ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка представляет собой заявку PCT, которая испрашивает приоритет и преимущество по заявке США 62/867503, поданной 27 июня 2019 г.; международной заявке PCT/KR2019/010244, поданной 12 августа 2019 г.; заявке США 16/715462, поданной 16 декабря 2019 г.; заявке США 62/991493, поданной 18 марта 2020 г.; заявке США 63/004827, поданной 3 апреля 2020 г.; заявке США 63/043237, поданной 24 июня 2020 г., содержание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рак остается одной из основных причин смерти в мире. Согласно недавно проведенной статистике, 13% населения Земли умирает от рака. В соответствии с оценками Международного агентства по изучению рака (IARC), в 2012 г. по всему миру было зарегистрировано 14,1 миллиона новых случаев рака и 8,2 миллиона смертей от рака. Ожидается, что к 2030 г. глобальная нагрузка возрастет до 21,7 миллиона новых случаев рака и 13 миллионов смертей от рака вследствие увеличения и старения населения и воздействия факторов риска, таких как курение, нездоровое питание и отсутствие физической активности. Кроме того, боль и медицинские расходы на лечение рака снижают качество жизни как для раковых пациентов, так и для их семей.
T-клетки, сконструированные с химерными антигенными рецепторами (CAR-T), обладают большим терапевтическим потенциалом в отношении лечения заболеваний, таких как рак. Терапевтические средства на основе CAR-T придают T-клеткам мощную аффинность к мишени и сигнальную функцию. Однако впечатляющая эффективность терапевтических средств на основе CAR-T часто сопровождается тяжелыми побочными эффектами, такими как синдром высвобождения цитокинов (СВЦ). Таким образом, остается неудовлетворенная потребность в разработке терапевтических средств на основе CAR-T и стратегий, обладающих меньшими побочными эффектами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном документе предложены иммунные клетки, содержащие химерный антигенный рецептор (CAR), причем (CAR) содержит: (a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен; (b) трансмембранный домен; и (c) внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор представляет собой один полипептид. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор состоит из двух полипептидов.
В некоторых вариантах осуществления костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот, причем пять дополнительных аминокислот кодируются SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий эндодомен содержит SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен является гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен является человеческим. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывает антиген, ассоциированный с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывает опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: глипикана-3 (GPC3), вариантного рецептора злокачественного образования (MVR) и CD19.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен выбран из белка, выбранного из группы, состоящей из: 4-1BB/CD137, активирующего NK-клетки рецептора, белка иммуноглобулина, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD3 гамма, CD3 дзета, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8 альфа, CD8 бета, CD96 (Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, цитокинового рецептора, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc-гамма-рецептора, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, Ig альфа (CD79a), IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, индуцибельного костимулятора T-клеток (ICOS), интегрина, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, лиганда, который специфически связывается с CD83, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), связанного с функцией лимфоцитов антигена-1 (LFA-1), молекулы ГКГС класса 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, белка 1 запрограммированной гибели (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), сигнальной активирующей лимфоциты молекулы (белка SLAM), SLAM (SLAMF1), SLAMF4 (CD244), SLAMF6 (NTB-A), SLAMF7, SLP-76, белка рецептора TNF, TNFR2, TNFSF14, рецептора лиганда Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 и VLA-6. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен из CD8α. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен дополнительно содержит внутриклеточный домен из CD3ζ.
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор дополнительно содержит сигнальный пептид или лидерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор дополнительно содержит шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область CD8α. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор дополнительно дополнительный антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления дополнительный антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой иммунную клетку человека. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка человека представляет собой аутологичную иммунную клетку человека. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка человека представляет собой аллогенную иммунную клетку человека. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой T-клетку. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой NK-клетку.
В данном документе предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие химерный антигенный рецептор (CAR), причем химерный антигенный рецептор содержит: (a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен; (b) трансмембранный домен; и (c) внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор представляет собой один полипептид. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор состоит из двух полипептидов.
В некоторых вариантах осуществления костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот, причем пять дополнительных аминокислот кодируются нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий эндодомен содержит SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен является гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен является человеческим. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывает антиген, ассоциированный с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывает опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: гликана-3 (GPC3), вариантного рецептора злокачественного образования (MVR) и CD19.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен выбран из белка, выбранного из группы, состоящей из: 4-1BB/CD137, активирующего NK-клетки рецептора, белка иммуноглобулина, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD3 гамма, CD3 дзета, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8 альфа, CD8 бета, CD96 (Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, цитокинового рецептора, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc-гамма-рецептора, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, Ig альфа (CD79a), IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, индуцибельного костимулятора T-клеток (ICOS), интегрина, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, лиганда, который специфически связывается с CD83, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), связанного с функцией лимфоцитов антигена-1 (LFA-1), молекулы ГКГС класса 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, белка 1 запрограммированной гибели (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), сигнальной активирующей лимфоциты молекулы (белка SLAM), SLAM (SLAMF1), SLAMF4 (CD244), SLAMF6 (NTB-A), SLAMF7, SLP-76, белка рецептора TNF, TNFR2, TNFSF14, рецептора лиганда Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 и VLA-6. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен из CD8 альфа.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен дополнительно содержит внутриклеточный домен из CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор дополнительно содержит сигнальный пептид или лидерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор дополнительно содержит шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область CD8α.
В данном документе предложены векторы, содержащие любую из описанных в данном документе нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления вектор дополнительно содержит промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой конститутивный промотор. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой индуцибельный промотор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.
В данном документе предложены способы получения сконструированной иммунной клетки, включающие: внесение в иммунную клетку любой из описанных в данном документе нуклеиновых кислот или любого из описанных в данном документе векторов с получением, таким образом, сконструированной иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, после этапа внесения, культивирование сконструированной иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой T-клетку. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой NK-клетку.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, до этапа внесения, получение иммунной клетки от субъекта. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту сконструированной иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления у субъекта был диагностирован или идентифицирован рак.
В данном документе предложены сконструированные иммунные клетки, полученные любым из описанных в данном документе способов.
В данном документе предложены фармацевтические композиции, содержащие любую из описанных в данном документе сконструированных иммунных клеток и фармацевтически приемлемый носитель.
В данном документе предложены способы лечения рака у субъекта, включающие введение субъекту любой из описанных в данном документе сконструированных иммунных клеток или любой из описанных в данном документе фармацевтических композиций. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой анти-глипикан-3-ассоциированный рак, анти-CD19-ассоциированный рак или анти-MVR-ассоциированный рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой карциному, лимфому (например, ходжкинскую и неходжкинскую лимфомы), бластому, саркому, лейкоз, плоскоклеточную карциному, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, перитонеальный рак, гепатоцеллюлярную карциному, рак желудка, рак поджелудочной железы, глиому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, другие лимфопролиферативные расстройства и различные типы рака головы и шеи. В некоторых вариантах осуществления субъект ранее получал один или более видов противораковой терапии, выбранных из группы, состоящей из: ионизирующего облучения, химиотерапевтического агента, терапевтического антитела и ингибитора контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления у субъекта был идентифицирован или диагностирован рак.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг.1 приведено схематическое изображение типовой конструкции MVR CAR.
На Фиг.2 приведены типовые результаты картирования ферментов после клонирования MVRL2H2-4-1BB.
На Фиг.3 приведены результаты по расщеплению рестрикционными ферментами huGC33(VH-VL)-euBBz, причем ожидаемый размер отмечен на ДНК-лэддерах, а результаты приведены на изображениях гель-электрофореза.
На Фиг.4 приведены результаты по расщеплению рестрикционными ферментами huGC33(VH-VL)-BBz, причем ожидаемый размер отмечен на ДНК-лэддере, а результат приведен на изображении гель-электрофореза.
На Фиг.5A приведен график, иллюстрирующий общую кратность экспансии CAR-T-клеток за 11-суточный период in vitro.
На Фиг.5B приведен график со сравнением кратности экспансии CAR-T-клеток in vitro.
На Фиг.5C приведен график, иллюстрирующий жизнеспособность CAR-T-клеток in vitro.
На Фиг.6 приведен анализ T-клеток, трансдуцированных huGC33(VH-VL)-euBBz и huGC33(VH-VL)-BBz для экспрессии CAR.
На Фиг.7A приведен график, иллюстрирующий анализ цитотоксичности на основе ЛДГ с клетками-мишенями из линии клеток Huh-7.
На Фиг.7B приведен график, иллюстрирующий анализ цитотоксичности на основе ЛДГ с клетками-мишенями из линии клеток PLC/PRF/5.
На Фиг.8 приведен набор графиков со сравнением in vivo эффективности CAR-T-клеток huGC33(VH-VL)-euBBz и huGC33(VH-VL)-BBz.
На Фиг.9A приведен график, иллюстрирующий число CAR-T-клеток из мышиной модели через 5 недель после инъекции CAR-T-клеток huGC33(VH-VL)-euBBz и huGC33(VH-VL)-BBz.
На Фиг.9B приведен набор графиков со сравнением числа CAR-T-клеток из мышиной модели через 5 недель после инъекции CAR-T-клеток huGC33(VH-VL)-euBBz и huGC33(VH-VL)-BBz.
На Фиг.10 приведен анализ CAR-T-клеток в крови, костном мозге, селезенке и печени мышей через 5 недель после инъекции CAR-T-клеток huGC33(VH-VL)-euBBz и huGC33(VH-VL)-BBz с использованием окрашивания FACS.
На Фиг.11A проиллюстрирована экспрессия CAR в T-клетках, трансдуцированных CD19-BBz и CD19-euBBz.
На Фиг.11B приведен график из анализа цитотоксичности на основе люциферазы, иллюстрирующий активность уничтожения в T-клетках, трансдуцированных CD19-BBz и CD19-euBBz.
На Фиг.12 приведены результаты визуализации IVIS эффекта CAR-T CD19-BBz и CAR-T-клеток CD19-euBBz с использованием животной модели.
На Фиг.13 приведены графики, иллюстрирующие значения фотонов в животной модели после инъекции CD19-BBz CAR-T and CD19-euBBz CAR-T-клеток.
На Фиг.14A приведен набор графиков, иллюстрирующих процент общего числа CAR-T-клеток CD19, присутствующих в крови, с использованием FACS после орбитального забора крови у мышей с 3-4-суточными интервалами.
На Фиг.14B приведен набор графиков, иллюстрирующих процент CD4/CD8 CAR-T-клеток, присутствующих в крови, с использованием FACS после орбитального забора крови у мышей с 3-4-суточными интервалами.
На Фиг.14C приведен график, иллюстрирующий общее число CD19 CAR-T-клеток, присутствующих в крови, с использованием FACS после орбитального забора крови у мышей с 3-4-суточными интервалами.
На Фиг.15A приведено схематическое изображение типовой конструкции GPC3 CAR.
На Фиг.15B приведено схематическое изображение типовой конструкции GPC3 CAR.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном изобретении описаны химерные антигенные рецепторы (CAR), которые содержат костимулирующий эндодомен 4-1BB, а также способы их получения и применения.
Определения
Около: В контексте данного документа термин «около», используемый в отношении значения, относится к значению, которое является сходным в контексте ссылаемого значения. В целом, специалистам в данной области техники, знакомым с контекстом, будет понятна соответствующая степень вариации, заключенная в слове «около» в данном контексте. Например, в некоторых вариантах осуществления термин «около» может охватывать диапазон значений, которые находятся в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее относительно указанного значения.
Введение: В контексте данного документа термин «введение», как правило, относится к введению композиции субъекту или системе для достижения доставки агента, который представляет собой композицию или включен нее. Специалистам в данной области техники известен ряд путей, которые можно, в зависимости от ситуации, использовать для введения субъекту, например человеку. Например, в некоторых вариантах осуществления введение может быть глазным, пероральным, парентеральным, местным и т.д. В некоторых конкретных вариантах осуществления введение может быть бронхиальным (например, путем бронхиальной инстилляции), буккальным, кожным (что может представлять собой или включать, например, одно или более из местного введения в кожу, внутрикожного, межкожного, чрескожного и т.д.), энтеральным, внутриартериальным, внутрикожным, внутрижелудочным, интрамедуллярным, внутримышечным, интраназальным, внутрибрюшинным, интратекальным, внутривенным, внутрижелудочковым, введением в конкретный орган (например, внутрипеченочным), мукозальным, назальным, пероральным, ректальным, подкожным, сублингвальным, местным, трахеальным (например, путем интратрахеальной инстилляции), вагинальным, витреальным и т.д. В некоторых вариантах осуществления введение может включать одну дозу, несколько доз или фиксированное число доз. В некоторых вариантах осуществления введение может включать дробное введение (например, множество доз, разделенных во времени) и/или периодическое введение (например, отдельные дозы, разделенные общим периодом времени). В некоторых вариантах осуществления введение может включать непрерывное дозирование (например, перфузию) в течение по меньшей мере выбранного периода времени.
Аффинность: Как известно в данной области техники, «аффинность» является показателем силы, с которой конкретный лиганд связывается со своим партнером. Аффинность можно измерять разными способами. В некоторых вариантах осуществления аффинность измеряют с помощью количественного анализа. В некоторых таких вариантах осуществления концентрация партнера по связыванию может быть фиксированной так, чтобы находиться в избытке относительно концентрации лиганда, чтобы имитировать физиологические условия. В альтернативном или дополнительном варианте, в некоторых вариантах осуществления концентрация партнера по связыванию и/или концентрация лиганда могут варьироваться. В некоторых таких вариантах осуществления можно проводить сравнение аффинности с референсом в сравнимых условиях (например, концентрациях).
Агент-антитело: В контексте данного документа термин «агент-антитело» может относиться к агенту, который специфически связывается с конкретным антигеном. В некоторых вариантах осуществления этот термин охватывает любой полипептид или полипептидный комплекс, который содержит структурные элементы иммуноглобулина, достаточные для обеспечения специфического связывания. Типовые агенты-антитела включают, но не ограничиваются этим, моноклональные антитела, поликлональные антитела и их фрагменты. В некоторых вариантах осуществления агент-антитело может содержать один или более элементов последовательности, которые являются гуманизированными, приматизированными, химерными и т.д., как известно в данной области техники. Во многих вариантах осуществления термин «агент-антитело» используется для обозначения одной или более известных в данной области техники конструкций или одного или более форматов для использования структурных и функциональных характеристик антитела в альтернативном представлении. Например, в некоторых вариантах осуществления агент-антитело, используемый в соответствии с настоящим изобретением, находится в формате, выбранном из, без ограничения, интактных антител IgA, IgG, IgE или IgM; би- или мультиспецифических антител (например, зитела®,и т.д.); фрагментов антител, таких как фрагменты Fab, фрагменты Fab’, фрагменты F(ab’)2, фрагменты Fd’, фрагменты Fd, и выделенных CDR или их наборов; одноцепочечных Fv; слияний полипептид-Fc; однодоменных антител (например, однодоменных антител акул, таких как IgNAR, или их фрагментов); антител верблюжьих; замаскированных антител (например, протела®); малых модульных иммунофармацевтических средств («SMIP™»); одноцепочечных или тандемных диател (TandAb®); VHH; антикалинов®; нанотел®; минител; BiTE®s; белков с анкириновыми повторами или DARPIN®; авимеров®; DART; TCR-подобных антител; аднектинов®; аффилинов®; транс-тел®; аффител®; TrimerX®; микробелков; финомеров®, центиринов®; и KAFBITOR®s. В некоторых вариантах осуществления в агенте-антителе может отсутствовать ковалентная модификация (например, присоединение гликана), которую бы он имел при естественном получении. В некоторых вариантах осуществления агент-антитело может содержать ковалентную модификацию (например, присоединение гликана, нагрузку [например, выявляемый фрагмент, терапевтический фрагмент, каталитический фрагмент и т.д.] или другую подвешенную группу [например, полиэтиленгликоль и т.д.]. Во многих вариантах осуществления агент-антитело представляет собой или содержит полипептид, чья аминокислотная последовательность содержит один или более структурных элементов, известных специалистам в данной области техники как определяющие комплементарность области (CDR). В некоторых вариантах осуществления агент-антитело представляет собой или содержит аминокислотную последовательность, которая включает по меньшей мере одну CDR (например, по меньшей мере одну CDR тяжелой цепи и/или по меньшей мере одну CDR легкой цепи), которая является по существу идентичной таковой в референсном антителе. В некоторых вариантах осуществления включенная CDR является по существу идентичной референсной CDR в том, что она является идентичной по последовательности или содержит 1-5 аминокислотных замен по сравнению с референсной CDR. В некоторых вариантах осуществления включенная CDR является по существу идентичной референсной CDR в том, что она демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с референсной CDR. В некоторых вариантах осуществления включенная CDR является по существу идентичной референсной CDR в том, что она демонстрирует по меньшей мере 96%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с референсной CDR. В некоторых вариантах осуществления включенная CDR является по существу идентичной референсной CDR в том, что по меньшей мере одна аминокислота во включенной CDR удалена, добавлена или заменена по сравнению с референсной CDR, но включенная CDR имеет аминокислотную последовательность, которая в остальном идентична референсной CDR. В некоторых вариантах осуществления включенная CDR является по существу идентичной референсной CDR в том, что 1-5 аминокислот во включенной CDR удалены, добавлены или заменены по сравнению с референсной CDR, но включенная CDR имеет аминокислотную последовательность, которая в остальном идентична референсной CDR. В некоторых вариантах осуществления включенная CDR является по существу идентичной референсной CDR в том, что по меньшей мере одна аминокислота во включенной CDR заменена по сравнению с референсной CDR, но включенная CDR имеет аминокислотную последовательность, которая в остальном идентична референсной CDR. В некоторых вариантах осуществления включенная CDR является по существу идентичной референсной CDR в том, что 1-5 аминокислот во включенной CDR удалены, добавлены или заменены по сравнению с референсной CDR, но включенная CDR имеет аминокислотную последовательность, которая в остальном идентична референсной CDR. В некоторых вариантах осуществления агент-антитело представляет собой или содержит полипептид, чья аминокислотная последовательность содержит структурные элементы, известные специалистам в данной области техники как вариабельный домен иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления агент-антитело представляет собой полипептид или белок, имеющий связывающий домен, который является гомологичным или большей частью гомологичным связывающему домену иммуноглобулина. Во некоторых вариантах осуществления агент-антитело представляет собой или содержит по меньшей мере часть химерного антигенного рецептора (CAR).
