АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD79b, КОНЪЮГАТЫ С ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВОМ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C07K16/18 C07K16/28 C07K16/22 C07K16/46 C12N15/13 C12N15/09 C12N1/19 A61K39/00 A61K39/395 A61P35/00 A61P37/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к антителам против CD79b, конъюгатам с лекарственным средством и их применениям.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

CD79b (то есть Igβ или В29) представляет собой сигнальный компонент В-клеточного рецептора и функционирует, образуя ковалентно связанный гетеродимер с CD79a (то есть Igα или mb-1). CD79b включает внеклеточный иммуноглобулиновый (Ig) домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен. Поверхностная экспрессия CD79b была обнаружена почти у всех пациентов с неходжкинской лимфомой (NHL) и хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL) методом проточной цитометрии. В дополнение к сигнальной функции, при перекрестном связывании В-клеточного рецептора происходит его нацеливание в компартмент для молекул главного комплекса гистосовместимости II класса (подобный лизосомам компартмент), что является частью презентации антигена В-клетками.

Эта биологическая характеристика CD79b делает его мишенью для конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), поскольку антитела против CD79b интернализуются и доставляются в лизосомальные компартменты, которые, как известно, содержат протеазы, высвобождающие цитотоксические лекарственные средства. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) способны осуществлять направленную доставку лекарственного средства в опухоль, и там происходит их внутриклеточное накопление. Попытки увеличить терапевтический индекс ADC (то есть наибольшую эффективность при минимальной токсичности) были сосредоточены на специфичности поликлональных и моноклональных антител, а также на присоединении лекарственного средства и профилях высвобождения лекарственного средства.

Были получены различные ADC, такие как гуманизированное антитело против CD79b (гуманизированное SN8), присоединенное к монометилауристатину Е (ММАЕ) посредством расщепляемого протеазой линкера, которое является клинически эффективным в лечении NHL.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предложены антитела против CD79b или их функциональные фрагменты, фармацевтические композиции или их конъюгаты с лекарственными средствами, а также их применение в лечении гематологических опухолей.

В одном аспекте предложено антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:

HCDR1 (определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1;

HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2;

HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3;

LCDR1 (определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4;

LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, и

LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6.

В одном или более чем одном воплощении описанное здесь антитело против CD79b представляет собой моноклональное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело.

В одном или более чем одном воплощении аминокислотная последовательность HCDR1 антитела против CD79b или его антигенсвязывающего фрагмента представлена в SEQ ID NO: 1; аминокислотная последовательность HCDR2 представлена в SEQ ID NO: 2; аминокислотная последовательность HCDR3 представлена в SEQ ID NO: 3; аминокислотная последовательность LCDR1 представлена в SEQ ID NO: 4; аминокислотная последовательность LCDR2 представлена в SEQ ID NO: 5, и аминокислотная последовательность LCDR3 представлена в SEQ ID NO: 6.

В одном или более чем одном воплощении аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против CD79b представлена в SEQ ID NO: 7 или 11 и/или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против CD79b представлена в SEQ ID NO: 8 или 12.

В одном или более чем одном воплощении аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против CD79b выбрана из аминокислотных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 13-17, и/или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антител против CD79b выбрана из аминокислотных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 18-22.

В одном или более чем одном воплощении антитело против CD79b содержит (а) тяжелую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% гомологична SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 или 33, (б) легкую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% гомологична SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32 или 34, или (в) тяжелую цепь (а) и легкую цепь (б).

В одном или более чем одном воплощении аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против CD79b выбрана из аминокислотных последовательностей, по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичных аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 или 33, и/или аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против CD79b выбрана из аминокислотных последовательностей, по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичных аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32 и 34.

В одном или более чем одном воплощении антитело против CD79b выбрано из группы, состоящей из антител, у которых:

(1) аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 25, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 26;

(2) аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 27, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 28;

(3) аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 29, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 30;

(4) аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 31, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 32, и

(5) аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 33, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 34.

В другом аспекте предложен конъюгат антитело-лекарственное средство, представляющий собой конъюгат описанного в настоящем документе антитела с цитотоксическим агентом.

В одном или более чем одном воплощении цитотоксический агент представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, ингибитор роста, токсин или радиоактивный изотоп.

В другом аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство, описанные в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте предложено изделие, содержащее контейнер и композицию, находящуюся в контейнере, где композиция содержит одно или более антител против CD79b, описанных в настоящем документе. В некоторых воплощениях изделие представляет собой набор, содержащий первый контейнер, содержащий композицию, содержащую одно или более антител против CD79b, описанных в настоящем документе, и второй контейнер, содержащий буфер.

В другом аспекте предложено применение антитела против CD79b или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем документе, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания, опосредованного CD79b. В некоторых воплощениях заболевание представляет собой гематологическую опухоль, в частности, В-клеточное пролиферативное расстройство. В некоторых воплощениях заболевание представляет собой лимфому или лейкоз. В некоторых воплощениях заболевание представляет собой неходжкинскую лимфому (NHL), агрессивную NHL, рецидивирующую агрессивную NHL, рецидивирующую безболезненную NHL, рефрактерную NHL, рефрактерную безболезненную NHL, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, мантийноклеточную лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз (HCL) или острый лимфоцитарный лейкоз (ALL).

В другом аспекте предложен способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей CD79b, включающий приведение клетки в контакт с антителом или конъюгатом антитело-лекарственное средство, описанными в настоящем документе, вызывающее ингибирование роста клетки. В некоторых воплощениях клетка представляет собой В-клетку.

В другом аспекте предложен способ лечения заболевания, опосредованного CD79b, включающий введение млекопитающему, которому это необходимо, терапевтически эффективного количества антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство, описанных в настоящем документе. В некоторых воплощениях опосредованное CD79b заболевание представляет собой рак.

В еще одном аспекте предложен способ определения присутствия CD79b в образце, в котором предположительно присутствует CD79b, включающий подвергание образца взаимодействию с антителом, описанным в настоящем документе, и определение связывания антитела против CD79b с образцом, где связывание антитела с CD79b в образце указывает на присутствие указанного белка в образце.

В еще одном аспекте предложен способ диагностирования клеточного пролиферативного расстройства, ассоциированного с увеличением количества клеток, экспрессирующих CD79b, таких как В-клетки. Указанный способ включает приведение исследуемых клеток в биологическом образце в контакт с антителом, описанным в настоящем документе; определение уровня антитела, связавшегося с исследуемыми клетками в образце, путем исследования связывания указанного антитела с CD79b; и сравнение с уровнем антитела, связавшегося с клетками в контрольном образце, где уровень связавшегося антитела нормализуют по отношению к количеству клеток, экспрессирующих CD79b, в исследуемом и контрольном образцах и где уровень антитела, связавшегося в исследуемом образце, превышающий уровень в контрольном образце, указывает на присутствие клеточного пролиферативного расстройства, ассоциированного с клетками, экспрессирующими CD79b. В некоторых воплощениях биологический образец представляет собой кровь или сыворотку.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Результаты исследования аффинности гуманизированных антител.

Фиг. 2. Терапевтический эффект AS11259-ADC-001, 002, 004 в отношении подкожных ксенотрансплантатов В-клеточной лимфомы человека линии Ramos у бестимусных мышей.

Фиг. 3. Терапевтический эффект AS11259-ADC-010, 0012, 011, 008 в отношении подкожных ксенотрансплантатов В-клеточной лимфомы человека линии Ramos у бестимусных мышей.

Фиг. 4. Терапевтический эффект AS11259-ADC-001, 002, 004 в отношении подкожных ксенотрансплантатов лимфомы человека линии Granta-519 у бестимусных мышей.

Фиг. 5. Терапевтический эффект AS11259-ADC-001, 0012, 011, 010 в отношении подкожных ксенотрансплантатов лимфомы человека линии Granta-519 у бестимусных мышей.

Фиг. 6. Терапевтический эффект AS11259-ADC-001, 004 в отношении подкожных ксенотрансплантатов лимфомы человека линии WSU-DLCL2 у бестимусных мышей.

Фиг. 7. Терапевтический эффект AS11259-ADC-001, 0012, 011, 010 в отношении подкожных ксенотрансплантатов лимфомы человека линии WSU-DLCL2 у бестимусных мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следует понимать, что в рамках настоящего изобретения различные технические признаки настоящего изобретения, упомянутые выше, и технические признаки, конкретно описанные в нижеследующей части (как и в воплощениях) могут быть скомбинированы друг с другом, образуя новые технические решения.

Если не указано иное, при осуществлении настоящего изобретения используют стандартные методики молекулярной биологии (включая рекомбинантные методики), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, известные специалистам в области техники. Такие методики подробно описаны в литературе, например Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (RI Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds. 1987, с регулярными обновлениями); PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR: Polymerase Chain Reaction), (Mullis et al., ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001).

«Выделенное» антитело в настоящем описании относится к антителу, которое было идентифицировано и отделено от компонентов его естественного окружения. В предпочтительном воплощении антитело очищено до: (1) более чем до 95% по массе антитела, наиболее предпочтительно более чем до 99% по массе при определении методом Лоури и (2) степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с вращающимся стаканом или (3) гомогенности при проведении SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси синим или, предпочтительно, серебром.

Термин «CD79b» относится к любому естественному CD79b из любого источника-позвоночного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди, макаки) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Термин «CD79b» охватывает «полноразмерный», непреобразованный CD79b и любую преобразованную форму CD79b из клеток. Термин также охватывает варианты CD79b естественного происхождения, такие как сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы. Полипептиды CD79b, описанные в настоящем документе, могут быть выделены из различных источников, таких как человеческие типы тканей или другие источники, или получен рекомбинантными или синтетическими методами. «Полипептид CD79b с нативной последовательностью» включает полипептиды, имеющие такую же аминокислотную последовательность, как один из соответствующих полипептидов CD79b природного происхождения. Такие полипептиды CD79b с нативной последовательностью могут быть выделены из природного источника или могут быть получены рекомбинантными или синтетическими методами. Термин «полипептид CD79b с нативной последовательностью» конкретно охватывает усеченную или секретируемую форму конкретного полипептида CD79b естественного происхождения (например, последовательность внеклеточного домена), формы вариантов естественного происхождения (например, формы, образованные в результате альтернативного сплайсинга) и аллельные варианты полипептида естественного происхождения.

«Внеклеточный домен», или «ECD» полипептида CD79b относится к форме полипептида CD79b, по существу не содержащей трансмембранного и цитоплазматического доменов. Как правило, ECD полипептида CD79b имеет менее 1% таких трансмембранных доменов и/или цитоплазматических доменов, предпочтительно менее чем 0,5% таких доменов. Точные границы трансмембранного домена могут варьировать, предпочтительно, внеклеточный домен полипептида CD79b может содержать приблизительно 5 или менее 5 аминокислот по обе стороны от границ транс мембранного домена/внеклеточного домена, указанных в Примерах или в описании. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность ECD CD79b, описанная в настоящем документе, представлена в SEQ ID NO:35.

Термин «антитело» включает моноклональные антитела (включая полноразмерные антитела, имеющие Fc-области иммуноглобулина), композиции антител, обладающие специфичностью к множеству эпитопов, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), диатела и одноцепочечные молекулы, а также фрагменты антител (например, Fab, F(ab')2 и Fv). Термин «иммуноглобулин» (Ig) и «антитело» могут использоваться взаимозаменяемо.

Термин «антитело против CD79b» или ему подобные относятся к антителу, которое способно связываться с CD79b с достаточной аффинностью. Предпочтительно, степень связывания антитела против CD79b с нерелевантными не являющимися CD79b белками составляет менее чем приблизительно 10% от степени связывания антитела с CD79b по результатам, например, радиоиммунологического анализа (RIA). В некоторых воплощениях антитело, которое связывается с CD79b, имеет константу диссоциации (Kd)<10 нМ,<1 нМ или<0,1 нМ. В некоторых воплощениях антитело против CD79b связывается с эпитопом CD79b, который является консервативным у CD79b из различных биологических видов.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» антитела относится к N-концевому домену тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей могут обозначаться «VH» и «VL», соответственно. Эти домены обычно являются наиболее вариабельными частями антитела (при сравнении с другими антителами того же типа) и содержат антигенсвязывающие сайты.

Термин «вариабельный» относится к ситуации, когда некоторые сегменты вариабельных доменов в последовательностях антитела значительно отличаются. Вариабельный домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределена среди ПО аминокислот, расположенных в вариабельном домене. Действительно, вариабельная область состоит из относительно инвариантных сегментов длиной 15-30 аминокислот, называемых каркасными участками (FR) и чрезвычайно вариабельных более коротких областей длиной 9-12 аминокислот каждая, разделяющих каркасные области и обозначаемых «гипервариабельными участками» (HVR). Каждый вариабельный домен нативной тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR участка, которые по большей части принимают конформацию бета-слоя. HVR в каждой цепи удерживаются очень близко друг к другу посредством участков FR и вместе с HVR другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антитела. Константные домены непосредственно не участвуют в связывании с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции.

В настоящем описании термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, если не считать возможные естественные мутации и/или посттрансляционные модификации (например, изомеризацию, амидирование), которые могут присутствовать в незначительном количестве. Моноклональные антитела в высокой степени специфичны и нацелены на единственный антигенный сайт.В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против единственной антигенной детерминанты. Помимо их специфичности, преимуществом моноклональных антител является то, что их синтезируют в культуре гибридом и у них отсутствует контаминация другими иммуноглобулинами. «Моноклональные» указывает, что антитела получены из по существу гомогенной популяции антител, и это не следует истолковывать как необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему описанию могут быть получены различными способами, включая, например, гибридомные методы (например, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)), рекомбинацию ДНК (например, патент US 4816567), технологию фагового дисплея (например, Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991)) и методику получения человеческого или подобного человеческому антитела у животного, имеющего часть локусов или все локусы иммуноглобулинов человека или гены, кодирующие последовательности иммуноглобулинов человека (например, WO 1998/24893).

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» или «полное антитело» могут использоваться взаимозаменяемо и обозначают антитело, содержащее антигенсвязывающий сайт, а также CL и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи CH1, СН2 и СН3. Константный домен может представлять собой константный домен с нативной последовательностью (например, человеческий константный домен с нативной последовательностью) или вариант его аминокислотной последовательности. В некоторых случаях интактное антитело может обладать одной или более чем одной эффекторной функцией.

«Фрагмент антитела» содержит часть интактного антитела, предпочтительно содержащую антигенсвязывающую область и/или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, диатела, линейные антитела (см. патент US 5641870), молекулы одноцепочечных антител (scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Расщепление антитела папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, так называемых «Fab»-фрагмента, и остаточный «Few-фрагмент.Fab-фрагмент состоит из полной легкой цепи и вариабельных доменов тяжелой цепи (VH) и первого константного домена одной тяжелой цепи (СН1). Каждый Fab-фрагмент является одновалентным при связывании с антигеном, то есть имеет один антигенсвязывающий сайт.Обработка антитела пепсином приводит к образованию более крупного Р(аb’)2-фрагмента, который приблизительно соответствует двум Fab-фрагментам, соединенным дисульфидными связями, который обладает иной антигенсвязывающей активностью и по-прежнему способен к перекрестному связыванию антигенов. Fab'-фрагмент отличается от Fab-фрагмента добавлением нескольких дополнительных остатков на С-конце домена СН1, включая один или более чем один цистеин из шарнирной области антитела. Р(аb’)2-фрагмент антитела исходно был получен в виде пары Fab'-фрагментов с шарнирным цистеином между Fab'-фрагментами. Также известны другие химические конъюгаты фрагментов антител. Fc-фрагмент содержит С-концевую часть двух тяжелых цепей, удерживаемых вместе посредством дисульфидной связи. Эффекторная функция антитела определяется последовательностью Fc-области, которая также представляет собой область, распознаваемую Fc-рецептором (FcR), который обнаруживается на некоторых типах клеток.

«Fc-область», или Fc-фрагмент в настоящем документе используется для обозначения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая нативную последовательность Fc-области и варианта Fc-области. Несмотря на то, что границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как участок от аминокислотного остатка в положении Cys226 или Рго230 до карбокси-конца. С-концевой лизин Fc-области (остаток 447 согласно системе нумерации EU) может быть удален, например, в ходе получения или очистки антитела или при конструировании рекомбинантных нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелые цепи антитела. Так, конъюгат интактного антитела может включать конъюгат антитела, в котором удалены все остатки К447, конъюгат антитела без удаления какого-либо остатка К447 или смешанные конъюгаты с остатком К447 или без остатка К447. «Функциональная Fc-область» обладает эффекторной функцией Fc-области с нативной последовательностью. Примеры эффекторных функций включают связывание C1q, CDC (комплемент-зависимую цитотоксичность), связывание Fc-рецепторов, ADCC (антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность), фагоцитоз, понижающую регуляцию экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточных рецепторов) и тому подобное. «Fc-область с нативной последовательностью» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, обнаруживаемой в природе. Человеческая Fc-область с нативной последовательностью включает Fc-область IgG1 человека с нативной последовательностью, Fc-область IgG2 человека с нативной последовательностью, Fc-область IgG3 человека с нативной последовательностью, Fc-область IgG4 человека с нативной последовательностью и их варианты естественного происхождения. «Вариант Fc-области» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-области по меньшей мере одной аминокислотной модификацией, предпочтительно одной или более чем одной аминокислотной заменой. Предпочтительно, вариант Fc-области имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с Fc-областью с нативной последовательностью или с Fc-областью родительского полипептида, например имеет от приблизительно 1 до приблизительно 10 аминокислотных замен в нативной последовательности Fc-области или в Fc-области родительского полипептида, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 5 аминокислотных замен. Варианты Fc-области предпочтительно имеют по меньшей мере приблизительно 80% гомологии с Fc-областью с нативной последовательностью и/или Fc-областью родительского полипептида, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% гомологии с ними, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% гомологии с ними.

«Fv» - это минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. Этот фрагмент представляет собой димер вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи, которые тесно нековалентно связаны. При укладке этих двух доменов происходит выпячивание шести гипервариабельных петель (по 3 петли для каждой тяжелой и легкой цепи), вносящих вклад в антигенсвязывающие аминокислотные остатки и придающих антителу специфичность связывания антигена. Однако даже одиночный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три HVR, специфичных в отношении антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя аффинность является более низкой по сравнению с интактным сайтом связывания.

