) при комнатной температуре в течение 15 мин, затем к полученной дисперсии добавляли 100 мл водного раствора, содержащего 250 мг EDC, 335 мг NHS, с помощью HCl (ω = 1%) доводили до значения pH = 5-6 и перемешивали 2 ч. Далее с помощью NaHCO₃ доводили до значения pH = 8-9, затем добавляли 5 мл водного раствора FA (С = 1 г⋅л^-1) и оставляли перемешиваться в течение 48 ч при комнатной температуре. Затем 0,5 г GO-FA диспергировали в 100 мл PBS и добавляли 0,5 г цитарабина (Cyt), и полученную смесь перемешивали в течение 72 ч в темноте. Образовавшуюся дисперсию центрифугировали при 4000 об⋅мин^-1 и осадок несколько раз промывали дистиллированной водой. Осадок сушили в вакуумном центрифужном испарителе при 45°С в течение 48 ч. Загрузка Cyt составила 45%.

Пример 2

0,5 г окисленных углеродных нанотрубок (oУН, содержание карбоксильных групп составляет 5 масс. %) диспергировали в дистиллированной воде (100 мл) и выдерживали на ультразвуковой бане (мощность 150 Вт) в течение 15 мин. Затем к дисперсии добавляли 100 мл водного раствора, содержащего 250 мг EDC, 335 мг NHS, после чего в систему добавляли HCl (ω = 1%) до значения pH = 5-6. Дисперсию перемешивали в течение 2 ч, добавляли NaHCO₃ (до значения pH = 8-9) и 0,5 мл водного раствора (С = 1 мг·мл^-1) трастузумаба (антитело - AB). Смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 48 ч, затем центрифугировали при 4000 об⋅мин⁻¹. Осадок промывали дистиллированной водой и этанолом несколько раз и сушили при 45°С в течение 48 ч. Затем 0,5 г oУН-AB диспергировали в 100 мл PBS и добавляли 0,5 г паклитаксела (Ptx), и полученную смесь перемешивали в течение 72 ч в темноте. Образовавшуюся дисперсию центрифугировали при 4000 об⋅мин⁻¹ и осадок несколько раз промывали дистиллированной водой, после чего сушили при 35°С в вакуумном центрифужном испарителе в течение 48 ч. Загрузка Ptx составила 60%.

Пример 3

0,5 г детонационных наноалмазов (DND, процентное содержание карбоксильных групп составляет 5 масс. %) диспергировали в воде (100 мл) и выдерживали на ультразвуковой бане (мощность 150 Вт) в течение 15 мин. Затем к дисперсии добавляли 100 мл водного раствора, содержащего 250 мг EDC, 335 мг NHS, после чего в систему добавляли HCl (ω = 1%) до значения pH = 5-6. Дисперсию перемешивали в течение 2 ч, и добавляли NaHCO₃ до значения pH = 8-9, затем добавляли 5 мл водного раствора FA (С = 1 г⋅л^-1). Смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 48 ч, затем центрифугировали при 4000 об⋅мин⁻¹. Осадок промывали дистиллированной водой и этанолом несколько раз и сушили при 45°С в течение 48 ч. Затем 0,5 г DND-FA диспергировали в 100 мл PBS, добавляли 0,5 г цитарабина (Cyt), и полученную смесь перемешивали в течение 72 ч в темноте. Образовавшуюся дисперсию центрифугировали при 4000 об⋅мин⁻¹ и осадок несколько раз промывали дистиллированной водой, после чего сушили при 45°С в сушильном шкафу в течение 48 ч. Загрузка Cyt составила 65%.

Пример 4

0,5 г фуллеренола (C₆₀(OH)₂₄ c содержанием гидроксильных групп 36 масс. %) диспергировали в 100 мл системы вода-ДМСО (ω_ДМСО = 15 %) и выдерживали на ультразвуковой бане (мощность 150 Вт) в течение 15 мин. Затем к дисперсии добавляли 25 мл водного раствора, содержащего 650 мг DDC и 50 мг DMAP, дисперсию перемешивали в течение 1,5 ч и добавляли 5 мл раствора FA (С = 1 г⋅л^-1) в системе вода-ДМСО (ω_ДМСО = 15 %). Смесь перемешивали при комнатной температуре в темноте в течение 48 ч, затем центрифугировали при 4000 об⋅мин^-1. Полученный C₆₀(OH₂₄)-FA очищали с помощью диализа против дистиллированной воды, после чего высушивали при 45°С. Затем 0,5 г C₆₀(OH₂₄)-FA растворяли в 100 мл дистиллированной воды и добавляли 0,5 г доксорубицина (DOX), и полученную смесь перемешивали в течение 72 ч в темноте. Далее смесь сушили в сушильном шкафу при 45°С, затем полученную твердую фазу промывали 3 раза этанолом, после чего высушивали при тех же условиях в течение 48 ч. Загрузка DOX составила 30%.