Антиген: В контексте данного документа термин «антиген» может относиться к агенту, который связывается с агентом-антителом. В некоторых вариантах осуществления антиген связывается с агентом-антителом и может индуцировать или нет конкретный физиологический ответ в организме. В общем случае антиген может представлять собой или включать любое химическое соединение, такое как, например, малая молекул, нуклеиновая кислота, полипептид, углевод, липид, полимер (включая биологические полимеры [например, полимеры нуклеиновых кислот и/или аминокислот] и полимеры, отличные от биологических полимеров [например, отличные от полимера нуклеиновых кислот или аминокислот]) и т.д. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой или включает полипептид. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой или включает гликан. В общем случае специалистам в данной области техники понятно, что антиген может быть предоставлен в выделенной или чистой форме или, в альтернативном варианте, может быть предоставлен в неочищенной форме (например, вместе с другими материалами, например, в экстракте, таком как клеточный экстракт, или другом относительно неочищенном препарате антиген-содержащего источника). В некоторых определенных вариантах осуществления антиген представлен в клеточном контексте (например, антиген экспрессируется на поверхности клетки или экспрессируется в клетке). В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой рекомбинантный антиген.
Антигенсвязывающий домен: В контексте данного документа термин «антигенсвязывающий домен» может относиться к агенту-антителу или его части, которые специфически связываются с фрагментом- или объектом-мишенью. Как правило, взаимодействие между антигенсвязывающим доменом и его мишенью является нековалентным. В некоторых вариантах осуществления фрагмент- или объект-мишень может относиться к любому химическому классу, включая, например, углевод, липид, нуклеиновую кислоту, металл, полипептид или малую молекулу. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен может представлять собой или включать полипептид (или его комплекс). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен является частью слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен является частью химерного антигенного рецептора (CAR).
Связанный с: В контексте данного документа два события или объекта «связаны» друг с другом, если наличие, уровень и/или форма одного коррелируют с таковыми другого. Например, конкретный объект (например, полипептид, генетическая сигнатура, метаболит, микроб и т.д.) считается связанным с конкретным заболеванием, нарушением или патологическим состоянием, если его наличие, уровень и/или форма коррелируют с частотой заболевания, нарушения или патологического состояния и/или восприимчивостью нему (например, среди соответствующей популяции). В некоторых вариантах осуществления два или более объекта физически «связаны» друг с другом, если они взаимодействуют, напрямую или опосредовано, так что они находятся и/или остаются в физической близости друг с другом. В некоторых вариантах осуществления два или более объекта, которые физически связаны друг с другом, ковалентно связаны друг с другом. В некоторых вариантах осуществления два или более объекта, которые физически связаны друг с другом, не связаны друг с другом ковалентно, а связаны нековалентно, например, посредством водородных связей, взаимодействия Ван-дер-Ваальса, гидрофобных взаимодействий, магнетизма и их комбинаций.
Связывание: Следует понимать, что в контексте данного документа термин «связывание», как правило, относится к нековалентной ассоциации между двумя или более объектами. «Прямое» связывание включает физический контакт между объектами или фрагментами. Непрямое связывание включает физическое взаимодействие посредством физического контакта с одним или более промежуточными объектами. Связывание между двумя объектами, как правило, можно оценивать в любом из ряда случаев, включая случаи, когда взаимодействующие объекты или фрагменты изучают в выделенном состоянии или в контексте более сложных систем (например, в ковалентной или иной ассоциации с носителем и/или в биологической системе или клетке).
Рак: В контексте данного документа термины «рак», «злокачественное образование», «новообразование», «опухоль» и «карцинома относятся к клеткам, которые демонстрируют относительно аномальный, неконтролируемый и/или автономный рост так, что они демонстрируют аберрантный фенотип роста, характеризующийся значительной потерей регуляции пролиферации клеток. В некоторых вариантах осуществления опухоль может представлять собой или содержать клетки, которые являются предраковыми (например, доброкачественными), злокачественными, предметастатическими, метастатическими и/или неметастатическими. В настоящем изобретении явным образом определены определенные виды рака, к которым в особенности применимы его идеи. В некоторых вариантах осуществления рак релевантный рак можно охарактеризовать как солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления рак релевантный рак можно охарактеризовать как гематологическую опухоль. В общем случае примеры разных типов рака, известных в данной области техники, включают, например, гемопоэтические виды рака, включая лейкозы, лимфомы (ходжкинские и неходжкинские), миеломы и миелопролиферативные расстройства; саркомы, меланомы, аденомы, карциномы солидной ткани, плоскоклеточные карциномы ротовой полости, горла, гортани и легкого, рак печени, раки органов мочеполовой системы, такие как рак предстательной железы, шейки матки, мочевого пузыря, матки и эндометрия, и почечно-клеточные карциномы, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, кожную или интраокулярную меланому, рак органов эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, раки головы и шеи, рак молочной железы, раки желудочно-кишечного тракта и раки нервной системы, доброкачественные поражения, такие как папилломы, и т.п.
CDR: В контексте данного документа термин «CDR» может относиться к определяющей комплементарность области в рамках вариабельной области агента-антитела. В каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи существует три CDR, которые обозначают CDR1, CDR2 и CDR3 для каждой из вариабельных областей. «Набор из CDR» или «набор CDR» относится к группе из трех или шести CDR, которые находятся в одной вариабельной области, способной связывать антиген, или CDR вариабельных областей когнатных тяжелой и легкой цепей, способным связывать антиген. В данной области техники были установлены определенные системы для определения границ CDR (например, Kabat, Chothia и т.д.); специалистам в данной области техники известна разница между этими системами и они могут определить границы CDR в степени, необходимой для понимания и практической реализации заявляемого изобретения.
Химиотерапевтический агент: В контексте данного документа термин «химиотерапевтический агент» имеет свое стандартное в данной области техники значение и относится к одному или более проапоптотическим, цитостатическим и/или цитотоксическим агентам, в частности, например, включая агенты, применяемые и/или рекомендуемые для применения в лечении одного или более заболеваний, расстройств или патологических состояний, связанных с нежелательной клеточной пролиферацией. Во многих вариантах осуществления химиотерапевтические агенты применимы в лечении рака. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтический агент может представлять собой или содержать один или более алкилирующих агентов, один или более антрациклинов, один или более цитоскелетных разрушителей (например, нацеленных на микротрубочки агентов, таких как таксаны, майтанзин и их аналоги), один или более эпотилонов, один или более ингибиторов гистондеацетилазы (HDAC), один или более ингибиторов топоизомеразы (например, ингибиторы топоизомеразы I и/или топоизомеразы II), один или более ингибиторов киназы, один или более нуклеотидных аналогов или аналогов нуклеотидных предшественников, один или более пептидных антибиотиков, один или более агентов на основе платины, один или более ретиноидов, один или более алкалоидов барвинка и/или один или более аналогов одного или более из следующего (т.е. которые обладают релевантной антипролиферативной активностью). В некоторых конкретных вариантах осуществления химиотерапевтический агент может представлять собой или содержать одно или более из актиномицина, полностью транс-ретиноевой кислоты, ауристатина, азацитидина, азатиоприна, блеомицина, бортезомиба, карбоплатина, капецитабина, цисплатина, хлорамбуцила, циклофосфамида, куркумина, цитарабина, даунорубицина, доцетаксела, доксифлуридина, доксорубицина, эпирубицина, эпотилона, этопозида, фторурацила, гемцитабина, гидроксимочевины, идарубицина, иматиниба, иринотекана, майтанзина и/или его аналогов (например DM1), мехлорэтамина, меркаптопурина, метотрексата, митоксантрона, майтанзиноида, оксалиплатина, паклитаксела, пеметрекседа, тенипозида, тиогуанина, топотекана, валрубицина, винбластина, винкристина, виндезина, винорелбина и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтический агент можно применять в контексте конъюгата антитело - лекарственный препарат.В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтический агент представляет собой агент из конъюгата антитело - лекарственный препарат, выбранного из группы, состоящей из: hLL1-доксорубицина, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLL1-Pro-2-P-Dox, P4/D10-доксорубицина, гемтузумаба озогамицина, брентуксимаба ведотина, трастузумаба эмтанзина, инотузумаба озогамицина, глембатумомаба ведотина, SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, анти-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, ворзетузумаба мафодотина или лорвотузумаба мертанзина.
Сконструированный: В общем случае термин «сконструированный» может относится к аспекту, связанному с манипуляциями со стороны человека. Например, полипептид считается «сконструированным», если полипептидная последовательность была подвергнута манипуляциям со стороны человека. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сконструированный полипептид содержит последовательность, которая содержит одну или более аминокислотных мутаций, делеций и/или вставок, которые были внесены человеком в референсную полипептидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид включает полипептид, который был слит (т.е. ковалентно связан) человеком с одним или более дополнительными полипептидами с образованием слитого полипептида, который бы не возник естественным образом in vivo. Аналогично, клетка или организм считаются «сконструированными», если они были подвергнуты манипуляциям, которые привели к изменению их генетической информации (например, был внесен новый генетический материал, который ранее отсутствовал, например, путем трансформации, спаривания, соматической гибридизации, трансфекции, трансдукции или другого механизма, или же ранее присутствующий генетический материал был изменен или удален, например, путем мутации замены или делеции мутации или с помощью протоколов спаривания). Как принято на практике и понятно специалистам в данной области техники, производные и/или потомство сконструированных полипептида или клетки, как правило, также называют «сконструированными», даже если фактическим манипуляциям был подвергнут предшествующий объект.
Клетка-хозяин: В контексте данного документа термин «клетка-хозяин» может относиться к клетке организма, которая была отобрана, модифицирована, трансформирована, выращена, использована или подвергнута другим манипуляциям для выработки материала клеткой, например, для экспрессии клеткой гена, последовательности ДНК или РНК, белка или фермента. Клетки-хозяева могут включать иммунные клетки, включая, но не ограничиваясь этим, лимфоциты (например, T-клетки, B-клетки и NK-клетки), нейтрофилы и моноциты/макрофаги.
In vitro: В контексте данного документа термин «in vitro» относится к событиям, которые происходят в искусственном окружении, например в пробирке или реакционном сосуде, в культуре клеток и т.д., а не в многоклеточном организме.
In vivo: В контексте данного документа термин «in vivo» относится к событиям, которые происходят в многоклеточном организме, таком как человек и отличное от человека животное. В контексте клеточных систем этот термин можно использовать для обозначения событий, которые происходят внутри живой клетки (в отличие, например, от систем in vitro).
Выделенный: В контексте данного документа термин «выделенный» может относиться к веществу и/или объекту, которые были (1) отделены по меньшей мере от некоторых компонентов, с которыми они были связаны при первоначальной выработке (в природе и/или в экспериментальных условиях), и/или (2) сконструированы, получены, изготовлены и/или произведены вручную. Выделенные вещества и/или объекты могут быть отделены от около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более чем около 99% других компонентов, с которыми они были первоначально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные агенты имеют чистоту около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более чем около 99%. В контексте данного документа вещество является «чистым», если оно по существу не содержит других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, как будет понятно специалистам в данной области техники, вещество может все еще считаться «выделенным» или даже «чистым» после объединения с некоторыми другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или эксципиентов (например, буфер, растворитель, вода и т.д.); в таких вариантах осуществления процент выделения или чистоты вещества рассчитывают без учета таких носителей или эксципиентов. Например, в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, такой как полипептид или полинуклеотид, который встречается в природе, считается «выделенным», когда: a) в силу своего происхождения или источника получения он не связан с некоторыми или всеми из компонентов, которые находятся вместе с ним в его естественном состоянии в природе; b) он по существу не содержит других полипептидов или нуклеиновых кислот того же вида, который его вырабатывает в природе; c) экспрессируется или иным образом находится в ассоциации с компонентами клетки или другой экспрессионной системы, которая не относится к виду, который его вырабатывает в природе. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, который синтезирован химически или синтезирован в клеточной системе, отличной от той, которая вырабатывает его в природе, считается «выделенным» полипептидом. В некоторых альтернативных или дополнительных вариантах осуществления полипептид, который был подвергнут одному или более способам очистки, может считаться «выделенным» полипептидом в той степени, в которой он был отделен от других компонентов, а) с которыми он связан в природе; и/или b) с которыми он был связан при первоначальной выработке.
Функционально связанный: В контексте данного документа термин «функционально связанный» может относиться к взаимному расположению, в котором описываемые таким образом компоненты находятся во взаимосвязи, обеспечивающей осуществление их функций предполагаемым образом. Регуляторный элемент, «функционально связанный» с функциональным элементом, связан таким образом, чтобы экспрессия и/или активность функционального элемента достигалась в условиях, совместимых с регуляторным элементом. В некоторых вариантах осуществления «функционально связанные» регуляторные элементы являются непрерывными (например, ковалентно связанными) с представляющими интерес кодирующими элементами. В некоторых вариантах осуществления регуляторные элементы действуют в транс-положении или ином положении относительно представляющего интерес функционального элемента.
Фармацевтическая композиция: В контексте данного документа термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции, в которой активный агент составлен вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями. В некоторых вариантах осуществления композиция подходит для введения субъекту-человеку или животному. В некоторых вариантах осуществления активный агент присутствует в количестве единичной дозы, подходящем для введения в рамках терапевтической схемы, которая демонстрирует статистически значимую вероятность достижения заданного терапевтического эффекта при введении соответствующей популяции.
Полипептид: В контексте данного документа термин «полипептид» в общем случае имеет сове известное в данной области техники значение полимера из по меньшей мере трех аминокислот.Специалистам в данной области техники понятно, что термин «полипептид» является достаточно общим, чтобы включать не только полипептиды, имеющие полную приведенную в данном документе последовательность, но также включать полипептиды, которые представляют функциональные фрагменты (т.е. фрагменты, сохраняющие по меньшей мере один вид активности) таких полных полипептидов. Кроме того, специалистам в данной области техники понятно, что белковые последовательности в общем случае допускают некоторое количество замен без нарушения активности. Таким образом, любой полипептид, который сохраняет активность и обладает по меньшей мере 30-40% общей идентичности последовательности, часто более чем около 50%, 60%, 70% или 80%, и дополнительно обычно содержащий по меньшей мере одну область намного большей идентичности, часто больше чем около 90% или даже 95%, 96%, 97%, 98% или 99% в одной или более высококонсервативных областях, обычно содержащих по меньшей мере 3-4 и часто до 20 или более аминокислот, с любым полипептидом того же класса, включен в соответствующий термин «полипептид» в контексте данного документа. Полипептиды могут содержать L-аминокислоты, D-аминокислоты или и те, и другие, и могут содержать любые из ряда аминокислотных модификаций или аналогов, известных в данной области техники. Применимые модификации включают, например, концевое ацетилирование, амидирование, метилирование и т.д. В некоторых вариантах осуществления белки могут содержать природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их комбинации. Термин «пептид» в общем случае используют для обозначения полипептида, имеющего длину менее чем около 100 аминокислот, менее чем около 50 аминокислот, менее чем 20 аминокислот или менее чем 10 аминокислот.В некоторых вариантах осуществления белки представляют собой агенты антител, фрагменты антител, их биологически активные части и/или их характерные части.
Предотвращать или предотвращение: В контексте данного документа термины «предотвращать» или «предотвращение», используемые в связи с появлением заболевания, расстройства и/или патологического состояния, могут относиться к снижению риска развития заболевания, расстройства и/или патологического состояния и/или к отсрочке появления и/или тяжести одной или более характеристик или одного или более симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния. В некоторых вариантах осуществления предотвращение оценивают на популяционном основании, при этом считается, что агент «предотвращает» конкретное заболевание, расстройство или патологическое состояние, если в популяции, подверженной заболеванию, расстройству или патологическому состоянию, наблюдается статистически значимое снижение развития, частоты и/или интенсивности одного или более симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния.