«Одноцепочечный Fv» может также обозначаться аббревиатурой «scFv» и представляет собой фрагмент антитела, в котором домены VH и VL антитела соединены в единую полипептидную цепь. Предпочтительно, полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, так что sFv образует желаемую антигенсвязывающую структуру.

«Диатело» относится к фрагменту антитела, имеющему два антигенсвязывающих сайта, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), соединенные в общую полипептидную цепь (VH-VL). Малые фрагменты антител получают путем конструирования фрагмента scFv с использованием короткого линкера (приблизительно 5-10 остатков) между доменами VH и VL, и поскольку линкер короткий, происходит межцепочечное, а не внутрицепочечное спаривание вариабельных доменов. В результате образуется бивалентный фрагмент, фрагмент, имеющий два антигенсвязывающих сайта. Диатела могут быть бивалентными или биспецифическими. Биспецифическое антитело представляет собой гетеродимер из двух «перекрещивающихся» фрагментов scFv, в которых домены VH и VL обоих антител находятся на разных полипептидных цепях.

«Функциональный фрагмент» или «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, описанного в настоящем документе, включает часть интактного антитела, обычно включая антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела или Fc-область антитела, сохраняя способность связывать FcR или обладая измененной способностью связывать FcR. Примеры функциональных фрагментов антитела включают линейные антитела, одноцепочечные антитела (scFv) и мультиспецифические антитела, образованные фрагментами антител, в частности, фрагментами Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc, или диатела или любой фрагмент, способный увеличивать время полужизни в результате химической модификации или включения в липосомы. Химическая модификация включает добавление поли(алкилен)гликолей, таких как полиэтиленгликоль, то есть модификацию ПЭГилированием (обозначаются как Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG или ПЭГилированный фрагмент Fab'-PEG) при СВ79b-связывающей активности.

Предпочтительно, функциональный фрагмент описанного в настоящем документе антитела состоит из или содержит часть последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, из которого он имеет происхождение, часть последовательности является достаточной для сохранения такой же специфичности связывания и полной аффинности, как и у антитела, из которого он имеет происхождение. Такие функциональные фрагменты будут содержать минимум 5 аминокислот, предпочтительно 10, 15, 25, 50 и 100 смежных аминокислот последовательности антитела, из которого они имеют происхождение.

В настоящем документе моноклональные антитела включают «химерные» антитела (иммуноглобулины). В «химерном антителе» часть тяжелой цепи и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антитела, имеющего происхождение из конкретного биологического вида или принадлежащего к определенному классу или подклассу антител, тогда как другая часть идентична или гомологична соответствующей последовательности другого антитела, имеющего происхождение из другого биологического вида или принадлежащего к другому классу или подклассу антител.

«Гуманизированное антитело» представляет собой специфический класс «химерных антител». «Гуманизированная» форма антитела, не являющегося человеческим (например, грызунов), относится к химерному антителу с минимальным содержанием последовательностей, имеющих происхождение из антитела, не являющегося человеческим. По большому счету, гуманизированные антитела относятся к иммуноглобулинам, где остатки гипервариабельной области иммуноглобулинов человека (реципиентных антител) заменены остатками гипервариабельной области антител видов, не являющихся человеком (донорных антител), таких как мыши, крысы, кролики или не являющиеся человеком приматы, обладающих желаемой антительной специфичностью, аффинностью и связывающей способностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Такие модификации осуществляют для дальнейшего улучшения характеристик антител. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по меньшей мере один, обычно два по существу полных вариабельных домена, где все или по существу все из гипервариабельных петель соответствуют гипервариабельным петлям из иммуноглобулинов, не являющихся человеческими, и все или по существу все FR представляют собой FR из последовательностей человеческих иммуноглобулинов. Гуманизированное антитело, возможно, также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно константной области человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела могут быть получены из антител мышиного происхождения, полученных в результате иммунизации мышей, при помощи компьютерного моделирования в комбинации с технологией фагового дисплея.

«Человеческое антитело» относится к антителу, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, продуцированного человеком и/или полученного любой из методик получения человеческих антител, известных в области техники. Человеческие антитела не охватывают гуманизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие остатки, не являющиеся человеческими. Человеческие антитела можно получать различными методиками, известными в области техники, включая библиотеки фагового дисплея.

«Аффинность связывания» относится к силе суммы всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, в настоящем документе «аффинность связывания» относится к собственной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y обычно может выражаться константой диссоциации (K_d). Низкоаффинные антитела обычно связываются с антигеном медленно и имеют склонность к легкой диссоциации, тогда как высокоаффинные антитела обычно связываются с антигеном более быстро и имеют склонность сохранять связывание дольше. Аффинность можно измерить стандартными способами, известными в области техники, включая анализы связывания радиоактивно меченного антигена (RIA).

«Регуляторная последовательность» относится к последовательности ДНК, необходимой для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Например, регуляторные последовательности, подходящие для прокариот, включают промотор, последовательность возможного оператора и сайт связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», если она находится в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, если лидерная последовательность или обеспечивающая секрецию лидерная ДНК экспрессируется в виде про-белка, задействованного в секреции полипептида, она функционально связана с ДНК полипептида; если промотор или энхансер влияют на транскрипцию кодирующей последовательности, они функционально связаны с последовательностью; или если положение сайта связывания рибосомы облегчает трансляцию, он функционально связан с кодирующей последовательностью. В общем, «функционально связан» означает, что соединенные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторного лидера это означает, что они являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако, энхансеры не обязательно должны быть смежными. Лигирование может осуществляться путем соединения в удобном сайте рестрикции. При отсутствии таких сайтов используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры, в соответствии со стандартной практикой.

«Вектор» в настоящем документе относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другие нуклеиновые кислоты, с которыми она связана. Один тип вектора представляет собой «плазмиду», которая относится к кольцевой двуцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является фаговый вектор. Другим типом вектора является вектор на основе вируса, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их внедряют (например, бактериальный вектор, имеющий бактериальный репликатор, и эписомный вектор млекопитающих). Другие векторы (например, не-эписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при внедрении в клетку-хозяина, таким образом реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем документе обозначают «рекомбинантными экспрессирующими векторами» (или просто «рекомбинантными векторами»). Как правило, экспрессирующие векторы используют в методиках рекомбинации ДНК, и они зачастую существуют в форме плазмид. В настоящем описании «плазмида» и «вектор» используются взаимозаменяемо, поскольку плазмида представляет собой наиболее распространенную форму вектора.

«Полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» в настоящем документе используются взаимозаменяемо и обозначают полимер из нуклеотидов любой длины, включая ДНК и РНК. Нуклеотид может представлять собой дезоксирибонуклеотид, рибонуклеотид, модифицированный нуклеотид или основание и/или их аналог, или может быть любым субстратом, включенным в полимер ДНК- или РНК-полимеразой или в результате реакции синтеза. Полинуклеотиды могут содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если присутствуют модификации нуклеотидной структуры, они могут быть внесены до или после сборки полимера. Нуклеотидная последовательность может прерываться не нуклеотид ным компонентом. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после синтеза, например путем присоединения метки.

«Олигонуклеотид» обычно относится к короткому полинуклеотиду, обычно одноцепочечному, синтетическому, обычно, но не обязательно длиной менее чем приблизительно 200 нуклеотидов.

В настоящем документе термин «опухоль» относится к физиологическому состоянию млекопитающего, которое обычно характеризуется неконтролируемым клеточным ростом. Опухоли можно подразделять на доброкачественные опухоли и злокачественные опухоли, и злокачественные опухоли также называют раковыми. Опухоли можно подразделять на солидные опухоли и гематологические опухоли. В некоторых воплощениях изобретение в частности относится к лечению рака кроветворной системы или гемобластозов. В настоящем описании «кроветворная система» включает тимус и костный мозг, а также периферические лимфоидные ткани, такие как селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные ткани, ассоциированные со слизистыми оболочками, такие как лимфоидная ткань кишечника, гланды, Пейеровы бляшки и другие ассоциированные со слизистой отростки и лимфоидные ткани, такие как выстилка бронхов. Так, рак кроветворной системы или гемобластозы, описанные в настоящем документе, могут включать лимфому, лейкоз, миелому или лимфоидные злокачественные новообразования, а также рак селезенки и рак лимфатических узлов. Более конкретные примеры видов рака кроветворной системы или гемобластозов включают ассоциированные с В-клетками злокачественные виды рака, включая, например, распространенные, промежуточные и медленно прогрессирующие лимфомы, включая В-клеточные лимфомы, такие как В-клеточные лимфомы лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками и неходжкинская лимфома (NHL), мантийноклеточная лимфома, лимфома Беркитта, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, лимфома из клеток краевой зоны, диффузная крупноклеточная лимфома, фолликулярная лимфома и лимфома Ходжкина и Т-клеточная лимфома; и лейкозы, включая вторичный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), такой как В-клеточный лейкоз (CD5+ В-лимфоцитарный), миелоидный лейкоз, такой как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, лимфоидный лейкоз, такой как острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и спинальная дисплазия; и другие гематологические В-клеточные и/или Т-клеточные виды рака. Виды рака кроветворной системы или гемобластозы также включают виды рака из других гемопоэтических клеток, включая полиморфноядерные лейкоциты, такие как базофилы, эозинофилы, нейтрофилы и моноциты, дендритные клетки, тромбоциты, эритроциты и клетки-натуральные киллеры. Конкретно, они могут включать раковое В-клеточное пролиферативное расстройство, выбранное из группы, состоящей из неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей безболезненной NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной безболезненной NHL, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфобластного лейкоза (ALL) и мантийноклеточной лимфомы.

В настоящем документе рак также включает рак, бластому и саркому. Так, другие примеры рака включают плоскоклеточную карциному, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, перитонеальный рак, гепатоцеллюлярную карциному, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатосаркому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак эндометрия или рак матки, рак слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы и различные типы рака головы и шеи и так далее.

«Лечение» или «облегчение» относится к облегчению (уменьшению) или излечению патологического состояния или нарушения, на которое оно направлено. Если пациент демонстрирует наблюдаемое и/или измеримое снижение или исчезновение одного или более чем одного из нижеперечисленного после получения терапевтического количества антитела против CD79b согласно описанному в настоящем документе способу, у субъекта успешно «излечиваются» опухоли (в частности, рак), экспрессирующие полипептид CD79b: снижение количества опухолевых клеток или исчезновение опухолевых клеток; уменьшение объема опухоли; подавление инфильтрации опухолевыми клетками; подавление метастазирования опухоли; подавление опухолевого роста до некоторой степени и/или облегчение до некоторой степени одного или более симптомов, ассоциированных с конкретными опухолями; уменьшение заболеваемости и смертности и улучшение качества жизни. В случае, когда антитело против CD79b предупреждает рост опухолевых клеток и/или уничтожает существующие опухолевые клетки, оно может подавлять клетки и/или отравлять клетки. Облегчение указанных признаков или симптомов также может ощущаться пациентом.

«Терапевтически эффективное количество» означает дозу, достаточную для того, чтобы принести пользу субъекту, которому ее вводят.Фактически введенное количество, а также скорость и периодичность введения будут зависеть от состояния субъекта, лечение которого осуществляют, и его тяжести. Назначение лечения (например, определение дозы и так далее) в конечном итоге находится в компетенции лечащего врача и других медицинских специалистов, и на них лежит ответственность принятия решений, обычно с учетом заболевания, лечение которого осуществляют, состояния конкретного пациента, места доставки, способа введения и других факторов, известных медицинским специалистам. В случае опухолей, терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшать количество опухолевых клеток; уменьшать объем опухоли; подавлять инфильтрацию окружающих органов злокачественными клетками, подавлять метастазирование опухоли, подавлять рост опухоли до некоторой степени и/или уменьшать до некоторой степени один или более симптомов, относящихся к опухоли. Под «профилактически эффективным количеством» понимают количество, эффективное для достижения желаемого профилактического эффекта при необходимой дозе за необходимое время. Как правило, но не обязательно, поскольку профилактическую дозу вводят субъекту до развития заболевания или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

«Подавляющее рост количество» антитела против CD79b относится к количеству, способному подавлять рост клеток, в частности, опухолевых, таких как раковые клетки, in vitro или in vivo. «Подавляющее рост количество» антитела против CD79b для подавления неопластического роста можно определить эмпирически и стандартным образом.

«Цитотоксическое количество» антитела против CD79b относится к количеству, способному вызвать разрушение клеток, в частности, опухолевых клеток, таких как раковые клетки, in vitro или in vivo. «Цитотоксическое количество» антитела против CD79b для подавления неопластического роста можно определить эмпирически и стандартным образом.

В настоящем описании «индивидуум» или «субъект» относятся к позвоночному. В некоторых воплощениях позвоночное представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают одомашненных животных (таких как домашний скот), животных для участия в спортивных состязаниях, домашних животных (таких как кошки, собаки и лошади), приматов, мышей и крыс, но не ограничиваются ими. Предпочтительно, млекопитающее относится к человеку.

Введение «в комбинации с» одним или более чем одним терапевтическим агентом включает одновременное (совместное) введение и последовательное введение в любом порядке.

Что касается «идентичности последовательностей» эталонной полипептидной последовательности, ее определяют как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и расстановки пропусков, если это необходимо для достижения наибольшего процента идентичности последовательностей, и без принятия каких-либо консервативных замен за часть идентичной последовательности. Сравнение для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными способами, известными специалисту в данной области, например с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Согласно описанию в настоящем документе, включены аминокислотные последовательности с по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи или тяжелой цепи и легкой цепи антитела (в частности, отдельные последовательности, специально указанные в настоящем документе). Предпочтительно, в описанных в настоящем документе антителах против CD79b могут быть осуществлены мутации, например с использованием любых методик и рекомендаций для консервативных и неконсервативных мутаций, например согласно описанию в патенте US 5364934. В некоторых воплощениях вариации не затрагивают CDR, представленные в настоящем документе как SEQ ID NO: 1-6. Вариация может представлять собой замену, делецию или вставку одного или более кодонов, кодирующих антитело или полипептид, что приводит к изменению аминокислотной последовательности по сравнению с нативной последовательностью антитела. Возможно, вариация представляет собой замену по меньшей мере одной аминокислоты в одном или более чем одном домене антитела против CD79b на любую другую аминокислоту. Путем сравнения последовательности антитела против CD79b с последовательностью молекулы известного гомологичного белка и минимизации количества изменений в аминокислотной последовательности, производимых в высокогомологичной области, можно вывести правила, на основании которых можно вставлять, заменять или удалять аминокислотные остатки без негативного влияния на ожидаемую активность. Аминокислотные замены могут быть результатом замены одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую схожие структурные и/или химические свойства, такой как замена лейцина на серии, то есть консервативной аминокислотной замены. Возможно, вставки или делеции могут варьировать от приблизительно 1 до 5 аминокислот.Допустимая вариация может быть определена путем систематического осуществления аминокислотных вставок, замен или делеций в последовательности и анализа полученных вариантов на предмет активности, демонстрируемой полноразмерными или зрелыми нативными последовательностями.

Вариацию можно осуществлять способами, известными в области техники, такими как опосредованный олигонуклеотидами (сайт-направленный) мутагенез, аланиновое сканирование и РСR(полимеразная цепная реакция)-мутагенез. Для получения варианта ДНК антитела против CD79b можно осуществлять сайт-направленный мутагенез, кассетный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез клонированной ДНК или другие известные методики.

Также можно осуществлять замену любого остатка цистеина, не вовлеченного в поддержание правильной конформации антитела против CD79b, обычно на серии, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предупреждения образования неправильных поперечных сшивок. Напротив, для улучшения стабильности антитела против CD79b можно добавлять в него цистеиновые связи (особенно когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как фрагмент Fv).

В некоторых воплощениях суррогатный вариант включает замену одного или более чем одного остатка гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированные или человеческие антитела). В общем, полученные варианты, отобранные для дальнейшего усовершенствования, будут иметь улучшенные биологические свойства по сравнению с родительским антителом, из которого они получены. Удобный способ получения таких суррогатных вариантов включает созревание аффинности с использованием фагового дисплея. Вкратце, несколько сайтов гипервариабельных областей (например, 6-7 сайтов) подвергают мутациям для получения всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антител экспонируют в моновалентной форме на частицах нитчатых фагов в слитом виде с продуктом гена III бактериофага М13, упакованного в каждую частицу. Затем осуществляют скрининг вариантов фагов не предмет биологической активности (например, аффинности связывания). Для выявления кандидатов для модификации среди сайтов гипервариабельных областей можно осуществлять аланин-сканирующий мутагенез для выявления остатков гипервариабельных областей, играющих важную роль в связывании антигена. В альтернативном варианте или в качестве дополнения анализируют кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для выявления точки контакта между антителом и полипептидом CD79b. Такие контактирующие остатки и смежные с ними остатки являются сайтами-кандидатами, которые подвергают замене в соответствии с описанными в настоящем документе методиками. После получения таких вариантов осуществляют скрининг панели вариантов, как описано в настоящем документе, и в одном или более соответствующих тестов отбирают антитела с лучшими свойствами для дальнейшего усовершенствования. «Цитотоксический агент» относится к веществу, подавляющему функцию или препятствующему функции клеток и/или вызывающему разрушение клеток. Термин включает: радиоактивные изотопы At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³_,Bi²¹², P³² и Lu; химиотерапевтические агенты, такие как метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (такие как винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил или даунорубицин; ферменты и их фрагменты, такие как лизоцим; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или обладающие ферментативной активностью токсины, имеющие происхождение из бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты; а также противоопухолевые или противораковые агенты, хорошо известные в области техники.

«Фармацевтическая композиция» означает комбинацию по меньшей мере одного лекарственного средства и возможно фармацевтически приемлемого носителя или эксципиента, которые комбинированы вместе для достижения конкретной цели. В некоторых воплощениях фармацевтические композиции включают комбинации, которые разделены во времени и/или пространстве, при условии, что они способны действовать совместно для достижения задач настоящего изобретения. Например, компоненты, содержащиеся в фармацевтической композиции (например, антитела, молекулы нуклеиновых кислот, комбинации молекул нуклеиновых кислот и/или конъюгаты, описанные в настоящем документе) можно вводить субъекту как единое целое или по отдельности. Когда компоненты, содержащиеся в фармацевтической композиции, вводят субъекту раздельно, компоненты можно вводить субъекту одновременно или последовательно. Предпочтительно, фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду, забуференный водный раствор, изотонический солевой раствор, такой как PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), глюкозу, маннит, декстрозу, лактозу, крахмал, стеарат магния, целлюлозу, карбонат магния, 0,3% глицерин, гиалуроновую кислоту, этанол или полиалкиленгликоли, такие как полипропиленгликоль, триглицериды и тому подобное. Тип используемого фармацевтически приемлемого носителя зависит, в частности, от того, составлена ли композиция по изобретению для перорального, назального, внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиции по изобретению могут содержать смачивающее вещество, эмульгирующее вещество или буферное вещество в качестве добавки.

Фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, можно вводить любым подходящим путем, например перорально, назально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутривенно.

Предложены антитела против CD79b или их функциональные фрагменты, фармацевтические композиции или их конъюгаты с лекарственными средствами и способы их применения в лечении гемопоэтических опухолей.

Антитела в настоящем документе представляют собой антитела, которые специфически привязаны к применению CD79b в лечении опухолей и могут представлять собой моноклональные антитела, фрагменты антител (включая Fab, Fab', F(ab')2 и Fv-фрагменты), диатела, однодоменные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела или антитела, конкурентно ингибирующие связывание антитела против полипептида CD79b с его соответствующим антигенным эпитопом. Описанные в настоящем документе антитела возможно могут быть конъюгированы с цитотоксическим агентом, таким как токсин, включая, например, ауристатин, майтанзиноиды, производные доластатина или калихеамицина, антибиотики, радиоактивные изотопы, лизоцимы и тому подобное. Описанные в настоящем документе антитела возможно могут быть получены в клетках СНО (клетки яичника китайского хомяка) или бактериальных клетках, и предпочтительно индуцируют гибель клеток, связанных с ними. Для выявления описанные в настоящем документе антитела могут быть мечены выявляемыми метками и присоединены к твердому носителю.

В настоящем документе антитела против CD79b содержат по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или все шесть аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-6. В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела против CD79b содержит любую одну, любые две или все три из SEQ ID NO: 1-3, и/или вариабельная область его легкой цепи содержит любую одну, любые две или все три из SEQ ID NO: 4-6. В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела против CD79b содержит аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1-3, и/или вариабельная область его легкой цепи содержит аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4-6. В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела против CD79b содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1-3, и вариабельная область его легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4-6. В некоторых воплощениях антитело против CD79b содержит: HCDR1, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4; LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5; и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. В некоторых воплощениях антитело против CD79b содержит последовательности CDR, представленные в SEQ ID NO: 1-6.

В некоторых воплощениях антитело представляет собой мышиное антитело 104Е1, его аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи может быть такой, как представленная в SEQ ID NO: 7, и/или аминокислотная последовательность вариабельной области его легкой цепи может быть такой, как представленная в SEQ ID NO: 8.

В некоторых воплощениях антитело по настоящему описанию представляет собой гуманизированное антитело, где по меньшей мере одна, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или все шесть из SEQ ID NO: 1-6 использованы для замены соответствующих областей CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи человеческого антитела. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность, использованная для получения вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела, представлена в SEQ ID NO:9, и аминокислотная последовательность, использованная для получения вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела является такой, как представленная в SEQ ID NO: 10. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела, описанного в настоящем документе, представлена в SEQ ID NO: 11, и/или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела является такой, как SEQ ID NO: 12.

В некоторых воплощениях для нахождения в мышиной FR области аминокислотного положения, играющего важную роль в аффинности антитела, в базе данных PDC осуществляют поиск кристаллической структуры, схожей по гомологии с мышиным антителом 104Е1, описанным в настоящем документе. В результате была найдена кристаллическая структура scFv антитела Ab735 к полисиаловой кислоте, обладающая гомологией 77% с последовательностью антитела 104Е1 и имеющая достаточно высокое разрешение. Так, используя эту кристаллическую структуру в качестве структурной матрицы, сравнивали две последовательности для установления модели антитела 104Е1 на основе гомологии с scFv 3WBD. Согласно данной модели на основе гомологии, были обнаружены аминокислотные сайты домена FR последовательности 104Е1, которые были окружены доменом CDR или находились на расстоянии менее 5А от домена CDR, затем эти аминокислотные сайты, которые могут играть важную роль в аффинности антитела, подвергли обратным мутациям в последовательностях с пересаженными CDR (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12) избегая сайтов гликозилирования, дезамидирования, окисления и так далее. Всего в вариабельной области тяжелой цепи выявили 15 сайтов, которые было необходимо подвергнуть обратным мутациям, включая А24Т, RV67KA, S84R, Т98К, К12А, S16A, V20L, А24Т, R38K, M48I, V68A, I70L, Y95F, Т98К и V113L; всего в вариабельной области легкой цепи выявили 7 сайтов, которые было необходимо подвергнуть обратным мутациям, включая V3L, F41Y, RR50KL, FQ41YL, R51L, V88L и V109L. Затем сконструировали библиотеки Fab согласно стандартному протоколу Kingsley и провели скрининг с использованием платформы фагового дисплея. После гуманизации провели скрининг последовательностей с аффинностью не меньшей, чем у мышиного антитела 104Е1 и секвенировали для подтверждения последовательностей. Соответственно, в некоторых воплощениях аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против CD79b, описанного в настоящем документе, может быть выбрана из аминокислотных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 13-17, и/или аминокислотная последовательность вариабельной области его легкой цепи может быть выбрана из аминокислотных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 18-22. Настоящее изобретение также охватывает последовательности вариабельной области тяжелой цепи, идентичные по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% вариабельным областям тяжелой цепи, и последовательности вариабельной области легкой цепи, идентичные по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% вариабельным областям легкой цепи. В некоторых воплощениях мутации в вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи возникают внутри FR, а не в CDR.

Описанные в настоящем документе антитела могут также содержать константную область. Константная область может представлять собой константную область IgM, IgD, IgG, IgA и IgE человека. Например, константная область может представлять собой константную область IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2 человека. В некоторых воплощениях тяжелая цепь описанного в настоящем документе антитела против CD79b содержит вариабельную область тяжелой цепи и Fc-область тяжелой цепи, описанные в настоящем документе, легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и Fc-область легкой цепи, описанные в настоящем документе. Аминокислотная последовательность приведенной в качестве примера Fc-области тяжелой цепи может быть такой, как представленная в SEQ ID NO: 23, а аминокислотная последовательность приведенной в качестве примера Fc-области легкой цепи может быть такой, как представленная в SEQ ID NO: 24. В некоторых воплощениях Fc-область тяжелой цепи, подходящая для применения по изобретению, дополнительно содержит Fc-область тяжелой цепи, идентичную по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, и/или Fc-область легкой цепи, подходящая для применения по изобретению, дополнительно содержит Fc-область легкой цепи, идентичную по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 24. Предпочтительно, мутации, известные в области техники, которые изменяют эффекторную функцию Fc-области, могут возникать в Fc-областях тяжелой и/или легкой цепи. Например, Fc-область со сниженной эффекторной функцией имеет мутацию с заменой одного или более остатков в положениях 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (см. US 6737056). Одна или более аминокислотных замен, которые улучшают ADCC, могут затрагивать остатки 298, 333 и/или 334 Fc-области (остатки пронумерованы согласно системе нумерации EU).

В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против CD79b, описанного в настоящем документе, может быть выбрана из аминокислотных последовательностей, идентичных по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 и 33, и/или аминокислотная последовательность его легкой цепи может быть выбрана из аминокислотных последовательностей, по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичных аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32 и 34.

Соответственно, в некоторых воплощениях антитело против CD79b в настоящем документе выбрано из группы, состоящей из: (1) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 25 и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 26; (2) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 27 и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 28; (3) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 29 и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 30; (4) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 31 и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 32 и (5) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 33, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 34.

В настоящем документе также представлены кодирующие последовательности для CDR, вариабельных областей легкой цепи, вариабельных областей тяжелой цепи, легкой и тяжелой цепей и комплементарные им последовательности (нуклеиновокислотные последовательности), векторы, содержащие кодирующие последовательности или комплементарные им последовательности и клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор. Примеры кодирующих последовательностей представлены в SEQ ID NO: 36, 37, 38 и 39, которые являются кодирующими последовательностями для SEQ ID NO: 33, 34, 7 и 8, соответственно.

Для получения полинуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела или их функциональные фрагменты, описанные в настоящем документе, можно использовать стандартные рекомбинантные методики. Желаемые полинуклеотидные последовательности могут быть выделены из продуцирующих антитела клеток, таких как клетки гибридомы, и секвенированы. В альтернативном варианте, полинуклеотид может быть синтезирован с использованием нуклеотидного синтезатора или методики PCR. После получения последовательность, кодирующую полипептид, встраивают в рекомбинантный вектор, способный реплицироваться в прокариотическом хозяине и экспрессировать гетерологичный полинуклеотид. Для задач настоящего изобретения можно использовать разнообразные векторы, доступные и известные в области техники. Выбор подходящего вектора будет преимущественно зависеть от размера нуклеиновой кислоты, подлежащей встраиванию в вектор, и конкретной клетки-хозяина, которую будут трансформировать вектором. Каждый вектор содержит набор строительных блоков, в зависимости от его функции (амплификация или экспрессия гетерологичного полинуклеотид а, или и то, и другое), и его совместимости с конкретной клеткой-хозяином, в которой он находится.

Например, вектор может быть в форме плазмиды, космиды, вирусной частицы или бактериофага. Подходящая последовательность нуклеиновой кислоты может быть встроена в вектор различными способами. Как правило, последовательность ДНК, представляющую интерес, встраивают в подходящий сайт, распознаваемый рестрикционной эндонуклеазой, с использованием методик, известных в области техники. Компоненты вектора, как правило, включают, без ограничения, одно или более чем одно из перечисленного: сигнальную последовательность, репликатор, один или нескольких маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции. Подходящие носители, содержащие один или более чем один из этих компонентов, могут быть сконструированы с использованием стандартных методов лигирования, известных специалисту в данной области. Вектор может представлять собой клонирующий вектор или экспрессирующий вектор.

CD79b может быть получен не только непосредственно путем рекомбинации, но также и в виде слитого полипептида с гетерологичным полипептидом, который может быть сигнальной последовательностью или другим полипептидом, имеющим специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида. Как правило, сигнальная последовательность может быть компонентом вектора или может быть частью ДНК, кодирующей антитело против CD79b, встроенной в вектор. Сигнальная последовательность может быть прокариотической сигнальной последовательностью, например, выбранной из лидерной последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы, 1рр или термостабильного энтеротоксина II. Для секреции дрожжами сигнальная последовательность может быть, например, лидерной последовательностью инвертазы дрожжей, лидерной последовательностью альфа-фактора (включая лидерную последовательность а-фактора Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces) или лидерной последовательностью кислой фосфатазы, лидерной последовательностью глюкоамилазы Candida albicans и так далее. При экспрессии в клетках млекопитающих для направления секреции белка можно использовать сигнальные последовательности млекопитающих, такие как сигнальные последовательности секретируемых полипептидов из того же или родственного вида, а также лидерные последовательности вирусного происхождения.

Как правило, векторы для экспрессии в клетках млекопитающих не требуют компонента, представляющего собой репликатор. Например, репликатор SV40 обычно может использоваться просто потому, что он содержит ранний промотор. Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно будут содержать ген селекции, также обозначаемый селективным маркером. Типичный ген селекции кодирует белок, который: (а) придает устойчивость к антибиотику или другому токсину, такому как ампициллин, неомицин, метотрексат или тетрациклин; (б) комплементирует ауксотрофы или (в) обеспечивает ключевые питательные вещества, которые невозможно получить из сложной среды, как ген, кодирующий рацемазу D-аланина у Bacillus.

В приведенном в качестве примера протоколе отбора используются лекарственные средства для блокирования роста клеток-хозяев. Те клетки, которые были успешно трансформированы гетерологичным геном, продуцируют белок, который придает устойчивость к лекарственному средству и, следовательно, выживают при протоколе отбора. Примеры такой доминантной селекции включают использование лекарственных средств неомицина, микофеноловой кислоты и гигромицина.

Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против CD79b, для управления синтезом мРНК (матричная РНК). Промоторы, которые распознаются различными потенциальными клетками-хозяевами, хорошо известны. Примеры последовательностей промоторов, подходящие для применения у дрожжей, включают промоторы 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.

Транскрипция антител против CD79b в клетках-хозяевах от млекопитающих, опосредованная векторами, находится под контролем промоторов, полученных, например, из генома вирусов (например, вируса полиомы, вируса оспы кур, аденовируса (например, аденовируса 2 типа), вируса бычьей папилломы, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса, ретровируса, вируса гепатита В и вируса обезьян 40 (SV40)), гетерологичных промоторов млекопитающих (таких как промоторы актина или промоторы иммуноглобулина) и промоторов теплового шока. В некоторых воплощениях используют ранние и поздние промоторы SV40, которые дополнительно содержат вирусный репликатор SV40.

Транскрипцию ДНК, кодирующей антитело против CD79b, клетками высших эукариот можно усилить путем встраивания в вектор последовательности энхансера. Энхансер представляет собой действующий в цис-положении элемент ДНК, обычно длиной приблизительно от 10 до 300 п. о., который действует на промотор и усиливает транскрипцию. Известно много энхансерных последовательностей генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, альф а-фето протеина и инсулина). Однако обычно используют энхансеры вирусов эукариот.Примеры включают энхансер на участке позднего начала репликации SV40 (п.о. 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер на участке позднего начала репликации вируса полиомы и энхансеры аденовирусов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в 5'-или 3'-положении от кодирующей последовательности антитела против CD79b, но предпочтительно располагается в 5'-положении от промотора.

Экспрессирующие векторы для использования в эукариотических клетках (дрожжей, грибов, растений, животных, человека или ядросодержащих клеток других многоклеточных организмов) будет также содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно получают из 5'-концевой и иногда 3'-концевой нетранслируемой области эукариотической или вирусной ДНК или кДНК (комплементарная ДНК). Эти области содержат нуклеотидные сегменты, которые транскрибируются в полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело против CD79b. Одним из полезных представителей терминаторов транскрипции является область полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота.

Векторы, содержащие нуклеиновокислотные последовательности, описанные в настоящем документе, могут быть перенесены в клетку-хозяина при помощи хорошо известных в области техники методов. Методики, подходящие для переноса нуклеиновых кислот в клетки-хозяева in vitro включают использование липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, DEAE-декстран, преципитацию фосфатом кальция и тому подобное.

Клетка-хозяин может быть прокариотической клеткой и эукариотической клеткой. Подходящие прокариоты включают археи и эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, такие как Enter obacteriaceae, такие как Е. coli, но не ограничиваются перечисленными. Другие подходящие прокариотические клетки-хозяева включают Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, такие как Salmonella typhimurium, Serratia, такие как Serratia marcescans, Shigella, и Bacillus, такие как В. subtilis и Bacillus licheniformis, Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla Paracoccus и Streptomyces.

Полноразмерные антитела, фрагменты антител и слитые белки антител, могут быть получены в бактериях, в частности, когда гликозилирование и эффекторные функции Fc не требуются, например когда терапевтическое антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом (например, токсином) и сам иммуноконъюгат демонстрирует эффективность при разрушении опухолевой клетки. Полноразмерные антитела могут иметь более длительное время полужизни в циркуляции. Получение в Е. coli является более быстрым и более экономичным. Для информации об экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, US 5648237, US 5789199 и US 5840523, где описаны области инициации трансляции (TIR) и сигнальные последовательности для оптимизации экспрессии и секреции. После экспрессии антитело выделяют из клеточной массы Е. coli в виде растворимой фракции и могут очищать, например, с использованием колонки с белком А или G, в зависимости от его изотипа. Окончательную очистку можно осуществлять такими же способами, которые применялись для очистки антител, экспрессированных, например, в клетках СНО.

Эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, также являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела против CD79b. Часто используемым низшим эукариотическим микроорганизмом-хозяином является Saccharomyces cerevisiae. Другие включают Schizosaccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces и им подобные.

Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированного антитела против CD79b, имеют происхождение из многоклеточного организма. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки насекомых, такие как клетки S2 дрозофилы и клетки Sf9 ночницы, и культуры клеток растений, таких как хлопок, кукуруза, картофель, соя, петуния, томат, табак. Обнаружили ряд штаммов и вариантов бакуловирусов, и соответствующие пермиссивные клетки-хозяева растений, имеющие происхождение из таких хозяев, как Spodoptera frugiperda, Aedes aegypti, Aedes albopictus, Drosophila melanogaster и Bombyx mori.

Примерами полезных клеточных линий млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1 (COS-7, АТСС CRL1651), трансформированных SV40, линия эмбриональных клеток почки человека (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре), клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, ATCCCCL10), клетки яичника китайского хомяка/-DHFR (СНО), мышиные клетки Сертоли (ТМ4), клетки почки обезьяны (CV1, ATCCCCL70), клетки почки зеленой африканской мартышки (VERO-76, ATCCCRL-1587), клетки рака шейки матки человека (HELA, ATCCCCL2), клетки почки собаки (MDCK, ATCCCCL34), гепатоциты крысы Буффало (BRL3A, ATCCCRL1442), клетки легкого человека (W138, ATCCCCL75), гепатоциты человека (HepG2, НВ8065), клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ060562, ATCCCCL51), клетки TRI, клетки MRC5, клетки FS4 и клетки гепатосаркомы человека (HepG2).

Клетки-хозяева для получения антител против CD79b, описанных в настоящем документе, можно культивировать в различных средах в условиях культивирования, хорошо известных в области техники.

Различные формы антител против CD79b можно получать как из культуральной среды, так и из лизатов клеток-хозяев. Если они связаны с мембраной, то отделять их от мембраны возможно с использованием раствора подходящего поверхностно-активного вещества (например, Тритон-Х100) или посредством ферментативного лизиса. Клетки, использованные для экспрессии антител против CD79b, могут быть разрушены различными физическими или химическими способами, такими как циклы замораживания-оттаивания, обработка ультразвуком, механическое разрушение или лидирующие агенты.