Для характеризации полученного наноматериала использовались следующие физико-химические методы анализа:

¹³C ЯМР спектроскопия

На Фиг. 1 представлены ¹³С ЯМР-спектры Cyt, GO, GO-FA-Cyt. На спектре видны следующие пики для GO: (1) слабо выраженный сигнал при 60 м. д., соответствующий эпоксидным группам; (2) интенсивный сигнал при 69 м. д., относящийся к гидроксильным группам; (3) низкоинтенсивный сигнал при 100 м. д., соответствующий атому углерода в лактольной группе; (4) сигнал при 129 м. д., относящийся к C=C структурному фрагменту графеновой плоскости; (5) низкоинтенсивный сигнал при 165 м. д., соответствующий карбоксильным группам; (6) широкий сигнал при 191 м. д., соответствующий карбонильным группам. На основании полученных данных было определено процентное содержание кислородсодержащих функциональных групп на поверхности GO: 55 масс. % гидроксильных групп, 22 масс. % эпоксидных групп, 4 масс. % лактольных групп, 3 масс. % карбонильных групп, 1 масс. % карбоксильных групп (всего 85 масс. %). Спектр индивидуального Cyt подтверждают его состав и строение. Следует отметить, что в спектре GO-FA-Cyt присутствует сигнал в области 176 м. д., который соответствует атому углерода в составе сложноэфирной группы и подтверждает ковалентную конъюгацию GO с FA.

Коэффициент загрузки

Загрузка Cyt определялась по формуле (1):

где m_GO-FA-Cyt, m_GO, m_Cyt - масса GO-FA-Cyt, GO-FA, Cyt.

Установлено, что загрузка цитостатического препарата составляет 45%.

Инфракрасная спектроскопия GO-FA-Cyt

ИК-спектры GO, GO-FA, GO-FA-Cyt и индивидуального Cyt представлены на Фиг. 2. В спектре GO широкий пик при 3440 см⁻¹ относится к νO-H гидроксильной, карбоксильной и лактольной групп; интенсивный пик при 1718 см⁻¹ соответствует νC=O в составе карбоксильной, карбонильной и лактольной групп; три пика при 1363, 1418 и 1226 см⁻¹ относятся к νC-OH гидроксильных групп в том числе в составе лактольной и карбоксильной групп; пик при 1085 см⁻¹ соответствует νC-O эпоксидных групп; пик при 1630 см⁻¹ соответствует колебаниям ароматических доменов νC=C графена. В спектре GO-FA (Фиг. 3) присутствует пик при 1077 см⁻¹, соответствующий деформационным колебаниям эпоксидных групп. Пик при 1624 см⁻¹ свидетельствует о наличии гетероциклического ароматического фрагмента FA в конъюгате. При этом характеристический пик в области 1712 см⁻¹ относится к валентным колебаниям фрагмента νС=О в сложноэфирной группе GO-FA. ИК-спектр Cyt: пики при 3477, 3441, 3357, 3264 см⁻¹ соответствуют νN-H и νO-H; при 3264, 798 см⁻¹ - δСH; 1656 см⁻¹ - νС=O, пики 1581, 1529, 1480 см⁻¹ - νC=N и νC=С, пики 1280, 1111, 1071 см⁻¹ - νC-О.