Рекомбинантный: В контексте данного документа термин «рекомбинантный» может относиться к полипептидам, которые разработаны, сконструированы, получены, экспрессированы, созданы, произведены и/или выделены с помощью рекомбинантных средств, таким как полипептиды, экспрессируемые с помощью рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина; полипептидам, выделенным из рекомбинантной комбинаторной библиотеки полипептидов человека; полипептидам, выделенным из организма животного (например, мыши, кролика, овцы, рыбы и т.д.), которое является трансгенным или подвергалось иным манипуляциям для экспрессии гена или генов, или компонентов генов, которые кодируют и/или управляют экспрессий полипептида или одного или более его компонентов, частей, элементов или доменов; и/или полипептидам, полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любыми другими способами, которые включают сплайсинг или лигирование выбранных элементов последовательности нуклеиновых кислот друг с другом, химический синтез выбранных элементов последовательности и/или получение иным образом нуклеиновой кислоты, которая кодирует и/или управляет экспрессией полипептида или одного или более из его компонентов, частей, элементов или доменов. В некоторых вариантах осуществления один или более таких выбранных элементов последовательности встречаются в природе. В некоторых вариантах осуществления один или более таких выбранных элементов последовательности сконструированы in silico. В некоторых вариантах осуществления один или более таких выбранных элементов последовательности являются результатом мутагенеза (например, in vivo или in vitro) известного элемента последовательности, например, из природного или синтетического источника, например, из зародышевой линии представляющего интерес исходного организма (например, человека, мыши и т.д.).
Специфическое связывание: В контексте данного документа термин «специфическое связывание» может относиться к способности различения возможных партнеров по связыванию в окружении, в котором может происходить связывание. Говорят, что связывающий агент, который взаимодействует с одной конкретной мишенью, когда присутствуют другие потенциальные мишени, «специфически связывается» с мишенью, с которой он взаимодействует.В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание оценивают путем выявления или определения степени ассоциации между связывающим агентом и его партнером. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание оценивают путем выявления или определения степени диссоциации комплекса связывающий агент - партнер; в некоторых вариантах осуществления специфическое связывание оценивают путем выявления или определения способности связывающего агента конкурентно подавлять альтернативное взаимодействие его партнера и другого объекта. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание оцениваю, проводя такое выявление или определение в некотором диапазоне концентраций.
Субъект: В контексте данного документа термин «субъект» относится к организму, как правило, млекопитающему (например, человеку, в некоторых вариантах осуществления, включая пренатальные человеческие формы). В некоторых вариантах осуществления субъект страдает соответствующим заболеванием, расстройством или патологическим состоянием. В некоторых вариантах осуществления субъект предрасположен к заболеванию, расстройству или патологическому состоянию. В некоторых вариантах осуществления субъект демонстрирует один или более симптомов или характеристик заболевания, расстройства или патологического состояния. В некоторых вариантах осуществления субъект не демонстрирует любые из симптомов или характеристик заболевания, расстройства или патологического состояния. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой лицо с одной или более показательными характеристиками предрасположенности к заболеванию, расстройству или или патологическому состоянию или их риска. В некоторых вариантах осуществления субъектом является пациент.В некоторых вариантах осуществления субъектом является индивид, которому поставлен диагноз и/или назначена терапия.
Терапевтический агент: В контексте данного документа выражение «терапевтический агент» в целом относится к любому агенту, который вызывает необходимый фармакологический эффект при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления агент считается терапевтическим, если он демонстрирует статистически значимый эффект в соответствующей популяции. В некоторых вариантах осуществления подходящая популяция может представлять собой популяцию модельных организмов. В некоторых вариантах осуществления подходящая популяция может определяться различными критериями, такими как определенная возрастная группа, пол, генетический фон, предсуществующие клинические состояния и т.д. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой вещество, которое можно использовать для облегчения, ослабления, улучшения, подавления, предотвращения, задержки начала, уменьшения тяжести и/или уменьшения частоты одного или более симптомов или признаков заболевания, расстройства и/или патологического состояния. В некоторых вариантах осуществления «терапевтический агент» представляет собой агент, который был одобрен или должен быть одобрен правительственным агентством, прежде чем он может быть выведен на рынок для введения людям. В некоторых вариантах осуществления «терапевтический агент» представляет собой агент, для введения которого человеку требуется предписание врача.
Терапевтически эффективное количество: В контексте данного документа термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, которое является достаточным при введении популяции, страдающей или подверженной заболеванию, расстройству и/или патологическому состоянию, в соответствии с терапевтической схемой дозирования для лечения заболевания, расстройства и/или патологического состояния. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое снижает частоту и/или тяжесть, стабилизирует одну или более характеристик и/или сдерживает появление одного или более симптомов заболевания, расстройства и/или патологического состояния. Специалистам в данной области техники понятно, что термин «терапевтически эффективное количество» на самом деле не подразумевает обеспечение успешного лечения конкретного индивида. Скорее, терапевтически эффективное количество может представлять собой такое количество, которое обеспечивает конкретный необходимый фармакологический ответ у значительного числа субъектов при введении пациентам, нуждающимся в таком лечении. Например, в некоторых вариантах осуществления «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое при введении нуждающемуся в этом индивиду в контексте терапии по изобретению будет блокировать, стабилизировать, ослаблять или обращать способствующий раку процесс, происходящий в организме указанного индивида, или будет усиливать или повышать подавляющий рак процесс в организме указанного индивида. В контексте лечения рака «терапевтически эффективное количество» представляет собой количество, которое при введении индивиду, у которого диагностирован рак, будет предотвращать, стабилизировать, ингибировать или снижать дальнейшее развитие раку у индивида. В особенности предпочтительно, чтобы «терапевтически эффективное количество» описанной в данном документе композиции обращало (при терапевтическом лечении) развитие злокачественного образования, такого как карцинома поджелудочной железы, или помогало обеспечивать или продлевать ремиссию злокачественного образования. Терапевтически эффективное количество, вводимое индивиду для лечения рака у этого индивида, может быть таким же или отличаться от терапевтически эффективного количества, вводимого для стимуляции ремиссии или ингибирования метастазов. Как и в случае большинства видов противораковой терапии, описанные в данном документе терапевтические способы не следует интерпретировать как сводящиеся к «излечению рака» или иным образом ограниченные этим; скорее, способы лечения направлены на применение описанных композиций для «лечения» рака, т.е. обеспечения необходимого или благоприятного изменения состояния здоровья индивида, имеющего рак. Такие благоприятные эффекты известны поставщикам медицинских услуг в области онкологии и включают, но не ограничиваются этим, стабилизацию состояния пациента, уменьшение размера опухоли (регрессию опухоли), улучшение показателей жизнедеятельности (например, улучшение функции раковых тканей или органов), уменьшение или ингибирование дополнительных метастазов, уменьшение оппортунистический инфекций, повышение выживаемости, уменьшение боли, улучшение двигательной функции, улучшение когнитивной функции, улучшение ощущений энергичности (жизненный тонус, уменьшение недомогания), улучшение самочувствия, восстановление нормального аппетита, восстановления здорового веса и их комбинации. Кроме того, регрессию конкретной опухоли у индивида (например, в результате описанного в данном документе лечения) также можно оценивать путем взятия образцов раковых клеток из места опухоли, такой как аденокарцинома поджелудочной железы (например, в течение курса лечения), и исследования раковых клеток в отношении уровня метаболических и сигнальных маркеров для отслеживания статуса раковых клеток, чтобы верифицировать на молекулярном уровне регрессию раковых клеток до менее злокачественного фенотипа. Например, на регрессию опухоли, индуцированную применением способов по данному изобретению, указывало бы обнаружение снижения любого из проангиогенных маркеров, обсуждаемых выше, повышения анти-ангиогенных маркеров, описанных в данном документе, нормализации (т.е. изменения в направлении состояния, присущего нормальным индивидам, не имеющим рак) метаболических путей, путей межклеточной сигнализации или путей внутриклеточной сигнализации, которые демонстрируют аномальную активность у индивидов, у которых диагностирован рак. Специалистам в данной области техники понятно, что в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество можно составлять и/или вводить в виде однократной дозы. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество можно составлять и/или вводить в виде множества доз, например, как часть схемы дозирования.
Трансфекция: В контексте данного документа термин «трансфекция» может относиться к внесению чужеродной нуклеиновой кислоты в клетку с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В контексте данного документа термин «трансформация» может относиться к внесению чужеродных гена, последовательности ДНК или РНК в клетку-хозяина так, чтобы клетка-хозяин экспрессировала внесенные ген или последовательность для выработки кодируемого белка или фермента.
Трансдукция: В контексте данного документа термин «трандукция» может относиться к внесению чужеродной нуклеиновой кислоты в клетку с помощью вирусного вектора.
Вариант: В данном документе в контексте молекул, например нуклеиновых кислот, белков или малых молекул, термин «вариант» может относиться к молекуле, которая демонстрирует значительную структурную идентичность с референсной молекулой, но структурно отличается от референсной молекулы, например присутствием или отсутствием, или уровнем одного или более химических фрагментов по сравнению с референсным объектом. В некоторых вариантах осуществления вариант также функционально отличается от его референсной молекулы. В общем, то, приемлемо ли считать конкретную молекулу «вариантом» референсной молекулы, зависит от степени ее структурной идентичности с референсной молекулой. Как понятно специалистам в данной области техники, любая биологическая или химическая референсная молекула имеет определенные характерные структурные элементы. Вариант по определению представляет собой отличную молекулу, которая обладает одним или более такими характерными структурными элементами, но отличается по меньшей мере в одном аспекте от референсной молекулы. В качестве лишь некоторых примеров, полипептид может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества аминокислот, имеющих обозначенные позиции относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве и/или являющихся частью определенного структурного мотива и/или биологической функции; нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества нуклеотидных остатков, имеющих обозначенные позиции относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве. В некоторых вариантах осуществления вариантные полипептид или нуклеиновая кислота могут отличаться от референсных полипептида или нуклеиновой кислоты за счет одного или более отличий в аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления вариантные полипептид или нуклеиновая кислота демонстрируют общую идентичность последовательности с референсными полипептидом или нуклеиновой кислотой, которая составляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. В некоторых вариантах осуществления вариантные полипептид или нуклеиновая кислота не обладают по меньшей мере одним характерным элементом последовательности с референсными полипептидом или нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления референсные полипептид или нуклеиновая кислота обладают одним или более видами биологической активности. В некоторых вариантах осуществления вариантные полипептид или нуклеиновая кислота обладают одним или более видами биологической активности референсных полипептида или нуклеиновой кислоты.
Вектор: В контексте данного документа термин «вектор» может относиться к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Векторы могут включать как невирусные, таки и вирусные носители для внесения молекул нуклеиновых кислот в клетки in vitro, ex vivo или in vivo.
Вектор может представлять собой репликон с другим фрагментом ДНК, присоединенным для амплификации присоединенного фрагмента. Термин «репликон» относится к любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме или вирусу), который способен действовать как автономная единица in vivo репликации ДНК. Многие векторы, известные в данной области техники, можно использовать для конструирования нуклеиновых кислот, включения элементов ответа и промоторов в гены и т.п.Предпочтительные векторы включают, но не ограничиваются этим, плазмиды (например, производные плазмид PBR322 или pUC), модифицированные вирусы (например, аденовирусы, ретровирусы, аденоассоциированные вирусы или герпесвирусы), или векторы Bluescript. Например, фрагменты ДНК, соответствующие элементам ответа и промоторам, можно вставлять в соответствующие векторы посредством объединения соответствующих фрагментов ДНК с выбранными векторами, имеющими комплементарные «липкие» концы. В некоторых вариантах осуществления концы молекул ДНК можно ферментативно модифицировать или можно создавать любой сайт путем связывания нуклеотидной последовательности с концами ДНК посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления можно создавать векторы, содержащие ген селективного маркера, для скрининга клеток, в чей клеточный геном включен этот маркер. Такие маркеры делают возможными идентификацию и/или скрининг клеток-хозяев, экспрессирующих белок, кодируемый маркером.
Одним типом вектора является «плазмида», которая относится к двухцепочечной кольцевой ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к независимой репликации в клетке-хозяине, в которую они внесены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки-хозяина после внесения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы могут управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе «экспрессионными векторами». Неограничивающие примеры экспрессионных векторов и пакующих конструкций, которые можно использовать для доставки описанных в данном документе химерных антигенных рецепторов, включают ретровирусные векторы (например, SFG, pMX, pSAMEN, pMP71, pLXSN, pMSCV, pMSGV), лентивирусные векторы (например, epHIW, pLenO, pSIN, pSIEW, pELPS, pELNS, pHR), пакующие конструкции (psPAX2, pRDF, pEQ-PAM3(-E), pVSVg, pCL, pMEVSVg, pMD2G, pMDLg/p.RRE, pRSV.REV, pTSV.rev, pCHGP, pCMV-g, pCMV-Rev2, pCMVdR8.91, pGALV).
В некоторых вариантах осуществления вектор обеспечивает необходимые регуляторные последовательности (например, транскрипционные и трансляционные элементы) для регуляции экспрессии слитого белка в соответствующей клетке-хозяине. Регуляторные последовательности могут содержать промоторные области, энхансерные области, сайты терминации транскрипции, сайты связывания рибосом, кодоны инициации, сигналы сплайсинга, интроны, сигналы полиаденилирования, трансляционные последовательности Шайна - Дальгарно и консенсусные последовательности Козака. Регуляторную последовательность выбирают с учетом клетки-хозяина, в которой будет вырабатываться слитый белок. В некоторых вариантах осуществления подходящие бактериальные промоторы включают, но не ограничиваются этим, бактериофаг λpL или pR, T6, T7, T7/lacO, lac, recA, gal, trp, ara, hut и trp-lac. В некоторых вариантах осуществления подходящие эукариотические промоторы включают, но не ограничиваются этим, промоторы PRBI, GAPDH, металлотионеина, тимидинкиназы, вирусных ДКП, цитомегаловируса, SV40, или тканеспецифические или опухолеспецифические промоторы, такие как промотор a-фетопротеина, амилазы, катепсина E, мускаринового рецептора M1 или g-глутамилтрансферазы.
В некоторых вариантах осуществления дополнительные векторы включают липоплексы (катионные комплексы липосома - ДНК), полиплексы (катионные комплексы полимер - ДНК) и комплексы белок - ДНК. Помимо нуклеиновых кислот векторы также могут содержать одну или более регуляторных областей и/или один или более селективных маркеров, применимых для отбора, измерения и отслеживания результатов доставки нуклеиновой кислоты (например, доставку в определенную ткань или длительность экспрессии).
Векторы можно вносить в клетку-хозяина методами, известными в данной области техники, такими как инъекция, трансфекция, электропорация, микроинъекция, трансдукция, клеточное слияние, липофекция, осаждение фосфатом кальция (Graham, F.L. et al, Virology, 52: 456 (1973), Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987)), опосредованный липосомами текстурированный солевой метод (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87 (1980), Nicolau and Sene, Biochim. Biophys.Acta, 721: 185-190 (1982), Nicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987)), обработка ДЭАЭ-декстраном (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)), генную бомбардировку (Yang et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)) с использованием векторных транспортеров генов или ДНК (смотрите Wu et al, J. Biol. Chem. 267: 963 (1992), Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621 (1988), Hartmut et al, Canadian Patent Application No. 2,012,311).
В некоторых вариантах осуществления вирусные векторы использовали в широком диапазоне применений для переноса генов в клетках, а также в живых субъектах-животных. Вирусные векторы, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются этим, векторы на основе аденовируса, ретровируса, вируса осповакцины, поксвируса, аденоассоциированного вируса, вируса простого герпеса, лентивируса, бакуловируса, вируса Сендай, вируса кори, вируса обезьян 40 и вируса Эпштейна - Барр. Невирусные векторы включают плазмиды, липоплексы (катионные комплексы липосома - ДНК), полиплексы (катионные комплексы полимер - ДНК) и комплексы белок - ДНК. Помимо нуклеиновых кислот векторы могут содержать одну или более регуляторных областей и/или один или более селективных маркеров, применимых для скрининга, измерения и отслеживания результатов доставки нуклеиновой кислоты (например, доставку в ткань или продолжительность экспрессии).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды можно вносить in vivo с помощью липофекции. Применение липосом для инкапсуляции и трансфекции нуклеиновых кислот in vitro возросло. В некоторых вариантах осуществления для получения липосом для in vivo трансфекции генов можно использовать синтетические катионные липиды, предназначенные для уменьшения трудностей и рисков, связанных с опосредованной липосомами трансфекцией (Feigner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413 (1987), Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027 (1988), Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)). В некоторых вариантах осуществления применение катионных липидов может способствовать инкапсуляции отрицательно заряженных нуклеиновых кислот и может также способствовать слиянию с отрицательно заряженными клеточными мембранами (Feigner et al., Science 337:387 (1989)). В частности, применимые липидные соединения и композиции для доставки нуклеиновых кислот описаны в W095/18863, W096/17823 и U.S. 5459127, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления, в частности, будет необходима прямая трансфекция в конкретные типы клеток в случае тканей с клеточной гетерогенностью, таких как поджелудочная железа, печень, почки и головной мозг.В некоторых вариантах осуществления липиды могут химически связываться с другими молекулами для нацеливания (Mackey et al, 1988). В некоторых вариантах осуществления нацеленные пептиды, такие как гормоны или нейромедиаторы, и белки, такие как антитела, или непептидные молекулы могут быть химически связаны с липосомами.
Для получения рекомбинантных ДНК, синтеза олигонуклеотидов и культивирования и трансформации тканей можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию). Ферментативные реакции и очистку можно осуществлять в соответствии со спецификациями производителя, или как это обычно делается в данной области техники, или как описано в данном документе. Вышеприведенные методики и процедуры в общем случае можно осуществлять в соответствии с традиционными методами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных общих и более конкретных справочных материалах, которые цитируются и обсуждаются в тексте данного описания. Смотрите, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), которая включена в данный документ посредством ссылки в любых целях.
