СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕКРЕТИРУЕМЫХ СТРЕСС-БЕЛКОВ FRANCISELLA TULARENSIS Российский патент 2024 года по МПК C12P21/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для регулируемого синтеза секретируемых стресс-белков Francisella tularensis с последующим их выделением из культуральной жидкости.

Стресс-белки туляремийного микроба представляют собой полифункциональные белки, продукция которых увеличивается в ответ на действие неблагоприятных условий. Внутриклеточный уровень белков Bfr, GroEl/GroEs и HSP повышается в условиях теплового стресса, перекисного окисления и недостатка питательных веществ. Основными функциями стресс-белков являются повышение устойчивости патогена к выживанию в неблагоприятных условиях среды. Кроме того, данные антигены являются одними из ключевых компонентов иммунной реакции организма-хозяина на внедрение патогена. Показано, что Bfr и GroEl/GroEs туляремийного микроба обладают протективным действием по отношению к лабораторным биомоделям, активно продуцируются в ответ на стресс-условия и вызывают мощную стимуляцию клеточного иммунологического ответа у иммунных клеток организма-хозяина. В связи с высокой иммунобиологической активностью, антигены Bfr и GroEl/GroEs являются перспективными компонентами профилактических и диагностических препаратов. Предлагаемый способ получения секретируемых стресс-белков позволяет получать их в препаративном количестве без примесей других компонентов бактериальной клетки.

Кузнецовой Е.М. с соавт.(2019) описан способ выделения комплексного антигена, содержащего Bfr и О-антиген туляремийного микроба, из бактериальных клеток. Получение состоит из следующих последовательно выполняющихся стадий: культивирование Francisella tularensis 15 НИИЭГ; отделение центрифугированием микробной биомассы; ультразвуковая дезинтеграция клеточной массы; изоэлектрическая преципитация при рН 4,3; энзиматический гидролиз с помощью проназы Е; центрифугирование для удаления нерастворимых примесей; хроматографическая очистка путем гель-фильтрации (Sephacryl S-300); диализ. Bfr-O-антиген имеет соотношение белковой и липополисахаридной частей 2:1.

Известен метод получения рекомбинантного стресс-белка туляремийного микроба GroEl путем экспрессии гена этого белка в клетках Е. coli с последующим рефолдингом (Горбатов А.А. с соавт, 2017). Авторами отмечается высокая диагностическая активность рекомбинантного белка GroEL FTT 1696 и отсутствие протективной активности.

Lee B.Y. et al. (2006) описали способ получения пула белков теплового шока Francisella tularensis из культуральной жидкости. Выделенные белки не содержали примесей в виде компонентов клетки и обладали протективной активностью. При этом авторы не ставили задачи выделить данные антигены в препаративных количествах.

Данных о параметрах управляемого синтеза секретируемых стресс-белков Bfr и GroEl/GroEs F. tularensis и условиях их получения из культуральной жидкости нет.

Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего увеличить синтез и секрецию стресс-белков Bfr и GroEl/GroEs F. tularensis с последующим выделением данных антигенов в биологически активном состоянии из культуральной жидкости без примесей других компонентов бактериальной клетки для использования их как основу для профилактических и диагностических препаратов.

Технический результат заключается в реализации указанного назначения.

Технический результат достигается способом получения секретируемых стресс-белков Francisella tularensis, который предусматривает активацию выхода стресс-белков путем добавления 38% Н₂О₂ до конечной концентрации 5 мМ и повышения температуры до 42°С в течение 2 часов, стерилизующую фильтрацию культуральной жидкости, осаждение белковой фракции сульфатом аммония с последующей очисткой колоночной и ионообменной хроматографией.

Новизна заявляемого изобретения заключается в том, что антигены F. tularensis получают не из бактериальных клеток, а из культуральной жидкости, что позволяет исключить риск примеси липополисахаридными компонентами клетки и сохранить биологическую активность белковых препаратов.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом:

В качестве штамма-продуцента используется F. tularensis subsp.holarctica 15 НИИЭГ. Двухсуточную культуру, выращенную на FT-arape, суспендируют в 0,9% растворе NaCl и инокулируют в жидкую среду Мюллера-Хинтона до достижения OD₅₆₅=0,5-0,6 единиц Мак-Фарланда. После этого, колбы с культурой переносят в термостатируемый шейкер-инкубатор, где культивируют до ранней стационарной фазы в течение (19±1) ч при температуре (37±1)°С до концентрации OD₅₆₅=2,5-3,0 единицы Мак-Фарланда.