Рентгенофазовый анализ

На Фиг. 3 в качестве примера представлены спектры GO, полученного по модифицированному методу Хаммерса, GO-FA, GO-FA-Cyt и Cyt. Видно, что пик, соответствующий плоскости 001 в спектре GO, проявляется при 2θ = 12,2°; для расчета межплоскостного расстояния в GO был применен закон Брэгга:

где λ - длина волны рентгеновского луча (0,154 нм), d - расстояние между соседними слоями GO, θ - угол дифракции. Межплоскостное расстояние, рассчитанное по уравнению (2), составляет 0,73 нм, что согласуется с данными, полученными для высокоокисленного GO [A.O.E. Abdelhalim, V.V. Sharoyko, S.V. Ageev, V.S. Farafonov, D.A. Nerukh, V.N. Postnov, A.V. Petrov, K.N. Semenov, Graphene Oxide of Extra High Oxidation: A Wafer for Loading Guest Molecules, J. Phys. Chem. Lett. 2021, 12, 10015]. В спектре GO-FA помимо пиков GO присутствуют пики, характерные для FA. В свою очередь спектр конъюгата GO-FA-Cyt является суперпозицией спектров GO-FA и Cyt.

На Фиг. 4 показаны рамановские спектры образцов GO, GO-FA и GO-FA-Cyt. Спектры содержат полосы D, G, и 2D. Полоса G характерна для всех графитоподобных материалов, содержащих атомы углерода в состоянии sp²-гибридизации; наличие данной полосы свидетельствует о том, что синтезированный материал содержит фрагмент C=C, входящий в состав π-системы. Полоса D указывает на наличие дефектов, связанных с функционализацией поверхности, сопровождающейся переходом атомов углерода в состояние sp³-гибридизации и разупорядочением π-системы. Полоса 2D характеризует количество графеновых слоёв и определяет, являются ли эти структуры однослойными, двухслойными или многослойными. В частности, в случае однослойного GO отношение I_2D / I_G равно 2 [A.O.E. Abdelhalim, V.V. Sharoyko, S.V. Ageev, V.S. Farafonov, D.A. Nerukh, V.N. Postnov, A.V. Petrov, K.N. Semenov, Graphene Oxide of Extra High Oxidation: A Wafer for Loading Guest Molecules, J. Phys. Chem. Lett. 2021, 12, 10015; A.O.E. Abdelhalim, V.V. Sharoyko, A.A. Meshcheriakov, S.D. Martynova, S.V. Ageev, G.O. Iurev, H. Al Mulla, A. V. Petrov, I.L. Solovtsova, L.V. Vasina, I. V. Murin, K.N. Semenov, Reduction and functionalization of graphene oxide with L-cysteine: Synthesis, characterization and biocompatibility, Nanomedicine Nanotechnology, Biol. Med. 2020, 29, 102284; A.O.E. Abdelhalim, V.V. Sharoyko, A.A. Meshcheriakov, M.D. Luttsev, A.A. Potanin, N.R. Iamalova, E.E. Zakharov, S. V. Ageev, A.V. Petrov, L. V. Vasina, I.L. Solovtsova, A.V. Nashchekin, I.V. Murin, K.N. Semenov, Synthesis, characterisation and biocompatibility of graphene-L-methionine nanomaterial, J. Mol. Liq. 2020, 314, 113605; A.O.E. Abdelhalim, A.A. Meshcheriakov, D.N. Maistrenko, O.E. Molchanov, S.V. Ageev, D.A. Ivanova, N.R. Iamalova, M.D. Luttsev, L.V. Vasina, V.V. Sharoyko, K.N. Semenov, Graphene oxide enriched with oxygen-containing groups: on the way to an increase of antioxidant activity and biocompatibility, Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2021, 210, 112232], уменьшение этого соотношения указывает на увеличение числа слоев. Отношение I_D / I_G позволяет оценить степень функционализации поверхности GO, а также содержание дефектов. Анализ Фиг. 4 показывает наличие полос D и G при 1360 и 1592 см⁻¹. Отношение полос I_D / I_G составляет 0,94, в то время как отношение I_2D / I_G равно 0,33, что указывает на то, что наноматериал является многослойным.

Фиг. 4 показывает, что в спектре GO-FA-Cyt присутствуют полосы D, G и 2D. По сравнению с GO, D и G полосы GO-FA-Cyt смещены и являются более интенсивными. Увеличение отношения I_D / I_G (0,97) для GO-FA-Cyt по сравнению с GO указывает на увеличение количества дефектов в результате функционализации GO, что можно объяснить ковалентной функционализацией FA, а также молекулами Cyt в результате невалентных взаимодействий. В то же время отношение I_2D / I_G равно 0,30, что указывает на то, что образовавшийся наноматериал является многослойным.