Сконструированные иммунные клетки
В контексте данного документа термин «иммунные клетки» относится к клеткам иммунной системы, которые можно классифицировать как лимфоциты (например, T-клетки, B-клетки и NK-клетки), нейтрофилы и моноциты/макрофаги. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой T-клетку. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой NK-клетку. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой макрофаг. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой сконструированную иммунную клетку, что означает, что иммунная клетка была генетически модифицирована для экспрессии не встречающегося в природе белка (например, химерного антигенного рецептора) или для включения экзогенной нуклеиновой кислоты.
Иммунные клетки (например, T-клетки) можно модифицировать одним или более способами. Иммунные клетки (например, T-клетки) могут экспрессировать по меньшей мере одну неприродную молекулу, которая является рецептором для антигена, который присутствует на поверхности одного или более типов клеток. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки включают иммунные клетки (например, T-клетки), которые не встречаются в природе, поскольку они сконструированы так, чтобы содержать или экспрессировать по меньшей мере одну синтетическую молекулу, которая не встречаются в природе. В конкретных вариантах осуществления иммунные клетки (например, T-клетки) сконструированы так, чтобы экспрессировать по меньшей мере один химерный антигенный рецептор (CAR), включая CAR, нацеленный на конкретный опухолевый антиген, такой как глипикан-3 (GPC3), вариант рецептора злокачественного образования (MVR), HLA-DR (белок, родственный человеческому лейкоцитарному антигену D) или CD19. В конкретных вариантах осуществления иммунная клетка может представлять собой T-клетку, например, CD4+T-клетку, CD8+T-клетку, Treg-клетку, Th1 T-клетку, Th2 T-клетку, Thl7 T-клетку, неспецифическую T-клетку или популяцию T-клеток, которая содержит комбинацию любых из вышеприведенных клеток. Иммунные клетки (например, T-клетки), сконструированные с химерными антигенными рецепторами (CAR-T-клетки), обладают большим терапевтическим потенциалом в отношении лечения рака. С помощью CAR можно перепрограммировать рецептор так, чтобы он распознавал антиген, который при связывании активирует иммунные клетки для уничтожения клетки, экспрессирующей этот антиген. Следовательно, иммунные клетки, экспрессирующие CAR для антигена, экспрессируемого на опухолевой клетке, могут нацеливаться на опухолевую клетку и уничтожать ее. Например, недавние клинические исследования CD19-нацеленных CAR-трансдуцированных T-клеток (CD19-CAR T-клеток) против гематологических злокачественных образований продемонстрировали впечатляющий эффект технологии CAR T. (Kochenderfer, J. N. et al. (2010) Blood 116: 4099-4102; Porter, D. L., et al. (2011) N. Engl. J. Med. 365: 725-733; Grupp, S. A. et al. (2013) N. Engl. J. Med. 368: 1509-1518; Kochenderfer, J. N. et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33: 540-549; Brown, C. E. et al. (2016) N. Engl. J. Med. 375: 2561-2569). Клинический успех CAR T связан, по меньшей мере частично, со слитой структурой CAR, которую создают путем искусственного объединения антигенсвязывающего домена с некоторым количеством сигнальных доменов (Maus, M. V. et al. (2014) Blood 123: 2625-2635; van der Stegen, S. J. et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14: 499-509).
CAR содержат внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), способный распознавать опухолеассоциированный антиген, трансмембранный домен содержит трансмембранный домен из молекул, таких как CD8 и CD28, а внутриклеточный сигнальный домен содержит иммунорецепторный тирозиновый мотив активации (например, CD3ζ) внутриклеточный сигнальный домен костимулирующей сигнальной молекулы (например, CD28 и CD137 (4-1BB)).
В контексте данного документа термин «одноцепочечный вариабельный фрагмент scFv» относится к фрагменту антитела, определяемому как рекомбинантный белок, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), соединенные линкером, которые соединяет два домена вместе с образованием антигенсвязывающего сайта.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен из белка, выбранного из 4-1BB/CD137, активирующего NK-клетки рецептора, белка иммуноглобулина, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD3 гамма, CD3 дзета, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8 альфа, CD8 бета, CD96 (Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, цитокинового рецептора, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc-гамма-рецептора, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, Ig альфа (CD79a), IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, индуцибельного костимулятора T-клеток (ICOS), интегрина, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, лиганда, который специфически связывается с CD83, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), связанного с функцией лимфоцитов антигена-1 (LFA-1), молекулы ГКГС класса 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, белка 1 запрограммированной гибели (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), сигнальной активирующей лимфоциты молекулы (белка SLAM), SLAM (SLAMF1), SLAMF4 (CD244), SLAMF6 (NTB-A), SLAMF7, SLP-76, белка рецептора TNF, TNFR2, TNFSF14, рецептора лиганда Toll, CE/RANKL, VLA1 и VLA-6.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит внутриклеточный сигнальный домен из белка, выбранного из 4-1BB/CD137, активирующего NK-клетки рецептора, белка иммуноглобулина, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD3 гамма, CD3 дзета, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8 альфа, CD8 бета, CD96 (Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, цитокинового рецептора, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc-гамма-рецептора, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, Ig альфа (CD79a), IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, индуцибельного костимулятора T-клеток (ICOS), интегрина, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, лиганда, который специфически связывается с CD83, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), связанного с функцией лимфоцитов антигена-1 (LFA-1), молекулы ГКГС класса 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, белка 1 запрограммированной гибели (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), сигнальной активирующей лимфоциты молекулы (белка SLAM), SLAM (SLAMF1), SLAMF4 (CD244), SLAMF6 (NTB-A), SLAMF7, SLP-76, белка рецептора TNF, TNFR2, TNFSF14, рецептора лиганда Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 и VLA-6, или любой их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор дополнительно дополнительный антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор представляет собой биспецифический CAR (т.е. нацеленный на два антигенсвязывающих домена). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор является многовалентным (т.е. нацеленным на много антигенсвязывающих доменов). В некоторых вариантах осуществления дополнительный антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
Иммунные клетки (например, T-клетки) могут быть получены из любого источника, известного в данной области техники. Например, иммунные (например, T) клетки можно дифференцировать in vitro из популяции гемопоэтических стволовых клеток или иммунные (например, T) клетки можно получать от субъекта. T-клетки можно получать из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), костного мозга, ткани лимфатических узлов, пуповинной крови, ткани вилочковой железы, ткани из места инфекции, асцитов, плеврального выпота, ткани селезенки или опухолей. Кроме того, иммунные (например, T) клетки могут быть получены из одной или более линий иммунных клеток, доступных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки могут быть получены из крови, полученной от субъекта, с использованием любого количества методов, известных специалисту в данной области техники, таких как разделение FICOLL™ и/или аферез. Дополнительные методы выделения Т-клеток для Т-клеточной терапии описаны в публикации патента США №2013/0287748. Другие неограничивающие примеры можно найти в международной заявке №PCT/US2015/014520 (опубликованной как WO2015/120096) и в международной заявке №PCT/US2016/057983 (опубликованной как WO2017/070395), каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой аутологичные T-клетки. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки получены от субъекта, который не является пациентом. В некоторых вариантах осуществления T-клетки для применения в терапевтическом способе являются сингенными (донор и реципиент разные, но являются идентичными близнецами). В некоторых вариантах осуществления T-клетки для применения в терапевтическом способе являются аллогенными (от одного вида, но отличного доноров) для субъекта-реципиента. В некоторых вариантах осуществления T-клетки представляют собой аутологичные стволовые клетки (для терапии аутологичными стволовыми клетками или ТАСТ). В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой неаутологичные T-клетки. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки получены от здорового донора. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки получены от пациента, имеющего рак или опухоль.
T-клетки могут быть сконструированы для экспрессии, например, химерных антигенных рецепторов (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR-T-клетки могут быть сконструированы для экспрессии внеклеточного одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv). В некоторых вариантах осуществления CAR сконструирован так, чтобы костимулирующий домен экспрессировался в виде отдельной полипептидной цепи. Типовые варианты терапии на основе CAR-T-клеток и конструкции описаны в публикациях патентов США №№2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309 и 2014/0050708, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
Конструкция CAR
В настоящем изобретении предложены, по меньшей мере частично, полипептиды химерных антигенных рецепторов (CAR). В контексте данного документа термин «химерный антигенный рецептор (CAR)» относится к рецептору, не встречающемуся в природе и способному придавать иммунной эффекторной клетке специфичность к конкретному антигену. В некоторых вариантах осуществления CAR относится к рецептору, используемому для обеспечения специфичности моноклонального антитела T-клетке. В общем случае CAR содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен (эктодомен), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (эндодомен).
В некоторых вариантах осуществления для обеспечения хорошей экспансии, функции, персистенции и противоопухолевой активности иммунных (например, CAR-T) клеток можно добавлять костимулирующие сигналы путем включения внутриклеточных сигнальных доменов из костимулирующих молекул иммунных клеток (например, T-клеток) в конструкцию CAR. В некоторых вариантах осуществления выбор и расположение костимулирующих доменов в конструкции CAR может влиять на функцию и судьбу иммунных (например, CAR-T) клеток и оказывать различное влияние на кинетику, цитотоксические функции и потенциально профиль безопасности иммунных (например, CAR-T) клеток. Неограничивающие примеры костимулирующих молекул включают CD28, ICOS, CD27, 4-1BB/CD137, OX40 и CD40L.
В контексте данного документа 4-1BB/CD137 представляет собой индуцируемую активацией костимулирующую молекулу T-клеток, экспрессируемую на подгруппе покоящихся CD8+T-клеток, чья регуляция повышается как на CD4+, так и на CD8+T-клетках после активации. В некоторых вариантах осуществления T-клетки, экспрессирующие CAR, которые содержат домены 4-1BB/CD137, могут экспрессировать гранзим B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF и антиапоптотический белок Bcl-XL (Zhong et al., Mol. Ther. 2010; 18: 413-420), причем CAR, содержащие костимулирующий домен 4-1BB/CD137, могут демонстрировать более длительную персистенцию CAR-T-клеток (Zhao et al., Cancer Cell 2015; 28: 415-428). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен химерного рецептора, описанного в данном документе, содержит сигнальный домен 4-1BB, за которым следует последовательность из пяти аминокислот, который может быть дополнительно скомбинирован с любыми другими необходимыми внеклеточными, трансмембранными и/или внутриклеточными доменами, применимыми в контексте химерного рецептора.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит: (a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен; (b) трансмембранный домен; и (c) внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот. В данном документе предусматривается, что конструкция CAR может содержать внеклеточный домен, направленный на любой необходимый антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот, причем пять дополнительных аминокислот кодируются SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий эндодомен содержит SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий эндодомен содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 2 или 4.
SEQ ID NO: 1 - пять аминокислот (последовательность ДНК)
CGTTTCTCTGTTGTT
SEQ ID NO: 2 - костимулирующий домен 4-1BB с пятью дополнительными аминокислотами (последовательность ДНК)
CGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
SEQ ID NO: 3 - пять аминокислот (аминокислотная последовательность)
RFSVV
SEQ ID NO: 4 - костимулирующий домен 4-1BB с пятью дополнительными аминокислотами (аминокислотная последовательность)
RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR содержит антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывает антиген, ассоциированный с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывает опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывается с любым числом мишеней, включая поверхностные антигены, цитоплазматические или ядерные антигены. Например, антигенсвязывающий домен может связывать BCMA, CD2, CD3, CD4, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD33, CD38, CD44, CD52, CD70, CD99, CD138, CD123, CD274, TIM-3, членов семейства рецепторов эпидермального фактора роста (erb1, erb2, erb3, erb4 и их мутантов), членов семейства рецепторов эфрина (EphA1-10, EphB1-6), простат-специфические антигены (например, антиген стволовых клеток предстательной железы PSCA, простат-специфический мембранный антиген PSMA), эмбриональные антигены (например, карциноэмбриональный антиген CEA, фетальный ацетилхолиновый рецептор), членов семейства фактора роста сосудистого эндотелия (VEGFR 1-3), эпителиальную молекулу клеточной адгезии EpCAM, альфафетопротеин AFP, членов семейства белков муцина (например, MUC1, MUC16), рецептор фолликулостимулирующего гормона (FSHR), человеческий высокомолекулярный меланома-ассоциированный антиген (HMW-MAA), фолат-связывающий белок FBP, a-фолатный рецептор, лиганды рецептора NKG2D, членов семейства эпителиальных гликопротеинов (например EGP-2, EGP-4), дисиалоганглиозиды (например, GD2, GD3), членов семейства угольной ангидразы (например, CAIX) и членов семейства углеводных антигенов (например, Ley), включая мутантов указанных белков и белковых семейств. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен может связываться с антителами или их фрагментами, которые связываются с цитоплазматическими или ядерными антигенами, такими как антиген La/SSB, члены семейства Rho ГТФаз, члены семейства белков высокомобильной группы и другие. Аналогично, антигенсвязывающий домен может связываться с альфа и бета или гамма и дельта цепями T-клеточного рецептора (ТКР) или их фрагментами. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен может связываться с пептидами, которые презентируются белковыми комплексами человеческого лейкоцитарного антигена класса (HLA) I и II. Примеры включают, но не ограничиваются этим, ТКР, специфические в отношении пептидов, полученных из белков, таких как белки семейства EGFR, сурвивин, белок семейства sry-подобной высокомобильной группы (SOX), меланома-ассоциированные антигены (например аутоиммуногенный раково-тестикулярный антиген NY-ESO-1, члены семейства антигенов меланомы A MAGEA, предпочтительно экспрессируемый антиген меланомы PRAME, gp100, MART-1) и лейкоз--ассоциированные антигены (например, AML1-ETO, DEK-CAN, PML-RAR-альфа, Flt3-ITD, NPM1, AurA, Bcl-2, Bl-1, BMI1, BRAP, CML28, CML66, циклин A, циклин Bl, циклин E, CYP1B1, ETO/MTG8, G250/CAIX, HOXA9, hTERT, Mcl-1, MAGE, мезотелин, mHAg, миелопероксидаза, MPP11, MUC1, NuSAP1, OFA/iLRP, PASD1, PRAME, протеиназа 3, RAGE-1, RGS5, RHAMM, SSX2IP, сурвивин, ген опухоли Вильмса 1 (WT1)). Антигенсвязывающий домен может связываться с цитокиновыми рецепторами (например, рецептором IL-13, рецептором IL-22), рецепторами NKG2D (например, ULBP1, ULBP2), членами семейства EGFR или аутореактивными ТКР. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен специфически связывается с опухолевыми антигенами. Примеры включают, но не ограничиваются этим, глипикан-3 (GPC), вариантный рецептор злокачественного образования (MVR), HLA-DR (родственный человеческому лейкоцитарному антигену D), AFP, CEA, CA-125, MUC-1, ETA, тирозиназу, MAGE, незрелый рецептор ламинина, TAG-72, HPV E6, HPV E7, BING-4, кальций-активируемый хлорный канал 2, циклин-B1, 9D7, Ep-CAM, EphA3, Her2/neu, теломеразу, мезотелин, SAP-1, сурвивин, NY-ESO-1/LAGE-1, PRAME, SSX-2, BRCA1/2, CDK4, CML66 или CD19. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой или содержит агент-антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой или содержит агент-антитело, которое специфически связывается с GPC3, MVR, HLA-DR или CD19.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен из белка, выбранного из 4-1BB/CD137, активирующего NK-клетки рецептора, белка иммуноглобулина, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD3 гамма, CD3 дзета, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8 альфа, CD8 бета, CD96 (Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, цитокинового рецептора, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc-гамма-рецептора, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, Ig альфа (CD79a), IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, индуцибельного костимулятора T-клеток (ICOS), интегрина, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, лиганда, который специфически связывается с CD83, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), связанного с функцией лимфоцитов антигена-1 (LFA-1), молекулы ГКГС класса 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, белка 1 запрограммированной гибели (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), сигнальной активирующей лимфоциты молекулы (белка SLAM), SLAM (SLAMF1), SLAMF4 (CD244), SLAMF6 (NTB-A), SLAMF7, SLP-76, белка рецептора TNF, TNFR2, TNFSF14, рецептора лиганда Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 и VLA-6. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен из CD8α. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO: 5 - CD8/шарнирная область/трансмембранная область
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCTAGCCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен дополнительно содержит внутриклеточный домен из CD3ζ. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 6 - CD3ζ
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит саморасщепляющийся пептид T2A. В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит сигнальный пептид или лидерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит лидерную последовательность CD8α. В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит последовательность тега flag. В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область CD8α. В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 7 или 8.
SEQ ID NO: 7 - лидерная последовательность CD8α
GGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG
SEQ ID NO: 8 - последовательность тега flag
GACTACAAGGACGACGATGACAAG
GPC3 CAR
Глипикан-3 (GPC3) представляет собой белок клеточной поверхности, кодируемый у человека геном GPC3 и онкофетальный антиген, повторно экспрессируемый с высокой частотой неопластических гепатоцитов (Vidali, et al, 2008, J hepatol 48:399-406). GPC3 экспрессируется на высоком уровне в печени плода и не экспрессируется в нормальной ткани печени взрослого человека, но его экспрессия повторно активируется при гепатоцеллюлярной карциноме и тесно связана с развитием рака печени, причем уровень выявления экспрессии GPC3 является относительно высоким во время ранней стадии рака печени и повышается с развитием рака печени. Кроме того, GPC3 также экспрессируется в таких опухолях, как меланома, светлоклеточная карцинома яичника, опухоль желточного мешка, нейробластома и другие опухоли. С учетом его специфической высокой экспрессии при гепатоцеллюлярной карциноме, меланоме и других опухолях, GPC3 стал полезным иммуногистохимическим диагностическим тестом (Anatelli, et al., 2008, Am J Clin Path 130:219-223) и потенциальным биомаркером (Aburatani, 2005, J Gastroenterol 40. SI 6: 1-6).
