Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка представляет собой переход на национальную фазу международной патентной заявки PCT/CN2022/095859, поданной 30 мая 2022 года, по которой испрашиваются приоритеты патентной заявки КНР №2021105946626, поданной 28 мая 2021 года, патентной заявки КНР №2021108141169, поданной 19 июля 2021 года, патентной заявки КНР №2022101388358, поданной 15 февраля 2022 года, и патентной заявки КНР №2022105520774, поданной 18 мая 2022 года, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Материал в файле XML PCT CN 2022095859 sequence list.xml, который подан с настоящей заявкой, создан 15 сентября 2023 года и имеет размер 26440 байт, включен в настоящий документ посредством ссылки для всех целей.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к получению и применению ряда полипептидов и, в частности, к полипептиду, имеющему последовательность, которая представлена в формуле (II).

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Глобальная заболеваемость неалкогольной жировой болезнью печени (NAFLD) достигает 25%, при этом глобальная заболеваемость неалкогольным стеатогепатитом (NASH) составляет приблизительно от 3% до 8%. У некоторых пациентов с NASH в дальнейшем развивается цирроз и рак печени, который в настоящее время представляет собой одну из основных причин терминальной стадии заболевания печени и трансплантации печени. Патогенез NASH сложен, и в настоящее время не существует одобренного FDA лекарственного средства для лечения этого заболевания. В нескольких доклинических исследованиях было показано, что двойные агонисты глюкозозависимого инсулинотропного полипептида (GIP/глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) могут быть использованы для лечения NASH. Клинические исследования тирзепатида, двойного агониста GLP-1/GIP, проводимые компанией Eli Lilly and Company, продемонстрировали, что он может улучшить уровни транс амин азы, связанной с NASH, и других соответствующих маркеров, что показывает его потенциал в качестве средства лечения NASH.

Агонисты GLP-1 могут быть использованы для синергетического лечения NASH несколькими путями. Например, агонисты GLP-1 могут снижать циркулирующие уровни фактор а некроза опухоли (TNF)-α, интерлейкина IL-1β, IL-6, CD163 и hsCRP, и в результате этого достигается противовоспалительный эффект. Полипептид GIP, секретируемый нейроэндокринными К-клетками тонкого кишечника, может дополнительно облегчать синтез липидов в печени на основе лечения агонистами GLP-1. Таким образом, двойные агонисты GLP-1/GIP оказывают синергетический эффектпри лечении NASH.

Краткое раскрытие настоящего из обретения

Согласно настоящему изобретению предложен полипептид, имеющий последовательность, которая представлена в формуле (II),

который имеет модификации, перечисленные ниже:

1) аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях j и j+4 присоединены к

причем i составляет 17 (т.е. когда i составляет 17, изолейциновый остаток в положении 17 сначала заменяется лизиновым остатком, и аминогруппа на боковой цепи замененного лизинового остатка затем присоединяется к вместе с аминогруппой на боковой цепи лизинового остатка в положении 20), или при этом j составляет 20; и

2) заменяются дополнительно от 0 до 2 аминокислот в полипептидной последовательности, которая представлена в формуле (II),

при этом

Aib имеет структуру

S₀ выбирают из группы, которую составляют

X выбирают из группы, которую составляют и при этом «*» показывает положение присоединения к X₁;

X₁ выбирают из группы, которую составляют простая связь, -С(=О)-, -О-С(=О)- и -N(R₁)-C(=О)-;

R₁ выбирают из группы, которую составляют Н и C_1-3 алкил,

Х₂ выбирают из группы, которую составляют

m выбирают из 2, 3 и 4;

n выбирают из 15, 16, 17, 18 и 19;

р выбирают из 1 и 2.

Последовательность формулы (II) является такой, как представляет последовательность SEQ ID NO. 1.

Согласно настоящему изобретению предложен полипептид, имеющий последовательность, которая представлена в формуле (Р),

который имеет модификации, представленные ниже:

1) аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях 17 и 20 присоединены к и

2) заменены от 0 до 2 аминокислот в полипептидной последовательности, которая представлена в формуле (Р);

при этом

Aib имеет структуру

S₀ выбирают из группы, которую составляют

X выбирают из группы, которую составляют и при этом «*» показывает положение присоединения к X₁;

X₁ выбирают из группы; которую составляют простая связь, -С(=О)-, -О-С(=О)- и -N(R₁)-C(=О)-;

R₁ выбирают из группы, которую составляют Н и С_1-3 алкил;

X₂ выбирают из группы, которую составляют

m выбирают из 2, 3 и 4;

n выбирают из 15, 16, 17, 18 и 19;

р выбирают из 1 и 2.

Последовательность формулы (Р) является такой, как представляет последовательность SEQ ID NO. 2.

Согласно настоящему изобретению предложен полипептид, имеющий последовательность, которая представлена в формуле (II),

который имеет модификации, представленные ниже:

1) аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях j и j+4 присоединены к

причем i составляет 17 (т.е. когда i составляет 17, изолейциновый остаток в положении 17 сначала заменяется лизиновым остатком, и аминогруппа на боковой цепи замененного лизинового остатка затем присоединяется к вместе с аминогрупп ой на боковой цепи лизинового остатка в положении 20), или при этом j составляет 20, и

2) заменяются дополнительно от 0 до 2 аминокислот в полипептидной последовательности, которая представлена в формуле (II),

при этом

Aib имеет структуру

S₀ выбирают из группы, которую составляют

X выбирают из группы, которую составляют и при этом«*» показывает положение присоединения к X₁;

X₁ выбирают из группы; которую составляют простая связь, -С(=О)-, -О-С(=О)- и -N(R₁)-C(=О)-;

R₁ выбирают из группы, которую составляют Н и С_1-3 алкил;

X₂ выбирают из группы, которую составляют

m выбирают из 2, 3 и 4,

n выбирают из 15, 16, 17, 18 и 19;

р выбирают из 1 и 2.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заменены от 0 до 2 аминокислот в положении 21, 23 или 24 полипептида, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения полипептид имеет последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности, которые представлены в формулах (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (IV-7), (IV-8), (IV-9) и (IV-10), и последовательности формул (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-6), (IV-7), (IV-8), (IV-9) и (IV-10) являются такими, как представлено в последовательностях SEQ ID NO. 3-11, соответственно,

которые имеют модификации, представленные ниже:

аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях 17 и 20 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях 20 и 24 присоединены к

при этом

Aib, X, X₁ и Х₂ принимают такие значения, которые определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше R₁ выбираютиз Н, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше X₁ выбирают из простой связи, -С(=О)-, -О-С(=О)- и -NH-C(=О)-, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше m выбирают из 2, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше n выбирают из 15 и 17, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше Х'2 выбирают из группы, которую составляют

при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше выбирают из группы, которую составляют

при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях j и j+4 присоединены к с образованием

или при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях j и j+4 присоединены к с образованием или при этом другие переменные определены в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше выбирают из группы, которую составляют

при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше выбирают из группы, которую составляют

при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно настоящему изобретению предложен полипептид, имеющий последовательность, которая представлена в формуле (II),

который имеет модификации, представленные ниже:

1) аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях j и j+4 присоединены к причем 1 составляет 17, или при этом j составляет 20;

2) заменены от 0 до 2 аминокислот в полипептиде, который представлен в формуле (II);

при этом

Aib имеет структуру

S₀ выбирают из группы, которую составляют

X выбирают из группы, которую составляют и при этом«*» показывает положение присоединения к X₁;

X₁ выбирают из группы, которую составляют -С(=О)-, -О-С(=О)- и -N(R₁)-C(=О)-;

R₁ выбирают из группы, которую составляют Н и С_1-3 алкил;

Х₂ выбирают из

m выбирают из 2, 3 и 4,

n выбирают из 15, 16, 17, 18 и 19.