Композиция антител, полученная из клеток, может быть очищена, например, с использованием хроматографии на гидроксиапатите, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии. Предпочтительной методикой очистки является аффинная хроматография. В зависимости от выделяемого антитела, можно также использовать и другие методики очистки белков, такие как фракционирование на ионообменной колонке, преципитация этанолом, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарин-Сефарозе™ хроматография на анионо- или катионообменной смоле (например, колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматографическое фокусирование, SDS-PAGE и преципитация сульфатом аммония.

В другом аспекте предложены иммуноконъюгаты или конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), содержащие антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, и способы их применения и получения. Цитотоксические агенты, подходящие для применения в настоящем изобретении, могут представлять собой лекарственные средства (например, химиотерапевтические лекарственные средства), ингибиторы роста, токсины (например, токсины с ферментативной активностью или их фрагменты, имеющие происхождение из бактерий, грибов, растений или животных) или радиоактивные изотопы (то есть радиоактивные конъюгаты). Как правило, иммуноконъюгат содержит любое из вышеуказанных антител против CD79b, ковалентно связанное с цитотоксическим или выявляемым агентом.

В настоящем описании «лекарственное средство» относится к любому соединению, имеющему желаемую биологическую активность. Желаемые биологические активности включают диагностирование, излечение, облегчение, лечение, предупреждение заболеваний у человека или других животных. Так, термин «лекарственное средство» относится к соединениям, которые признаются официальной государственной фармакопеей, а также, например, официальной гомеопатической фармакопеей США, официальным национальным формуляром и любым приложением к данным документам. Типичные лекарственные средства приведены в настольном справочнике лекарственных средств для врачей (PDR) и Оранжевой книге Управления по контролю качества пищевых продуктов медикаментов (FDA). По мере появления и разработки новых лекарственных средств, эти лекарственные средства также будут включены в конъюгированные с лекарственными средствами пролекарства, описанные в настоящем документе. Предпочтительно, лекарственное средство имеет реакционноспособную функциональную группу, так что его можно применять для получения конъюгатов, описанных в настоящем документе.

Примеры подходящих для применения в настоящем изобретении лекарственных средств включают цитотоксические лекарственные средства для лечения рака, белки или полипептиды, имеющие желаемую биологическую активность, такие как токсины, такие как токсин акации, рицин А, экзотоксин синегнойной палочки и дифтерийный токсин, но не ограничиваются перечисленными. Другие подходящие белки включают фактор некроза опухоли, интерферон-альфа, интерферон-бета, фактор роста нервной ткани, тромбоцитарный фактор роста, фактор роста плазминогена тканевого типа и агенты, модулирующие биологический ответ, такие как лимфокины, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-6 (IL-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или другие известные факторы.

Примеры лекарственных средств включают: майтанзин; майтанзиноид; ауристатиновые лекарственные средства (такие как монометилауристатин Е (ММАЕ) и монометилауристатин F (MMAF)); калихеамицины (такие как калихеамицин); доксорубицины (такие как доксорубицин); бензодипиррольные антибиотики (такие как дуокармицины, СС-1065 и так далее) и другие производные циклопропилпиррол-4-она (CPI), такие как аналог циклопропилбензоиндол-4-она, такой как:

пирролбензодиазепины (PBD) или димеры PBD, такие как

Антитело может быть присоединено к лекарственному средству либо напрямую, либо через линкер. Линкеры можно подразделить на два класса: нерасщепляемые линкеры и расщепляемые линкеры. Для конъюгата антитело-лекарственное средство, содержащего нерасщепляемый линкер, механизм высвобождения лекарственного средства является следующим: после связывания конъюгата с антигеном и его интернализации клеткой антитело гидролизуется в лизосоме, и происходит высвобождение активной молекулы, состоящей из низкомолекулярного лекарственного средства, линкера и аминокислотного остатка антитела. Происходящее изменение молекулярной структуры лекарственного средства не уменьшает его цитотоксичность, но, поскольку активная молекула несет заряд (аминокислотные остатки), она не может инфильтрировать прилежащие клетки. Таким образом, такие активные лекарственные средства не способны уничтожать прилежащие опухолевые клетки, которые не экспрессируют антиген-мишень (антиген-негативные клетки) (эффект наблюдателя) (Ducry et al., 2010, Bioconjugate Chem. 21: 5-13). Расщепляемый линкер может расщепляться в клетке-мишени и высвобождать активное лекарственное средство. Расщепляемые линкеры можно подразделить на два основных класса: химически неустойчивые линкеры и ферментативно неустойчивые линкеры. Химически неустойчивые линкеры могут избирательно расщепляться вследствие различий в свойствах плазмы и цитоплазмы. Такие свойства включают рН, концентрацию глутатиона и тому подобное. рН-чувствительные линкеры, зачастую обозначаемые как кислото-расщепляемые линкеры, являются относительно стабильными в нейтральном окружении в крови (рН 7,3-7,5), но будут гидролизоваться в слабокислых эндосомах (рН 5,0-6,5) и лизосомах (рН 4,5-5,0). Глутатион-чувствительные линкеры также обозначаются как дисульфидные линкеры. Высвобождение лекарственного средства основано на различиях между высокой концентрацией (в миллимолярном диапазоне) внутриклеточного глутатиона и относительно низкой концентрацией глутатиона (в микромолярном диапазоне) в крови. Это особенно справедливо для опухолевых клеток, в которых низкие уровни кислорода приводят к усилению редуктазной активности, следствием чего являются более высокие концентрации глутатиона. Дисульфидные связи являются термодинамически стабильными и поэтому обладают большей стабильностью в плазме. Ферментативно неустойчивые линкеры, такие как пептидные линкеры, обеспечивают лучший контроль высвобождения лекарственного средства. Пептидные линкеры могут эффективно расщепляться протеазами, такими как катепсин В или плазмин (повышение количества таких ферментов в некоторых опухолевых тканях) в лизосоме. Такая пептидная связь считается очень стабильной в циркулирующей плазме, поскольку внеклеточные значения рН и сывороточные ингибиторы протеаз обычно приводят к тому, что протеазы неактивны. Вследствие высокой стабильности в плазме и хорошей избирательности и эффективности внутриклеточного расщепления ферментативно неустойчивые линкеры широко применяются в качестве расщепляемых линкеров в конъюгатах антитело-лекарственное средство. Типичные ферментативно неустойчивые линкеры включают Val-Cit (vc), Phe-Lys и им подобные. Саморасщепляющиеся линкеры обычно интегрированы между расщепляемым линкером и активным лекарственным средством или сами являются частью расщепляемого линкера. Механизм действия саморасщепляющегося линкера заключается в том, что, когда расщепляемый линкер расщепляется в подходящих условиях, линкер-самоубийца может спонтанно изменить структуру и высвободить присоединенное к нему активное лекарственное средство. Распространенные саморасщепляющиеся линкеры включают и-аминобензиловые спирты (РАВ) и бета-глюкурониды.

Линкер может содержать один или более линкерных элементов. Например, в некоторых воплощениях линкер может иметь структуру V-L, где элемент V может присутствовать или отсутствовать, как описано ниже для трехзубчатого линкерного элемента или тетрамалеимидного линкерного элемента; элемент L может быть нерасщепляемым линкером и расщепляемым линкером, как описано выше, таким как не устойчивый к кислоте линкер (например, гидразин), чувствительный к протеазе (например, чувствительный к пептидазе) линкер, светочувствительный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащие линкеры и тому подобное. Примеры линкерных элементов включают 6-малеимидокапроил, малеимидопропионилпролин-цитруллин, аланин-фенилаланин, и-аминобензилоксикарбонил, N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)пентаноат, N-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 карбоксилат и N-сукцинимидил (4-йодо-ацетил) аминобензоат.Другие приведенные в качестве примера элементы линкеров могут также быть линкерами, содержащими аминокислотное звено, обеспечивающее расщепление протеазами, тем самым облегчая высвобождение лекарственного средства из иммуноконъюгата после воздействия внутриклеточной протеазы, такой как лизосомальный фермент.Примеры аминокислотных звеньев включают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и пентапептиды, но не ограничиваются перечисленным. Примеры дипептидов включают: валин-цитруллин, аланин-фенилаланин, фенилаланин-лизин или N-метил-валин-цитруллин. Примеры трипептидов включают: глицин-валин-цитруллин и глицин-глицин-глицин.

Примеры трехзубчатых линкерных элементов (или элементов бисмалеимидного типа) могут иметь следующую структуру:

Примеры линкерных элементов тетрамалеимидного типа могут иметь следующую структуру:

Другие примеры подходящих линкеров, лекарственных средств или конструкций линкер-лекарственное средство можно найти в CN 103933575 А и CN 107652219 А, включая, без ограничения, конструкции линкер-лекарственное средство, представленные в конъюгатах антитело-лекарственное средство H-1-vcMMAE, Н-1-MMAF, H-3-vcMMAE, H-3-MMAF, H-4-vcMMAE, H-4-MMAF, раскрытых в CN 103933575 А, а также раскрытых в CN 107652219 А под номерами от 1-vcMMAE до 12-vcMMAE. Содержание обеих заявок включено в настоящее описание во всей полноте путем ссылки. Так, в некоторых воплощениях конъюгат антитело-лекарственное средство может иметь следующую структуру:

A-(V-L-D)n

где А представляет собой раскрытое в настоящем документе антитело, V-L представляет собой линкер; V может присутствовать или отсутствовать и может представлять собой любое из: трехзубчатых линкерных элементов или тетрамалеимидного линкерного элемента, описанных выше, a L представляет собой расщепляемый линкер или нерасщепляемый линкер, по меньшей мере один из V и L присутствует; D представляет собой цитотоксический агент, представляющий интерес; п представляет собой целое число от 1 до 4.

В некоторых воплощениях L представляет собой линкер, содержащий аминокислотное звено, как описано выше, обеспечивающее расщепление протеазой.

Примеры приведенных в качестве примера конъюгатов антитело-лекарственное средство можно найти среди примеров в настоящем документе, включая AS 11259-ADC-001, AS11259-ADC-002, AS11259-ADC-003, AS11259-ADC-004, AS 11259-ADC-005, AS11259-ADC-006, AS11259-ADC-007, AS11259-ADC-008, AS11259-ADC-010, AS11259-ADC-011 и AS11250-ADC-0012, но не ограничиваясь перечисленными.

В некоторых воплощениях иммуноконъюгат может содержать высокорадиоактивный атом. Для получения радиоактивных конъюгатов антител существуют разнообразные радиоактивные изотопы. Примеры их включают радиоактивные изотопы At²¹¹,I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и Lu. Если для выявления применяют иммуноконъюгат, он может содержать радиоактивный атом для проведения сцинтиграфических исследовании, например Tс^99m или I¹²³, или спиновую метку для визуализации посредством ядерного магнитного резонанса (NMR) (также известного под названием магнитно-резонансной визуализации (MRI)), такую как иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, цезий, марганец или железо.

Радиоактивные или другие метки могут быть включены в иммуноконъюгат известным образом. Например, пептиды могут быть синтезированы биологическим способом или синтезированы в результате химического синтеза аминокислот с использованием подходящих аминокислотных предшественников, включая, например, фтор-19 вместо водорода. Такие метки, как Tс^99m или I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ и In¹¹¹, можно присоединять через остатки цистеина в пептиде. Y-90 можно присоединять через остаток лизина.

ADC в настоящем изобретении могут быть получены несколькими путями с использованием реакций органической химии, условий и реагентов, известных специалистам в области техники, включая: (1) реакцию нуклеофильной группы антитела с двухвалентным линкерным реагентом с образованием ковалентной связи между антителом и линкером, перед реакцией с лекарственным средством; и (2) реакцию нуклеофильной группы группировки лекарственного средства с двухвалентным линкерным реагентом с образованием ковалентной связи между лекарственным средством и линкером, с последующей реакцией с нуклеофильной группой антитела.

Антитела, их функциональные фрагменты или конъюгаты антитело-лекарственное средство можно вводить любым способом, соответствующим состоянию, подлежащего лечению, включая пероральный, парентеральный, подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, интратекальный и эпидуральный.

Для предупреждения или лечения заболевания подходящая доза антитела, его функционального фрагмента или конъюгата антитело-лекарственное средство, описанных в настоящем документе (при использовании по отдельности или в комбинации с одним или более чем одним другим агентом, таким как химиотерапевтические лекарственные средства) будет зависеть от типа заболевания, типа антитела, его функционального фрагмента или конъюгата антитело-лекарственное средство, тяжести и прогрессирования заболевания, введения антитела, его функционального фрагмента или конъюгата антитело-лекарственное средство в профилактических или терапевтических целях, предшествующего лечения, клинического анамнеза пациента и ответа на антитела, их функциональные фрагменты или конъюгаты антитело-лекарственное средство, а также суждения лечащего врача. Подходящим образом, антитело, его функциональный фрагмент или конъюгат антитело-лекарственное средство вводят пациенту либо однократно, либо в виде серии введений. В зависимости от типа и тяжести заболевания первоначальная кандидатная доза для введения пациенту может составлять от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг (например, от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг) антитела, его функционального фрагмента или конъюгата антитело-лекарственное средство, например, в виде одного или нескольких раздельных введений или в виде непрерывной инфузии. Типичные суточные дозы могут варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от описанных выше факторов. Для повторных введений, которые длятся несколько дней или более, в зависимости от состояния, лечение обычно продолжают до желаемого подавления симптомов заболевания. Примером дозировок антител, их функциональных фрагментов или конъюгатов антитело-лекарственное средство может быть диапазон от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более доз антитела, его функционального фрагмента или конъюгата антитело-лекарственное средство, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Эти дозы можно вводить с перерывами, например каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получал от приблизительно 2 до приблизительно 20 доз, например приблизительно 6 доз антитела или иммуноконъюгата). Можно вводить первоначальную ударную дозу с последующим введением одной или более чем одной более низкой дозы. Пример схемы введения включает введение первоначальной ударной дозы приблизительно 4 мг/кг антитела с последующим введением поддерживающей дозы приблизительно 2 мг/кг в неделю. Однако могут оказаться полезными и другие схемы введения. Успешность такой терапии легко отслеживать при помощи стандартных методик и анализов.

Помимо введения пациенту белков антител в настоящей заявке предусмотрено введение антител посредством генной терапии. Применение генной терапии для выработки внутриклеточных антител рассматривается, например, в WO 96/07321. Существуют два основных способа, позволяющих нуклеиновым кислотам (возможно, содержащимся в векторе) проникать в клетки пациента, то есть in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo осуществляют непосредственную инъекцию нуклеиновой кислоты пациенту, обычно в участок, где требуется антитело. Для терапии ex vivo собирают клетки пациента, в выделенные клетки вводят нуклеиновые кислоты и модифицированные клетки либо вводят пациенту непосредственно, либо, например, встраивают в пористую мембрану и имплантируют пациенту (см., например, патенты US 4892538 и US 5283187). Доступно множество методик внедрения нуклеиновых кислот в живые клетки. Эти методики могут варьировать в зависимости от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в культивируемые клетки in vitro или в клетки заданного хозяина in vivo. Методики, подходящие для переноса нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих in vitro, включают использование липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, DEAE-декстран, кальций-фосфатную преципитацию и тому подобное. Вектор, обычно используемый для доставки генов ex vivo, представляет собой ретровирус.

Предпочтительные в настоящее время способы переноса нуклеиновой кислоты in vivo включают трансфекцию с использованием вирусных векторов (таких как аденовирус, вирус простого герпеса I типа или аденоассоциированный вирус) и систем на основе липидов (липидами, подходящими для опосредованного липидами переноса генов, являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Choi).

Также в настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одно антитело против CD79b, описанное в настоящем документе, и/или по меньшей мере один его иммуноконъюгат и/или по меньшей мере один конъюгат антитела против CD79b с лекарственным средством, описанный в настоящем документе. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит: (1) антитело против CD79b и/или его иммуноконъюгат и (2) фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит: (1) антитело против CD79b и/или его иммуноконъюгат и возможно (2) по меньшей мере одну известную терапевтическую композицию, такую как терапевтические композиции, которые можно применять в лечении заболевания, опосредованного CD79b.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против CD79b или конъюгат антитела против CD79b с лекарственным средством, применяемая в настоящем изобретении, может быть приготовлена для хранения в виде лиофилизированной лекарственной формы или водного раствора путем смешивания антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство желаемой чистоты с возможным фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или стабилизатором. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы в используемых дозировках и концентрациях не являются токсичными для реципиента и включают буферы, такие как ацетатный, Трис, фосфатный, цитратный и содержащие другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; хлоргексидин аммоний; бензалкония хлорид; бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт); алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как белок сыворотки, желатин или иммуноглобулин; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрин; хелатирующие агенты, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); регуляторы тоничности, такие как трегалоза и хлорид натрия; сахариды, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN®, PLURONICS® или полиэтиленгликоли (ПЭГ). Фармацевтические композиции, предназначенные для введения in vivo, как правило, стерильны. Это легко достигается посредством фильтрования через стерильный фильтр.

Антитела против CD79b но настоящему изобретению можно применять для лечения экспрессирующих CD79b опухолей у млекопитающего или облегчения одного или более их симптомов. Такие опухоли включают виды рака кроветворной системы или гемобластозы, такие как лимфомы, лейкозы, миелома или лимфоидные злокачественные новообразования, а также виды рака селезенки и лимфатических узлов, но не ограничиваются перечисленным. Опухоли, экспрессирующие CD79b, в частности, включают ассоциированные с В-клетками виды рака, частные примеры которых включают, например, распространенные, промежуточные и медленно прогрессирующие лимфомы (включая В-клеточные лимфомы, например, такие как В-клеточные лимфомы лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, и неходжкинские лимфомы, мантийноклеточную лимфому, лимфому Беркитта, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфому из клеток краевой зоны, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому и лимфому Ходжкина и Т-клеточную лимфому) и лейкозы (включая вторичный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, такой как В-клеточный лейкоз (CD⁵⁺ В-лимфоцитарный), миелоидный лейкоз, такой как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, лимфоидный лейкоз, такой как острый лимфоцитарный лейкоз и миелодисплазия). Рак охватывает любые из вышеупомянутых метастатических видов рака. Антитело способно связываться по меньшей мере с частью опухолевых клеток млекопитающего, экспрессирующих полипептид CD79b. В предпочтительном воплощении антитело эффективно разрушает или уничтожает опухолевые клетки, экспрессирующие CD79b, или подавляет рост таких опухолевых клеток при связывании с полипептидом CD79b на клетке in vitro или in vivo. Такие антитела включают «голые» антитела против CD79b (не связанные с каким-либо агентом). Кроме того, «голые» антитела с цитотоксическими или цитостатическими свойствами могут действовать совместно с цитотоксическими агентами, делая их более эффективными в разрушении опухолевых клеток. Антителу против CD79b можно придать цитотоксичность, например, за счет присоединения к антителу цитотоксического агента с образованием иммуноконъюгата, как описано в настоящем документе.