GPC3 является членом семейства протеогликанов, который функционирует как внеклеточный матрикс при клеточной адгезии при органогенезе или как рецептор фактора клеточного роста. Белковая сердцевина GPC3 содержит две субъединицы, и N-концевую субъединицу и C-концевую субъединицу. Гликозилфосфатидилинозитольный (GPI) якорь добавлен к серину в позиции 560, расположенной на карбокси (C)-концевой стороне GPC3. GPI-якорь играет роль в локализации GPC3 на клеточной поверхности посредством ковалентного связывания с липидом клеточной мембраны. Также серин в позиции 495 и серин в позиции 509 GPC3 модифицированы цепью гепарансульфата (ГС-цепью), при этом известно, что ГС-цепь регулирует множество путей передачи сигналов роста, таких как пути передачи сигнала Wnt, сигнала FGF и сигнала BMP. Известно, что вовлеченный путь передачи сигналов роста отличается среди разных типов рака. Например, при гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК) клетки растут за счет стимуляции пути сигнала Wnt.
В настоящем изобретении предложены, по меньшей мере частично, полипептиды GPC3 CAR. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен GPC3 CAR содержит антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой или содержит агент-антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой или содержит агент-антитело, которое специфически связывается с GPC3.
В некоторых вариантах осуществления полипептид химерного антигенного рецептора (CAR) содержит: i) внеклеточный антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 9; CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10; и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11; вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 12; CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 13; и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 14; ii) трансмембранный домен; и iii) внутриклеточный сигнальный домен, который приводит к активации T-клеток, когда антиген связывается с агентом-антителом.
В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит: i) внеклеточный антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 15, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 16; ii) трансмембранный домен; и iii) внутриклеточный сигнальный домен, который приводит к активации T-клеток, когда антиген связывается с агентом-антителом. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит: i) внеклеточный антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 17, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 18; ii) трансмембранный домен; и iii) внутриклеточный сигнальный домен, который приводит к активации T-клеток, когда антиген связывается с агентом-антителом.
В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит: i) внеклеточный антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 15; и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 16; ii) трансмембранный домен; и iii) внутриклеточный сигнальный домен, который приводит к активации T-клеток, когда антиген связывается с агентом-антителом.
SEQ ID NO: 15 - вариабельная область легкой цепи GC33 человека (аминокислотная последовательность)
DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO: 16 - вариабельная область тяжелой цепи GC33 человека (аминокислотная последовательность)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWIGALDPKTGDTAYSQKFKGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 17 - вариабельная область легкой цепи GC33 человека (последовательность ДНК)
GACGTCGTTATGACACAGAGTCCCCTCTCCTTGCCGGTGACCCTGGGTCAGCCTGCGTCCATCTCTTGCAGATCCTCCCAGTCTCTGGTACACTCCAACGGCAACACATACTTGCACTGGTACCAACAAAGACCTGGTCAGTCACCGCGACTTCTCATATATAAAGTTTCCAATAGGTTCAGTGGAGTGCCAGACAGGTTCAGTGGTTCAGGATCAGGCACTGATTTCACGCTTAAAATCAGTCGGGTTGAGGCGGAGGACGTAGGAGTTTACTATTGCAGCCAGAATACGCACGTGCCGCCTACTTTTGGCTCTGGAACCAAGTTGGAAATAAAG
SEQ ID NO: 18 - вариабельная область тяжелой цепи GC33 человека (последовательность ДНК)
CAAGTGCAACTCGTACAATCAGGTGCTGAAGTCAAAAAGCCGGGAGCCTCTGTTAAAGTGTCCTGTAAAGCCAGCGGCTACACCTTTACCGATTATGAGATGCACTGGGTTCGGCAGGCTCCGGGCCAAGGTCTGGAGTGGATCGGGGCTCTTGACCCAAAGACGGGCGACACGGCTTATTCACAAAAATTCAAAGGTAGGGCTACTCTGACTGCCGATAAGTCCACCAGCACCGCGTATATGGAGCTCTCTAGCTTGCGAAGCGAGGACACGGCGGTGTACTATTGCACACGCTTCTATAGTTACACATATTGGGGTCAAGGCACGCTTGTGACCGTGTCTAGC
MVR CAR
Человеческий лейкоцитарный антиген-DR (HLA-DR) представляет собой классическую молекулу главного комплекса гистосовместимости II (Shackelford, D. A. et al., 1982 Immunol. Rev. 66: 133-187). HLA-DR и его лиганд, пептид длиной в 9 аминокислот или более, составляют лиганд для T-клеточного рецептора (ТКР). Регуляция молекул HLA-DR повышается в ответ на сигнализацию. В случае инфекции пептид (такой как пептид I стафилококкового энтеротоксина) связывается молекулой DR и презентируется T-клеточным рецепторам на T-хелперных клетках. Затем эти клетки связываются с антигенами на поверхности B-клеток, стимулируя пролиферацию B-клеток.
Основной функцией HLA-DR является презентация пептидных антигенов, потенциально чужеродных по происхождению, иммунной системе с целью вызвать или подавить ответы T-(хелперных)-клеток, которые в конечном итоге приводят к выработке антител против этого пептидного антигена. HLA-DR представляет собой αβ-гетеродимер, рецептор клеточной поверхности, каждая субъединица которого содержит два внеклеточных домена, трансмембранный домен и цитоплазматический хвост. Как α, так и β цепи закреплены в мембране. N-концевой домен зрелого белка образует альфа-спираль, которая составляет открытую часть связывающей бороздки, C-концевая цитоплазматическая область взаимодействует с другой цепью, образуя бета-складку под связывающей бороздкой, идущую к клеточной мембране. Большинство контактных позиций пептида находятся в первых 80 остатках каждой цепи.
HLA-DR характеризуется ограниченной экспрессией на антигенпрезентирующих клетках, например, дендритных клетках, макрофагах, моноцитах и B-клетках. Повышенное присутствие «антигена» HLA-DR на поверхности клетки часто является ответом на стимуляцию и, следовательно, HLA-DR также является маркером иммунной стимуляции. По причине высокого уровня экспрессии HLA-DR при B-клеточных злокачественных образованиях и ограниченного спектра экспрессии на нормальных клетках были разработаны и исследованы антитела против HLA-DR для B-клеточных злокачественных образований в доклинических и клинических исследованиях. (Nagy, Z. A., et al. (2002) Nat. Med. 8: 801-807; DeNardo, G.L., et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11: 7075s-7079s; Ivanov, A., et al. (2009) J. Clin. Invest. 119: 2143-2159; Lin, T.S., et al. (2009) Leuk. Lymphoma 50: 1958-1963). При исследовании фазы I/II, хотя токсичность не была серьезной, дополнительное исследование прекратили из-за ограниченной эффективности (Lin, T.S., et al. (2009) Leuk. Lymphoma 50: 1958-1963).
В контексте данного документа агент-антитело к вариантному рецептору злокачественного образования (MVR) распознает полиморфную область HLA-DR (описанную в публикации заявки на патент США №US 2016-0257762, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки). В настоящем изобретении предложены, по меньшей мере частично, полипептиды MVR CAR. Схематическое изображение типовых конструкций MVR CAR в соответствии с настоящим изобретением приведено на Фиг.1. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен CAR содержит антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой или содержит агент-антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой или содержит агент-антитело, которое специфически связывается с HLA-DR.
В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) из агента-антитела к MVR. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) из агента-антитела к MVR. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 20.
SEQ ID NO: 19 - MVRL2H2 (аминокислотная последовательность)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSTPFTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSRYSVTTWIRQPPGKGLEWLGMIWGGGSTDYNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARNEGDTTAGTWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 20 - MVRL2H2 (последовательность ДНК)
GATATTCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTGACCACATCAACAACTGGCTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATCAGCGGCGCCACCTCTCTGGAAACCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTTCCGGATCTGGGAAGGATTACACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAGTACTGGTCCACCCCCTTCACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTTTCTCCCTGAGTCGGTACTCTGTGCATTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGCTGGGGATGATCTGGGGAGGCGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGACTGACCATATCAAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTCCTTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAATGAGGGCGATACCACCGCCGGCACTTGGTTTGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
CD19 CAR
CD19 представляет собой биомаркер нормальных и неопластических B-клеток, а также фолликулярных дендритных клеток. CD19 играет критически важную роль в установлении характерных порогов сигнализации B-клеток посредством модуляции как зависимой, так и независимой от B-клеточных рецепторов сигнализации. Кроме того, CD19 функционирует как доминантный компонент сигнализации мультимолекулярного комплекса на поверхности зрелых B-клеток наряду с комплементарным рецептором CD21 и мембранным белком тетраспанина CD81 (TAPA-1), а также CD225, причем CD19 также играет критическую роль в поддержании баланса между гуморальным антиген-индуцированным ответом и индукцией толерантности.
В настоящем изобретении предложены, по меньшей мере частично, полипептиды CD19 CAR. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен CAR содержит антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой или содержит агент-антитело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой или содержит агент-антитело, которое специфически связывается с CD19.
В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) из агента-антитела к CD19. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) из агента-антитела к CD19. В некоторых вариантах осуществления полипептид CAR содержит SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 22.
SEQ ID NO: 21 - CD19 (аминокислотная последовательность)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVTWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 22 - CD19 (последовательность ДНК)
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
Нуклеиновые кислоты
В контексте данного документа термин «нуклеиновая кислота» включает любое соединение и/или вещество, которое содержит полинуклеотиды. Типовые нуклеиновые кислоты или полинуклеотиды могут включать, но не ограничиваются этим, рибонуклеиновые кислоты (РНК) и/или дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК).
В некоторых вариантах осуществления конструкции нуклеиновых кислот содержат области, которые кодируют CAR, причем CAR содержит: (a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен; (b) трансмембранный домен; и (c) внутриклеточный домен, содержащий внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот.В некоторых вариантах осуществления конструкции нуклеиновых кислот могут быть вставлены в экспрессионный вектор или вирусный вектор методами, известными в данной области техники, а молекулы нуклеиновых кислот могут быть функционально связаны с последовательностью контроля экспрессии. Неограничивающие примеры экспрессионных векторов включают плазмидные векторы, транспозонные векторы, космидные векторы и векторы, полученные из вирусов (например, векторы, полученные из аденовируса (AV), векторы, полученные из цитомегаловируса (CMV), векторы, полученные из вируса обезьян (SV40), векторы, полученные из аденоассоциированного вируса (AAV), лентивирусные векторы и ретровирусные векторы). В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор представляет собой вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор дополнительно содержит промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой конститутивный промотор. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой индуцибельный промотор. В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор содержит SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 и/или 28. В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 и/или 28.
SEQ ID NO: 23 - промотор EF1α
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
SEQ ID NO: 24 - повтор U5
AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAG
SEQ ID NO: 25 - Gag/Pol
CGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTAT
SEQ ID NO: 26 - cPPT
TAGACTGTAGCCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCTTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGTAATTCCAGCAGAGACAGGGCAAGAAACAGCATACTTCCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACAGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGGATCAAGCAGGAATTTGGCATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAATAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGCT
SEQ ID NO: 27 - последовательность сурка/PRE
ATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG
SEQ ID NO: 28 - R/область
GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCA
Лентивирусный вектор получен из лентивируса. В основе лентивирусных векторов лежит одноцепочечная РНК лентивирусов, которые являются подклассом ретровирусов. В них объединены преимущества клонирующей способности среднего диапазона со стабильной генной экспрессией, причем они способны трансдуцировать делящиеся и неделящиеся клетки, включая нейроны. После инфицирования лентивирусный геном интегрирует трансгены в геном хозяина и стимулирует продолжительную генную экспрессию. Лентивирусные векторы, такие как векторы на основе HIV, являются типовыми ретровирусными векторами для доставки генов. В отличие от других ретровирусов, известно, что векторы на основе HIV включают свои «пассажирские» гены в неделящиеся клетки, следовательно, их можно использовать в лечении устойчивых форм заболевания.
К таким клонирующим и/или экспрессионным последовательностям можно добавлять дополнительные последовательности, чтобы оптимизировать их функцию клонирования и/или экспрессии, облегчить выделение полинуклеотида или улучшить внесение полинуклеотида в клетку. Применение клонирующих векторов, экспрессионных векторов, адаптеров и линкеров хорошо известно в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот вставлены в вектор так, чтобы он был способен экспрессировать CAR по настоящему изобретению при внесении в сконструированную иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой T-клетку.
Получение CAR-T-клеток
В данном документе предложены способы получения иммунных клеток, содержащих CAR. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка, в которую внесен CAR, представляет собой иммунную клетку человека. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой аутологичную иммунную клетку человека. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой аллогенную иммунную клетку человека. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой CD4+T-клетку (хелперную T-клетку, TH-клетку), CD8+T-клетку (цитотоксическую T-клетку, ЦТЛ), T-клетку памяти, регуляторную T-клетку (Treg-клетку), апоптотическую T-клетку, но не ограничивается этим. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой NK-клетку.
В некоторых вариантах осуществления вирусное инфицирование иммунной клетки может включать трансфекцию клетки-хозяина (например, клетки 293T, МКПК, клетки Plat-GP или PA317) экспрессионным вектором CAR и пакующей плазмидой для получения рекомбинантных вирусов и инфицирование иммунной клетки рекомбинантными вирусами. Метод вирусного инфицирования можно осуществлять любым методом, известным в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления перенос экспрессионного вектора CAR в иммунную клетку можно подтвердить путем исследования экспрессии CAR методом проточной цитометрии, нозерн-блоттинга, саузерн-блоттинга, ПЦР (например, РВ-ПЦР), ИФА или вестерн-блоттинга, или исследования экспрессии маркерного гена, вставленного в вектор.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы получения сконструированной иммунной клетки, включающие: внесение в иммунную клетку (i) нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, причем CAR содержит (a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен; (b) трансмембранный домен; и (c) внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот, или (ii) вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, причем CAR содержит (a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен; (b) трансмембранный домен; и (c) внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления для повышения иммунологической эффективности в цитоплазматическом сигнальном домене 4-1BB, в цитоплазматический сигнальный домен 4-1BB, используемый при получении CAR в качестве костимулирующего сигнального фактора, добавлено 5 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полная конструкция содержит антигенсвязывающий домен, который представляет собой scFv; промотор EF1-α; шарнирную область и трансмембранный домен CD8 человека; и внутриклеточный сигнальный домен. В частности, внутриклеточный сигнальный домен содержит стимулирующий домен и костимулирующий сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может содержать альфа, бета или дзета цепь T-клеточного рецептора, один или более из CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154, но не ограничен этим. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит CD8. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточные сигнальные домены содержат костимулирующие сигнальные домены в основном сигнальном домене CD3 дзета, выбранные из CD28, OX40, CD27, ICAM-1, ICOS (CD278) и 4-1BB/CD137. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий домен содержит 4-1BB, к которому добавлены 5 последовательных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий домен связан с CD3 дзета.
В некоторых вариантах осуществления способ получения сконструированной иммунной клетки по настоящему изобретению дополнительно включает культивирование сконструированной иммунной клетки in vitro в течение по меньшей мере 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток или 12 суток.
В некоторых вариантах осуществления способ получения сконструированной иммунной клетки дополнительно включает, после этапа внесения, культивирование сконструированной иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления способ получения сконструированной иммунной клетки дополнительно включает, до этапа внесения, получение иммунной клетки от субъекта.
В контексте настоящего изобретения можно использовать любой известный в данной области техники метод для экспрессии CAR в иммунных клетках. Например, в данной области техники известны различные векторы нуклеиновых кислот для экспрессии, такие как линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, с которыми связано ионное или амфифильное соединение, плазмиды или вирусные векторы, хотя настоящее изобретение и не ограничено ими. В некоторых вариантах осуществления вектор для экспрессии CAR в иммунных клетках может представлять собой или включать автономно реплицирующиеся плазмиду или вирус или их производное. Вирусные векторы могут включать, но не ограничиваются этим, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор, ретровирусный вектор и т.д. В некоторых вариантах осуществления можно использовать лентивирусный вектор, который представляет собой ретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор является соединением, отличным от плазмиды и вируса, таким как, например, липосома.
Настоящее изобретение подразумевает, что CAR-T-клетки, созданные описанными в данном документе методами, могут быть терапевтически применимы (например, для лечения рака).
Терапевтические применения
В данном документе предложены способы лечения субъекта, имеющего рак или другое злокачественное образование, включающие введение субъекту композиции, которая содержит или доставляет иммунную клетку, содержащую CAR. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой анти-глипикан-3-ассоциированный рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой анти-CD19-ассоциированный рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой анти-MVR-ассоциированный рак.
Рак может относиться к широкой группе заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом аномальных клеток в организме. Нерегулируемые деление и рост клеток приводят к образованию злокачественных опухолей или клеток, которые проникают в соседние ткани и также могут метастазировать в отдаленные части тела по лимфатической системе или кровотоку. Рак или раковая ткань может включать опухоль.