Согласно настоящему изобретению предложен полипептид, имеющий последовательность, которая представлена в формуле (II),

который имеет модификации, представленные ниже:

1) аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях j и j+4 присоединены к причем i составляет 17, или при этом j составляет 20;

2) заменены от 0 до 1 аминокислоты в полипептиде, который представлен в формуле (II);

при этом

Aib имеет структуру

S₀ выбирают из группы, которую составляют

X выбирают из группы, которую составляют и при этом«*» показывает положение присоединения к X₁;

X₁ выбирают из группы, которую составляют -С(=О)-, -О-С(=О)- и -N(R₁)-C(=О)-;

R₁ выбирают из группы, которую составляют Н и C_1-3 алкил,

Х₂ выбирают из

m выбирают из 2, 3 и 4,

n выбирают из 15, 16, 17, 18 и 19.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения полипептид имеет последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности, которые представлены в формулах (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (II-5) и (III-6), причем последовательность формулы (II-5) является такой, как представлено в последовательности SEQ ID NO. 12.

которые имеют модификации, представленные ниже:

аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях 17 и 20 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях 20 и 24 присоединены к

при этом Aib, X, X₁ и X-J принимают такие значения, которые определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше R₁ выбираютиз Н, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше X₁ выбирают из -С(=О)-, -О-С(=О)- и -NH-C(=О)-, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше m выбирают из 2, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше n выбираютиз 17, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше Х₂ выбирают из при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях j и j+4 присоединены к с образованием причем Z₂FZ₃представляет собой AFV, EFV или AFI, при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизиновых остатков в положениях j и j+4 присоединены к с образованием или при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанный выше выбирают из группы, которую составляют

при этом другие переменные определены в настоящем документе.

Настоящее изобретение также охватывает некоторые варианты осуществления, образованные любым сочетанием указанных выше переменных.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен полипептид, выбранный из группы, которую составляют представленные ниже формулы,

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, в которой содержится терапевтически эффективное количество указанного выше по ли пептидно го соединения или соответствующей фармацевтически приемлемой соли в качестве активного ингредиента, а также фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предложено применение указанного выше по ли пептидно го соединения или соответствующей фармацевтически приемлемой соли или указанной выше фармацевтической композиции в получении лекарственных средств для лечения неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) и лечения неалгогольного стеатогепатита (NASH).

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) и не алкогольно го стеато гепатита (NASH), включающий введение указанного выше полипептидного соединения или соответствующей фармацевтически приемлемой соли, или указанной выше фармацевтической композиции нуждающемуся в этом субъекту.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения указанное выше полипептидное соединение или соответствующая фармацевтически приемлемая соль, или указанная выше фармацевтическая композиция вводится по одной порции раз в трое суток, раз в четверо суток, раз в неделю или раз в две недели.

Технический эффект

Полипептид согласно настоящему изобретению проявляет очень сильную агонистическую активность в отношении GLP-1R/GIPR; полипептидное соединение согласно настоящему изобретению проявляет превосходные фармакокинетические свойства, устойчивость в плазме и чрезвычайно сильное связывание с белками плазмы; и соединение согласно настоящему изобретению может значительно улучшать показатель активности неалкогольной жировой болезни печени (NAS) в мышиной модели STZ-NASH.

Определения и иллюстрации

Если не указаны иные условия, предусмотрено, что следующие термины и выражения, которые используются в настоящем документе, имеют следующие значения. Конкретные термины или выражения не следует истолковывать как неопределенные или неясные при отсутствии конкретного определения, но их следует понимать в соответствующем обычном значении. Когда товарное наименование упоминается в настоящем документе, предусмотрено, что оно означают соответствующий товар или его активный ингредиент.

Термин «фармацевтически приемлемый», который используется в настоящем документе, означает соединения, материалы, композиции и/или дозированные лекарственные формы, которые являются подходящими для использования в контакте с тканями человека и животных по обоснованному медицинскому заключению, без проявления чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений и соразмерно обоснованному соотношению пользы и риска.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» означает соль соединения согласно настоящему изобретению, которая получена с применением соединения, которое содержит определенный заместитель и используется в настоящем изобретении, и относительно нетоксичной кислоты или основания. Когда соединение согласно настоящему изобретению содержит относительно кислую функциональную группу, соль присоединения основания может быть получена в результате введения такого соединения в контакт с достаточным количеством основания в чистом растворе или подходящем инертном растворителе. Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания представляют собой соли натрия, калия, кальция, аммония, органического амина или магния, или аналогичные соли. Когда соединение согласно настоящему изобретению содержит относительно основную функциональную группу, соль присоединения кислоты может быть получена в результате введения такого соединения в контакт с достаточным количеством кислоты в чистом растворе или подходящем инертном растворителе. Примерные фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты представляют собой соли неорганических кислот, в том числе таких как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, азотная кислота, угольная кислота, бикарбонат, фосфорная кислота, моногидрофосфат, дигидрофосфат, серная кислота, гидросульфат, йодистоводородная кислота, фосфористая кислота, и т.д.; а также соли органических кислот, в том числе таких как уксусная кислота, пропионовая кислота, изомасляная кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, бензойная кислота, янтарная кислота, октандиовая кислота, фумаровая кислота, молочная кислота, миндальная кислота, фталевая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, лимонная кислота, винная кислота, и метансульфоновая кислота или другие аналогичные кислоты; и соли аминокислот (например, соли аргинина и т.д.), и соли органических кислот, таких как глюкуроновая кислота и т.д. Некоторые конкретные соединения согласно настоящему изобретению одновременно содержат основные и кислые функциональные группы и, таким образом, могут быть превращены как в соли присоединения основания, так и в соли присоединения кислоты.

Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы из исходных соединений, содержащих кислую или основную группу, с помощью обычных химических методов. Как правило, такие соли получают путем взаимодействия таких соединений в форме свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или органическом растворителе, или их смеси.

Термин «аминокислоты» распространяется на встречающиеся в природе или синтезированные аминокислоты, а также на аналоги аминокислот и миметики аминокислот, которые действуют аналогично встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, закодированные генетическими кодами, а также модифицированные аминокислоты, такие как гидроксипролин, γ-карбоксиглутаминовая кислота и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот представляют собой соединения, имеющим такую же основную химическую структуру (например, α-углерод, связанный с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и R-группу), как встречающиеся в природе аминокислоты, такие как гомосерин, норлейцин, сульфоксид метионина и метионинметилсульфоний. Такие аналоги могут содержать модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированный пептидный остов, но сохраняют те же основные химические структуры, что и природные аминокислоты. Миметики аминокислот представляют собой химические соединения, которые имеют химическую структуру, отличающуюся от структуры обычных аминокислот, но выполняют аналогичную функцию с встречающимися в природе аминокислотами.

При упоминании в настоящем документе А или Ala представляет собой аланин, имеющий структуру R или Arg представляет собой аргинин, имеющий структуру N или Asn представляет собой аспарагин, имеющий структуру D или Asp представляет собой аспарагиновую кислоту, имеющую структуру С или Cys представляет собой цистеин, имеющий структуру Q или Gln представляет собой глутамин, имеющий структуру Е или Glu представляет собой глутаминовую кислоту, имеющую структуру G или Gly представляет собой глицин, имеющий структуру Н или His представляет собой гистидин, имеющий структуру I или Ile представляет собой изолейцин, имеющий структуру L или Leu представляет собой лейцин, имеющий структуру ; K или Lys представляет собой лизин, имеющий структуру М или Met представляет собой метионин, имеющий структуру F или Phe представляет собой фенилаланин, имеющий структуру Р или Pro представляет собой пролин, имеющий структуру S или Ser представляет собой серин, имеющий структуру Т или Thr представляет собой треонин, имеющий структуру W или Trp представляет собой триптофан, имеющий структуру Y или Tyr представляет собой тирозин, имеющий структуру V или Val представляет собой валин, имеющий структуру ; и Fmoc-AEEA-OH представляет собой

Термин «лечение» распространяется на ингибирование, облегчение, остановку или обращение прогрессирования или снижение тяжести существующего симптома или заболевания.