В настоящем документе также предложены изделия, содержащие вещество, полезное в лечении, предупреждении и/или диагностировании опухоли, экспрессирующей CD79b. Изделие содержит контейнер и этикетку или листовку-вкладыш, размещенную на контейнере или ассоциированную с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и тому подобное. Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения, предупреждения и/или диагностирования опухолевого состояния, и может иметь отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере одно активное вещество в композиции представляет собой антитело против CD79b, предложенное в настоящем документе. На этикетке или листовке-вкладыше указано, что композицию применяют для лечения, предупреждения и/или диагностирования опухоли. Этикетка или листовка-вкладыш дополнительно содержит инструкции для введения композиции антитела пациенту с опухолью, в частности, раком. Кроме того, изделие может содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактерио статическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может также содержать другие материалы, привлекательные с коммерческой и с потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Также предложены наборы, которые можно применять для различных задач, таких как исследования цитотоксичности в отношении клеток, экспрессирующих CD79b, для очистки или иммунопреципитации полипептидов CD79b из клеток. Для выделения и очистки CD79b набор может содержать антитело против CD79b, конъюгированное с гранулами (например, гранулами сефарозы). Могут быть предоставлены содержащие антитела наборы для выявления и количественного определения полипептидов CD79b in vitro, например посредством ELISA или вестерн-блоттинга. Так же, как и изделие, набор содержит контейнер и этикетку или листовку-вкладыш, размещенную на контейнере или ассоциированную с контейнером. Контейнер содержит композицию, содержащую по меньшей мере одно из антител против CD79b по настоящему изобретению. Могут быть включены дополнительные контейнеры, в которых находятся, например, разбавители и буферы, контрольные антитела. Этикетка или листовка-вкладыш могут предоставлять описание композиции, а также инструкции по предполагаемому применению in vitro или в исследовании.

ПРИМЕРЫ

Далее изобретение проиллюстрировано конкретными воплощениями. Следует понимать, что Примеры не предназначены для ограничения объема изобретения. Экспериментальные способы в приведенных ниже Примерах, где не указаны конкретные условия, обычно осуществляют в соответствии со стандартными условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем. Все реакции проводили в атмосфере азота (за исключением реакции гидрирования).

Если не указано иное, все профессиональные и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют обычное значение, известное специалистам в области техники. Кроме того, при осуществлении изобретения можно применять любые способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе. Способы и вещества, описанные в настоящем документе, служат только для иллюстрации.

Аббревиатуры

Аb - антитело

ACN - ацетонитрил

ADC - конъюгат антитело-лекарственное средство

ВОС(Вос) - трет-бутоксикарбонил

DCM - дихлорметан

DIPEA - диизопропилэтиламин

DMF - N,N-диметилформамид

ELISA - иммуноферментный анализ

EtOAc - этилацетат

Экв. (экв.) - эквивалент

г - грамм

HATU - O-(7-азабензотриазол- 1-ил)-N,N,N,N-тетраметилмочевины гексафторфосфат

HOSu - N-гидроксисукцинимид

HIС - хроматография гидрофобных взаимодействий

HPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография

LC-MS - жидкостная хроматография с масс-спектрометрией

mAb - моноклональное антитело

мин - минута

мл - миллилитр

MS - масс-спектрометрия

нм - нанометр

мкл - микролитр

РЕ - етролейный эфир

rt - комнатная температура

Rt - время удерживания

SDS-PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле

SEC - эксклюзионная хроматография

TEA - триэтиламин

TFA - трифторуксусная кислота

THF - тетрагидрофуран

Если не указано иное, все безводные реагенты приобретали непосредственно у поставщика и хранили в атмосфере азота. Все другие приобретенные реагенты и растворители имели высокую степень чистоты и не подвергались дополнительной очистке перед применением.

Спектры ядерного магнитного резонанса записывали на NMR-спектрометре Bruker Avance III 500 М. Единицей химического сдвига (δ) является ррm, а в качестве эталонной системы применяли тетраметилсилан (химический сдвиг равен 0).

В способе жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией данные, полученные при масс-спектрометрии низкого разрешения, записывали с использованием масс-спектрометра Agilent 6110 (кислотный способ) или 6120 В (основный способ), связанного с помощью интерфейса с высокоэффективным жидкостным хроматографом HP Agilent 1200.

Способ 1: Кислотную высокоэффективную жидкостную хроматографию осуществляли с использованием колонки для обращенно-фазовой хроматографии Waters Sunfire C18 (4,60x50 мм, 3,5 мкм) с элюированием градиентом от 5% до 95% фазы В (ацетонитрил, содержащий 0,01% TFA) в фазе А (водная фаза, содержащая 0,01% TFA) за 1,4 мин, при скорости тока 2,0 мл/мин, и температурой колонки 50°С;

Способ 2: Кислотную высокоэффективную жидкостную хроматографию осуществляли с использованием колонки для обращенно-фазовой хроматографии Poroshell 120 ЕС-С18 (4,60x30 мм, 2,7 мкм). Градиент элюирования был от 5% до 95% фазы В (ацетонитрил, содержащий 0,01% TFA) в фазе А (водная фаза, содержащая 0,01% TFA) за 2 мин, при скорости тока 1,5 мл/мин, и температурой колонки 50°С;

Способ 3: Основную высокоэффективную жидкостную хроматографию осуществляли с использованием колонки для обращенно-фазовой хроматографии Waters Xbridge C18 (4,60x50 мм, 3,5 мкм) с элюированием градиентом от 5% до 95% фазы В (ацетонитрил) в фазе А (водная фаза, содержащая 10 мМ бикарбонат аммония) за 1,5 мин, при скорости тока 2,0 мл/мин, и температурой колонки 40°С.

Препаративная хроматография представляла собой высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (prep-RP-HPLC) на инструменте Gilson с использованием колонки для обращенно-фазовой хроматографии Waters Sunfire С18 (250x19 мм, 10 мкм).

Способ 4: Препаративная хроматография кислотным способом. Подвижная фаза: А:водная фаза, содержащая 0,1% TFA; В:ACN. Скорость тока: 20 мл/мин

Способ 5: Препаративная хроматография основным способом. Подвижная фаза: А:водная фаза, содержащая 10 мМ бикарбонат аммония; В:ACN. Скорость тока: 20 мл/мин

Доступные в продаже реагенты, упомянутые в Примерах, использовали в соответствии с инструкциями производителя, если не указано иное. 1. Анализ связывания антитела с антигеном (ELISA)

В Примерах исследовали аффинность антитела против CD79b (включая мышиную сыворотку, супернатант гибридомы или рекомбинантно экспрессированное моноклональное антитело и так далее) к антигену CD79b при помощи иммуноферментного анализа.

Схема эксперимента была следующей: На поверхности 96-луночных планшетов (Corning, кат.номер 9018) иммобилизовали антиген (человеческий CD79b-ECD, novoprotein, СА29) в концентрации 1 мкг/мл в PBS (10 мМ фосфат, 138 мМ NaCl, рН 7,2) по 100 мкл/лунку при 4°С в течение ночи и затем блокировали блокирующим раствором (PBS+1%BSA (бычий сывороточный альбумин) (Sangon, кат.номер А0332)) в количестве 250 мкл/лунку в течение одного-трех часов при 25°С. Планшеты промывали 3 раза промывающим раствором (PBS + 0,05% Tween-20 (Sangon, кат.номер ТВ0560)) и затем инкубировали со 100 мкл антитела против CD79b в серии разведений в блокирующем растворе в дублирующих лунках при 25°С в течение 2 ч. Планшеты промывали 3 раза промывающим раствором и затем инкубировали со 100 мкл вторичного антитела (антитело к Fc-фрагменту IgG мыши, конъюгированное с HRP (пероксидазой хрена), Sigma, кат.номер А00168 или антитело к Р(аb’)2-фрагменту IgG человека, конъюгированное с HRP, Sigma, кат.номер А0293) в разведении 1:10 000 при 25°С в течение 1 ч. Планшеты промывали 3 раза промывающим раствором и затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл ТМВ (Sangon, кат.номер ТВ0954) и инкубировали при 25°С до развития окраски (приблизительно 15 мин). Реакции останавливали добавлением останавливающего раствора (IN H₂SO₄) по 100 мкл/лунку. Через 10 мин определяли OD (оптическую плотность) при 450/630 нм при помощи планшетного анализатора.

2. Выявление связывания антител с CD79b клеточной поверхности посредством FACS

В данном Примере для определения способности антител против CD79b (включая мышиную сыворотку, антитела гибридомы и так далее) связываться с внеклеточным доменом нативного CD79b на поверхности раковых клеток in vitro использовали проточную цитометрию (FACS).

Линии раковых клеток, положительные или отрицательные в отношении экспрессии CD79b, приобретали в DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур) или АТСС (Американская коллекция типовых культур), а количественное определение поверхностного CD79b выполняли с использованием набора для количественного определения мембранных рецепторов клеточной поверхности QIFIKIT (DAKO, K0078). Получили следующие результаты:

Выявление и скрининг иммунизированных мышей и супернатантов гибридом осуществляли с использованием клеточной линии SU-DHL-4. В частности, клетки SU-DHL-4 собирали в логарифмической фазе роста, промывали PBS и затем вносили в пробирки типа эппендорф объемом 1,5 мл приблизительно по 100000 клеток на пробирку. Добавляли разведенную мышиную сыворотку или супернатант гибридомы по 100 мкл/пробирку и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. После двукратного промывания PBS-2% BSA добавляли конъюгированное с Alexa Fluor 488 козье антитело к иммуноглобулинам мыши IgG (H+L) (Molecular probes, кат.номер А11001), разведенное 1:400 в PBS-2% BSA, по 100 мкл/пробирку и затем инкубировали раствор при 4°С в течение 45 минут в темноте. Клетки дважды промывали PBS-2% BSA, и затем ресуспендировали в 500 мкл PBS-2% BSA и анализировали на проточном питометре Guava (Millipore, 8НТ). Силу связывания антитела с рецептором клеточной поверхности CD79b определяли по интенсивности флуоресценции (значение MFI).

3. Получение конъюгатов с лекарственным средством

Для проверки эффективности антитела против CD79b конъюгировали антитела с различными низкомолекулярными лекарственными средствами с использованием различных линкеров для получения конъюгатов с лекарственными средствами, и конкретно способ конъюгирования был следующим:

Трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (ТСЕР, 10 экв., исходный раствор с концентрацией 10 мМ) добавляли к раствору антитела (20 мМ буферный раствор однозамещенного фосфата натрия - двузамещенного фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2). Реакционный раствор инкубировали в течение 2 ч при 37°С на термостатируемой водяной бане. Охлаждали реакционный раствор приблизительно до комнатной температуры и заменяли посредством ультрафильтрации (Millipore Amicon® Ultra, 50000 MWCO) или гель-фильтрации на буфер (100 мМ однозамещенный фосфат калия - двузамещенный фосфат калия, 100 мМ хлорид натрия, 1 мМ этилентриаминпентауксусная кислота, рН 7,0-8,0) или буфер (20 мМ лимонная кислота-трехзамещенный цитрат натрия, 50 мМ хлорид натрия, 1 мМ диэтилентриаминпентауксусная кислота, рН 6,0). Добавляли диметилсульфоксид и соответствующее соединение линкер-лекарственное средство (исходный раствор диметилсульфоксида, 3-10 эквивалентов по отношению к антителу) и доводили объем диметилсульфоксида в реакционном растворе приблизительно до 10-15%. Реакцию присоединения проводили при 10°С в течение 0,5 ч.

К реакционному раствору добавляли избыточное количество раствора цистеина, чтобы погасить непрореагировавшее соединение линкер-лекарственное средство, и проводили реакцию гашения при 10°С в течение 30 минут.Сначала реакционный раствор подвергали ультрафильтрации (Millipore Amicon® Ultra, 50000 MWCO) или гель-фильтрации для удаления аддукта линкер-лекарственное средство-цистеин и избытка цистеина, а затем осуществляли замену буфера в образце на буфер для хранения (20 мМ буфер однозамещенный фосфат натрия - двузамещенный фосфат натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2), который затем стерилизовали посредством фильтрования через фильтрующее устройство с размером пор 0,22 мкм (Millex-GV Filter) с получением ADC антитела против CD79b, хранение осуществляли при 4°С.

Антитела, конъюгаты которых с лекарственными средствами получены вышеуказанными способами, включают крысиное антитело НВ58 против иммуноглобулина мыши (АТСС® НВ-58ТМ), химерное человеческое-мышиное антитело против CD79b и различные гуманизированные варианты, включая другие контрольные антитела, упомянутые в настоящем документе.

4. Анализ со вторичным ADC для выявления ингибирующего эффекта супернатанта гибридомы на пролиферацию клеток лимфомы BJAB

Если антитела имеются в небольшом количестве или трудно очищаются, их количества недостаточно для выполнения эксперимента по присоединению линкера и низкомолекулярного токсина. В таких случаях антитело сначала связывают с антителом, которое конъюгировано с линкером и низкомолекулярным токсином, а затем инкубируют вместе с опухолевыми клетками, и связавшийся с ними конъюгат антитело-лекарственное средство переносится в клетки в результате эндоцитоза целевого антитела и уничтожает раковые клетки. Эндоцитозные свойства таких опосредовано активированных антител и ингибирующий эффект на пролиферацию раковые клеток относятся к экспериментам со вторичными ADC.

Для проведения эксперимента со вторичными ADC приобретали линию клеток НВ58 (АТСС® НВ-58™) из АТСС.Линия клеток представляла собой клетки гибридомы, полученные путем слияния В-клеток крысы с клетками миеломы P3X63Ag8.653. Секретируемое антитело может специфически связываться с мышиными антителами. Антитело НВ58 получали в достаточном количестве путем очищения среды, в которой культивировали клетки линии НВ58. Получали конъюгат антитело-лекарственное средство HB58-ADC.

Клетки лимфомы человека BJAB инокулировали в 96-луночные планшеты для клеточных культур (BD falcon, кат.номер 353072) по 1×10⁵ клеток/100 мкл/лунку, и среда представляла собой модифицированную АТСС среду RPMI1640 (Gibco, кат.номер А10491) +10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Gibco, кат.номер 10099141). Инкубировали одни сутки в инкубаторе (SANYO, MC0018AIC) при 37°С и в следующие сутки добавляли супернатант гибридомы, содержащий антитело против CD79b, предварительно смешанный с HB58-ADC при соотношении концентраций 1:1, а также соответствующий контроль, по 100 мкл/лунку, с трехкратным разведением, всего было 9 лунок с градиентом концентраций+1 контрольная лунка. Инкубировали в течение 3 суток в инкубаторе при 37°С. В пятые сутки использовали набор для подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, CK04) для развития окраски. Пролиферацию клеток измеряли по согласно инструкциям набора. Для расчета IC₅₀ и степени ингибирования определяли поглощение при 450/630 нм при помощи микропланшетного анализатора (BioTek Synergy MX).

5. Определение аффинности антитела методом поверхностного плазменного резонанса

В данных Примерах для выявления способности антител против CD79b (включая химерные человеческие-мышиные антитела и гуманизированные антитела и так далее) связываться с рекомбинантным внеклеточным доменом белка CD79b in vitro использовали поверхностный плазмонный резонанс (SPR).

Анализ выполняли на инструменте Biacore Т200 (GE), тестируемое антитело разводили до 10 мкг/мл буфером HBS-EP (GE, BR100826) согласно инструкциям к набору для связывания по аминогруппам Amine-Coupling Kit (GE, BR-1000-50). Тестируемое антитело иммобилизовали на чипе СМ5 (GE, BR-1006-68) в течение времени фиксирования 300 сек и скорости тока 10 мкл/мин. Осуществляли реакцию захвата внеклеточного домена рекомбинантного белка CD79b, разведенного в градиенте буфера HBS в различных концентрациях (0,25 нМ, 0,5 нМ, 1 нМ, 2 нМ, 4 нМ, 8 (х2) нМ, 16 нМ), с использованием программы Kinetics, устанавливая время связывания антигена с антителом 300 секунд, время диссоциации 900 секунд, скорость тока антигенного белка 30 мкл/мин. Кривые диссоциации аппроксимировали для расчета значений KD различных антител. Все вышеуказанные эксперименты проводили при 25°С.

Пример 1. Создание и скрининг линий клеток, продуцирующих мышиное моноклональное антитело против CD79b человека

Линии клеток мышиного происхождения, продуцирующих моноклональное антитело против человеческого CD79b, получали путем иммунизации мышей, слияния клеток селезенки и скрининга гибридом, что выполнялось в Nanjing Jinsui Biotechnology Co., Ltd. Антиген, используемый для иммунизации, представлял собой внеклеточный домен рекомбинантного белка CD79b человека (Shanghai Novoprotein, Ltd., название продукта человеческий рекомбинантный CD79B, лот № СА29, аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 35), а для иммунизации отбирали четыре разновидности мышей (Balb/C, С3Н, SJL, C57BL/6, соответственно), по шесть для каждой разновидности. Иммунологический адъювант представляет собой стандартный адъювант Фрейнда, а доза при первоначальной иммунизации составляет 50 мкг антигена на мышь. Бустерную иммунизацию проводили с интервалом две недели с уменьшением дозы до 25 мкг.Начиная с первой бустерной иммунизации, собирали сыворотку мышей через 7 дней после каждой бустерной иммунизации. Титр определяли методом ELISA (способ описан в первом пункте раздела «Материалы и методы»). Сыворотку мышей, собранную через 7 дней после второй бустерной иммунизации (см. второй пункт раздела «Материалы и методы»), исследовали методом FACS, чтобы установить, способна ли она связывать CD79b на поверхности клеток линии SU-DHL4, положительных в отношении экспрессии CD79b. Титр связывания определяли одновременно для всех мышей.