«Анти-глипикан-3-ассоциированный рак» представляет собой рак, который характеризуется наличием раковых клеток, на чьей поверхности присутствует глипикан-3. GPC3, мембраносвязанный протеогликан гепарансульфат, сверхэкспрессируется приблизительно в 70%-80% случаях гепатоцеллюлярной карциномы, но обычно не экспрессируется в здоровых тканях. Кроме того, сверхэкспрессию GPC3 можно обнаружить в нескольких опухолях, таких как, без ограничения, гепатоцеллюлярная карцинома, гепатобластома, герминогенные опухоли (например, опухоли желточного мешка, хориокарциномы), опухоль Вильмса, карцинома желудка, немелкоклеточный рак легкого и рак щитовидной железы.
«Анти-CD19-ассоциированный рак» представляет собой рак, который характеризуется экспрессией CD19, причем CD19 играет важную роль в развитии и созревании B-клеток. Экспрессия CD19 является высококонсервативной для большинства B-клеточных опухолей. Он экспрессируется в большинстве случает острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) и B-клеточных лимфом.
«Анти-MVR-ассоциированный рак» характеризуется наличием раковых клеток с повышенной экспрессией антигена HLA-DR по сравнению с нераковыми клетками субъекта. В некоторых вариантах осуществления рак с более высокой экспрессией антигена HLA-DR может включать, но не ограничивается этим, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак эндометрия, рак пищевода, рак фаллопиевой трубы, рак желчного пузыря, рак желудочно-кишечного тракта, рак головы и шеи, гемобластоз, рак гортани, рак печени, рак легкого, лимфому, меланому, мезотелиому, рак яичника, первичный перитонеальный рак, рак слюнной железы, саркому, рак желудка, рак щитовидной железы, рак поджелудочной железы и рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления заболевания, связанные с экспрессией HLA-DR, включают, но не ограничиваются этим, атипичные и/или неклассические раковые заболевания, злокачественные образования, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, экспрессирующие HLA-DR, или любую их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления рак, подлежащий лечению способом по настоящему изобретению, может включать, но не ограничивается этим, карциному, лимфому (например, ходжкинскую и неходжкинскую лимфомы), бластому, саркому и лейкоз. В некоторых вариантах осуществления рак может включать плоскоклеточную карциному, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, перитонеальный рак, гепатоцеллюлярную карциному, рак желудка, рак поджелудочной железы, глиому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатоцеллюлярную карциному, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, лейкоз и другие лимфопролиферативные расстройства и различные типы рака головы и шеи.
В некоторых вариантах осуществления рак, подлежащий лечению способами по настоящему изобретению, представляет собой гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления гемобластоз представляет собой лейкоз. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из одного или более острых лейкозов, включая, без ограничения, B-клеточный острый лимфоидный лейкоз («B-ОЛЛ»), Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз («T-ОЛЛ»), острый лимфоидный лейкоз (ОЛЛ); одного или более хронических лейкозов, включая, без ограничения, хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); дополнительных гемобластозов или гематологических состояний, включая, без ограничения, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, бластому из плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную B-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелко- или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT, мантийноклеточную лимфому, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмабластическую лимфому, бластому из плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и «предлейкоз», которые представляют собой широкий набор гематологических состояний, объединенных неэффективной выработкой (или дисплазией) миелоидных клеток крови.
В некоторых вариантах осуществления рак, подлежащий лечению способами по настоящему изобретению, представляет собой B-клеточную лимфому (т.е. злокачественную лимфому B-клеточного происхождения). B-клеточные лимфомы включают лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, диффузную B-крупноклеточную лимфому (ДВКЛ)), фолликулярную лимфому, лимфому лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), хронический лимфоцитарный лейкоз, мантийноклеточную лимфому (МКЛ), лимфому Беркитта, медиастинальную B-крупноклеточную лимфому, макроглобулинемию Вальденстрема, нодальную B-клеточную лимфому из клеток мергинальной зоны (НМЗЛ), лимфому маргинальной зоны селезенки (ЛМЗС), интраваскулярную B-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфогранулематоз и СПИД-ассоциированную лимфому, но не ограничиваются ими при условии, что лимфома имеет B-клеточное происхождение.
Иммунные клетки (например, CAR-T-клетки) можно вводить в терапевтически эффективном количестве нуждающемуся в этом пациенту. Например, терапевтически эффективное количество иммунных клеток (например, CAR-T-клеток) может составлять по меньшей мере около 104 клеток, по меньшей мере около 105 клеток, по меньшей мере около 106 клеток, по меньшей мере около 107 клеток, по меньшей мере около 108 клеток, по меньшей мере около 109 или по меньшей мере около 1010. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество T-клеток составляет около 104 клеток, около 105 клеток, около 106 клеток, около 107 клеток или около 108 клеток. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество T-клеток составляет от около 0,4×108 до около 2×108 T-клеток. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество T-клеток составляет около 0,4×108, около 0,5×108, около 0,6×108, около 0,7×108, около 0,8×108, около 0,9×108, около 1,0×108, около 1,1×108, около 1,2×l08, около 1,3×108, около 1,4×108, около 1,5×108, около 1,6×108, около 1,7×108, около 1,8×108, около 1,9×108 или около 2,0×108 T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество CAR T-клеток составляет около 2×106 клеток/кг, около 3×106 клеток/кг, около 4×106 клеток/кг, около 5×106 клеток/кг, около 6×106 клеток/кг, около 7×106 клеток/кг, около 8×106 клеток/кг, около 9×106 клеток/кг, около 1×107 клеток/кг, около 2×107 клеток/кг, около 3×107 клеток/кг, около 4×107 клеток/кг, около 5×107 клеток/кг, около 6×107 клеток/кг, около 7×107 клеток/кг, около 8×107 клеток/кг или около 9×107 клеток/кг.В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество иммунных клеток (например, CAR T-клеток) составляет от около 1×106 до около 2×106 T-клеток на кг массы тела вплоть до максимальной дозы около 1×108 T-клеток. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество T-клеток составляет около 1×106 или около 2×106 T-клеток на кг массы тела вплоть до максимальной дозы около 1×108 T-клеток.
Число клеток будет зависеть от предполагаемого применения, для которого предназначена композиция, и типа включенных в нее клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления популяция T-клеток, содержащих CAR, будет содержать более чем 10%, более чем 15%, более чем 20%, более чем 25%, более чем 30% или более чем 35% таких клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция T-клеток, содержащих CAR, будет содержать от 10% до 50%, от 15% до 45%, от 20% до 40%, от 25% до 35% или от 20% до 30% таких T-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция T-клеток для введения находится в объеме, составляющем литр или менее. В некоторых вариантах осуществления T-клетки для введения находятся в объеме менее 500 мл, менее 250 мл или 100 мл или менее. В некоторых вариантах осуществления плотность необходимых T-клеток, как правило, составляет более чем 106 клеток/мл и в общем случае составляет более чем 107 клеток/мл, в общем случае 108 клеток/мл или более. Клинически релевантное число иммунных клеток может быть разделено на несколько инфузий, которые суммарно равны или превышают 107 клеток, 108 клеток, 109 клеток, 1010 клеток, 1011 клеток или 1012 клеток.
В некоторых вариантах осуществления композицию можно вводить пациенту парентерально. В некоторых вариантах осуществления композицию, которая содержит или доставляет T-клетки, содержащие CAR, можно вводить пациенту парентерально за одно или несколько введений. В некоторых вариантах осуществления композицию, которая содержит или доставляет T-клетки, содержащие CAR, можно вводить пациенту парентерально один раз в сутки, один раз в 2-7 суток, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц, один раз в три месяца или один раз в 6 месяцев.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающие введение субъекту сконструированной иммунной клетки, содержащей CAR, причем CAR содержит (a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен; (b) трансмембранный домен; и (c) внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления субъект ранее получал один или более видов противораковой терапии, выбранных из группы, состоящей из: ионизирующего облучения, химиотерапевтического агента, терапевтического антитела и ингибитора контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления у субъекта был идентифицирован или диагностирован рак.
Фармацевтические композиции
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, которые содержат T-клетку, содержащую CAR, причем CAR содержит (a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен; (b) трансмембранный домен; и (c) внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка, содержащая CAR, представляет собой аутологичную Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать буфер, разбавитель, солюбилизатор, эмульгатор, консервант, адъювант, эксципиент или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления композиция, при необходимости, также может содержать одно или более дополнительных терапевтически активных веществ.
В некоторых вариантах осуществления Т-клетки по настоящему изобретению получают в виде состава путем их сбора из их культуральной среды, а затем промывки и концентрации клеток в среде и системе упаковки, подходящих для введения («фармацевтически приемлемый» носитель) в эффективном для лечения количестве. Подходящей инфузионной средой может быть любой состав изотонический среды, как правило, физиологический раствор, Normosol R (Abbott) или Plasma-Lyte A (Baxter), но также можно использовать 5% декстрозу в воде или лактат Рингера. Инфузионная среда может быть дополнена человеческим сывороточным альбумином.
В некоторых вариантах осуществления композиции составлены для парентерального введения. Например, предложенная в данном документа фармацевтическая композиция может быть предоставлена в стерильной инъекционной форме (например, форме, подходящей для подкожной инъекции или внутривенной инфузии). Например, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предоставлена в жидкой лекарственной форме, подходящей для инъекции. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предоставлена в виде порошков (например, лиофилизированных и/или стерилизованных), необязательно в вакуумной упаковке, которые можно восстанавливать водным разбавителем (например, водой, буфером, солевым раствором и т.д.) перед инъекцией. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция разведена и/или восстановлена в воде, растворе хлорида натрия, растворе ацетата натрия, растворе бензилового спирта, фосфатно-солевом буферном растворе и т.д. В некоторых вариантах осуществления порошок необходимо аккуратно смешать с водным разбавителем (например, без встряхивания).
В некоторых вариантах осуществления Т-клетка, содержащая CAR и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, по настоящему изобретению составлены в фармацевтически приемлемом исходном носителе. Примерами таких носителей являются вода, солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и 1-10% человеческий сывороточный альбумин. Также можно использовать липосомы и неводные носители, такие как нелетучие масла. Носитель или лиофилизированный порошок может содержать добавки, которые поддерживают изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и консерванты). В некоторых вариантах осуществления состав стерилизуют известными или подходящими методами. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый эксципиент, который в контексте данного документа включают любые и все растворители, дисперсионные среды, разбавители или другие жидкие носители, дисперсии или вспомогательные вещества для суспендирования, поверхностно-активные агенты, изотонические агенты, загустители или эмульгаторы, консерванты, твердые связующие вещества, лубриканты и т.п., в зависимости от конкретной необходимой лекарственной формы. В Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) описаны различные эксципиенты, используемые при составлении фармацевтических композиций, и известные методики их изготовления. За исключением тех случаев, когда любой традиционный эксципиент несовместим с веществом или его производными, например, за счет оказания нежелательного биологического эффекта или иного вредоносного взаимодействия с любыми другими компонентами фармацевтической композиции, подразумевается, что его применение находится в рамках объема этого изобретения.
В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая популяцию Т-клеток, содержащих CAR и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, по настоящему изобретению, является стабильной. В некоторых вариантах осуществления стабильный состав популяции Т-клеток, содержащих CAR и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, по настоящему изобретению, может содержать фосфатный буфер с солевым раствором или выбранной солью, а также консервированные растворы и составы, содержащие консервант, а также многоразовые консервированные составы, подходящие для фармацевтического или ветеринарного применения.
Консервированные составы содержат по меньшей мере один известный консервант, необязательно выбранный из группы, состоящий из по меньшей мере одного фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, холестерина, бензилового спирта, нитрита фенилртути, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, хлорида магния (например, гексагидрата), алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида бензетония, дегидроацетата натрия и тимеросала, или их смесей в водном разбавителе. Можно использовать любую подходящую концентрацию или смесь, как известно в данной области техники, например 0,001-5% или любые диапазон или значение в этих пределах, например, без ограничения, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или любые диапазон или значение в этих пределах. Неограничивающие примеры включают отсутствие консерванта, 0,1-2% м-крезола (например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% бензилового спирта (например, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% тимеросала (например, 0,005, 0,01), 0,001-2,0% фенола (например, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% алкилпарабена(ов) (например, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) и т.п.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предоставлена в форме, которую можно охлаждать и/или замораживать. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предоставлена в форме, которую нельзя охлаждать и/или замораживать. В некоторых вариантах осуществления восстановленные растворы и/или жидкие лекарственные формы можно хранить в течение определенного периода времени после восстановления (например, 2 часа, 12 часов, 24 часов, 2 суток, 5 суток, 7 суток, 10 суток, 2 недели, месяц, два месяца или дольше). В некоторых вариантах осуществления хранение композиций, содержащих агент-антитело, в течение времени, превышающего указанное, приводит к деградации агента-антитела. Жидкие лекарственные формы и/или восстановленные растворы могут содержать вещество в виде частиц и/или подвергаться обесцвечиванию перед введением. В некоторых вариантах осуществления раствор не следует использовать в случае его обесцвечивания или помутнения и/или если вещество в виде частиц остается после фильтрации. Общие подходы по составлению и/или изготовлению фармацевтических агентов можно найти, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая Т-клетку, содержащую CAR и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, по настоящему изобретению, может находиться в контейнере для хранения или для введения, например, флаконе, шприце (например, в/в шприце) или пакете (например, в/в пакете). Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением можно изготавливать, упаковывать и/или продавать оптом, в виде отдельной единичной дозы и/или в виде множества отдельных единичных доз. В контексте данного документа термин «единичная доза» представляет собой дискретное количество фармацевтической композиции, содержащее заданное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, которую предполагается вводить субъекту, и/или удобной доле такой дозы, такой как, например, половина или треть такой дозы.
Наборы
В настоящем изобретении дополнительно предложен набор, содержащий один или более контейнеров, заполненных по меньшей мере одним CAR и/или нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, описанными в данном документе. Наборы можно использовать любым применимым способом, включая, например, терапевтические способы, диагностические способы, способы пролиферации и/или выделения клеток и т.д. Необязательно, к таким контейнерам может прилагаться уведомления в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, причем это уведомление отражает (a) одобрение агентством производства, применения или продажи для введения человеку, (b) инструкции по применению, или и то, и другое.
В некоторых вариантах осуществления набор может содержать один или более реагентов для выявления (например, выявления CAR и/или нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR). В некоторых вариантах осуществления набор может содержать CAR и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, в выявляемой форме (например, ковалентно связанной с выявляемым фрагментом или компонентом). В некоторых вариантах осуществления один или более CAR и/или нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, предложенных в данном документе, могут быть включены в набор для лечения субъектов. В некоторых вариантах осуществления CAR и/или нуклеиновая кислота, кодирующая CAR, предложенные в данном документе, могут быть включены в набор, используемый для получения аутологичных T-клеток, экспрессирующих CAR.
В некоторых вариантах осуществления в наборе могут находиться один, два, три, четыре или более антиген-специфических агентов-антител, каждое из которых подходит для клонирования в конструкцию CAR. В некоторых вариантах осуществления в наборе могут находиться другие реагенты для анализа аффинности связывания агента-антитела, и/или CAR, и/или CAR T-клетки в отношении T-клетки, идентифицированной или выделенной у субъекта. В некоторых вариантах осуществления в наборе могут находиться другие реагенты для анализа функциональной авидности агента-антитела, и/или CAR, и/или CAR T-клетки в отношении T-клетки субъекта.
ПРИМЕРЫ
Данное изобретение будет дополнительно описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.
Пример 1 - Лентивирусная плазмида для переноса GPC3
ДНК-конструкцию, кодирующую форму одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) (Фиг.2) гуманизированного анти-GC33 агента-антитела, создавали путем соединения областей VH и VL, используя стандартные методики клонирования ДНК, известные в данной области техники. Используемая в данном документе лентивирусная плазмида для переноса приведена в таблице 1.
Таблица 1
huGC33 VH-VL-scFv клонировали в лентивирусный вектор pELPS4-MVRL2H2-euBBz, при этом pELPS4-MVRL2H2-euBBz представляет собой лентивирусный вектор, содержащий костимулирующий домен 4-1BB с пятью дополнительными аминокислотами. Лентивирусную векторную конструкцию pELPS4-huGC33 VH-VL расщепляли рестрикционными ферментами, при этом результаты расщепления рестрикционными ферментами приведены на Фиг.3.
Для создания конструкции CAR без пяти дополнительных аминокислот в костимулирующем домене 4-1BB huGC33 VH-VL-scFv клонировали в лентивирусный вектор pELPS2-CD19-BBz, при этом pELPS2-CD19-BBz представляет собой лентивирусный вектор, содержащий костимулирующий домен 4-1BB без пяти дополнительных аминокислот.Лентивирусную векторную конструкцию huGC33(VH-VL)-BBz расщепляли рестрикционными ферментами, при этом результаты расщепления рестрикционными ферментами приведены на Фиг.4.
Пример 2 - Фармацевтическая композиция GPC3 CAR-T-клеток
МКПК размораживали и активировали путем помещения криофлаконов с МКПК (5×107 клеток/1 мл/флакон) на водяную баню на 2-3 минуты. 10 мл культуральной среды CAR-T-клеток и 1 мл МКПК помещали в 50 мл коническую пробирку и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут.Супернатант удаляли и подсчитывали CAR-T-клетки после ресуспендирования клеток в 5 мл свежей среды. Свежую клеточную среду добавляли для доведения плотности клеток до 1×106 клеток/мл. По 10 мкл активирующих T-клетки гранул добавляли на каждые 1×106 клеток и дополняли среду IL-2. Клеточную культуральную среду культивировали в колбе T75 при 5% CO2 и 37°C в инкубаторе.