Если не указаны иные условия, предусмотрено, что термин «изомер» распространяется на геометрические изомеры, цис-транс-изомеры, стереоизомеры, энантиомеры, оптические изомеры, диастереомеры и таутомеры.

Соединение согласно настоящему изобретению может существовать в определенных геометрических или стерео из о мерных формах. Настоящее изобретение распространяется на все такие соединения, в том числе цис- и транс-из о меры, (-)- и (+)-энантиомеры, (R)-и (S)-энантиомеры, диастереомеры, (D)-изомеры, (L)-изомеры, а также соответствующие рацемические смеси и другие смеси, такие как смеси, обогащенные энантиомером или диастереомером, все из которых входят в объем настоящего изобретения. Дополнительные асимметрические атомы углерода могут присутствовать в заместителях, таких как алкильные группы. Все указанные изомеры и их смеси включены в объем настоящего изобретения.

Если не указаны иные условия, термин «энантиомеры» или «оптические изомеры» означает стереоизомеры, которые представляют собой зеркальные отражения друг друга.

Если не указаны иные условия, термин «цис-транс-изомеры» или «геометрические изомеры» означает изомеры, которые возникают в результате ограниченного вращения вокруг двойных или простых связей циклических атомов углерода.

Если не указаны иные условия, термин «диастереомеры» означает стереоизомеры, которые имеют два или более хиральных центра и демонстрируют незеркальные взаимоотношения между молекулами.

Если не указаны иные условия, «(+)» означает правовращающее соединение, «(-)» означает левовращающее соединение, «(±)» означает рацемическое соединение.

Если не указаны иные условия, связь в виде клинообразной сплошной линии и связь в виде клиновидной пунктирной линии используются для обозначения абсолютной конфигурации стереоцентра, связь в виде прямой сплошной линии и связь в виде прямой пунктирной линии используются для обозначения относительной конфигурации стереоцентра, волнистая линия может использоваться для обозначения связи в виде клинообразной сплошной линии или связи в виде клинообразной пунктирной линии или волнистая линия может использоваться для обозначения линейной связи в виде прямой сплошной линии или линейной связи в виде прямой пунктирной линии

Если не указаны иные условия, термин «обогащенный одним изомером», «изомерно обогащенный», «обогащенный одним энантиомером» или «энантиомерно обогащенный» означает, что содержание одного изомера или энантиомера в данном веществе составляет менее чем 100%, но составляет более чем или равняется 60%, или составляет более чем или равняется 70%, или составляет более чем или равняется 80%, или составляет более чем или равняется 90%, или составляет более чем или равняется 95%, или составляет более чем или равняется 96%, или составляет более чем или равняется 97%, или составляет более чем или равняется 98%, или составляет более чем или равняется 99%, или составляет более чем или равняется 99,5%, или составляет более чем или равняется 99,6%, или составляет более чем или равняется 99,7%, или составляет более чем или равняется 99,8%, или составляет более чем или равняется 99,9%.

Если не указаны иные условия, термин «изомерный избыток» или «энантиомерный избыток» означает разность между относительным процентным содержанием двух изомеров или двух энантиомеров. Например, если содержание одного изомера или энантиомера составляет 90%, а содержание другого изомера или энантиомера составляет 10%, то изомер или энантиомер имеет избыток, составляющий 80% (значение энантиомерного избытка).

Оптически активные (R)- и (8)-изомеры, а также D- и L-изомеры могут быть получены хиральным синтезом или с использованием хиральных реагентов или других традиционных методов. Чтобы получить один энантиомер соединения согласно настоящему изобретению, он может быть получен посредством асимметричного синтеза или дериватизации с использованием хирального вспомогательного агента. Полученную диастереомерную смесь затем разделяют и вспомогательную группу отщепляют, получая чистый желаемый энантиомер. В качестве альтернативы, когда молекула содержит основную функциональную группу (такую как аминогруппа) или кислую функциональную группу (такую как карбоксильная группа), соли диастереомеров могут быть образованы в результате реакции с соответствующей оптически активной кислотой или основанием. Диастереомеры затем могут быть разделены обычными методами, известными в данной области техники, с последующим выделением чистых энантиомеров. Кроме того, разделение энантиомеров и диастереомеров обычно осуществляется с помощью хроматографии, в которой используются хиральные неподвижные фазы, необязательно в сочетании с химической дериватизацией (например, посредством получения карбаматов из аминов).

Соединения согласно настоящему изобретению могут содержать неестественные пропорции атомных изотопов для одного или нескольких атомов, составляющих данные соединения. Например, соединения могут содержать в качестве меток радиоактивные изотопы, которые представляют собой, например, тритий (³Н), йод-125 (¹²⁵I) или углерод-14 (¹⁴С). Кроме того, например, водород может быть заменен дейтерием с образованием дейтерированных лекарственных средств. Связь между атомами дейтерия и углерода прочнее, чем связь между атомами обычного водорода и углерода, и по сравнению с недейтерированными лекарственными средствами дейтерированные лекарственные средства обладают преимуществами, которые представляют собой снижение токсических и побочных эффектов, повышение стабильности лекарственных средств, повышение эффективности и увеличение биологического периода полувыведения лекарственных средств. Все вариации изотопного состава соединений согласно настоящему изобретению, независимо от того, являются ли они радиоактивными они или нерадиоактивными, включены в объем настоящего изобретения.

Если в указанной соединительной группе не указано направление связи, то направление связи является произвольным. Например, соединительная группа L во фрагменте представляет собой -M-W-, и -M-W- может либо соединять кольцо А и кольцо В в том же направлении, что и порядок чтения слева направо, с образованием фрагмента либо соединять кольцо А и кольцо В в противоположном направлении по отношению к порядку чтения слева направо, с образованием фрагмента Комбинации соединительных групп, заместителей и/или их вариантов оказываются допустимыми только в том случае, если такие комбинации приводят к устойчивым соединениям.

Если не указаны иные условия, когда группа содержит одно или несколько положений с возможностью образования связей, любое одно или несколько таких положений группы могут быть связаны с другими группами посредством химических связей. Если способ соединения посредством химической связи является ненаправленным, и в положении с возможностью образования связей присутствуют атомы водорода, то при соединении посредством химической связи количество атомов водорода в этом положении будет уменьшаться соответственно количеству образованных химических связей с образованием группы соответствующей валентности. Химические связи между этим положением и другими группами могут быть представлены прямой сплошной линией прямой пунктирной линией или волнистой линией Например, прямая сплошная линия связи в группе -ОСН₃ указывает на то, что группа связана с другими группами через атом кислорода в этой группе; прямая пунктирная линия в группе указывает на то, что группа соединена с другими группами на двух концах атома азота в этой группе; волнистая линия в группе указывает на то, что фенильная группа связана с другими группами через атомы углерода в положениях 1 и 2 фенильной группы.

Если не указаны иные условия, термин «C_1-3 алкил» используется для обозначения линейной или разветвленной насыщенной углеводородной группы, состоящей из 1, 2 или 3 атомов углерода. Термин «C_1-3 алкил» распространяется на С_1-2 и С_2-3 алкил и т.д., и он означает радикал, который может быть одновалентным (например, метил), двухвалентным (например, метилен) или многовалентным (например, метилидин). Примеры С_1-3 алкила представляют собой, но без ограничения, метил (Me), этил (Et), пропил (в том числе н-пропил и изопропил) и т.д.

Структура соединений согласно настоящему изобретению может быть определена традиционными методами, которые известны специалистам в данной области техники. Если согласно настоящему изобретению предусмотрена абсолютная конфигурация соединений, эта абсолютная конфигурация может быть подтверждена с использованием традиционных методов в данной области техники. Например, может быть использована дифракция рентгеновских лучей на монокристаллах (SXRD), в процессе которой дифрактометр Bruker D8 используется для сбора данных об интенсивности дифракции выращенного монокристалла с применением CuKα в качестве источника излучения и в режиме сканирования ϕ/ω, и после сбора соответствующих данных кристаллическая структура может быть затем решена прямым методом с применением программного обеспечения SHELXS97, и в результате этого подтверждается абсолютная конфигурация.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены с применением множества синтетических методов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники, включая конкретные варианты осуществления, перечисленные ниже, варианты осуществления, полученные в результате комбинации с другими методами химического синтеза, и эквивалентные альтернативы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Предпочтительные варианты осуществления представляют собой, но без ограничения, примеры настоящего изобретения.