После двух бустерных иммунизаций отбирали мышей с наиболее высокими титрами по результатам ELISA и FACS для слияния клеток (посредством электрослияния), и эффективность слияния составляла приблизительно 3000 В-клеток селезенки, слитых с одной клеткой гибридомы. Все слитые клетки высаживали в 96-луночные планшеты, по 40 планшетов на слияние. Через одну неделю выполняли ELISA (способ описан в пункте 1 раздела «Материалы и методы»). Супернатант клонов, положительных в отношении результатам ELISA, отбирали для выявления методом FACS (способ описан в пункте 2 раздела «Материалы и методы»). Проводили субклонирование всех клонов, положительных в отношении результатам выявления методом FACS. После одного субклонирования отбирали супернатант из лунок с моноклонами для выявления вторичного ADC (см. пункт 3 раздела «Материалы и методы»). Клоны, которые в анализе вторичного ADC были способны подавлять пролиферацию опухолевых клеток BJAB, положительных в отношении экспрессии CD79b, подвергали непрерывному субклонированию до образования стабильной моноклональной линии клеток.

В данном Примере осуществляли три эффективных слияния. Всего после скрининга получали 31 клон, положительный по результатам FACS. Наконец, для окончательного субклонирования отбирали 18 штаммов, с наилучшим ингибирующим эффектом на пролиферацию (см. Таблицу 1 ниже).

Пример 2. Секвенирование антитела против CD79b из гибридомы и конструирование рекомбинантного химерного антитела

Секвенирование гибридом осуществляли для 18 моноклональных клеточных линий, приведенных в Таблице 1 Примера 1, и затем рекомбинантно экспрессировали химерные антитела с константной областью человеческого IgG1 и исследовали их активность. В данном Примере гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела амплифицировали посредством PCR с обратной транскрипцией, лигировали в вектор и секвенировали последовательности легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела. Конкретно, сначала выделяли общую РНК каждого моноклонального клеточного штамма с использованием набора для выделения РНК (Qiagen, кат.номер 74104). Затем получали одноцепочечную кДНК посредством обратной транскрипции с использованием олиго-dT праймеров для кДНК и набора для синтеза кДНК (mvitrogen, кат.номер 18080-051). Используя ее в качестве матрицы, синтезировали последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей посредством PCR и клонировали продукт PCR в ТА вектор pMD-18T и затем секвенировали.

Путем анализа последовательностей CDR областей тяжелой и легкой цепей, исключали антитела с сайтами возможной посттрансляционной модификации. Наконец, для рекомбинантной экспрессии антитела отбирали шесть клонов (35В5, 78В6, 85G11, 88В12, 104А2 и 104Е1). Прежде всего, осуществляли оптимизацию кодонов последовательностей легкой и тяжелой цепей антитела для синтеза целых генов. Затем добавляли рестрикционные сайты Hindlll/Nhel на оба конца тяжелой цепи и добавляли рестрикционные сайты Hindlll/BsiWI на оба конца легкой цепи. Гены вариабельных областей тяжелой/легкой цепи лигировали в экспрессирующий вектор РТТ5, содержащий последовательность константной области человеческого IgGl или последовательность константной области К-цепи через эти две пары рестрикционных сайтов для конструирования экспрессирующих векторов для химерных антител. Рекомбинантные антитела экспрессировали посредством транзиторной экспрессии в клетках 293F.

Пример 3. Анализы цитотоксичности конъюгатов антитела против CD79b с лекарственным средством

Шесть рекомбинантных химерных антител (35В5, 78В6, 85G11, 88В12, 104А2 и 104Е1) конъюгировали с BMP-vcMMAE (линкер-лекарственное средство 1) по отдельности для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC). Исследование ингибирования пролиферации проводили на семи линиях клеток лимфомы, положительных в отношении экспрессии CD79b BJAB, Ramos, DoHH2, SU-DHL-4, U-698-M, Granta-519, WSU-DLCL2, и двух линиях клеток лимфомы, отрицательных в отношении экспрессии CD79b (Raji и Jurkat). Условия культивирования раковых клеток были все те же (см. часть 3 раздела «Материалы и методы»). Плотность посева клеток и изначальная концентрация ADC для различных раковых клеточных линий показаны в Таблице 2 ниже.

Результаты исследования ингибирующего эффекта шести ADC на пролиферацию различных опухолевых клеточных линий показаны в Таблице 3.

Пример 4. Гуманизация антитела против CD79b

Конъюгаты рекомбинантного химерного антитела, экспрессируемого 104Е1, с лекарственным средством способны ингибировать пролиферацию клеток лимфомы Granta-519 и WSU-DLCL2 с относительно низкими уровнями экспрессии CD79b существенно лучше, чем другие пять антител. Таким образом, для иммунизации выбирали 104Е1.

Информация о последовательности антитела 104Е1 (по системе Kabat) представлена ниже:

mVH:

mVL:

(SEQ ID NO: 8, нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 39)

Гуманизация последовательности 104Е1 была поручена Nanjing GenScript Biotech Corp.Конкретная процедура заключалась в следующем: вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела против CD79b 104Е1 сравнивали с базой данных человеческих последовательностей зародышевого типа и обнаружили человеческую последовательность зародышевого типа IGHV1-69*02 с наибольшей гомологией с вариабельной областью тяжелой цепи 104Е1, гомология составляла 64,3%. Также обнаружили человеческую последовательность зародышевого типа IGKV2-30*02 с наибольшей гомологией с вариабельной областью легкой цепи 104Е1, гомология составляла 79,0%. Затем антитело AGC78785.1 (вариабельная область тяжелой цепи, SEQ ID NO: 9) и ВАС01734.1 (вариабельная область легкой цепи, SEQ ID N0:10), созданное из этих двух последовательностей зародышевого типа, нашли в библиотеке человеческих антител, и информация о последовательности этого антитела приведена ниже:

AGC78785.1 вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина [Homo sapiens]

ВАС01734.1 вариабельная область легкой каппа-цепи иммуноглобулина [Homo sapiens]

Используя FR области этих двух антител человеческого происхождения в качестве каркаса, произвели замену CDR областей соответствующими последовательностями CDR областей мышиного 104Е1 для создания гуманизированных антител с пересаженными CDR, и последовательности приведены ниже:

VH с пересаженными HCDR:

VL с пересаженными LCDR:

(SEQ ID NO: 12).

Для нахождения аминокислотных сайтов в FR областях мышиного происхождения, играющих важную роль в аффинности антитела, в базе данных PDC проводили поиск кристаллической структуры, со схожей гомологией с мышиным антителом 104Е1. В результате была найдена кристаллическая структура scFv антитела АЬ735 к полисиаловой кислоте, обладающего гомологией 77% с последовательностью антитела 104Е1 и имеющая достаточно высокое разрешение. Используя эту кристаллическую структуру в качестве матрицы, производили выравнивание двух последовательностей для построения модели антитела 104Е1 на основе гомологии с scFv 3WBD. На основании этой модели, построенной на основе гомологии, идентифицировали аминокислотные сайты, окруженные CDR доменом или находящиеся в пределах 5А от CDR доменов в FR домене последовательности 104Е1. Затем эти сайты, которые могут играть важную роль в аффинности антитела, подвергали обратным мутациям в последовательностях с пересаженными CDR (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12), избегая сайтов гликозилирования, дезамидирования и окисления и так далее. Всего в вариабельной области тяжелой цепи выявили 15 сайтов, которые было необходимо подвергнуть обратным мутациям, включая А24Т, RV67KA, S84R, Т98K, K12А, S16A, V20L, А24Т, R38K, M48I, V68A, I70L, Y95F, Т98K и V113L; всего в вариабельной области легкой цепи выявили 7 сайтов, которые было необходимо подвергнуть обратным мутациям, включая V3L, F41Y, RR50KL, FQ41YL, R51L, V88L и V109L. Затем конструировали библиотеки Fab согласно стандартному протоколу Genscript и проводили скрининг с использованием платформы фагового дисплея. После гуманизации проводили скрининг последовательностей с аффинностью не меньшей, чем у мышиного антитела 104Е1 и секвенировали для подтверждения последовательностей.

После гуманизации вариабельные области легкой и тяжелой цепи были следующими:

1. Вариабельная область тяжелой цепи

AS11161:

ASH 164:

AS11252:

AS11254:

AS11259:

2. Вариабельная область легкой цепи AS11161:

(SEQ ID NO: 18); ASH 164:

AS11252:

AS11254:

AS11259:

Легкие тяжелые цепи после гуманизации и Fc-сегмент IgG1 рекомбинировали для получения гуманизированного моноклонального антитела против CD79b, описанного в настоящем документе. Использованные последовательности Fc были следующими:

Константная область тяжелой цепи:

Константная область легкой цепи:

Вышеуказанные антитела клонировали, экспрессировали и очищали способами клонирования генов и рекомбинантной экспрессии и определяли аффинность антитела при помощи Biacore (выполнялось в Genscript). Наконец, отбирали гуманизированные антитела AS 11161, AS 11164, AS 11252, AS 11254 и AS 11259 с наилучшими активностями. Последовательности были следующими:

Гуманизированное антитело AS 11161

Тяжелая цепь

Легкая цепь

Гуманизированное антитело AS11164 Тяжелая цепь

Легкая цепь

Гуманизированное антитело AS 11252 Тяжелая цепь

Легкая цепь

Гуманизированное антитело AS 11254 Тяжелая цепь

Легкая цепь

Гуманизированное антитело AS 11259 Тяжелая цепь

Легкая цепь

Аффинность антитела после гуманизации исследовали способом, описанным в 4 части раздела «Материалы и методы». Результаты приведены в Таблице 4 ниже и на Фиг. 1.

Результаты продемонстрировали, что значение KD связывания гуманизированного антитела по изобретению с антигеном CD79b in vitro составляло приблизительно 0,02 нМ (при исследовании на Biacore, GeneScript), что сопоставимо с химерным человеческим-мышиным антителом, гуманизация не приводила к большому изменению аффинности антитела.

Пример 5. Исследование связывающей активности гуманизированного антитела против CD79b с внеклеточным доменом человеческого CD79b in vitro и ингибирующий эффект его конъюгата с лекарственным средством на пролиферацию клеток лимфомы

Связывающую активность гуманизированного антитела против CD79b с внеклеточным доменом человеческого CD79b in vitro исследовали посредством ELISA, как описано в части 1 раздела «Материалы и методы». Результаты приведены в Таблице 5.

Получали конъюгаты антитело-лекарственное средство для гуманизированного антитела, и соответствующий ингибирующий эффект на пролиферацию раковых клеток лимфомы in vitro (способ описан в Примере 3) показан в Таблице 6.

Пример 6. Исследование биофизической стабильности гуманизированных антител против CD79b

Чтобы оценить стабильность антител, пять гуманизированных антител хранили вплоть до 26 суток в различных буферах с рН 4,5, 6,0 или 7,4 при 40°С. Анализировали свойства указанных образцов после хранения в течение 1, 6, 12 и 26 суток в указанных стрессовых условиях, и образца, находившегося при 4°С, в качестве контроля. Анализ аликвот осуществляли посредством ELISA и SEC-HPLC (TOSOH, TSKgel, G3000SWXL).

Результаты продемонстрировали, что у пяти гуманизированных антител, находившихся при 40°С в течение 26 суток при трех различных значениях рН, не было существенного отличия активности, определенной посредством ELISA. Уровни чистоты превышали 98% во всех случаях при определении методом SEC. Агрегатов по существу не наблюдалось.

Пример 7. Оценка эффективности конъюгатов гуманизированных антител против CD79b с лекарственным средством in vivo в отношении опухолей, представляющих собой лимфому, у мышей

Для проверки эффективности гуманизированного антитела против CD79b выбирали вариант AS 11259 и получали конъюгаты с лекарственным средством AS11259-ADC согласно способу, описанному в части 3 раздела «Материалы и методы», затем исследовали способность ADC вызывать регрессию опухолей на различных моделях с ксенотрансплантатами, включая Ramos, DoHH2, Granta519 и WSU-DLCL2.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 1:

Конструкцию линкер-лекарственное средство 1 получали, как описано в WO 2014114207.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 2

Конструкцию линкер-лекарственное средство 2 получали, как описано в WO 2014114207.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 3

N-трет-бутоксикарбонилэтилендиамин (710 мг, 4,43 ммоль) и диизопропилэтиламин (1,55 мл, 8,86 ммоль) растворяли в дихлорметане (10 мл) и затем по каплям добавляли хлорацетилхлорид (500 мг, 4,43 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, а затем разводили в метиленхлориде и последовательно промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония, насыщенным водным раствором гидрокарбоната аммония, водой и насыщенным солевым раствором. Органическую фазу сушили с помощью безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 11 в виде белого твердого вещества.

Полученное неочищенное соединение 11 растворяли в ацетоне (10 мл) и затем добавляли иодид натрия (3,32 г, 22,2 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при 50°С в течение 16 часов, а затем разводили в дихлорметане и промывали водой и насыщенным солевым раствором. Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт очищали посредством хроматографии на силикагелевой колонке (петролейный эфир/этил ацетат 1:1) с получением соединения 12 (400 мг) в виде белого твердого вещества. (LC-MS (Способ 1): время удерживания 1,61 мин; [M+Na]⁺ 351,0.

Соединение DM1 (40 мг, 0,054 ммоль) и соединение 12 (35,4 мг, 0,108 ммоль) растворяли в N,N-диметилформамиде (2 мл) и затем добавляли диизопропилэтиламин (29 мкл, 0,163 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 4: 50%-80% В в течение 8 мин до 95% В в течение 4 мин) с получением соединения 13 (40 мг) в виде белого твердого вещества.

Соединение 13 (40 мг, 0,043 ммоль) растворяли в дихлорметане (3 мл) и затем добавляли трифторуксусную кислоту (97 мг, 0,852 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт и соединение 14 (18,7 мг, 0,0639 ммоль) растворяли в>1,М-диметилформамиде (2 мл) и затем последовательно добавляли HATU (32,4 мг, 0,0852 ммоль) и диизопропилэтиламин (74 мкл, 0,426 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 4: 50% - 80% В в течение 8 мин до 95% В в течение 4 мин) с получением конструкции линкер-лекарственное средство 3 (8,3 мг) в виде белого твердого вещества. LCMS (А018): время удерживания 1,92 мин; [M+Na]⁺ 1134,3.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 4

Схема синтеза:

Соединение 15 (0,25 г, 0,305 ммоль, полученное, как описано в WO 2014114207), соединение 16 (0,20 г, 0,208 ммоль, полученное, как описано в WO 2016192527) и HOBt (28,1 мг, 0,208 ммоль) растворяли в N,N-диметилформамиде (4 мл) и затем добавляли пиридин (1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, а затем очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 5: 50% - 80% В в течение 8 мин до 95% В в течение 4 мин) с получением конструкции линкер-лекарственное средство 4 (45 мг) в виде бледно-розового твердого вещества. LCMS (Способ 3): время удерживания 2,127 мин; 1/2 [М+2Н]²⁺ 822,0.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 5

Схема синтеза:

Соединение 15 (14 мг, 0,017 ммоль), соединение 17 (14 мг, 0,014 ммоль, полученное, как описано в WO 2016192527) и HOBt (3 мг, 0,017 ммоль) растворяли в М,>1-диметилформамиде (2 мл) и затем добавляли пиридин (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, а затем очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 5: 45% - 75% В в течение 8 мин до 95% В в течение 4 мин) с получением конструкции линкер-лекарственное средство 5 (1,8 мг) в виде красного твердого вещества. LCMS (Способ 2): время удерживания 1,40 мин; 1/2 [М+2Н]²⁺ 843,9.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 6

Схема синтеза:

Соединение 15 (14 мг, 0,017 ммоль), соединение 18 (14 мг, 0,013 ммоль, полученное, как описано в WO 2016192527) и HOBt (3 мг, 0,017 ммоль) растворяли в N,N-диметилформамиде (2 мл) и затем добавляли пиридин (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, а затем очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 5: 45% - 75% В в течение 8 мин, затем 95% В в течение 4 мин) с получением конструкции линкер-лекарственное средство 6 (2,0 мг) в виде красного твердого вещества. LCMS (Способ 2): время удерживания 1,40 мин; 1/2 [М+2Н]²⁺ 865,3.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 7

Схема синтеза:

Соединение 15 (10 мг, 0,012 ммоль) и соединение 19 (8 мг, 0,024 ммоль, полученное, как описано в WO 2013/149948 A1) растворяли в смеси N,N-диметилформамида (1 мл) и пиридина (0,2 мл) и затем добавляли HOBt (3,2 мг, 0,024 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 4: 60% - 90% В в течение 8 мин, затем 95% В в течение 4 мин) с получением соединения 20 (6,0 мг) в виде белого твердого вещества. LC-MS (Способ 3): время удерживания 2,24 мин; [M+Na]⁺ 1028,3.

Соединение 20 (6,0 мг, 0,006 ммоль) растворяли в дихлорметане (1 мл) и затем добавляли дихлоруксусную кислоту (15 мг, 0,12 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и затем концентрировали для удаления растворителя. Остаток промывали н-гексаном/эфиром (1 мл/мл), фильтровали и высушивали с получением соединения 21 (4,5 мг) в виде белого твердого вещества. LC-MS (Способ 3): время удерживания 1,57 мин; [М+Н]⁺ 768,3.

Соединение 21 (4,5 мг, 0,005 ммоль) и соединение 22 (5 мг, 0,008 ммоль, полученное, как описано в US 8389697 В2) растворяли в N,N-диметилформамиде (1 мл) и затем добавляли диизопропилэтиламин (2,6 мл, 0,02 ммоль) и HATU (3,8 мг, 0,01 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 5: 50% - 80% В в течение 8 мин, затем до 95% В в течение 4 мин) с получением конструкции линкер-лекарственное средство 7 (0,9 мг) в виде красного твердого вещества. LCMS (Способ 3): время удерживания 2,05 мин; [М+Н]⁺ 1378,3.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 8

Схема синтеза:

Соединение 15 (100 мг, 0,122 ммоль), соединение 23 (60 мг, 0,071 ммоль, полученное, как описано в WO 2016192527) и HOBt (10 мг, 0,071 ммоль) растворяли в сухом DMF (2 мл) и затем добавляли пиридин (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, а затем очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 5: 50% - 80% В в течение 8 мин, затем до 95% В в течение 4 мин) с получением соединения 24 (30 мг) в виде белого твердого вещества. LCMS (Способ 3): время удерживания 2,41 мин; 1/2 [М+2Н]²⁺ 762,0.

