Изобретение относится к медицинской микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть использовано для обнаружения представителей рода Francisella методом молекулярной гибридизации.
Цель изобретения - создание штамма Е. coli, содержащего рекомбинантную плазмиду с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомаль- ной ДНК Francisella tularensls. Плазмида является источником ДНК-зонда для обнаружения франсисел.
Для достижения поставленной цели конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pRD6, содержащую репликон вектора pUC19, по Есо Rl-сайту которого встроен фрагмент
ДНК длиной 790 п.о., комплементарный специфическому участку хромосомальной ДНК Francisella tularensis. Плазмида неконьюга- тивна, амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола.
Рекомбинантная плазмида pRD6 длиной 3476 п.о., содержит целый репликон вектора pUC19 длиной 2680 п.о.,по Есо Rl- сайту которого встроен фрагмент ДНК длиной 790 п.о. (имеющий 3 сайта расщепления по Alul и один сайт по Cfol), комплементарный специфическому участку хромосомальной ДНК Francisella tularensls.
ДНК-зонд синтезируется в процессе репликации рекомбинантной плазмиды за счет репликона pUC19.
(
О
ю чэ
00
Штамм-продуцент зонда получают трансформацией Е. coli IM103 плазмидой pRD6. Рекомбинантная плазмида выделяется из продуцента на стационарной фазе роста с выходом 2-3 мг/мл.
Штамм-продуцент плэзмиды pRD6 E. coll IM103 pRD6 KM характеризуется следующими признаками.
Морфологические. Клетки штамма в мазках 18-часовых культур имеют вид грамот- рицательных коротких полиморфных палочек размером 1-2хО,3-0,5 мкм. Неподвижны. На LB-arape в течение 18 ч при 37°С образуют колонии серовато-белого цвета. В бульоне через 18 ч вызывают помутнение среды, образуют на дне осадок. Устойчивы к ампициллину (100 мкг/мл) и стрептомицину (100 мкг/мл).
Культуральные признаки и физиолого- биохимические.Нуждается в пролине.тиами- не. Штамм ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, арабинозу, галактозу, маннозу, Не ферментирует лактозу. Ли- зируется кишечными фагами Т и Avir. Клетки штамма авирулентны для белых мышей и морских свинок при подкожном, аэрозольном и енутриконъюнктивальном заражении.
Получение плазмиды pRD6 и штамма IM103 pRD6 KM иллюстрируется следующими примерами.
П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pRD6.
Хромосомальную ДНК туляремийного микроба выделяют методом щелочного лизиса с последующей обработкой фенолом и осаждением ДНК этанолом
1 мкг вектора pUC 19 гидролизуют ре- стриктазой EcoRI (5 ед.) в течение 1 ч при 37°С в буфере, содержащем 50 мМ трис- HCI. рН 8,0, 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCI. Полноту гидролиза контролируют электрофорезом аликвоты (1 /10 ч.) рестрикционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. Реакцию останавливают при 70°С (10 мин) и ДНК осаждают из 0,3 М ацетата натрия (рН 4,8) этанолом, Хромосомальную ДНК туляремийного микроба гидролизуют EcoRI аналогично (3-4 мкг). Плазмидную и хромосо- мальную ДНК лигируют в 50 мкл буфера (50 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ МдС1г. 0,5 мМ АТФ, 5 мМ ДДТ) в течение 10 ч при 10°С ДНК-лигазой (фаза Т4), Реакцию контролируют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле (1/10 ч.). Таким же количеством лигазной смеси трансформируют штамм Е. coll IM 103.
Выбор штамма обусловлен тем, что в присутствии pUC 19 он способен синтезировать фермент / -галактозидазу за счет комплементации дефектного хромосомального гена N-концевым фрагментом гена, находящегося на плазмиде. Эта способность штамма не проявляется в присутствии рекомбинантной плазмиды со встроенным по EcoRI сайту фрагментом ДНК, длина которого не кратна трем, вследствие сдвига рамки считывания / -галактозидазы. Клоны с такими рекомби- нантными плазмидами, не обладающие / галактозидазной активностью, могут быть отобраны на индикаторной среде с хромо- генным субстратом X-gal по отсутствию голубой окраски.
Клетки культуры E.coll IM 103, трансформированные лигазной смесью, высеивают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл X-gal и 240 мкг/мл индуктора-галактозидазы ИПТГ (изо- пропил- /S-D-тиогалактопиранозида). Через
14-20 ч при 37°С на чашках вырастают голубые и белые колонии трансформантов.
Из отобранных белых рекомбинантных клонов выделяют плазмидную ДНК, которую затем анализируют рестриктазами.
П р и м е р2.
1.Получение штамма-продуцента плазмиды pRD6.
Плазмидой pRDG трансформируют штамм Е. coli IM 103, в результате чего пол- учают продуцент плазмиды pRD6. Плазмидную ДНК выделяют из 500 мл стационарной культуры штамма Е. coli IM 103 pRD6 методом Бирнбойма и Доли.
2.Получение радиоактивного зонда для видоспецифического определения франсисел.