Растворители, используемые согласно настоящему изобретению, представляют собой имеющиеся в продаже вещества.

В настоящем документе используются следующие сокращения: водн. представляет собой водный, экв. представляет собой эквивалентное или равное количество; DCM представляет собой дихлорметан; РЕ представляет собой петролейный эфир; DMSO представляет собой диметилсульфоксид; МеОН представляет собой метанол; ВОС представляет собой трет-бутоксикарбонил, который защищает аминогруппу; к. т. представляет собой комнатную температуру; в т. н. представляет собой в течение ночи; THF представляет собой тетрагидрофуран; Вос₂О представляет собой ди-трет-бутилдикарбонат; TFA представляет собой трифторуксусную кислоту; DIEA представляет собой диизопропилэтиламин; DMF представляет собой N,N-диметилформамид; HBTU представляет собой гексафторфосфат бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония; НОВТ представляет собой 1-гидроксибензотриазол; HOAT представляет собой 1-гидрокси-7-азабензотриазол; DIC представляет собой N,N'-днизопропилкарбодинмид; DBU представляет собой 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен; PhSiH₃ представляет собой фенилсилан; и Pd(PPh₃)₄ представляет собой тетракис(трифенилфосфин)палладий.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение будет подробно описано посредством представленных ниже примеров, но при этом не подразумевается установление какого-либо неблагоприятного ограничения в отношении настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение подробно описано в данном документе, в котором также раскрыты конкретные варианты осуществления, для специалистов в данной области техники является очевидным, что могут быть произведены разнообразные изменения и модификации конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения без отклонения от идеи и выхода за пределы объема настоящего изобретения.

Промежуточное соединение А-1

Стадия 1. Заполнение смолой

1.1. Навески 4 г хлор-(о-хлорфенил)-дифенилметановой смолы (степень замещения S=1,00 ммоль/г) и 1,54 г соединения А-1_1 помещали в реакционную колонку, в которую после этого добавляли DCM (25 мл), а затем 3 мл N,N-диизопропилэтиламина, и реакционную колонку продували азотом в течение двух часов. После этого добавляли 4 мл МеОН, и реакционную колонку непрерывно продували азотом в течение 30 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

1.2. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

Стадия 2. Присоединение аминокислот

2.1. Присоединение А-1_1

1. Навеску А-1_1 (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 20 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 20 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

2.2. Присоединение А-1_а

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску А-1_а (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (3,00 экв.) и 20 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

2.3. Присоединение A-1_b

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску A-1_b (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 20 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

Стадия 3. Расщепление и высушивание неочищенного пептида

3.1 Расщепляющий раствор изготавливали, используя следующие объемные пропорции:

3.2. 60 мл изготовленного расщепляющего раствора выливали в реактор, содержащий смолу с пептидом после высушивания. Реактор продували в течение 20 минут, полученный в результате раствор фильтровали, и фильтрат помещали в колбу. Эту операцию осуществляли два раза, и собранный в двух операциях раствор высушивали на центрифуге с получением А-1.

Промежуточное соединение А-2

Промежуточное соединение А-2 было получено с применением метода синтеза промежуточного соединения А-1.

Промежуточное соединение А-3

Промежуточное соединение А-3 было получено с применением метода синтеза промежуточного соединения А-1.

Промежуточное соединение А-4

Промежуточное соединение А-4 было получено с применением метода синтеза промежуточного соединения А-1.

Вариант осуществления 1

Стадия 1. Навеску 1,34 г 4-(2',4'-диметоксифенилфлуоренил-метоксикарбониламинометил)-фенокси ацетамидометилбензилгидриламинной смолы (степень замещения Sub=0,3 ммоль/г) помещали в реакционную колонку, в которую после этого добавляли DMF (50 мл), и реакционную колонку продували азотом в течение двух часов. После этого отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

Стадия 2. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

Стадия 3. Присоединение аминокислот

3.1. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.2. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.3. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.4. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.5. Присоединение Fmoc-Ala-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ala-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.6. Присоединение Fmoc-Gly-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Gly-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.7. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.8. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.9. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.10. Присоединение Fmoc-Gly-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Gly-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.11. Присоединение Fmoc-Gly-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Gly-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.12. Присоединение Fmoc-Ala-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ala-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.13. Присоединение Fmoc-Ile-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ile-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.14. Присоединение Fmoc-Leu-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Leu-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.15. Присоединение Fmoc-Trp(Boc)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Trp(Boc)-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.16. Присоединение Fmoc-Lys(Dde)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Lys(Dde)-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.17. Присоединение Fmoc-Val-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Val-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.18. Присоединение Fmoc-Phe-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Phe-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.19. Присоединение Fmoc-Ala-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ala-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.20. Присоединение Fmoc-Lys(Alloc)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Lys(Alloc)-OH (2,0 экв.) добавляли в смолу, НОВТ (2,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли DIC (2,00 экв.) после того, как растворялись аминокислоты и НОВТ. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.21. Присоединение Fmoc-Gln(Trt)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут.Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Gln(Trt)-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.22. Присоединение Fmoc-Ala-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ala-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.23. Присоединение Fmoc-Ile-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ile-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.24. Присоединение Fmoc-Lys(Boc)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Lys(Boc)-OH (2,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.25. Присоединение Fmoc-Asp(OtBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Asp(OtBu)-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.26. Присоединение Fmoc-Leu-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Leu-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.27. Присоединение Fmoc-Aib-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты и Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Aib-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение двух часов. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.28. Присоединение Fmoc-Ile-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ile-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, НОАТ (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли DIC (6,00 экв.) после того, как растворялись аминокислоты и НОАТ. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение одного часа. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.29. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.30. Присоединение Fmoc-Tyr(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Tyr(tBu)-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.31. Присоединение Fmoc-Asp(OtBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Asp(OtBu)-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.32. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.33. Присоединение Fmoc-Thr(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Thr(tBu)-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.34. Присоединение Fmoc-Phe-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Phe-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.35. Присоединение Fmoc-Thr(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Thr(tBu)-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.36. Присоединение Fmoc-Gly-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Gly-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.37. Присоединение Fmoc-Glu(OtBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Glu(OtBu)-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, НОВТ (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли DIC (6,00 экв.) после того, как растворялись аминокислоты и НОВТ. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.38. Присоединение Fmoc-Aib-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Aib-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение ночи. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.39. Присоединение Boc-Tyr(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Boc-Tyr(tBu)-OH (6,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (12,0 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (5,70 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.40. Удаление Alloc

1. PhSiH₃ (10,0 экв.) и DCM (10 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли Pd(PPh₃)₄ (0,1 экв.), затем колонку продували азотом в течение 20 минут.Реакцию осуществляли два раза, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

2. Реакционную колонку промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.41. Присоединение Fmoc-Ida-OH

1. Навеску Fmoc-Ida-OH (4,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (8,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (3,80 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.42. Присоединение промежуточного соединения А-1

1. Раствор 10% DBU в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску промежуточного соединения А-1 (1,50 экв.) добавляли в смолу, DIEA (3,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (1,45 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.43. Удаление Dde

1. Раствор 3% гидразина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 15 минут, и отходы сливали. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

3.44. Замыкание амидного кольца

1. DIEA (3,0 экв.) в диметилформамиде добавляли в смолу, затем раствор HATU (1,5 экв.) в диметилформамиде в капельном режиме медленно помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

4. Усадку смолы осуществляли с помощью метанола (50 мл) каждый раз в течение трех минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Смолу извлекали и высушивали для последующего использования.