Для регуляции синтеза стресс-белков в культуральную жидкость используют добавление 38% Н₂О₂ до конечной концентрации 5 мМ и повышение температуры до 42°С, после чего культивирование продолжают еще в течение двух часов. По окончании культивирования культуральную жидкость отделяют от биомассы методом тангенциальной ультрафильтрации, после чего обеспложенный фильтрат собирают в отдельную емкость.

Осаждение из обеспложенного фильтрата культуральной жидкости фракций, содержащих стресс-белки, проводят путем высаливания сульфатом аммония ((NH₄)₂SO₄) в разной концентрации: при 55% - Bfr, 70% - GroEL/GroES. Инкубацию проводят в течение 1 часа при постоянном перемешивании при температуре (22±1)°С или в течение 18 ч при температуре (5±1)°С. Осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 40 минут. Освобождение от соли проводят диализом против буферного раствора следующего состава: 50 мМ Трис-HCl с 10 мМ ЭДТА. Смену раствора проводят до полного избавления от сульфата аммония.

От посторонних примесей осажденные стресс-белки очищают методом гель-хроматографии на колонке 2,6×70 см с носителем Сефадекс S-300. Элюцию проводят с постоянной скоростью (0,3 мл/мин) при температуре (22±1)°С. В качестве элюирующего буфера используют 50 мМ Трис-HCl буфер с добавлением 10 мМ ЭДТА. Контроль хроматографии проводят спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Для получения Bfr используют фракцию, полученную при 55% насыщения сульфатом аммония, и при гель-хроматографии собирают первый пик. При хроматографической очистке белков GroEL/GroES собирают второй хроматографический пик, используя фракцию, полученную при 70% насыщении сульфатом аммония.

Окончательную очистку белков Bfr и GroEL/GroES проводят методом ионообменной хроматографии на колонке 2,6×5,5 см с носителем DEAE-Sepharose, уравновешенной 50 мМ Трис-HCl буфером с добавлением 10 мМ ЭДТА. Элюирование проводят с использованием линейного градиента от 0 до 500 мМ NaCl. Полученные белки концентрируют на центрифужных концентраторах Vivaflow с отсечкой 10 кДа и хранят при температуре (-20±1)°С.

Образцы стресс-белков анализировали в электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) по U.Laemmli в 4% концентрирующем и 12,5% разделяющем гелях с последующей окраской Кумасси R-250. Были выявлены мажорные полосы, характерные для данных белков (Фиг. 1А, Фиг. 2С): для Bfr - 17кДа, GroEL/GroES - 60/12 кДа. Все мажорные белковые полосы были иммунореактивными - выявлялись в иммуноблоттинге специфической туляремийной сывороткой (сыворотка диагностическая туляремийная, ФКУЗ Иркутский НИПЧИ Роспотребнадзора) (Фиг. 1В, Фиг. 2D).

Все белки, полученные заявляемым методом, обладали антигенной активностью. Были получены кроличьи сыворотки к каждому стресс-белку. Сравнительный ДОТ-иммуноанализ показал, что все белки, полученные заявляемым методом, обладали иммунохимической активностью и взаимодействовали со специфическими антителами. При этом реакция с гетерогенными сыворотками и иммуноглобулинами отсутствовала, что говорит о специфичности полученных препаратов.

Пример 1

В качестве штамма-продуцента используется F. tularensis subsp.holarctica 15НИИЭГ. Двухсуточную культуру, выращенную на FT-arape, суспендируют в 0,9% растворе NaCl и инокулируют в жидкую среду Мюллера-Хинтона до достижения OD₅₆₅=0,5-0,6 единиц Мак-Фарланда. После этого, колбы с культурой переносят в термостатируемый шейкер-инкубатор, где культивируют до ранней стационарной фазы в течение (19±1) ч при температуре (37±1)°С до концентрации OD₅₆₅=2,5-3,0 единицы Мак-Фарланда.