Электронная спектроскопия

На Фиг. 5 представлены электронные спектры водных дисперсий GO, GO-FA, GO-FA-Cyt в диапазоне длин волн λ = 200-800 нм. Пики поглощения при 235 нм соответствуют π-π* переходам, связанных с наличием C=C связей; плечи при 300 нм связаны с n-π* переходами, обусловленными наличием C=O в составе карбоксильных, карбонильных и лактольных групп.

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

На Фиг. 6(а) представлен XPS спектр GO-FA-Cyt, с пиками C 1s (285,0 эВ), N 1s (406,0 эВ) и O 1s (532,0 эВ). На Фиг. 6(б) представлен результат деконволюции пика C 1s с образованием двух пиков при следующих энергиях связи: (1) пика при 284,4 эВ, связанного с наличием фрагмента C=С, (2) пика 286,4 эВ, характерного для фрагмента C–O–C в составе эпоксидных групп. На Фиг. 6(в) показан результат деконволюции пика O 1s с образованием пика при 532,0 эВ, который относится к группе C–O. На Фиг. 6(г) также показан спектр деконволюции N 1s с образованием двух пиков с энергиями связи 399,5 и 406,8 эВ, соответствующих связи C-N и дополнительному пику π-π*, который относится к связям в ароматическом фрагменте FA [Nitrogen XPS Periodic Table| Thermo Fisher Scientific - https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/materials-science/learning center/periodic-table/non-metal/nitrogen.html].

Термогравиметрический анализ

На Фиг. 7 представлены данные термогравиметрического анализа GO-FA-Cyt: кривая потери массы (TG) и её производная (DTG) в диапазоне температур 40-350°C. Видно, что наночастицы GO-FA-Cyt термически стабильны до 75°C. Дальнейшее повышение температуры приводит к различным видам перегруппировок, деградации функциональных групп конъюгата, а также молекул Cyt.

Распределение наночастиц по размерам и ζ-потенциалы

Распределение наночастиц по размерам GO-FA-Cyt (C = 10 мг⋅л^-1) представлено на Фиг. 8. Анализ распределения полученных наночастиц GO-FA-Cyt по размерам в водной дисперсии (C = 10 мг⋅л^-1) показывает, что средний размер ассоциатов GO-FA-Cyt составляет порядка 65-80 нм. В то же время, значение ζ-потенциала (−39 мВ) указывает на то, что полученная дисперсия обладает агрегативной устойчивостью.

Краткое описание чертежей:

Фиг. 1 - ЯМР спектр ¹³С Cyt (-), GO (-), GO-FA-Cyt (-), где 1 - химический сдвиг (м. д.).

Фиг. 2 - ИК-спектры Cyt (--), GO (-), GO-FA (-) и GO-FA-Cyt (-), где 2 - A (%), 3 - ν (см^-1).

Фиг. 3 - Спектр рентгенофазового анализа Cyt (--), GO (-), GO-FA (-) и GO-FA-Cyt (-), где 4 - интенсивность (пр. е.), 5 - угол 2θ.

Фиг. 4 - Рамановский спектр GO-FA-Cyt (-), GO-FA (-), GO (-), где 4 - интенсивность (пр. е.), 6 - Рамановское смещение (см^-1), 7 - линия D, 8 - линия G, 9 - линия 2D.

Фиг. 5 - Электронный спектр GO-FA-Cyt (-), GO-FA (-), ОГ (-), где 4 - интенсивность (пр. е.), 10 - λ (нм).

Фиг. 6 - РФЭ - спектр конъюгата GO-FA-Cyt (а), а также C 1s (б), O 1s (в) и N 1s (г) после деконволюции, где 4 - интенсивность (пр. е.), 11 - Энергия связывания (эВ), 12 - O 1s (532 эВ), 13 - N 1s (406 эВ), 14 - C 1s (285 эВ), 15 - C-O-C, 16 - sp² C, 17 - C-O, 18 - π-π* , 19 - C-N.

Фиг. 7 - Термограмма GO-FA-Cyt: TG (сплошная линия) и DTG (пунктирная линия), где 20 - TG (°C), 21 - t°, (°C) (эВ), 22 - DTG (%/мин).

Фиг. 8 - Распределение наночастиц по размерам GO-FA-Cyt, где 4 - интенсивность (пр. е.), 23 - d (нм).