Стадия 4. Расщепление и высушивание неочищенного пептида

4.1. Расщепляющий раствор изготавливали, используя следующие объемные пропорции:

4.2. Высушенную смолу с пептидом помещали в изготовленный расщепляющий раствор, встряхивали на встряхивающем устройстве в течение 2,5 часов, и осуществляли фильтрование. Фильтрат добавляли в десятикратный объем охлажденного льдом изопропилового эфира, центрифугировали и промывали пять раз изопропиловым эфиром. После этого осуществляли высушивание при пониженном давлении в течение двух часов и получали неочищенный пептид, который очищали с получением полипептидного соединения WX-001. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [M+4H]/4 составляло 1228,6, и обнаруженное значение составляло 1228,7.

Вариант осуществления 2

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-001 был получен полипептид WX-002. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [M+4H]/4 составляло 1243,1, и обнаруженное значение составляло 1242,8.

Вариант осуществления 3

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-001 был получен полипептид WX-003. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1232,1, и обнаруженное значение составляло 1232,2.

Вариант осуществления 4

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-001 был получен полипептид WX-004. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1228,6, и обнаруженное значение составляло 1228,2.

Вариант осуществления 5

Стадия 1. Навеску 1,34 г 4-(2',4'-диметоксифенилфлуоренил-метоксикарбониламинометил)-феноксиацетамидометилбензилгидрил аминной смолы (степень замещения Sub=0,3 ммоль/г) помещали в реакционную колонку, в которую после этого добавляли DMF (50 мл), и реакционную колонку продували азотом в течение двух часов. После этого отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

Стадия 2. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

Стадия 3. Присоединение аминокислот

3.1. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.2. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

5. Стадию 3.2 воспроизводили аналогичным образом для осуществления присоединения следующих аминокислот.

3.40. Удаление Alloc

1. PhSiH₃ (10,0 экв.) и DCM (10 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли Pd(PPh₃)₄ (0,1 экв.), затем колонку продували азотом в течение 20 минут. Реакцию осуществляли два раза, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

2. Реакционную колонку промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.41. Присоединение Fmoc-Ida-OH

1. Навеску Fmoc-Ida-OH (4. 0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (8,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (3,80 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.42. Присоединение промежуточного соединения А-1

1. Раствор 10% DBU в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску промежуточного соединения А-1 (1,50 экв.) добавляли в смолу, DIEA (3,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (1,45 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.43. Удаление Dde

1. Раствор 3% гидразина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 15 минут, и отходы сливали. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

3.44. Замыкание амидного кольца

1. DIEA (3,0 экв.) в диметилформамиде добавляли в смолу, затем раствор HATU (1,5 экв.) в диметилформамиде в капельном режиме медленно помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

4. Усадку смолы осуществляли с помощью метанола (50 мл) каждый раз в течение трех минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Смолу извлекали и высушивали для последующего использования.

Стадия 4. Расщепление и высушивание неочищенного пептида

4.1. Расщепляющий раствор изготавливали, используя следующие объемные пропорции:

4.2. Высушенную смолу с пептидом помещали в изготовленный расщепляющий раствор, встряхивали на встряхивающем устройстве в течение 2,5 часов, и осуществляли фильтрование. Фильтрат добавляли в десятикратный объем охлажденного льдом изопропилового эфира, центрифугировали и промывали пять раз изопропиловым эфиром. После этого осуществляли высушивание при пониженном давлении в течение двух часов и получали неочищенный пептид, который очищали с получением полипептида WX-005. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1232,6, и обнаруженное значение составляло 1232,5.

Вариант осуществления 6

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-001 был получен полипептид WX-006. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1232,4, и обнаруженное значение составляло 1232,4.

Вариант осуществления 7

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-001 был получен полипептид WX-007. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1218,1, и обнаруженное значение составляло 1218,3.

Вариант осуществления 8

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-001 был получен полипептид WX-008. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1228,6, и обнаруженное значение составляло 1228,6.

Вариант осуществления 9

Стадия 1. Навеску 1,34 г 4-(2',4'-диметоксифенилфлуоренил-метоксикар бониламино метил)-ф енокси ац етамидометилбензилгидрил аминной смолы (степень замещения Sub=0,3 ммоль/г) помещали в реакционную колонку, в которую после этого добавляли DMF (50 мл), и реакционную колонку продували азотом в течение двух часов. После этого отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

Стадия 2. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

Стадия 3. Присоединение аминокислот

3.1. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.2. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

5. Стадию 3.2 воспроизводили аналогичным образом для осуществления присоединения следующих аминокислот.

3.40. Удаление Alloc

1. PhSiH₃ (10,0 экв.) и DCM (10 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли Pd(PPh₃)₄ (0,1 экв.), затем колонку продували азотом в течение 20 минут.Реакцию осуществляли два раза, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

2. Реакционную колонку промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.41. Присоединение Fmoc-Ida-OH

1. Навеску Fmoc-Ida-OH (4. 0 экв.) добавляли в смолу, DIEA (8,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (3,80 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.42. Присоединение промежуточного соединения А-1

1. Раствор 10% DBU в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску промежуточного соединения А-1 (1,50 экв.) добавляли в смолу, DIEA (3,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (1,45 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.43. Удаление Dde

1. Раствор 3% гидразина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 15 минут, и отходы сливали. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

3.44. Замыкание амидного кольца

1. DIEA (3,0 экв.) в диметилформамиде добавляли в смолу, затем раствор HATU (1,5 экв.) в диметилформамиде в капельном режиме медленно помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

4. Усадку смолы осуществляли с помощью метанола (50 мл) каждый раз в течение трех минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Смолу извлекали и высушивали для последующего использования.

Стадия 4. Расщепление и высушивание неочищенного пептида

4.1. Расщепляющий раствор изготавливали, используя следующие объемные пропорции:

4.2. Пептидную смола с пептидом помещали в изготовленный расщепляющий раствор, встряхивали на встряхивающем устройстве в течение 2,5 часов, и осуществляли фильтрование. Фильтрат добавляли в десятикратный объем охлажденного льдом изопропилового эфира, центрифугировали и промывали пять раз изопропиловым эфиром После этого осуществляли высушивание при пониженно м давлении в течение двух часов и получали неочищенный пептид, который очищали с получением полипептида WX-QQ9. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1247,1, и обнаруженное значение составляло 1247,2.

Вариант осуществления 10

Стадия 1. Навеску 1,08 г 4-(2',4'-диметоксифенилфлуоренил-метоксикар бониламино метил)-ф енокси ац етамидометилбензилгидрил аминной смолы (степень замещения Sub=0,37 ммоль/г) помещали в реакционную колонку, в которую после этого добавляли DMF (50 мл), и реакционную колонку продували азотом в течение двух часов. После этого отходы сливали до техпор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

Стадия 2. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты и Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