Соединение 24 (30 мг, 0,0197 ммоль) растворяли в дихлорметане (1,5 мл) и затем добавляли трифторуксусную кислоту (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и затем концентрировали для удаления растворителя. Остаток очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ X) с получением соединения 25 (15 мг) в виде белого порошкообразного твердого вещества.

Соединение 25 (15 мг, 0,0197 ммоль) и соединение 26 (7 мг, 0,0189 ммоль, полученное, как описано в Journal of Organic Chemistry, 2001, 66, 4494-4503) растворяли в осушенном DMF (0.4 мл) и затем добавляли HATU (7,2 мг, 0,0189 ммоль) и DIPEA (3,7 мг, 0,0286 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 5: 50% - 80% В в течение 8 мин до 95% В в течение 4 мин) с получением конструкции линкер-лекарственное средство 8 (4,8 мг) в виде белого порошкообразного твердого вещества. LCMS (Способ 2): время удерживания 1,37 мин; 1/2 [М+2Н]²⁺ 909,5.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 9

Схема синтеза:

Соединение 27 (165 мг, 0,132 ммоль, полученное, как описано в WO 2007011968) и соединение 28 (90 мг, 0,231 ммоль, полученное, как описано в WO 2014114207) растворяли в DMF (2 мл) и затем добавляли DIPEA (51 мг, 0,395 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 0,5 ч и затем гасили путем добавления ледяной уксусной кислоты (50 мкл). Смесь очищали посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Способ 4: 50% - 80% В в течение 8 мин, затем до 95% В в течение 4 мин) с получением конструкции линкер-лекарственное средство 9 (128 мг) в виде белого порошкообразного твердого вещества. LCMS (Способ 2): время удерживания 1,51 мин; 1/2 [М+2Н]²⁺ 702,8.

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 10

Синтез конструкции линкер-лекарственное средство 10 осуществляли, как описано в CN 201710691056.Х.

Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство

Трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (ТСЕР, 10 экв., исходный раствор с концентрацией 10 мМ) добавляли к раствору антитела AS11259 (IgG1) (20 мМ буфер однозамещенный фосфат натрия - двузамещенный фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,2). Реакционный раствор инкубировали в течение 2 ч при 37°С на термостатируемой водяной бане. Охлаждали реакционный раствор приблизительно до комнатной температуры и затем осуществляли замену буфера посредством ультрафильтрации (Merck Millipore Amicon® Ultra, 50000 MWCO) или гель-фильтрации на буфер (100 мМ однозамещенный фосфат калия - двузамещенный фосфат калия, 100 мМ хлорид натрия, 1 мМ диэтилентриаминпентауксусная кислота, рН 7,0-8,0) или буфер (20 мМ лимонная кислота-трехзамещенный цитрат натрия, 50 мМ хлорид натрия, 1 мМ диэтилентриаминпентауксусная кислота, рН 6,0), в который добавляли диметилсульфоксид и конструкцию линкер-лекарственное средство 1, полученную, как описано в Примере 1 (исходный раствор диметилсульфоксида, 3-10 эквивалентов относительно антитела), чтобы объем диметилсульфоксида в реакционном растворе составлял приблизительно 10-15%. Реакцию конъюгирования проводили при 10°С в течение 0,5 ч.

К вышеуказанному раствору для конъюгирования добавляли избыточное количество раствора цистеина, чтобы погасить непрореагировавшую конструкцию линкер-лекарственное средство 1, и проводили реакцию гашения при 10°С в течение 30 минут.Сначала реакционный раствор подвергали ультрафильтрации (Millipore Amicon® Ultra, 50000 MWCO) или гель-фильтрации для удаления аддукта линкер-лекарственное средство 1-цистеин и избытка цистеина, а затем осуществляли замену буфера в образце на буфер для хранения (20 мМ буфер однозамещенный фосфат натрия - двузамещенный фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,2). Полученный раствор стерилизовали фильтрованием через фильтр с размером пор 0,22 мкм (Merck Millex-GV Filter) с получением конъюгата антитело-лекарственное средство AS11259-ADC-001, который хранили при 4°С.

Другие конъюгаты антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, AS11259-ADC-002 - AS11259-ADC-011, получали согласно описанной выше процедуре получения, с использованием конструкций линкер-лекарственное средство 2-10 вместо конструкции линкер-лекарственное средство 1, соответственно. Конъюгат антитело-лекарственное средство AS11259-ADC-0012 получали путем конъюгирования антитела AS 11259 с конструкцией линкер-лекарственное средство 1, где антитело частично восстанавливали, в среднем восстанавливая две пары дисульфидных связей.

В Таблице 6 обобщены данные по конъюгатам антитело-лекарственное средство, полученным в настоящем изобретении.

*: Количество эквивалентов ТСЕР относительно антитела равно 3.

Характеризация конъюгатов антитело-лекарственное средство

1) Определение среднего значения DAR (соотношение лекарственного средства и антитела)

Среднее значение DAR рассчитывали с использованием хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), см. Anal. Chem. 2013, 85, 1699 1704). Хроматографию гидрофобного взаимодействия осуществляли с использованием Agilent 1100 (Agilent 1100). Неподвижная фаза представляла собой колонку TSKgel бутил-NPR (4,6x35 мм, 2,5 мкм, Tosoh (Shanghai) Biotech Co., Ltd.). Элюирующий градиент представлял собой линейный градиент от 100% буфера А [50 мМ фосфат калия (рН 7,0) +1,5 М сульфат аммония] до 100% буфера В [80% об./об. 50 мМ фосфат калия (рН) 7,0) +20% об./об. изопропанол] в течение 25 минут.Скорость тока составляла 0,8 мл/мин, устанавливали температуру колонки 30°С и осуществляли выявление при длине волны 230 нм и 280 нм.

Результаты определения средних значений DAR конъюгатов антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению показаны в Таблице 7.

Исследование аффинности конъюгатов антитело-лекарственное средство в отношении антигена

Для определения аффинности связывания антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство с соответствующим антигеном применяли способ непрямого ELISA: антиген CD79b лигировали с твердофазным носителем (96-луночный планшет для ELISA) с образованием антигена на твердой фазе, а затем несвязанный антиген отмывали и удаляли; добавляли в градиентном разведении конъюгат антитело-лекарственное средство, полученного по настоящему изобретению, или его соответствующее антитело, при этом специфическое антитело связывалось с антигеном с образованием комплекса антиген-антитело на твердой фазе, а антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство, которые не связались с антигеном на твердой фазе, удаляли путем промывания. Добавляли вторичное антитело для ELISA для связывания с антителом или ADC, связанным с антигеном на твердой фазе, и удаляли несвязавшееся вторичное антитело путем промывания. Добавляли раствор субстрата, а затем измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм/630 нм при помощи микропланшетного анализатора Т, на основе этого строили кривую и рассчитывали ЕС₅₀.

Результаты определения аффинности конъюгатов антитело-лекарственное средство, полученных в настоящем изобретении для антигена CD79b, показаны в Таблице 8.

Как можно видеть в Таблице 8, аффинность конъюгатов антитело-лекарственное средство, полученных в настоящем изобретении, в отношении антигена существенно не отличается от «голого» антитела AS 11259.

Ингибирование клеточной пролиферации конъюгатами антитело-лекарственное средство

Цитостатическую активность антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство определяли следующим способом: клетки млекопитающих, экспрессирующие опухолеассоциированный антиген или белок-рецептор (в данном исследовании использовали клетки Ramos, экспрессирующие антиген CD79b) инокулировали в 96-луночные планшет, в каждую лунку помещали 40000 клеток, суспендированных в 100 мкл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS (GIBCO); исходная концентрация образца ADC составляла 2 мкг/мл, и выполняли 3-кратное серийное разведение в среде RPMI 1640, содержащей 2% FBS (GIBCO); в исходную среду также добавляли по 100 мкл образца ADC в градиентном разведении в каждую лунку, и исходная концентрация лекарственного средства составляла 1 мкг/мл; инкубирование продолжали при 37°С и 5% СО₂ в течение 72 часов; 50 мкл исходной среды удаляли и затем в каждую лунку добавляли 70 мкл раствора для развития окраски ССК-8 (ССК-8:RPMI 1640 равно 2:5), после чего осуществляли дальнейшее культивирование в течение 60-75 минут; определяли оптическую плотность при 450 нм/630 нм с использованием считывающего устройства для ELISA, на основании этого строили кривую и рассчитывали IC₅₀. Результаты ингибирования клеточной пролиферации конъюгатами антитело-лекарственное средство, полученными в настоящем изобретении, показаны в Таблице 9.

Результаты показали, что все конъюгаты антитело-лекарственное средство, полученные в настоящем изобретении, имели хороший эффект ингибирования пролиферации клеток.

Модель Ramos

Клетки Ramos культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С в 5% CO₂. Клетки подсчитывали и собирали в фазе логарифмического роста, ресуспендировали в PBS и Matrigel 1:1 и инокулировали подкожно в правый бок мышам (самки мышей CB17/SCID, возраст 8-9 недель, средняя масса тела 18,4 г, приобретенные в Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd., номер сертификата животных: 2013001832088; условия содержания: уровень SPF (свободный от специфических патогенов)). Объем клеток, инокулированных каждой мыши, составлял 0,1 мл, а количество инокулированных клеток составляло 1 × 10⁷ на мышь. Когда средний объем опухоли достигал 197 мм³, измеряли массу тела и мышей разбивали на группы случайным образом, после чего инициировали введение. Введение осуществляли через хвостовую вену, частота введения составляла только один раз.

Стандарт оценки результатов

Относительная скорость ингибирования опухоли TGI (%): TGI=1-Т/С (%). Т/С % представляет собой относительную скорость ингибирования опухоли, то есть процентное отношение относительного объема опухоли или массы опухоли в группе, получавшей лечение, к контрольной группе в определенный момент времени. Т и С представляют собой относительные объемы опухолей (RTV) в группе, получавшей лечение, и контрольной группе в определенный момент времени, соответственно.

Формула выглядит следующим образом: Т/С %=T_RTV/C_RTV*100% (T_RTV: средний RTV в группе, получавшей лечение; C_RTV: средний RTV в контрольной группе, получавшей носитель; RTV=V_t/V₀, V₀ представляет собой объем опухоли животного на момент разделения на группы, V_t представляет собой объем опухоли животного после лечения).

Формула для расчета объема опухоли выглядит следующим образом: длинный диаметр × короткий диаметр²_/2. Сутки инокуляции опухолевых клеток принимали за сутки 0. Опухоли измеряли дважды в неделю после введения.

Средний объем опухоли в контрольной группе, получавшей носитель, достигал 3003 мм³ в 14-е сутки после введения (PG-D14). Осуществляли эвтаназию и рассчитывали относительную скорость ингибирования опухоли в группах, получавших другие лекарственные средства, в 14 сутки после введения. В 45-е сутки после введения эксперимент завершали и подвергали эвтаназии всех оставшихся мышей, постоянно находившихся под наблюдением, при этом регистрировали количество мышей, у которых опухоли полностью регрессировали. Результаты эксперимента

Результаты эксперимента показаны в Таблице 10 и на Фиг. 2 и 3.

Средний объем опухоли в группе носителя достигал 3003 мм в 14-е сутки после введения (PG-D14).

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-001, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при трех дозах (1 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг), что позволяло предположить существенную зависимость «доза-ответ». В 14-е сутки после введения (PG-D14) средний объем опухолей в 3 группах, получавших различные дозировки, составлял 1558 мм³, 337 мм³ и 14 мм³, соответственно, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 48,7%, 90,1% и 99,6, соответственно, что статистически значимо отличалось от контрольной группы (значения р составляют 0,023, 0,001, 0,001, соответственно). В группе, получавшей высокую дозу (5 мг/кг), рост опухоли у мышей существенно подавлялся после введения. В 10-е сутки после введения (PG-D10) опухоль у 3 мышей из 6 начала исчезать, и полностью исчезла на 24 сутки после введения (PG-D24) у всех 6 мышей. В конце эксперимента (PG-D45) у мышей не было рецидива опухоли.

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-002, определенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при дозах 1 мг/кг и 2,5 мг/кг.В 14-е сутки после введения (PG-D14) средний объем опухолей составлял 2171 мм³ и 1986 мм³, соответственно, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 28,4% и 33,2%, соответственно, однако различия с контрольной группой, получавшей носитель, не были статистически значимыми (значения р составляли 0,195 и 0,126, соответственно). В группе, получавшей AS11259-ADC-002, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при дозе 5 мг/кг, а средний объем опухоли составлял 1294 мм³ в 14 сутки после введения (PG-D14). Ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 60,1%, что статистически значимо отличалось от контрольной группы (р составляет 0,014). Противоопухолевый эффект исследуемого лекарственного средства AS11259-ADC-002 демонстрировал существенную дозозависимость.

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-004, определенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при дозе 1 мг/кг. Средний объем опухоли в 14-е сутки после введения (PG-D14) составлял 1762 мм³. Относительная скорость ингибирования опухоли составляла 42,6%, однако статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, не наблюдалось (р составляет 0,075). В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-004, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при дозах 2,5 мг/кг и 5 мг/кг. В 14-е сутки после введения (PG-D14) средний объем опухолей составлял 1835 мм и 1030 мм³, соответственно, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 41,2% и 66,0%, соответственно, в обоих случаях различия с контрольной группой были статистически значимыми (значения р составляли 0,027 и 0,003, соответственно). Противоопухолевый эффект исследуемого лекарственного средства AS11259-ADC-004 демонстрировал существенную зависимость «доза-ответ».

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-010, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при трех концентрациях (1 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг), и наблюдалась существенная зависимость «доза-ответ». Средний объем опухоли в 14-е сутки после введения (PG-D14) составлял 1241 мм³, 15 мм³ и 12 мм³, соответственно, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 57,8%, 99,5% и 99,6%, соответственно. Наблюдалось статистически значимое различие по сравнению с контрольной группой (значения р 0,014, 0,001, 0,001, соответственно). В группе, получавшей медианную дозу (2,5 мг/кг), рост опухоли существенно подавлялся после введения. В 10-е сутки после введения (PG-D10) опухоли у 2 мышей из 6 начали исчезать. В 28-е сутки после введения (PG-D28) все опухоли у 6 мышей исчезли, а затем у одной мыши опухоль появилась вновь, тогда как у других 5 мышей опухоли в конце эксперимента не рецидивировали (PG-D45). В группе, получавшей высокую дозу (5 мг/кг), рост опухоли у мышей существенно подавлялся после введения. В 10-е сутки после введения (PG-D10) опухоль у 1 мыши из 6 начала исчезать. В 24-е сутки после введения (PG-D24) опухоли у всех 6 мышей исчезли. В конце эксперимента (PG-D45) опухоли у мышей не рецидивировали.

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-0012, наблюдался существенный противоопухолевый эффект в дозе 5 мг/кг по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, а средний объем опухоли в 14-е сутки после введения (PG-D14) составил 13 мм³. Ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 99,6%, что статистически значимо отличалось от контрольной группы (р составляет 0,001). У мышей данной группы лечения опухолевый рост существенно подавлялся после введения, а в 10-е сутки после введения (PG-D10) опухоли у 2 мышей из 6 начали исчезать, в 31-е сутки после введения (PG-D31) опухоли исчезли у 5 мышей из 6. В конце эксперимента (PG-D45) опухоли у этих 5 мышей не рецидивировали.

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-011, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при дозах 2 мг/кг и 5 мг/кг, и противоопухолевый эффект демонстрировал существенную зависимость «доза-ответ». В 14-е сутки после введения (PG-D14) средние объемы опухолей составляли 818 мм³ и 17 мм³, соответственно. Относительная степень ингибирования опухоли составляла 73,8% и 99,4%, соответственно, и наблюдались статистически значимые различия с контрольной группой (оба значения р составляли 0,001). В группе, получавшей высокую дозу (5 мг/кг), рост опухоли у мышей существенно подавлялся после введения. В 10-е сутки после введения (PG-D10) опухоль у 1 мыши из 6 начала исчезать. В 28-е сутки после введения (PG-D28) опухоли у всех 6 мышей исчезли. В конце эксперимента (PG-D45) опухоли у мышей не рецидивировали.

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-008, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при дозе 2,5 мг/кг, а средний объем опухоли в 14-е сутки после введения (PG-D14) составлял 1390 мм. Ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 54,8%, что статистически значимо отличалось от контрольной группы (р составляет 0,009).

Модель Granta-519

Клетки Granta-519 культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, при 37°С в 5% СО₂. Клетки в фазе логарифмического роста подсчитывали и собирали, ре суспендировали в PBS и Matrigel 1:1 и инокулировали подкожно в правый бок мышам NOD/SCID (самки, возраст 8-9 недель, средняя масса тела 20,5 г, приобретенные в Beijing Ankai Yibo Biotechnology Co., Ltd., номер сертификата животных: 11402400012442; условия содержания: уровень SPF (свободный от специфических патогенов)). Объем клеток, инокулированных каждой мыши, составлял 0,1 мл, а количество инокулированных клеток составляло 1 × 10⁷ на мышь. Когда средний объем опухоли достигал 200 мм³, измеряли массу тела и мышей разбивали на группы случайным образом, после чего инициировали введение. Введение осуществляли через хвостовую вену, частота введения составляла только один раз.

Стандарт оценки результатов

Средний объем опухоли в контрольной группе, получавшей носитель, в первой серии экспериментов достигал 2744 мм³ в 17-е сутки после введения (PG-D17). В контрольной группе осуществляли эвтаназию и рассчитывали TGI в группах, получавших лечение, в 17-е сутки. В 45-е сутки после введения эксперимент завершали и подвергали эвтаназии всех оставшихся мышей, при этом регистрировали количество мышей, у которых опухоли полностью регрессировали. Результаты эксперимента

Результаты приведены в Таблицах 11 и 12 и на Фиг. 4 и 5 ниже.

Средний объем опухоли в первой серии групп носителя достигал 2744 мм³ в 17-е сутки после введения (PG-D17).