Для регуляции синтеза стресс-белков в культуральную жидкость используют добавление 38% Н₂О₂ до конечной концентрации 5 мМ и повышение температуры до 42°С, после чего культивирование продолжают еще в течение двух часов. По окончании культивирования культуральную жидкость отделяют от биомассы методом тангенциальной ультрафильтрации, после чего обеспложенный фильтрат собирают в отдельную емкость.

Осаждение белка Bfr из обеспложенного фильтрата культуральной жидкости проводят путем высаливания сульфатом аммония ((NH₄)₂SO₄) в концентрации 55%. Инкубацию проводят в течение 1 часа при постоянном перемешивании при температуре (22±1)°С или в течение 18 ч при температуре (5±1)°С. Осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 40 минут. Освобождение от соли проводят диализом против буферного раствора следующего состава: 50 мМ Трис-HCl с 10 мМ ЭДТА. Смену раствора проводят до полного избавления от сульфата аммония.

От посторонних примесей осажденный белок очищают методом гель-хроматографии на колонке 2,6×70 см с носителем Сефадекс S-300. Элюцию проводят с постоянной скоростью (0,3 мл/мин) при температуре (22±1)°С. В качестве элюирующего буфера используют 50 мМ Трис-HCl буфер с добавлением 10 мМ ЭДТА. Контроль хроматографии проводят спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Для получения Bfr используют фракцию, полученную при 55% насыщения сульфатом аммония, и при гель-хроматографии собирают первый пик.

Окончательную очистку Bfr проводят методом ионообменной хроматографии на колонке 2,6×5,5 см с носителем DEAE-Sepharose, уравновешенной 50 мМ Трис-HCl буфером с добавлением 10 мМ ЭДТА. Элюирование проводят с использованием линейного градиента от 0 до 500 мМ NaCl. Полученный белок концентрируют на центрифужных концентраторах Vivaflow с отсечкой 10 кДа и хранят при температуре (-20±1)°С.

Стресс-белок Bfr анализировали в электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) по U.Laemmli в 4% концентрирующем и 12,5% разделяющем гелях с последующей окраской Кумасси R-250. Была выявлена мажорная полоса, характерная для Bfr - 17кДа (Фиг.1А), иммунохимическая активность была подтверждена в иммуноблоттинге со специфической туляремийной сывороткой (сыворотка диагностическая туляремийная, ФКУЗ Иркутский НИПЧИ Роспотребнадзора) (Фиг. 1В).

Иммунобиологические свойства полученного антигена Bfr изучали на лабораторных животных. Для определения токсичности Bfr вводили морским свинкам в объеме 500 мкг, после чего проводили ежедневный осмотр и взвешивание животных в течение 14 суток. Показано, что препарат не обладал токсигенными свойствами, не приводил к снижению веса и изменениям состояния биомоделей (Фиг. 3). Так же, введение препарата Bfr белым мышам в дозировке 15 мкг/животное показало высокую протективную активность при экспериментальной туляремии, вызванной вирулентным штаммом F. tularensis subs, tularensis 503/840, 100 м.кл. (Фиг. 4). Было показано, что средняя иммунизирующая доза для Bfr составляла 15,7 мкг/животное.

Таким образом, полученный заявляемым способом антиген Bfr не имеет посторонних примесей, обладает высокой протективной активностью и может использоваться в качестве компонента профилактических препаратов.

Пример 2

В качестве штамма-продуцента используется F. tularensis subsp.holarctica 15 НИИЭГ. Двухсуточную культуру, выращенную на FT-arape, суспендируют в 0,9% растворе NaCl и инокулируют в жидкую среду Мюллера-Хинтона до достижения OD₅₆₅=0,5-0,6 единиц Мак-Фарланда. После этого, колбы с культурой переносят в термостатируемый шейкер-инкубатор, где культивируют до ранней стационарной фазы в течение (19±1) ч при температуре (37±1)°С до концентрации OD₅₆₅=2,5-3,0 единицы Мак-Фарланда.

Для регуляции синтеза стресс-белков в культуральную жидкость используют добавление 38% Н2О2 до конечной концентрации 5 мМ и повышение температуры до 42°С, после чего культивирование продолжают еще в течение двух часов. По окончании культивирования культуральную жидкость отделяют от биомассы методом тангенциальной ультрафильтрации, после чего обеспложенный фильтрат собирают в отдельную емкость.