Затем создавали CAR-T-клетки путем центрифужной инокуляции активированных T-клеток кодирующим CAR лентивирусом. Подсчитывали активированные МКПК из клеточной культуры и высевали клетки в 24-луночный планшет в присутствии 500 мкл клеточной среды с лентивирусом. После трансдукции методом центрифужной инокуляции трансдуцированные клетки из 1 лунки культивировали в клеточной культуральной среде, дополненной IL-2.
Культивируемые CAR-T-клетки подсчитывали каждые 2-3 суток, а после каждого подсчитывания добавляли свежую культуральную среду и IL-2 (Фиг.5). На 12 сутки CAR-T-клетки собирали и хранили при -80°C в контейнере для заморозки.
Экспрессию CAR анализировали на 12 сутки культивирования, а результаты показывают, что контрольная группа не демонстрировала экспрессии, в то время как группы CAR-T-клеток демонстрировали 54-66% экспрессии CAR (Фиг.6).
Клетки-мишени (GPC3-положительная линия клеток) собирали и высевали в 96-луночный планшет с U-образным дном. Затем в лунки добавляли эффекторные клетки (CAR-T-клетки) в отношении эффекторные клетки: клетки-мишени 10:1, 3:1, 1:1, 0,3:1 и инкубировали в течение 24 часов при 37°C. После инкубации в каждую лунку добавляли реагент CytoTox96 и проводили количественную оценку цитотоксичности по измерению поглощения на 490 нм (Фиг.7).
Пример 3 - huGC33(VH-VL)-BBz CAR-T-клетки и huGC33(VH-VL)-euBBz CAR-T-клетки in vivo
Чтобы верифицировать и сравнить эффективность huGC33(VH-VL)-BBz CAR-T-клеток и huGC33(VH-VL)-euBBz CAR-T-клеток, клетки Huh-7_Luf-GFP (2×106 клеток/200 мкл/гранула) вводили мышам линии NSG (возраст 6-8 недель, самцы) и через 35 суток после инъекции мышей с опухолями размером около 200 мм3 разделяли на 5 групп по 4 мыши в каждой группе. Контрольная группа получала инъекции 5% ЧАС, а другие группы получали инъекции CAR-T-клеток. За ростом опухолей следили путем измерения размера опухолей дважды в неделю, используя TM900 (Фиг.8)
После введения CAR-T-клеток у мышей раз в неделю проводили орбитальный забор крови, при этом 100 мкл каждого образца крови центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 минут для подтверждения доли CAR-T-клеток и подсчета клеток. 100 мкл крови помещали в пробирку FACS и проводили окрашивание в отношении живых/мертвых клеток, используя набор Zombie NIR™ Fixable Viability Kit. После достижения концентрации 0,1 мкл/100 мкл ФСБД/пробирка проводили окрашивание при комнатной температуре в течение 10 минут.25 мкл гранул для подсчета, 0,5 мкл CD45, 0,5 мкл CD8, 1,0 мкл CD45RO, 1,0 мкл CD62L, 1,0 мкл PD-1, 1,0 мкл Tim-3, 0,5 мкл CD4, 0,5 мкл CD69 и 0,0125 мкл Flag добавляли в 100 мкл буфера FACS и проводили окрашивание при комнатной температуре в течение 30 минут. Через 30 минут добавляли лизисный буфер 1X RBC и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 5 минут. После центрифугирования в течение 4 минут при 2000 об/мин весь супернатант сливали. В пробирки добавляли по 2 мл буфера FACS и проводили центрифугирование в течение 4 минут при 2000 об/мин, а анализ проводили, используя FACSCelesta (Фиг.9).
Через 6 недель после инъекции CAR-T получали селезенку, печень и костный мозг мышей, чтобы оценить соотношение huGC33(VH-VL)-BBz CAR-T-клеток и huGC33(VH-VL)-euBBz CAR-T-клеток. Тканевые образцы обрабатывали и фильтровали через 40 мкм клеточное сито, затем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 минут и сливали весь супернатант.Добавляли 5 мкл буфера 1X ACK и проводили реакцию в течение 10 минут. Затем добавляли 10 мл ФСБД и центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 минут. Окрашивание FACS проводили, как описано выше (Фиг.10).
Пример 4 - Конструирование CD19-euBBz CAR
Чтобы повысить иммунологическую эффективность в цитоплазматическом сигнальном домене 4-1BB, в цитоплазматический домен 4-1BB, используемый в CAR-T в качестве костимулирующего сигнального фактора, добавляли 5 аминокислот, чтобы заново сконструировать экспрессионный вектор CAR (CD19-euBBz CAR). Полная конструкция содержит анти-CD19, содержащий промотор EF1 альфа, шарнирную область и трансмембранный домен CD8 человека, и внутриклеточный сигнальный домен. В частности, внутриклеточный сигнальный домен состоит из стимулирующего домена и костимулирующего сигнального домена. Внутриклеточный сигнальный домен представляет собой 4-1BB, костимулирующий сигнальный домен, к которому добавлены 5 последовательных аминокислот, с которым связан CD3 дзета. Полученный в итоге генный фрагмент CAR конъюгировали с лентивирусными экспрессионными векторами ELPS, расщепляемыми BamH I и Sal I. Кроме того, клонирование проводили, используя рестрикционный фермент BamH I/Nhe I для замещения только части scFv.
Пример 5 - CD19-euBBz и CD19-BBz CAR-T-клетки
Культура клеток 293T, используемая для получения рекомбинантных лентивирусов, содержит среду, содержащую 10% ФБС (Millipore, TMS-013-BKR) и 1 x П/С (Gibco, 15140-122) в DMEM с высоким содержанием глюкозы (Welgene, LM001-05). Клетки 293T инкубировали в среде DMEM, содержащей 10% ФБС, в течение 24 часов перед трансдукцией в инкубаторе при 37°C, 5% CO2. На следующий день с целью трансфекции смешивали трансфекционный реагент и лентивирусные плазмиды в соответствующей пропорции и инкубировали в течение 48 часов. Затем собирали супернатант, содержащий вирус, и центрифугировали при 400 x g в течение 10 минут.Кроме того, супернатант фильтровали с помощью 0,45 мкм шприцевого фильтра, используя 50 мл шприц. Полученный супернатант смешивали 3:1 с набором для лентивирусного обогащения (Clontech, 631231) и проводили реакцию при 4°C в течение 24-48 часов. За этим следовало центрифугирование в течение 2 часов при 4°C и 4000 об/мин для получения вируса, который ресуспендировали в 0,5 мл RPMI (Welgene, LM001-01), не содержащей ФБС, для получения лентивируса.
Чтобы определить эффективность трансдукции клеток млекопитающих, измеряли единицы трансформации (ЕТ/мл), анализируя число частиц способных к фактической трансдукции лентивирусов, используя клетки Jurkat. Экспрессию CAR можно оценить методом FACS. На первые сутки клетки Jurkat высевали в 96-луночные планшеты при 1×105 клеток/100 мкл на лунку. На вторые сутки лентивирус серийно разводили 1/3 в 96-луночных планшетах и проводили лентивирусную трансдукцию на уже высеянных клетках Jurkat. В этот момент времени трансдукцию лентивируса дополнительно повышали путем внесения полибрена (Millipore) в среду RPMI (10% ФБС и 1x П/С). После центрифугирования при 1200 x g и 32°C в течение 2 часов клетки инкубировали в течение 3 часов в инкубаторе с 37°C, 5% CO2, и добавляли только 100 мкл RPMI на лунку. На 5 сутки flag лентивируса, инфицированного в клетки, окрашивали анти-Flag-DYKDDDDK (Biolegend, кат.№637310), чтобы проанализировать процентное содержание трансдуцированных клеток на проточном цитометре. С помощью этого рассчитывали титр, как описано в Follenzi and Naldini, 2002 (Follenzi and Naldini, 2002).
Окрашивание FACS проводили, чтобы подтвердить долю выработки двух видов CAR-T-клеток после 14 суток инкубации. В случае каждого типа CAR-T-клеток собирали по 2×105 в пробирки FACS (FALCON, кат.№352052), затем добавляли 2 мл буфера FACS и проводили центрифугирование в течение 5 минут при 2000 об/мин, используя центрифугу (Thermo, ST16). После слива супернатанта добавляли 0,5 мкл/пробирка анти-CD8 APC (SKI, Biolegend, кат.№344722), 0,5 мкл/пробирка анти-CD4 BV650 (RPA-T4, Biolegend, кат.№300536) и 0,125 мкл/пробирка анти-flag PE (L5, Biolegend, кат.№637310) и проводили окрашивание при комнатной температуре в течение 30 минут.После добавления 2 мл буфера FACS и центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 минут, этот процесс повторяли еще раз. Для окрашивания в отношении выживших/мертвых клеток добавляли 1 мкл/пробирка 7-AAD (Biolegend, кат.№420404), оставляли смесь на 5 минут при комнатной температуре, а затем анализировали методом FACS (BD, FACSCelesta).
Подтверждение доли полученных CD19 CAR-T-клеток с помощью окрашивания FACS подтвердило, что в случае усовершенствованной конструкции CD19-euBBZ CAR-T-клеток соотношения между клетками составляли CD4+/CAR+29,4%, CD8+/CAR+50,8% и всего CAR-T 80,2%. Было подтверждено, что для неусовершенствованной конструкции CD19-BBz CAR-T-клеток соотношения между клетками составляли 42,7% для CD4+/CAR+, 29,3% для CD8+/CAR+и 72,0% для всех CAR-T. Соответственно, было подтверждено, что CD19-euBBz CAR-T-клетки характеризовались на 8,2% большей экспрессией CAR, чем CD19-BBz CAR-T-клетки, а CD8+/CAR+клетки составляли 21,5%, или в около 2 раз больше. (Фиг.11A)
Пример 6 - Подтверждение цитотоксичности полученных CD19 CAR-T-клеток
Чтобы определить цитотоксичность двух типов CAR-T-клеток, которые культивировали в течение 14 суток, долю CAR-T (Э): LCL (М) доводили до 30:1, 10:1, 3:1 и 1:1 в 96-луночных белых планшетах (Corning, кат.№3917). Сначала CAR-T-клетки помещали в лунки при 6×105 клеток/50 мкл, 2×105 клеток/50 мкл, 9×104 клеток/50 мкл и 2×104 клеток/50 мкл, соответственно. После этого добавляли линию клеток-мишеней, а именно линию клеток CBK LCL-Luc, до 2×104 клеток/50 мкл в инкубаторе с 37°C, CO2 (Mammert, INCO153med) и проводили реакцию в течение 4 часов. Через 4 часа в каждую лунку добавляли 100 мкл Bright-Glo™ (Promega, кат.№E2620) и через 5 минут измеряли значение относительных световых единиц (ОСЕ), используя люминометр (Thermo, Fluoroskan FL).
Не было обнаружено никакой разницы в цитотоксичности между CAR-T-клетками, в которые был внесен традиционный 4-1BB, и CAR-T-клетками, в которые был внесен euBBz, содержащий пять дополнительных аминокислот, добавленных к домену 4-1BB.
Эти результаты показывают, что когда два типа CAR-T-клеток и линии клеток CBK LCL-Luc инкубировали вместе в отношении 30:1, цитотоксичность составляла около 80% через 4 часа, а когда их инкубировали при 10:1, цитотоксичность составляла около 50%. Когда соответствующее число CAR-T-клеток, инкубируемых с раковыми клетками, снижалось в 3 раза, цитотоксичность снижалась примерно в 3 раза; кроме того, когда в домен 4-1BB были добавлены 5 аминокислот in vitro, было подтверждено, что это не влияет на цитотоксичность in vitro. (Фиг.11B)
Пример 7 - Индукция подкожных животных моделей и валидация CAR-T с помощью автоматического штангенциркуля и визуализации IVIS
В качестве экспериментальных животных использовали мышей NSG (NOD-scid IL2rγμL1) (The Jackson Laboratory), которых содержали в постоянных условиях в питомнике. Температура составляла 23±2°C с 12-часовым циклом день/ночь и влажностью 50±10%; пища и вода были доступны без ограничения. В экспериментах по эффективности с использованием CD19-euBBz CAR-T с пятью аминокислотами, добавленными к домену 4-1BB, готовили линии клеток CBK LCL-Luc при 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула и подкожно вводили 6-месячным самкам мышей для индукции подкожной животной модели. Когда размер рака достигал от 50 до 100 мм3 по измерению с помощью автоматического штангенциркуля (Youngbio, TM900), CD19-euBBz CAR-T-клетки и CD19-BBz CAR-T CAR-T-клетки при 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула (доза 1) и 6×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула (доза 2) однократно вводили через хвостовую вену для подтверждения эффективности. Во всех экспериментах с животными периодически проводили подтверждение размера и жизнеспособности рака.
Конкретнее, измеряли размер рака и значения фотонов, используя автоматический штангенциркуль и оборудование для визуализации IVIS (PerkinElmer, Luna III), с 3- и 4-суточными интервалами после введения CAR-T (Фиг.12, 13). В случае использования TM900 размер рака определяли после размещения оборудования в месте рака. При подтверждении визуализации и значений фотонов с использованием устройства IVIS мышам сначала внутрибрюшинно вводили 150 мг/кг XenoLight™ D-люциферина (PerkinElmer, кат.№122799). Через 15 минут начинали ингаляционную анестезию изофлураном, а еще через 5 минут использовали IVIS для визуализации наличия раковых клеток. После визуализации проводили нормализацию, а затем подтверждали и наносили на график значения люциферазы (значения фотонов). После создания подкожной животной модели с использованием линии клеток CBK LCL-Luc сравнивали эффекты CD19-BBz CAR-T и CD19-euBBz CAR-T-клеток, используя визуализацию IVIS. Как показано на Фиг.12, эффект может быть подтвержден в течение 1 недели после введения 2 видов CAR-T-клеток.
В экспериментальной группе, в которой CD19-euBBz CAR-T-клетки вводили при 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула и 6×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула, раковые клетки наблюдали при визуализации IVIS через 1 неделю после введения. Кроме того, в группе, обработанной CD19-BBz CAR-T, когда вводили 6×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула, при визуализации через 1 неделю после введения раковые клетки наблюдали редко. Однако раковые клетки были идентифицированы в экспериментальной группе, которой вводили CD19-BBz CAR-T, через 1 неделю.
Как показано на изображении, через 1 неделю после введения CAR-T после процесса визуализации было определено значение люциферазы, визуализированной для каждого субъекта; значения люциферазы были подтверждены только в группе, которой вводили CD19 CAR-T при 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула. При наблюдении через 3 или более недель после этого у мышей, которым не вводили CAR-T-клетки, опухоли продолжали расти, а в трех экспериментальных группах, в которых раковые клетки изначально исчезли, не было идентифицировано раковых клеток. Однако через 10 суток в группе, получавшей 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула для CD19 CAR-T, уровни люциферазы были снижены, но раковые клетки полностью не исчезли через 3 недели. При введении CD19-euBBz CAR-T при 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула с помощью экспериментальной визуализации раковых клеток было обнаружено, что эффективность была сходной с группой, обработанной CD19-BBz CAR-T при 6×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула. Эти результаты показывают отсутствие разницы в цитотоксичности CD19-euBBz CAR-T и CD19-BBz CAR-T in vitro, но было подтверждено, что в животных моделях эффективность CD19-euBBz CAR-T в 5 раз лучше. (Фиг.12).
Пример 8 - Подтверждение доли CD19-euBBz CAR-T в in vivo животной модели
После введения CAR-T-клеток в подкожной животной модели для подтверждения эффективности улучшенной конструкции CAR-T-клеток, подтверждали наличие CAR-T из мышиной крови. Конкретнее, у мышей проводили орбитальный забор крови с 3- и 4-суточными интервалами после введения CAR-T. На момент каждого забора крови получали 70 мкл крови и использовали 60 мкл крови для подтверждения доли CAR-T-клеток и числа клеток. 60 мкл крови помещали в пробирку 5 мл FACS и проводили окрашивание в отношении живых/мертвых клеток, используя набор Zombie Aqua BV510 (Biolegend, кат.№423101). После достижения концентрации 0,1 мкл/100 мкл ФСБД/пробирка проводили окрашивание при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавляли гранулы для подсчета (Molecularprobes, кат.№C36950), анти-CD45 ФИТЦ (HI30, Biolegend, кат.№304006), анти-CD8 BV786 (SK-1, Biolegend, кат.№344740), анти-CD4 BV650 и анти-flag PE и проводили окрашивание при комнатной температуре в течение 30 минут. Каждое антитело смешивали при 0,5 мкл/100 мкл буфера FACS/пробирка и добавляли 25 мкл гранул для подсчета. Через 30 минут добавляли 2 мл 1X лизисного буфера RBC (Biolegend, кат.№422401) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 5 минут. После центрифугирования в течение 5 минут при 2000 об/мин с помощью центрифуги весь супернатант сливали. В эту пробирку добавляли 2 мл промывочного буфера FACS и проводили центрифугирование в течение 5 мин при 2000 об/мин. Этот процесс повторяли еще раз, а затем добавляли 50 мкл буфера FACS и проводили анализ методом FACS.