Предлагаемый способ получения конъюгатов имеет следующие преимущества перед аналогами:

- использование в предложенном способе синтеза углеродных наночастиц c высоким содержанием кислородсодержащих групп обуславливает повышенную стабильность водных дисперсий, высокую биосовместимость, разнообразные варианты ковалентной функционализации наноматериала, а также повышенную сорбционную емкость по отношению к загрузке цитостатических агентов;

- использование метода с применением EDC и NHS или DCC и DMAP позволяет осуществить одностадийную и количественную ковалентную конъюгацию между гидроксильными группами углеродных наночастиц и карбоксильными группами вектора адресной доставки;

- данная методика позволяет получать стабильные водные дисперсии конъюгата без добавления поверхностно-активных веществ;

- синтетический подход, направленный на получение невалентного конъюгата с цитостатическим агентом, обеспечивает значительно большую загрузку молекул цитостатического агента (до 400 масс. %), а также его эффективное высвобождение в опухолевых клетках.

Способ получения нековалентных конъюгатов углеродных наночастиц с цитостатическими агентами и векторами для адресной доставки разработан в отделе фундаментальных исследований ФГБУ «РНЦРХТ им. ак. А.М. Гранова» Минздрава России.

Изобретение относится к способу создания конъюгатов на основе углеродных наноструктур, характеризующихся высоким содержанием кислородсодержащих групп и представляющих собой оксид графена, или углеродные нанотрубки, или наноалмазы, или аддукты фуллеренов, содержащие карбоксильные, и/или гидроксильные, и/или аминогруппы. Способ включает диспергирование углеродных наноструктур в растворителе, в качестве которого используют воду, или диметилсульфоксид, или вода-диметилсульфоксид, затем полученную дисперсию обрабатывают ультразвуком в течение 15 минут. Добавляют к полученной дисперсии сшивающие агенты 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид и N-гидроксисукцинимид или 1,3-дициклогексилкарбодиимид и 4-диметиламинопиридин, полученную смесь перемешивают в течение 90 минут и добавляют раствор вектора для адресной доставки. Затем полученную смесь перемешивают в течение 48 часов и центрифугируют, после чего полученный конъюгат промывают этанолом с последующим высушиванием, далее его диспергируют в фосфатно-солевом буфере. Добавляют цитотастический агент и перемешивают полученную смесь в течение 72 часов, после чего проводят ее очистку диализом против дистиллированной воды с последующим высушиванием при температуре 45°С и давлении 0,8 бар в течение 24 часов. Технический результат – получение конъюгатов на основе углеродных наноструктур, обладающих высокой емкостью по отношению к цитотоксическим агентам при их загрузке посредством невалентных взаимодействий. 11 ил., 4 пр.

Способ создания конъюгатов на основе углеродных наноструктур, включающий диспергирование углеродных наноструктур в растворителе, добавление к полученной дисперсии сшивающих агентов 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и N-гидроксисукцинимида, ее перемешивание, добавление к полученной смеси раствора вектора для адресной доставки, выделение конъюгатов на основе углеродных наноструктур с вектором для адресной доставки при помощи центрифугирования с последующей промывкой и высушиванием, диспергирование полученных коньюгатов в растворителе, добавление к полученной дисперсии цитостатического препарата при перемешивании, отличающийся тем, что углеродные наноструктуры характеризуются высоким содержанием кислородсодержащих групп и представляют собой оксид графена, или углеродные нанотрубки, или наноалмазы, или аддукты фуллеренов, содержащие карбоксильные, и/или гидроксильные, и/или аминогруппы, при этом в качестве растворителя используют воду, или диметилсульфоксид, или вода-диметилсульфоксид, затем полученную дисперсию обрабатывают ультразвуком в течение 15 минут, а в качестве сшивающих агентов дополнительно используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид и N-гидроксисукцинимид или 1,3-дициклогексилкарбодиимид и 4-диметиламинопиридин, полученную смесь перемешивают в течение 90 минут и добавляют раствор вектора для адресной доставки, затем полученную смесь перемешивают в течение 48 часов и центрифугируют, после чего полученный конъюгат промывают этанолом с последующим высушиванием, далее его диспергируют в фосфатно-солевом буфере, добавляют цитостатический агент и перемешивают полученную смесь в течение 72 часов, после чего проводят ее очистку диализом против дистиллированной воды с последующим высушиванием при температуре 45°С и давлении 0,8 бар в течение 24 часов.