Стадия 3. Присоединение аминокислот

3.1. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.2. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.3. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.4. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.5. Присоединение Fmoc-Ala-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ala-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.6. Присоединение Fmoc-Gly-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Gly-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.7. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.8. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.9. Присоединение Fmoc-Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Pro-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.10. Присоединение Fmoc-Gly-Gly-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Gly-Gly-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.11. Присоединение Fmoc-Ala-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ala-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.12. Присоединение Fmoc-Ile-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ile-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.13. Присоединение Fmoc-Leu-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Leu-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.14. Присоединение Fmoc-Trp(Boc)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Trp(Boc)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.15. Присоединение Fmoc-Glu(OtBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.16. Присоединение Fmoc-Val-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Val-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.17. Присоединение Fmoc-Phe-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Phe-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.18. Присоединение Fmoc-Ala-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ala-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.19. Присоединение Fmoc-Lys(AUoc)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Lys(Alloc)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.20. Присоединение Fmoc-Gln(Trt)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Gln(Trt)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.21. Присоединение Fmoc-Ala-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ala-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HBTU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.22. Присоединение Fmoc-Lys(Dde)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Lys(Dde)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.23. Присоединение Fmoc-Lys(Boc)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Lys(Boc)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.24. Присоединение Fmoc-Asp(OtBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Asp(OtBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.25. Присоединение Fmoc-Leu-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Leu-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.26. Присоединение Fmoc-Aib-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты и Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Aib-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение двух часов. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.27. Присоединение Fmoc-Ile-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ile-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение одного часа. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.28. Присоединение Fmoc-Ser(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Ser(tBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.29. Присоединение Fmoc-Tyr(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Tyr(tBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.30. Присоединение Fmoc-Asp(OtBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Asp(OtBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.31. Присоединение Fmoc-Thr(tBu)-SerPsi(Me,Me)Pro-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Thr(tBu)-SerPsi(Me,Me)Pro-OH (2,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (4,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (1,90 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.32. Присоединение Fmoc-Phe-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Phe-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.33. Присоединение Fmoc-Thr(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Thr(tBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.34. Присоединение Fmoc-Gly-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Gly-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.35. Присоединение Fmoc-Glu(OtBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.36. Присоединение Fmoc-Aib-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску Fmoc-Aib-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение ночи. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.37. Присоединение Boc-Tyr(tBu)-OH

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола приобретала синий цвет.

2. Boc-Tyr(tBu)-OH (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали хлоранил, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.38. Удаление Alloc

1. PhSiH₃ (10,0 экв.) и DCM (20 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли Pd(PPh₃)₄ (0,10 экв.), затем колонку продували азотом в течение 20 минут. Реакцию осуществляли два раза, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

2. Реакционную колонку промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.39. Присоединение Fmoc-Glu-OAll

1. Навеску Fmoc-Glu-OAll (3,00 экв.) добавляли в смолу, DIEA (6,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (2,85 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.40. Присоединение промежуточного соединения А-1

1. Раствор 20% пиперидина в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 20 минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

2. Навеску промежуточного соединения А-1 (1,50 экв.) добавляли в смолу, DIEA (3,00 экв.) и 10 мл DMF затем помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли HATU (1,45 экв.) после того, как растворялись аминокислоты. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

3. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

4. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.41. Удаление Alloc

1. PhSiH₃ (10,0 экв.) и DCM (20 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом, а затем добавляли Pd(PPh₃)₄ (0,10 экв.), затем колонку продували азотом в течение 20 минут. Реакцию осуществляли два раза, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

2. Реакционную колонку промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

3.42. Удаление Dde

1. Раствор 3% гидразингидрата в диметилформамиде (50 мл) помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом в течение 15 минут, и отходы сливали. Реакционную колонку промывали диметилформамидом (50 мл) пять раз, каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Для обнаружения использовали нингидрин, причем смола приобретала синий цвет.

3.42. Замыкание амидного кольца

1. DIEA (3,00 экв.) в диметилформамиде добавляли в смолу, затем раствор HATU (1,50 экв.) в диметилформамиде в капельном режиме медленно помещали в реакционную колонку, которую после этого продували азотом. Подачу азота регулировали таким образом, чтобы смола набухала равномерно.

2. Реакцию осуществляли при температуре 25°С в течение 30 минут. Для обнаружения использовали нингидрин, при этом смола становилась бесцветной и прозрачной.

3. Реакционный раствор извлекали из реакционной колонки, которую после этого промывали диметилформамидом пять раз (по 50 мл каждый раз), каждый раз в течение одной минуты, и отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать.

4. Усадку смолы осуществляли с помощью метанола (50 мл) каждый раз в течение трех минут. Отходы сливали до тех пор, пока жидкость не переставала вытекать. Смолу извлекали и высушивали для последующего использования.

Стадия 4. Расщепление и высушивание неочищенного пептида

4.1. Расщепляющий раствор изготавливали, используя следующие объемные пропорции:

4.2. Высушенную смолу с пептидом помещали в изготовленный расщепляющий раствор, встряхивали на встряхивающем устройстве в течение 2,5 часов, и осуществляли фильтрование. Фильтрат добавляли в десятикратный объем охлажденного льдом изопропилового эфира, центрифугировали и промывали пять раз изопропиловым эфиром После этого осуществляли высушивание при пониженном давлении в течение двух часов и получали неочищенный пептид, который подвергали очистке. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение составляло 1236,1, и обнаруженное значение составляло 1236,0.

Вариант осуществления 11

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-010 был получен полипептид WX-011. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1236,1, и обнаруженное значение составляло 1236,0.

Вариант осуществления 12

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-001 с использованием промежуточного соединения А-2 был получен полипептид WX-012. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1225,6, и обнаруженное значение составляло 1225,7.

Вариант осуществления 13

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-001 с использованием промежуточного соединения А-3 был получен полипептид WX-013. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1264,9, и обнаруженное значение составляло 1264,6.

Вариант осуществления 14

В результате осуществления метода синтеза соединения WX-001 с использованием промежуточного соединения А-4 был получен полипептид WX-014. Молекулярную массу полипептида определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, причем вычисленное значение [М+4Н]/4 составляло 1257,9, и обнаруженное значение составляло 1257,8.

Данные биологических исследований

Пример исследования 1. Исследование агонистической активности CLP-1R/GIPR в лабораторных условиях

А. Основные материалы:

1) Клеточные линии

Клеточные линии были созданы компанией Wuxi АРРТЕС (Shanghai) Co., Ltd. См подробное описание в приведенной ниже таблице 1.

2) Реагенты и расходные материалы

3) Приборы

В. Методы

1) Экспериментальные материалы Экспериментальные буферные растворы

Получение реагентов для анализа

2) Экспериментальные методы

а) Получение планшетов с соединениями:

Исследуемые соединения разбавляли, осуществляя четырехкратное разбавление с десятью точками, начиная от исходной концентрации, составляющей 30 мкМ. Разбавление осуществляли с помощью прибора Bravo.

b) Перенос соединений:

1) 100 нл соединений переносили на планшет OptiPlate-384 с помощью прибора Echo.

2) Планшет OptiPlate-384 центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 5 секунд.

c) Получение клеточной суспензии:

1) Клеточный криофлакон GLP-1R/GIPR помещали в теплую воду при температуре 37°С в процессе быстрого размораживания.

2) Клеточную суспензию переносили в переносную центрифужную пробирку объемом 15 мл и аккуратно промывали, используя 10 мл HBSS.

3) Центрифужную пробирку центрифугировали со скоростью 1000 об/мин при комнатной температуре в течение одной минуты.

4) Надосадочный раствор отбрасывали.

5) Клетки на дне аккуратно диспергировали, затем аккуратно промывали, используя 10 мл HBSS, центрифужную пробирку центрифугировали для осаждения клеток, и, наконец, клетки повторно суспендировали в экспериментальном буферном растворе.

6) Плотность и жизнеспособность клеток измеряли с помощью прибора Vi-cell.

7) Клетки GLP-1R/GIPR разбавляли экспериментальным буферным раствором до концентрации 2,0-10⁵/мл.

8) 100 нл разбавленной клеточной суспензии переносили на планшет OptiPlate-384.

9) Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 30 минут.

d) Добавляли реагент для анализа:

1) Добавляли 10 мкл градиентного разбавленного стандартного раствора 800 нМ цАМФ в пустые лунки планшета OptiPlate-384.

2) Добавляли 10 мкл цАМФ в качестве реагента для анализа.

3) Планшет OptiPlate-384 покрывали пленкой TopSeal-A и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут.

Пленку TopSeal-A удаляли, и считывание показаний осуществляли на приборе EnVision.

С.Экспериментальные результаты

Экспериментальные результаты представлены в приведенной ниже таблице 6.

Вывод: соединения согласно настоящему изобретению проявляют сильную агонистическую активность по отношению к GLP-1R/GIPR.