Для получения комплексного белка GroEl/GroEs на первом этапе используют метод осаждения сульфатом аммония ((NH₄)₂SO₄) при концентрации последнего 70%. Инкубацию проводят в течение 1 часа при постоянном перемешивании при температуре (22±1)°С или в течение 18 ч при температуре (5±1)°С.Осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 40 минут. Освобождение от соли проводят диализом против буферного раствора следующего состава: 50 мМ Трис-HCl с 10 мМ ЭДТА.

Хроматографическую очистку от посторонних примесей проводят методом гель-хроматографии на колонке 2,6×70 см с носителем Сефадекс S-300. Элюцию проводят с постоянной скоростью (0,3 мл/мин) при температуре (22±1)°С. В качестве элюирующего буфера используют 50 мМ Трис-HCl буфер с добавлением 10 мМ ЭДТА. Контроль хроматографии проводят спектрофотометрически при длине волны 280 нм. При хроматографической очистке белков GroEL/GroES собирают второй хроматографический пик. Окончательную очистку GroEL/GroES проводят методом ионообменной хроматографии на колонке 2,6×5,5 см с носителем DEAE-Sepharose, уравновешенной 50 мМ Трис-HCl буфером с добавлением 10 мМ ЭДТА. Элюирование проводят с использованием линейного градиента от 0 до 500 мМ NaCl. Белок концентрируют на центрифужных концентраторах Vivaflow с отсечкой 10 кДа и хранят при температуре (-20±1)°С.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) по U.Laemmli в 4% концентрирующем и 12,5% разделяющем гелях с последующей окраской Кумасси R-250 выявляет мажорные полосы, характерные для GroEL/GroES (Фиг. 2С) - это две мажорных полосы 60 и 12 кДа. Все мажорные белковые полосы были иммунореактивными - выявлялись в иммуноблоттинге специфической туляремийной сывороткой (сыворотка диагностическая туляремийная, ФКУЗ Иркутский НИПЧИ Роспотребнадзора) (Фиг. 2D).

Полученный заявляемым способом белковый комплекс GroEl/GroEs сохраняет иммуноспецифичность, выявляет специфические туляремийные антитела в сыворотках вакцинированных и переболевших животных в разные сроки иммуногенеза, не взаимодействует с гетерологичными сыворотками (Таблица 1). Секретируемый белковый комплекс GroEL/GroES был использован для получения специфического кроличьего иммуноглобулина (Ig к GroEL/GroES), который использовали для детекции клеток F. tularensis разных подвидов.

Показано, что Ig к GroEL/GroES выявлял клетки F. tularensis, но не взаимодействовал с гетерологичными бактериями (Таблица 2).

Таким образом, секретируемый комплекс GroEl/GroEs возможно использовать в качестве компонента иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и детекции возбудителя.

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии, и может быть использовано для регулируемого синтеза секретируемых стресс-белков Francisella tularensis. Предложен способ получения секретируемых стресс-белков Francisella tularensis, включающий стресс-воздействие на бактериальную культуру при культивировании в жидкой питательной среде путем добавления 38% Н₂О₂ до конечной концентрации 5 мМ и повышения температуры до 42°С в течение 2 часов, стерилизующую фильтрацию культуральной жидкости, осаждение белковой фракции сульфатом аммония при 55% для получения белков Bfr, при 70% для получения белков GroEL/GroES с последующей очисткой гель-хроматографией и ионообменной хроматографией. Способ позволяет увеличить синтез и секрецию стресс-белков Bfr и GroEl/GroEs F. tularensis с последующим выделением данных антигенов в биологически активном состоянии из культуральной жидкости без примесей других компонентов бактериальной клетки. 4 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ получения секретируемых стресс-белков Francisella tularensis, включающий стресс-воздействие на бактериальную культуру при культивировании в жидкой питательной среде путем добавления 38% Н₂О₂ до конечной концентрации 5 мМ и повышения температуры до 42°С в течение 2 часов, стерилизующую фильтрацию культуральной жидкости, осаждение белковой фракции сульфатом аммония при 55% для получения белков Bfr, при 70% для получения белков GroEL/GroES с последующей очисткой гель-хроматографией и ионообменной хроматографией.