Через одну неделю после введения CAR-T-клеток в группе обработки CD19-euBBz CAR-T приблизительно 20% CD19-euBBz CAR-T-клеток были подтверждены в крови в группах как с 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула, так и с 6×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула; но в группе, которой вводили CD19-BBz CAR-T, когда вводили 6×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула, было подтверждено только 5% CD19 CAR-T. Через 3 суток число и доля CAR-T-клеток в мышиной крови достигали максимума и снижались. В течение одной недели в 3 экспериментальных группах, в которых были идентифицированы CAR-T-клетки (CD19-euBBz CAR-T; 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула и 6×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула, CD19-BBz CAR-T; 6×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула), раковые клетки были быстро уничтожены, поскольку существовала возможность их контакта с относительно большим количеством CAR-T-клеток до того, как они начинали пролиферировать в организме мышей. Однако в экспериментальной группе, которой вводили CD19-BBz CAR-T при 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула, доля и число CAR-T-клеток достигали максимума через 2 недели, а доля CAR-T составляла около 25%, при этом раковые клетки довольно хорошо пролиферировали. CD19-euBBz CAR-T были более стабильными по количеству, чем CD19-BBz CAR-T, после того, как доля CAR-T сначала повысилась, а потом снизилась. Однако в случае CD19-BBz CAR-T доля CAR-T-клеток повышалась и снижалась позже и, следовательно, исчезновение опухоли в организме мышей происходило дольше. В результате этого эксперимента группа, которой вводили CD19-euBBz CAR-T при 2×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула, демонстрировала аналогичные уровни CAR-T и эффекты у мышей с группой, которой вводили CD19-BBz CAR-T при 6×106 клеток/100 мкл ФСБД/гранула, что указывает на то, что CD19-euBBz CAR-T обладает превосходящим эффектом (Фиг.14).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>Eutilex Co., Ltd.
<120>ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР С КОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДОМЕНОМ 4-1BB
<130>47683-0044WO1
<150>62/867503
<151>2019-06-27
<150>PCT/KR2019/010244
<151>2019-08-12
<150>16/715462
<151>2019-12-16
<150>62/991493
<151>2020-03-18
<150>63/004827
<151>2020-04-03
<150>63/043237
<151>2020-06-24
<160>28
<170>PatentIn, версия 3.5
<210>1
<211>15
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>1
cgtttctctg ttgtt 15
<210>2
<211>141
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>2
cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 60
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120
gaagaaggag gatgtgaact g 141
<210>3
<211>5
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический полипептид
<400>3
Arg Phe Ser Val Val
1. 5
<210>4
<211>47
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический полипептид
<400>4
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1. 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40 45
<210>5
<211>207
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>CD8/шарнирная область/трансмембранный домен
<400>5
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgctag ccagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207
<210>6
<211>339
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>6
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210>7
<211>69
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>лидерная последовательность CD8 альфа
<400>7
ggatccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60
gccaggccg 69
<210>8
<211>24
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>последовательность Flag-тега
<400>8
gactacaagg acgacgatga caag 24
<210>9
<211>16
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>CDR1 легкой цепи
<400>9
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1. 5 10 15
<210>10
<211>7
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>CDR2 легкой цепи
<400>10
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1. 5
<210>11
<211>9
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>CDR3 легкой цепи
<400>11
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1. 5
<210>12
<211>5
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>CDR1 тяжелой цепи
<400>12
Asp Tyr Glu Met His
1. 5
<210>13
<211>17
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>CDR2 тяжелой цепи
<400>13
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
1. 5 10 15
Gly
<210>14
<211>6
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>CDR3 тяжелой цепи
<400>14
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1. 5
<210>15
<211>112
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>вариабельная область легкой цепи GC33 человека
<400>15
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1. 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210>16
<211>115
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>вариабельная область тяжелой цепи GC33 человека
<400>16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1. 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>17
<211>336
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>вариабельная область легкой цепи GC33 человека
<400>17
gacgtcgtta tgacacagag tcccctctcc ttgccggtga ccctgggtca gcctgcgtcc 60
atctcttgca gatcctccca gtctctggta cactccaacg gcaacacata cttgcactgg 120
taccaacaaa gacctggtca gtcaccgcga cttctcatat ataaagtttc caataggttc 180
agtggagtgc cagacaggtt cagtggttca ggatcaggca ctgatttcac gcttaaaatc 240
agtcgggttg aggcggagga cgtaggagtt tactattgca gccagaatac gcacgtgccg 300
cctacttttg gctctggaac caagttggaa ataaag 336
<210>18
<211>345
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>вариабельная область тяжелой цепи GC33 человека
<400>18
caagtgcaac tcgtacaatc aggtgctgaa gtcaaaaagc cgggagcctc tgttaaagtg 60
tcctgtaaag ccagcggcta cacctttacc gattatgaga tgcactgggt tcggcaggct 120
ccgggccaag gtctggagtg gatcggggct cttgacccaa agacgggcga cacggcttat 180
tcacaaaaat tcaaaggtag ggctactctg actgccgata agtccaccag caccgcgtat 240
atggagctct ctagcttgcg aagcgaggac acggcggtgt actattgcac acgcttctat 300
agttacacat attggggtca aggcacgctt gtgaccgtgt ctagc 345
<210>19
<211>243
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический полипептид
<400>19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1. 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Glu Gly Asp Thr
210 215 220
Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210>20
<211>729
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>20
gatattcaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgca aggccagtga ccacatcaac aactggctgg cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaaactact gatcagcggc gccacctctc tggaaaccgg agtcccttct 180
cgcttctctg gttccggatc tgggaaggat tacactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcag tactggtcca cccccttcac cttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa aggcggaggc ggatctggcg gcggaggaag tggcggaggg 360
ggatctcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg 420
tccctcacct gcactgtctc tggtttctcc ctgagtcggt actctgtgca ttggatccgg 480
cagcccccag ggaagggact ggagtggctg gggatgatct ggggaggcgg cagcaccgac 540
tacaacagcg ccctgaagtc ccgactgacc atatcaaagg acaactccaa gaaccaggtg 600
tccttgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaaat 660
gagggcgata ccaccgccgg cacttggttt gcctattggg gccagggaac cctggtcacc 720
gtctcctca 729
<210>21
<211>242
<212>Белок
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический полипептид
<400>21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1. 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210>22
<211>726
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>22
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720
tcctca 726
<210>23
<211>1184
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>23
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccactgagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184
<210>24
<211>84
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>24
agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta 60
gtcagtgtgg aaaatctcta gcag 84
<210>25
<211>1377
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>25
cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc 60
ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt 120
tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga 180
gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat 240
taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt 300
tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag 360
gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa 420
ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa 480
gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg agatatgagg 540
gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta 600
gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga 660
gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc gtcaatgacg 720
ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg 780
agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat caagcagctc 840
caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg 900
ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat 960
aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag agaaattaac 1020
aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat 1080
gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca 1140
aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga 1200
atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc accattatcg 1260
tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat agaagaagaa 1320
ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg acggtat 1377
<210>26
<211>547
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>26
tagactgtag cccaggaata tggcagctag attgtacaca tttagaagga aaagttatct 60
tggtagcagt tcatgtagcc agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag 120
ggcaagaaac agcatacttc ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac 180
atacagacaa tggcagcaat ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg 240
ggatcaagca ggaatttggc attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta 300
tgaataaaga attaaagaaa attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga 360
cagcagtaca aatggcagta ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt 420
acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac 480
aaaaacaaat tacaaaaatt caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag 540
tttggct 547
<210>27
<211>591
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>27
atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60
cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120
tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180
ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240
gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300
ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360
tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg 420
cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480
atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540
gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct g 591
<210>28
<211>98
<212>ДНК
<213>Искусственная
<220>
<223>синтетический олигонуклеотид
<400>28
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttca 98
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТ HLA-DR, И CAR-T-КЛЕТКА | 2019 |
|
RU2778890C1 |
| УЛУЧШЕННЫЕ ИММУННЫЕ КЛЕТКИ С ДВОЙНОЙ кшРНК И КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ | 2019 |
|
RU2793922C2 |
| Модифицированные клетки с химерным антигеновым рецептором для лечения рака, экспрессирующего CLDN6 | 2020 |
|
RU2826058C2 |
| СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР КЛЕТОК | 2015 |
|
RU2751362C2 |
| НЕ РЕСТРИКТИРОВАННЫЕ ПО HLA T-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2812917C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ | 2013 |
|
RU2729401C2 |
| ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, СОДЕРЖАЩИЕ TRAF-6-ИНДУЦИРУЮЩИЕ ДОМЕНЫ, И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ | 2016 |
|
RU2773159C2 |
| СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР | 2019 |
|
RU2822196C2 |
| ХИМЕРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ АНТИТЕЛО/Т-КЛЕТОЧНЫЙ РЕЦЕПТОР И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2767209C2 |
| ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ ДЛЯ BCMA И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2785658C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены иммунные клетки, содержащие химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот. Внеклеточный домен CAR содержит антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с глипиканом-3. Также предложены нуклеиновые кислоты, векторы, композиции и способы лечения рака с использованием сконструированных иммунных клеток, содержащих CAR. Изобретение обеспечивает улучшенную эффективность CAR-T и может быть использовано для лечения определенных видов рака. 7 н. и 42 з.п. ф-лы, 19 ил., 1 табл., 8 пр.
1. Иммунная клетка, содержащая химерный антигенный рецептор (CAR), причем (CAR) содержит:
(a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен;
(b) трансмембранный домен; и
(c) внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот,
причем костимулирующий эндодомен содержит SEQ ID NO: 4,
причем антигенсвязывающий домен специфически связывается с глипиканом-3 (GPC3),
причем иммунная клетка представляет собой Т-клетку.
2. Иммунная клетка по п. 1, где химерный антигенный рецептор представляет собой один полипептид.
3. Иммунная клетка по п. 1, где химерный антигенный рецептор состоит из двух полипептидов.
4. Иммунная клетка по любому из пп. 1-3, где антигенсвязывающий домен является гуманизированным.
5. Иммунная клетка по любому из пп. 1-4, где антигенсвязывающий домен является человеческим.
6. Иммунная клетка по любому из пп. 1-5, где антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
7. Иммунная клетка по любому из пп. 1-6, где антигенсвязывающий домен специфически связывает опухолевый антиген.
8. Иммунная клетка по любому из пп. 1-7, где трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен, выбранный из белка, выбранного из группы, состоящей из: 4-1BB/CD137, активирующего NK-клетки рецептора, белка иммуноглобулина, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD3 гамма, CD3 дзета, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8 альфа, CD8 бета, CD96 (Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, цитокинового рецептора, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc-гамма-рецептора, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, Ig альфа (CD79a), IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, индуцибельного костимулятора T-клеток (ICOS), интегрина, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, лиганда, который специфически связывается с CD83, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), связанного с функцией лимфоцитов антигена-1 (LFA-1), молекулы ГКГС класса 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, белка 1 запрограммированной гибели (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), сигнальной активирующей лимфоциты молекулы (белка SLAM), SLAM (SLAMF1), SLAMF4 (CD244), SLAMF6 (NTB-A), SLAMF7, SLP-76, белка рецептора TNF, TNFR2, TNFSF14, рецептора лиганда Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 и VLA-6.
9. Иммунная клетка по любому из пп. 1-8, где трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен из CD8α.
10. Иммунная клетка по любому из пп. 1-9, где внутриклеточный домен дополнительно содержит внутриклеточный домен из CD3ζ.
11. Иммунная клетка по любому из пп. 1-10, где химерный антигенный рецептор дополнительно содержит сигнальный пептид или лидерную последовательность.
12. Иммунная клетка по любому из пп. 1-11, где химерный антигенный рецептор дополнительно содержит шарнирную область.
13. Иммунная клетка по п. 12, где шарнирная область представляет собой шарнирную область CD8α.
14. Иммунная клетка по любому из пп. 1-13, где химерный антигенный рецептор дополнительно содержит дополнительный антигенсвязывающий домен.
15. Иммунная клетка по п. 14, где дополнительный антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
16. Иммунная клетка по любому из пп. 1-15, где иммунная клетка представляет собой иммунную клетку человека.
17. Иммунная клетка по п. 16, где иммунная клетка человека представляет собой аутологичную иммунную клетку человека.
18. Иммунная клетка по п. 16, где иммунная клетка человека представляет собой аллогенную иммунную клетку человека.
19. Нуклеиновая кислота, кодирующая химерный антигенный рецептор (CAR), причем химерный антигенный рецептор содержит:
(a) внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен;
(b) трансмембранный домен; и
(c) внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий эндодомен, причем
костимулирующий эндодомен содержит внутриклеточный сигнальный домен из 4-1BB/CD137 и пять дополнительных аминокислот,
причем костимулирующий эндодомен содержит SEQ ID NO: 4,
причем антигенсвязывающий домен специфически связывается с глипиканом-3 (GPC3),
причем иммунная клетка представляет собой Т-клетку.
20. Нуклеиновая кислота по п. 19, где химерный антигенный рецептор представляет собой один полипептид.
21. Нуклеиновая кислота по п. 19, где химерный антигенный рецептор состоит из двух полипептидов.
22. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 19-21, где антигенсвязывающий домен является гуманизированным.
23. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 19-22, где антигенсвязывающий домен является человеческим.
24. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 19-23, где антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.
25. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 19-24, где антигенсвязывающий домен специфически связывает опухолевый антиген.
26. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 19-25, где трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен, выбранный из белка, выбранного из группы, состоящей из: 1BB/CD137, активирующего NK-клетки рецептора, белка иммуноглобулина, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD3 гамма, CD3 дзета, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8 альфа, CD8 бета, CD96 (Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, цитокинового рецептора, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc-гамма-рецептора, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, Ig альфа (CD79a), IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, индуцибельного костимулятора T-клеток (ICOS), интегрина, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, лиганда, который специфически связывается с CD83, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), связанного с функцией лимфоцитов антигена-1 (LFA-1), молекулы ГКГС класса 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, белка 1 запрограммированной гибели (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), сигнальной активирующей лимфоциты молекулы (белка SLAM), SLAM (SLAMF1), SLAMF4 (CD244), SLAMF6 (NTB-A), SLAMF7, SLP-76, белка рецептора TNF, TNFR2, TNFSF14, рецептора лиганда Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 и VLA-6.
27. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 19-26, где трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен из CD8 альфа.
28. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 19-27, где внутриклеточный домен дополнительно содержит внутриклеточный домен из CD3ζ.
29. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 19-28, где химерный антигенный рецептор дополнительно содержит сигнальный пептид или лидерную последовательность.
30. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 19-29, где химерный антигенный рецептор дополнительно содержит шарнирную область.
31. Нуклеиновая кислота по п. 30, где шарнирная область представляет собой шарнирную область CD8α.
32. Вектор для получения химерного антигенного рецептора (CAR), содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 19-31.
33. Вектор по п. 32, дополнительно содержащий промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой.
34. Вектор по п. 33, где промотор представляет собой конститутивный промотор.
35. Вектор по п. 33, где промотор представляет собой индуцибельный промотор.
36. Вектор по любому из пп. 32-35, где вектор представляет собой вирусный вектор.
37. Вектор по п. 36, где вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.
38. Способ получения сконструированной иммунной клетки, включающий:
введение в иммунную клетку нуклеиновой кислоты по любому из пп. 19-31 или вектора по любому из пп. 32-37 с получением, таким образом, сконструированной иммунной клетки,
причем иммунная клетка представляет собой T-клетку.
39. Способ по п. 38, дополнительно включающий, после стадии внесения, культивирование сконструированной иммунной клетки.
40. Способ по п. 38 или 39, дополнительно включающий, до стадии внесения, получение иммунной клетки от субъекта.
41. Способ по п. 40, дополнительно включающий введение субъекту сконструированной иммунной клетки.
42. Способ по п. 40 или 41, где у субъекта был диагностирован или идентифицирован рак.
43. Сконструированная иммунная клетка, полученная способом по любому из пп. 38-42.
44. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая сконструированную иммунную клетку по п. 43 и фармацевтически приемлемый носитель.
45. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту сконструированной иммунной клетки по п. 43 или фармацевтической композиции по п. 44.
46. Способ по п. 45, где рак представляет собой анти-глипикан-3-ассоциированный рак.
47. Способ по п. 45, где рак представляет собой карциному, лимфому (например, ходжкинскую и неходжкинскую лимфомы), бластому, саркому, лейкоз, плоскоклеточную карциному, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, перитонеальный рак, гепатоцеллюлярную карциному, рак желудка, рак поджелудочной железы, глиому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, другие лимфопролиферативные расстройства и различные типы рака головы и шеи.
48. Способ по любому из пп. 45-47, где субъект ранее получал один или более видов противораковой терапии, выбранных из группы, состоящей из: ионизирующего облучения, химиотерапевтического агента, терапевтического антитела и ингибитора контрольных точек.
49. Способ по любому из пп. 45-48, где у субъекта был идентифицирован или диагностирован рак.
| WO 2015187528 A1, 10.12.2015 | |||
| МНОГОЦЕПОЧЕЧНЫЙ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2013 |
|
RU2663725C2 |
| WO 2015069922 A2, 14.05.2015 | |||
| US 9359447 B2, 07.06.2016 | |||
| HUIPING GAO et al | |||
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