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-001, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при трех концентрациях (3,5 мг/кг, 7 мг/кг, 14 мг/кг). В этих трех группах введения средний объем опухоли в 17-е сутки после введения (PG-D17) составлял 68 мм³, 68 мм³ и 49 мм³, соответственно, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 97,5%, 97,6% и 98,2%, соответственно, статистическая значимость различий с контрольной группой была очень высокой (значения р менее 0,001). В 45-е сутки после введения (PG-D45) средний объем опухоли в этих трех группах введения достигал 1268 мм³, 536 мм³ и 184 мм³, соответственно, что указывало на то, что исследуемое вещество демонстрировало существенную зависимость «доза-ответ» для противоопухолевого эффекта.

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-002, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при трех концентрациях (3,5 мг/кг, 7 мг/кг, 14 мг/кг), и наблюдалась существенная зависимость «доза-ответ». В группе, получавшей низкую дозу (3,5 мг/кг), средний объем опухолей в 17-е сутки после введения (PG-D17) составлял 871 мм³, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 68,5%, статистическая значимость различий с контрольной группой, получавшей носитель, была очень высокой (р менее 0,001). В группе, получавшей среднюю дозу (7 мг/кг), средний объем опухолей в 17-е сутки после введения (PG-D17) составлял 246 мм³, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 90,8%, различия с контрольной группой, получавшей носитель, были статистически значимыми (р менее 0,001). В группе, получавшей высокую дозу (14 мг/кг), средний объем опухолей в 17-е сутки после введения (PG-D17) составлял 101 мм, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 96,3%, различия с контрольной группой, получавшей носитель, были статистически значимыми (р менее 0,001).

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-004, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при трех концентрациях (3,5 мг/кг, 7 мг/кг, 14 мг/кг), и наблюдалась существенная зависимость «доза-ответ». В группе, получавшей низкую дозу (3,5 мг/кг), средний объем опухолей в 17-е сутки после введения (PG-D17) составлял 703 мм³, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 74,3%, статистическая значимость различий с контрольной группой, получавшей носитель, была очень высокой (р менее 0,001). В группе, получавшей среднюю дозу (7 мг/кг), средний объем опухолей в 17-е сутки после введения (PG-D17) составлял 222 мм³, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 92,1%, различия с контрольной группой, получавшей носитель, были статистически значимыми (р менее 0,001). В группе, получавшей высокую дозу (14 мг/кг), средний объем опухолей в 17-е сутки после введения (PG-D17) составлял 117 мм³, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 95,7%, различия с контрольной группой, получавшей носитель, были статистически значимыми (р менее 0,001).

Во второй серии экспериментов средний объем опухоли в контрольной группе, получавшей носитель, достигал 2535 мм³ в 17-е сутки после введения (PG-D17).

В группах, получавших исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-001 (2,5 мг/кг), AS11259-ADC-0012 (6 мг/кг), AS 11259-ADC-011 (5 мг/кг) и AS11259-ADC-010 (2,5 мг/кг), наблюдалось существенное подавление опухолевого роста после введения. В 17-е сутки после введения (PG-D17) средний объем опухолей составлял 17 мм³, 6 мм³, 11 мм³ и 9 мм³, соответственно. Ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 99,3%, 99,8%, 99,6% и 99,6%, различия с контрольной группой, получавшей носитель, были статистически значимыми (все значения р равнялись 0,001).

Модель WSU-DLCL2

Клетки WSU-DLCL2 культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, при 37°С в 5% СО₂. Клетки собирали в логарифмической фазе роста и инокулировали подкожно путем инъекции в правый бок мышам NOD/SCID (самки, возраст 8-9 недель, приобретенные в Beijing Ankai Yibo Biotechnology Co., Ltd., номер сертификата животных: 11402400012441; условия содержания: Уровень SPF), объем клеток, инокулированных каждой мыши, составлял 0,1 мл, а количество инокулированных клеток составляло 1 × 10⁷. Когда средний объем опухоли достигал 200 мм³, измеряли массу тела и мышей разбивали на группы случайным образом, после чего инициировавли введение. Введение осуществляли через хвостовую вену, и частота введения составляла только один раз. Стандарт оценки результатов

Средний объем опухоли в контрольной группе, получавшей носитель, в первой серии экспериментов достигал 2146 мм³ в 32-е сутки после введения (PG-D32). В контрольной группе осуществляли эвтаназию и рассчитывали TGI в группах, получавших лекарственное средство, в 32-е сутки. В 43-е сутки после введения эксперимент завершали и подвергали эвтаназии всех оставшихся мышей, при этом регистрировали количество мышей в каждой группе, у которых опухоли полностью регрессировали.

Средний объем опухоли в контрольной группе, получавшей носитель, во второй серии экспериментов достигал 2360 мм³ в 35-е сутки после введения (PG-D35). В контрольной группе осуществляли эвтаназию и рассчитывали TGI в группах, получавших лекарственное средство, в 35-е сутки. В 42-е сутки после введения эксперимент завершали и подвергали эвтаназии всех оставшихся мышей, при этом регистрировали количество мышей в каждой группе, у которых опухоли полностью регрессировали.

Результаты эксперимента

Результаты эксперимента показаны ниже в Таблицах 13, 14 и на Фиг. 6 и 7.

В первой серии экспериментов на модели с ксенотрансплантацией в группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-001, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при трех концентрациях (3,5 мг/кг, 7 мг/кг, 14 мг/кг), и наблюдалась существенная зависимость «доза-ответ». В группе, получавшей низкую дозу (3,5 мг/кг), средний объем опухолей в 32-е сутки после введения (PG-D32) составлял 845 мм³, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 60,4%, различия с контрольной группой, получавшей носитель, были статистически значимыми (р составляет 0,004). В группе, получавшей среднюю дозу (7 мг/кг), средний объем опухолей в 32-е сутки после введения (PG-D32) составлял 273 мм³, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 87,6%, различия с контрольной группой, получавшей носитель, были статистически значимыми (р составляет 0,001). В группе, получавшей высокую дозу (14 мг/кг), средний объем опухолей в 32-е сутки после введения (PG-D32) составлял 132 мм³, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 93,7%, статистическая значимость различий с контрольной группой, получавшей носитель, была очень высокой (р составляет 0,001).

В группе, получавшей исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-004, существенный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, наблюдался при трех концентрациях (3,5 мг/кг, 7 мг/кг, 14 мг/кг), однако различия не были статистически значимыми. В этих трех группах дозирования средний объем опухолей в 32-е сутки после введения (PG-D32) составлял 1526 мм³, 1632 мм³ и 1521 мм³, соответственно, а ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 28,3%, 24,0% и 28,6%, соответственно. Значения р составляли 0,080, 0,123 и 0,080, соответственно.

Во второй серии экспериментов на модели с ксенотрансплантацией во всех группах, получавших исследуемое лекарственное средство AS11259-ADC-001 (3,5 мг/кг), AS11259-ADC-0012 (8,4 мг/кг), AS11259-ADC-011 (7 мг/кг) и AS11259-ADC-010 (3,5 мг/кг), наблюдалось существенное подавление опухолевого роста после введения. В 35-е сутки после введения (PG-D35) средний объем опухолей составлял 912 мм³, 840 мм³, 700 мм³ и 913 мм³, соответственно. Ингибирование опухолевого роста (TGI) составляло 61,0%, 64,4%, 71,4% и 62,0%, при этом значения р составляли менее 0,001, менее 0,001, менее 0,001 и 0,001, соответственно. Исследуемое лекарственное средство хорошо переносилось мышами во всех группах дозирования.

Все документы, упомянутые в настоящем описании, включены во всей полноте посредством ссылки, как если бы каждый документ был отдельно процитирован во всей полноте. Кроме того, следует понимать, что специалист в области техники может внести различные модификации и изменения, которые будут входить в объем прилагаемой формулы изобретения.

--->

Перечень последовательностей

<110> NEWBIO THERAPEUTICS, INC.

<120> Anti-CD79b Antibodies, Drug Conjugates, and Applications thereof

<150> 201811296100.8

<151> 2018-11-01

<130> 17A472

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR1

<400> 1

Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Asn

1 5 10

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR2

<400> 2

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR3

<400> 3

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR1

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR2

<400> 5

Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность mVH

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность mVL

<400> 8

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина AGC78785.1

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ser Gly Val Gly Leu His Phe Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 277

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область легкой каппа-цепи иммуноглобулина BAC01734.1

<400> 10

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser

20 25 30

Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

35 40 45

Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln

50 55 60

Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn

65 70 75 80

Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

85 90 95

Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly

115 120 125

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

130 135 140

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val

145 150 155 160

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

165 170 175

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

180 185 190

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

195 200 205

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr

210 215 220

His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu

225 230 235 240

Cys Ser Ala Arg Gln Ser Thr Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln

245 250 255

Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly

275

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH с пересаженными HCDR

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL с пересаженными LCDR

<400> 12

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи AS11161

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи AS11164

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи AS11252

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи AS11254

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи AS11259

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи AS11161

<400> 18

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи AS11164

<400> 19

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи AS11252

<400> 20

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи AS11254

<400> 21

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи AS11259

<400> 22

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи

<400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Константная область легкой цепи

<400> 24

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 25

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Тяжелая цепь AS11161

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 26

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Легкая цепь AS11161

<400> 26

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 27

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Тяжелая цепь AS11164

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 28

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Легкая цепь AS11164

<400> 28

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 29

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Тяжелая цепь AS11252

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 30

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Легкая цепь AS11252

<400> 30

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 31

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Тяжелая цепь AS11254

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 32

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Легкая цепь AS11254

<400> 32

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 33

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Тяжелая цепь AS11259

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Thr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 34

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Легкая цепь AS11259

<400> 34

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 35

<211> 139

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ECD CD79b

<400> 35

Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser

1 5 10 15

Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr

20 25 30

Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp

35 40 45

Leu Trp Lys Gln Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu

50 55 60

Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr

115 120 125

Leu Lys Asp Val Asp His His His His His His

130 135

<210> 36

<211> 1344

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи AS11259

<400> 36

caagttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcagcag cgtgaaggtg 60

tcctgcaaga ccagcggcaa cacctttacc agctacggca tcaactgggt caagcaggcc 120

cctggacaag gcttggagtg gatcggcgag atcttcccca ggagcggcaa catctactac 180

aacgagaaat tcaagggccg cgtgaccatc accgccgaca agagcacaag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actattgtgc caagggcggc 300

acaggcgact tcgactactg gggacagggc acactggtca cagtgtctag cgcaagcact 360

aaaggacctt ccgtgttccc actggcacca tcctctaaga gcacttccgg aggaaccgcc 420

gctctgggat gtctggtgaa ggactacttc ccagagcccg tcacagtgtc atggaacagc 480

ggggccctga ccagcggagt ccatacattt cctgctgtgc tgcagagttc aggcctgtat 540

agcctgagct ccgtggtcac tgtcccatct agttcactgg ggactcagac ctacatctgc 600

aacgtgaatc acaaaccatc taataccaag gtcgacaaga aagtggaacc caaaagttgt 660

gataagacac atacttgccc accttgtcct gcaccagagc tgctgggagg accaagcgtg 720

ttcctgtttc cacccaaacc taaggacacc ctgatgatta gccgcacacc agaagtcact 780

tgcgtggtcg tggacgtgag ccacgaggat cccgaagtca agtttaactg gtacgtggat 840

ggcgtcgagg tgcataatgc caaaacaaag cccagggagg aacagtataa ctctacatac 900

cgcgtcgtga gtgtcctgac tgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggaatacaaa 960

tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcccgcc cctatcgaga agaccatttc taaagccaag 1020

gggcagcctc gagaaccaca ggtgtataca ctgcctccaa gccgggacga gctgactaaa 1080

aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag gggttctacc cctccgatat tgctgtggag 1140

tgggaatcta atggacagcc tgagaacaat tataagacca caccccctgt gctggactcc 1200

gatggatctt tctttctgta ctcaaaactg accgtggata agagccgatg gcagcagggc 1260

aatgtctttt cttgtagtgt gatgcacgag gcactgcaca accactacac ccagaagtca 1320

ctgtcactgt caccaggcaa gtga 1344

<210> 37

<211> 660

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность легкой цепи AS11259

<400> 37

gacgtggtca tgacccagtc tccactgagc ctgccagtga cactgggaca gccagccagc 60

atctcctgtc ggagctccca gaacatcgtg cacagcgacg gcaataccta cctggagtgg 120

tatcagcagc ggcctggcca gtccccaaga ctgctgatct acaaggtgtc cttcaggctg 180

tctggagtgc cagaccgctt ttctggcagc ggctccggca ccgatttcac actgaagatc 240

tctcgggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactattgct tccagggcag ccatgtgccc 300

tggacctttg gcggcggcac aaaggtggag atcaagagaa ccgtggccgc ccctagcgtg 360

ttcatctttc cccctagcga cgagcagctg aagagcggca cagcctccgt ggtgtgcctg 420

ctgaacaact tctaccctag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggataa cgccctgcag 480

tccggcaatt ctcaggagag cgtgaccgag caggactcca aggattctac atatagcctg 540

tctagcaccc tgacactgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta tgcatgcgag 600

gtgacccacc agggcctgtc ctctcccgtg acaaagagct ttaaccgcgg cgagtgttag 660

<210> 38

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность mVH

<400> 38

caggttcagc tgcagcagtc tggatctgag ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaaga cttctggcaa caccttcaca agttatggta taaactgggt gaagcagaga 120

actggacagg gccttgagtg gattggagag atttttccta gaagtggtaa tatttactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcgtac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aaaaggggga 300

actggggact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

<210> 39

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность mVL

<400> 39

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtgatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaaa ctcctgattt acaaagtttc cttccgactt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatccggga cagatttcac actcaagatc 240

agaagagtgg aggctgagga tctgggaact tattattgtt ttcaaggttc acatgttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент, их конъюгат с лекарственным средством и их применения. Также раскрыты фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения заболевания, нуклеиновая кислота, экспрессирующий вектор, клонирующий вектор, набор для лечения или предупреждения заболевания, опосредованного CD79b. Изобретение позволяет использовать его для лечения или предупреждения заболевания, опосредованного CD79b, а также в изготовлении диагностического агента для клеточного пролиферативного расстройства, ассоциированного с повышенной экспрессией CD79b. 9 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 14 табл., 7 пр.

1. Антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат: HCDR1 (определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; LCDR1 (определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4; LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5; LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6.

2. Антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где аминокислотная последовательность HCDR1 антитела против CD79b или его антигенсвязывающего фрагмента представлена в SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность HCDR2 представлена в SEQ ID NO: 2, аминокислотная последовательность HCDR3 представлена в SEQ ID NO: 3, аминокислотная последовательность LCDR1 представлена в SEQ ID NO: 4, аминокислотная последовательность LCDR2 представлена в SEQ ID NO: 5, и аминокислотная последовательность LCDR3 представлена в SEQ ID NO: 6.

3. Антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, где антитело против CD79b представляет собой моноклональное антитело и/или антитело против CD79b представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело.

4. Антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против CD79b представлена в SEQ ID NO: 7 или 11, и/или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против CD79b представлена в SEQ ID NO: 8 или 12; или

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против CD79b выбрана из аминокислотных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 13-17, и/или аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против CD79b выбрана из аминокислотных последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 18-22.

5. Антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против CD79b выбрана из аминокислотных последовательностей, которые по меньшей мере на 90% идентичны любой из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 и 33; и

аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против CD79b выбрана из аминокислотных последовательностей, которые по меньшей мере на 90% идентичны любой из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32 и 34.

6. Антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело против CD79b выбрано из группы, состоящей из:

(1) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 25, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 26;

(2) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 27, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 28;

(3) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 29, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 30;

(4) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 31, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 32;

(5) антитела, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 33, и аминокислотная последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 34.

7. Конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения или предупреждения заболевания, опосредованного CD79b, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, конъюгированные с цитотоксическим агентом.

8. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 7, где структура конъюгата является следующей:

A-(V-L-D)_n,

где:

А представляет собой антитело;

V-L представляет собой линкер, V может присутствовать или отсутствовать и представляет собой линкерный элемент бисмалеимидного или тетрамалеимидного типа;

L может присутствовать или отсутствовать и может представлять собой расщепляемый линкер или нерасщепляемый линкер; присутствует по меньшей мере один из V и L;

D представляет собой цитотоксический агент, представляющий интерес; и n представляет собой целое число от 1 до 4.

9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 7 или 8, где цитотоксический агент представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, ингибитор роста, токсин или радиоактивный изотоп.

10. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения заболевания, опосредованного CD79b, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп. 1-6 или конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 7-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Фармацевтическая композиция по п. 10, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 7-9.

12. Нуклеиновая кислота для получения антитела по п. 1, выбранная из группы, состоящей из:

(1) нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1-8, 11-22 и 25-34;

(2) нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6;

(3) нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеиновой кислоте (1) или (2).

13. Нуклеиновая кислота по п. 12, выбранная из группы, состоящей из:

(а) нуклеиновой кислоты, представленной в любой из SEQ ID NO: 36-39; и

(б) нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеиновой кислоте (а).

14. Вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, или комплементарную ей последовательность, где вектор представляет собой клонирующий вектор.

15. Вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, или комплементарную ей последовательность, где вектор представляет собой экспрессирующий вектор.

16. Применение антитела против CD79b или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-6 или конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 7-9 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания, опосредованного CD79b.

17. Применение по п. 16, где заболевание представляет собой рак кроветворной системы, предпочтительно В-клеточное пролиферативное расстройство; предпочтительно заболевание представляет собой лимфому или лейкоз; более предпочтительно заболевание выбрано из неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей безболезненной NHL, рефрактерной NHL, рефрактерной безболезненной NHL, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), волосатоклеточного лейкоза (HCL) или острого лимфоцитарного лейкоза (ALL).

18. Применение антитела против CD79b или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-6 в изготовлении диагностического агента для клеточного пролиферативного расстройства, ассоциированного с повышенной экспрессией CD79b.

19. Набор для лечения или предупреждения заболевания, опосредованного CD79b, содержащий первый контейнер и листовку-вкладыш, где первый контейнер содержит композицию, содержащую антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, или конъюгат указанного антитела против CD79b или его антигенсвязывающего фрагмента с лекарственным средством, или фармацевтическую композицию указанного антитела против CD79b или его антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата.

20. Набор по п. 19, дополнительно включающий второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, или

композицию, содержащую антитело против CD79b или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6,

где набор дополнительно содержит контейнер, содержащий разбавитель, буфер или контрольное антитело для выявления.