Пример исследования 2. Оценка фармакокинетических профилей соединений на крысах

A. Экспериментальная цель:

Исследование фармакокинетических профилей соединений в отношении крыс Спрэга-Доули.

B. Экспериментальная процедура

Фармакокинетические характеристики животных-грызунов после подкожной инъекции соединений были исследованы с использованием стандартных протоколов. В процессе эксперимента соединения-кандидаты были переведены в прозрачные растворы, которые были введены крысам посредством однократной подкожной инъекции (SC) в количестве 0,048 мг/кг. Растворитель для инъекции представлял собой цитратный буферный раствор (20 мМ, рН=7). Цельная кровь была собрана и переработана для получения плазмы. Концентрацию лекарственного средства анализировали методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, и фармакокинетические параметры вычисляли с использованием программного обеспечения Phoenix WinNonlin.

C. Экспериментальные результаты

Экспериментальные результаты представлены в приведенной ниже таблице 7.

Вывод: соединения согласно настоящему изобретению проявляют превосходные фармакокинетические свойства в отношении крыс.

Пример исследования 3. Оценка фармакокинетических профилей соединений в отношении мышей

A. Экспериментальная цель:

Исследование фармакокинетических профилей соединений в отношении мышей линии C57BL/6.

B. Экспериментальная процедура

Фармакокинетические характеристики животных-грызунов после подкожной инъекции соединений были исследованы с использованием стандартных протоколов. В процессе эксперимента соединения-кандидаты были переведены в прозрачные растворы, которые были введены мышам посредством однократной подкожной инъекции (SC) в количестве 0,048 мг/кг. Растворитель для инъекции представлял собой цитратный буферный раствор (20 мМ, рН=7). Цельная кровь была собрана и переработана для получения плазмы. Концентрацию лекарственного средства анализировали методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, и фармакокинетические параметры вычисляли с использованием программного обеспечения Phoenix WinNonlin.

C. Экспериментальные результаты

Экспериментальные результаты представлены в приведенной ниже таблице 8.

Вывод: соединения согласно настоящему изобретению проявляют превосходные фармакокинетические свойства в отношении мышей.

Пример исследования 4. Оценка фармакокинетических профилей соединений в отношении яванских макаков (Cynomolgus macaques)

A. Экспериментальная цель:

Исследование фармакокинетических профилей соединений в отношении яванским макаков (Cynomolgus macaques).

B. Экспериментальная процедура

Фармакокинетические характеристики в отношении млекопитающих после внутривенной инъекции и подкожной инъекции соединений были исследованы с использованием стандартных протоколов. В процессе эксперимента соединения-кандидаты были переведены в прозрачные растворы, которые были введены яванским макакам посредством однократной подкожной инъекции (SC) в количестве 0,002 мг/кг. Растворитель для инъекции представлял собой цитратный буферный раствор (20 мМ, рН=7). Цельная кровь была собрана и переработана для получения плазмы. Концентрацию лекарственного средства анализировали методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, и фармакокинетические параметры вычисляли с использованием программного обеспечения Phoenix WinNonlin.

C. Экспериментальные результаты

Экспериментальные результаты представлены в приведенной ниже таблице 9.

Вывод: соединения согласно настоящему изобретению проявляют превосходные фармакокинетические свойства в отношении обезьян.

Пример исследования 5. Исследования устойчивости в плазме (PLS)

A. Экспериментальная цель:

Исследование устойчивости исследуемых соединений в плазме нормальных мышей.

B. Экспериментальная процедура

1. Перед экспериментом свернувшуюся замороженную плазму размораживали на водяной бане при температуре 37°С. Полученную плазму центрифугировали со скоростью 4000 об/мин в течение 5 минут. В случае присутствия сгустка крови его удаляли и доводили рН до 7,4±0,1

2. Раствор исследуемого соединения изготавливали в результате разбавления соединения диметилсульфоксидом с получением раствора, имеющего концентрацию 100 мкМ.

3. К 98 мкл плазмы в качестве холостого контрольного образца добавляли 2 мкл раствора исследуемого соединения (100 мкМ) для получения смешанного раствора с конечной концентрацией 2 мкМ, который инкубировали на водяной бане при температуре 37°С

4. В каждый момент времени (0, 10, 30, 60 и 120 минут) соответственно добавляли 100 мкл раствора H₃PO₄ и 800 мкл останавливающего раствора (100% раствор 200 нг/мл толбутамида и 200 нг/мл лабеталола в метаноле) для осаждения белка, который затем тщательно перемешивали.

5. Образцы центрифугировали со скоростью 4000 об/мин в течение 20 минут, и по 100 мкл надосадочного раствора отбирали из каждой лунки для анализа методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией.

С.Экспериментальные результаты

Экспериментальные результаты представлены в приведенной ниже таблице 10.

Вывод: соединения согласно настоящему изобретению проявляют превосходную устойчивость в плазме.

Пример исследования 6. Исследование связывания с белками плазмы (РРВ)

A. Экспериментальная цель:

Исследование связывания исследуемого соединения альбумином плазмы человека/мыши.

B. Экспериментальная процедура

1. Изготовление холостой матрицы: в день эксперимента плазму размораживали в холодной воде и центрифугировали со скоростью 3220 об/мин в течение 5 минут для удаления всех сгустков крови. Значение рН полученной плазмы измеряли и доводили до 7,4±0,1, используя по желанию раствор 1% фосфорной кислоты или 1 н гидроксида натрия.

2. Разбавление исследуемых соединений: исследуемые соединения растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) с получением концентрированных растворов, концентрация которых составляла 10 мМ и 2 мМ соответственно. 2 мкл концентрированного раствора (2 мМ) разбавляли, используя 98 мкл DMSO, с получением рабочего раствора с концентрацией 40 мкМ. 10 мкл концентрированного раствора разбавляли, используя 240 мкл DMSO, с получением рабочего раствора контрольных соединений с концентрацией 400 мкМ. Рабочий раствор соединений (5 мкл) равномерно смешивали с холостой матрицей (995 мкл) в соотношении 1:200 для изготовления загрузочной матрицы. 3. Аналитическая процедура

3.1. Равные количества по 30 мкл загрузочной матрицы (n=2) переносили на планшет для сбора образцов в целях подготовки образцов нулевого момента времени (Т0) для определения остатков. Образцы немедленно объединяли с соответствующим холостым буферным раствором до конечного объема 60 мкл, при этом объемное соотношение плазмы (загрузочной матрицы) и буферного раствора составляло 1:1 в каждой лунке. Затем в образцы Т0 исследуемых соединений добавляли соответственно 60 мкл водного раствора 4% Н₃РО₄ и 480 мкл останавливающего раствора, содержащего внутренний стандарт. Затем их хранили при температуре от 2°С до 8°С вместе с другими образцами для дальнейшей обработки.

3.2. Остальные образцы плазмы предварительно инкубировали в углекислотном инкубаторе при температуре 37±1°С в течение 30 минут. Были приготовлены безбелковые образцы (образцы F). Все образцы с матрицей (230 мкл) переносили в поликарбонатные пробирки (n=2) и ультрацентрифугировали при температуре 37°С и ускорении 155000×g (35000 об/мин) в течение 4 часов.

3.3. Чтобы приготовить образцы Т (исследуемые образцы), дополнительный образец, содержащий матрицу, переносили в отдельный 96-луночный планшет (планшет для инкубации образцов) и инкубировали при температуре 37°С в течение 4 часов.

3.4. После окончания центрифугирования безбелковые образцы (образцы F) объемом 30 мкл и образцы Т объемом 30 мкл были взяты из второго слоя (под верхним слоем) надосадочного раствора и перенесены в новый планшет для сбора образцов. Каждый образец смешивали с соответствующим холостым буферным раствором или матрицей до конечного объема 60 мкл, а соотношение объемов холостой матрицы и буферного раствора составляло 1:1. Ко всем образцам добавляли по 60 мкл водного раствора 4% Н₃РО₄ и 480 мкл останавливающего раствора, содержащего внутренний стандарт. Смесь центрифугировали со скоростью 4000 об/мин в течение 20 минут. Для анализа методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией отбирали по 100 мкл надосадочного раствора для каждого образца.