Для получения зонда 10 мкг плазмид-- ной ДНК гидролизуют в объеме 100 мкл ре- стриктазой EcoRI (20 ед.) в течение 1 ч при
37иС в буфере, содержащем 50 мМ трис- HCI, рН 8,0, 10 мМ MgCb, 100 мМ NaCI. Полноту гидролиза плазмидной ДНК проверяют электрофорезом аликвоты рестрикционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. К
гидролизату добавляют 3 мкм с удельной активностью 3000 кл/ммоль, по 2 мкл dTTP, dGTP с концентрацией 5 мМ/мл и 1 мкм (5-7 ед.) фрагмент Кленова ДНК- полимеразы 1. Смесь инкубируют при
комнатной температуре 5-10 мин и после добавления 20 мкл 50%-ного глицерина с красителями разделяют электрофорезом в 5%-ном полиакриламидном геле. Положение вырезанного из плазмиды фрагмента
ДНК определяют авторадиографией геля в течение 20-40 мин. Меченый фрагмент вырезают и элюируют из геля 0,3 М ацетатом натрия в течение 2 ч при 65°С. ДНК осаждают добавлением к элюату 10 мкг т-РНК-носителя и 2,5 объемов 96%-ного этанола. Осадок растворяют в 100 мкл дистиллированной воды и используют в качестве зонда при гибридизации колоний после 5-минутного прогревания при 100°С.
3. Использование зонда для гибридизации колоний разных видов микроорганизмов.
Клетки разных видов микроорганизмов наносят на нитроцеллюлозные фильтры СЫНПОР с помощью стеклянных палочек.
Лизис клеток и гибридизацию при 65°С с зондом проводят следующим образом.
Фильтры с нанесенными на них колониями помещают на фильтровальную бумагу, смоченную 0,5 н. NaOH,n выдерживают 5- 10 мин при комнатной температуре. Для нейтрализации фильтры помещают на фильтровальную бумагу (10 мин), пропитанную раствором 0.2 М трис-HCI (рН 7,5), 1 М NaCI. После5 мин просушивания на воздухофильтры погружают на 15 мин в раствор, содержащий 300 мМ NaCI, 25 мМ Na2HP04, 50 мМ ЭДТА (р 6,8). Затем фильтры высушивают при 80° в течение 2 ч.
Проводят гибридизацию. Высушенные фильтры помещают на 1-2 ч в раствор для предгибридизации, состоящий из б х SSC, 02% SDS, 5 х Denchardt, 100 мкг/мл ДНК из спермы лосося (однократный раствор SSC: 150 мМ NaCI, 15 мМ цитрата натрия; однократный Denchardt фикол 0.01 %, бычий сывороточный альбумин 0,01 %,поливинилпирролидон
0,01%). Из этого раствора фильтры переносят в раствор для гибридизации, состоящий из 4 х SSC, 0,2% SDS, 2 х Denchardt,100 мкг/мл ДНК лосося, к которому добавлен 1
мкг меченого зонда. Гибридизацию проводят при 65°С в течение 16 ч. Затем фильтры отмывают 2 раза по 30 мин при 65°С раствором, содержащим 2 х SSC, 0,2% SDS, и высушивают при 65°С. После авторадиографии
фильтров регистрируют те штаммы, которые гибридизуются с зондом.
Результаты гибридизации приведены в таблице.
Как видно из таблицы, с зондом гибридизуются только представители рода Franclsella, что позволяет использовать зонд для видоспецифического определения фран- сисел.
Формула изобретения
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК
pRD6 - источник зонда для тестирования бактерий рода Franclsella размером 3476 п.о. и содержащая ДНК вектора pUC 19, размером 2686 п.о.; EcoRI-EcoRI-фрагмент
ДНК хромосомы F, tuiarensls штамма 10/15 размером 790 п.о.; сайты рестрикции: 3 сайта расщепления по Alul и однин сайт по Cfol; генетические маркеры: атрг-устойчивость к ампициллину.
2. Штамм бактерий Escherichla coll KM 7. содержащий рекомбинантную плазмид- ную ДНК pRD6 - источник зонда для тестирования бактерий рода Franclsella.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть использовано для обнаружения представителей рода FRANCISELLA методом молекулярной гибридизации. Цель изобретения - создание штамма E. COLI, содержащего рекомбинантную плазмиду с фрагментом ДНК, комплиментарным видоспецифическому участку хромосомной ДНК FRANCISELLA TULARENSIS. Плазмида является источником зонда для обнаружения франсисел. Сконструирован штамм путем введения в E. COLI JM 103 с помощью генетической трансформации искусственно полученной рекомбинантной плазмиды PRD 6 с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДНК туляремийного микроба. Плазмида является источником ДНК-зонда для обнаружения франсисел. Штамм депонирован в Музее живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института "Микроб" под номером E. COLIJM 103PRD 6 КМ 7. 1 табл.
Frannsflta c.novicida
ichi a col
Г, i г (; i n i л p с ч т i к
С ГЧ1-ИЯ psciidotnbercu l
( . ГЧ1П13 «nn-rticulllic.l
(irsini.i k r i ч г гпчеп t i i
О. гsinn viuiTmrttin
V.cl nl,.r,.
Psemlum rt,i ч Teruglru 4H
Рачгourpl1 a mulcocida
К 1 t-Ьч | f | 1 я РПР11П1ОМ i Л
ItucKlm Pruituc vulgaris subcllis Ч i 1 1 a parncyphi Si i , 1 I i ( v-rm cri i llriu i I l.i Ti I itmsis llriif t 11 т a jo rt us
14 I
2f
И
2:
s
2
13 i 2