С.Экспериментальные результаты

Экспериментальные результаты представлены в приведенной ниже таблице 11.

Примечание: показатель «не применяется» означает, что способность связывания с белками плазмы была настолько высокой, что никакие свободные лекарственные средства не были обнаружены при нормальной концентрации белков плазмы.

Вывод: соединения согласно настоящему изобретению проявляют чрезвычайно высокую способность связывания с белками плазмы.

Пример исследования 7. Проверка эффективности в мышиных моделях STZ-NASH

A. Экспериментальная цель:

Проверка эффективности исследуемых соединений на моделях NASH, индуцированного STZ-HFD, у мышей линии C57BL/6.

B. Экспериментальная процедура

Метод моделирования. Новорожденным мышам подкожно вводили стрептозоцин (STZ) по 200 мкг на мышь в течение 48 часов после рождения. После 4 недель грудного вскармливания животных с уровнем глюкозы натощак выше 12 ммоль/л отбирали для 6 недель непрерывного применения диеты с высоким содержанием жиров (HFD), чтобы в конечном итоге создать модель NASH. Еще 8 животных были отобраны без инъекции STZ и применения диеты с высоким содержанием жиров (нормальная контрольная группа).

Режим дозирования. - Через неделю применения диеты с высоким содержанием жиров начинали введение доз. День введения первой дозы был установлен как день 1, после чего проводились подкожные инъекции каждые два дня в течение пяти недель подряд.

Обнаружение экспериментальной конечной точки: патологическое окрашивание с применением гематоксилина и эозина (НЕ) и сириуса красного (SR).

C. Экспериментальные результаты

Экспериментальные результаты представлены в приведенной ниже таблице 12.

Вывод: соединения согласно настоящему изобретению способны значительно улучшать показатели NAS в мышиных моделях STZ-NASH.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="PCTCN2022095859 sequence

list_updated_1.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-10-04">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ГУАНДУН РЭЙНОВЕНТ БАЙОТЕК КО.,

ЛТД.</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>GUANGDONG RAYNOVENT BIOTECH CO.,

LTD.</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">ЦЗЯН Чжигань</InventorName>

<InventorNameLatin>JIANG Zhigan</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ

ПОЛИПЕПТИДА</InventionTitle>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>(S)-2-amino-3-hydroxypropionic acid or

(S)-2-amino-3-hydroxypropanamide</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>(S)-2-амино-3-гидроксипропионовая

кислота или

(S)-2-амино-3-гидроксипропанамид</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKIAQKAFVKWLIAGGPSSGAPPPX</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>(S)-2-amino-3-hydroxypropionic acid or

(S)-2-amino-3-hydroxypropanamide</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>(S)-2-амино-3-гидроксипропионовая

кислота или

(S)-2-амино-3-гидроксипропанамид</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKKAQKAFVKWLIAGGPSSGAPPPX</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKIAQKAFVKWLIAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKIAQKEFVKWLIAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKIAQKAFIKWLIAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKIAQKAFVKWLLAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKKAQKAFVEWLIAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKKAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKKAQKAFVAWLIAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKKAQKAFVIWLIAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKKAQKEFVEWLIAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>39</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Aib</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>MOD_RES</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>AMIDATION</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>АМИДИРОВАНИЕ</NonEnglishQualifier_va

lue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>YXEGTFTSDYSIXLDKKAQKAFVKWLIAGGPSSGAPPPS</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии, конкретно к двойным агонистам GLP-1/GIP. Предложен полипептид с агонистической активностью в отношении GLP-1R/GIPR, имеющий последовательность, представленную в формуле (II): YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS₀, которая представлена в SEQ ID NO: 1. В конкретном варианте полипептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3-11. Аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях 17 и 20 или в положениях 20 и 24 присоединены к , и в полипептидной последовательности формулы (II) заменены дополнительно от 0 до 2 аминокислот. Также предложена фармацевтическая композиция на основе указанного полипептида и их применение в получении лекарственных средств для лечения неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) или неалкогольного стеатогепатита (NASH). Предложенный полипептид проявляет очень сильную агонистическую активность в отношении GLP-1R/GIPR, проявляет превосходные фармакокинетические свойства, устойчивость в плазме и чрезвычайно сильное связывание с белками плазмы. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 12 табл., 7 пр.

1. Полипептид с агонистической активностью в отношении GLP-1R/GIPR, имеющий последовательность, которая представлена в формуле (II)

YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS₀

Формула (II),

которая представлена в SEQ ID NO: 1,

который имеет модификации, представленные ниже:

1) аминокислота в положении i заменена лизином, а также аминогруппа на лизине в положении i присоединена к вместе с аминогруппой на боковых цепях лизина в положении i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях j и j+4 присоединены к , причем i составляет 17 или при этом j составляет 20; и

2) заменены дополнительно от 0 до 2 аминокислот в полипептидной последовательности, которая представлена в формуле (II),

при этом,

когда аминокислота в положении i заменена лизином, а также аминогруппа на лизине в положении i присоединена к вместе с аминогруппой на боковых цепях лизина в положении i+3, заменены от 0 до 2 аминокислот в положении 21 или 24 полипептида формулы (II), при этом аминокислота в положении 21 заменена на глутаминовую кислоту (E) и/или аминокислота в положении 24 заменена на глутамин (Q), аланин (A), изолейцин (I) или глутаминовую кислоту (E);

когда аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях j и j+4 присоединены к , заменена от 0 до 1 аминокислоты в положении 21, 23 или 27 полипептида формулы (II), при этом аминокислота в положении 21 заменена на глутаминовую кислоту (E), или аминокислота в положении 23 заменена на изолейцин (I), или аминокислота в положении 27 заменена на лейцин (L);

при этом

Aib имеет структуру

S₀ выбирают из группы, которую составляют

X выбирают из группы, которую составляют и , причем «*» показывает положение присоединения к X₁,

X₁ выбирают из группы, которую составляют простая связь, -С(=O)-, -O-С(=O)- и -N(R₁)-C(=O)-;

R₁ выбирают из группы, которую составляют Н и С_1-3 алкил,

Х₂ выбирают из группы, которую составляют

и ;

m выбирают из 2, 3 и 4;

n выбирают из 15, 16, 17, 18 и 19;

р выбирают из 1 и 2.

2. Полипептид по п. 1, в котором последовательность полипептида является такой, как представлено в формуле (Р)

YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS₀

Формула (P),

которая представлена в SEQ ID NO: 2,

который имеет модификации, представленные ниже:

1) аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях 17 и 20 присоединены к и

2) заменены от 0 до 2 аминокислот в положении 21 или 24 на полипептиде формулы (P), при этом аминокислота в положении 21 заменена на глутаминовую кислоту (E) и/или аминокислота в положении 24 заменена на глутамин (Q), аланин (A), изолейцин (I) или глутаминовую кислоту (E);

при этом Aib, S₀, X, X₁ и X₂ принимают такие значения, которые определены в п. 1.

3. Полипептид по п. 1, который имеет модификации, перечисленные ниже:

1) аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях 20 и 24 присоединены к и

2) заменена от 0 до 1 аминокислоты в положении 21, 23 или 27 полипептида формулы (II), при этом аминокислота в положении 21 заменена на глутаминовую кислоту (E) или аминокислота в положении 23 заменена на изолейцин (I) или аминокислота в положении 27 заменена на лейцин (L);

при этом Aib, S₀, X, X₁ и X₂ принимают такие значения, которые определены в п. 1.

4. Полипептид по п. 1, причем полипептид имеет последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности, которые представлены в формулах (II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-6), (IV-7), (IV-8), (IV-9) и (IV-10):

YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2

Формула (II-1),

которая представлена в SEQ ID NO: 3,

YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK EFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2

Формула (II-2),

которая представлена в SEQ ID NO: 4,

YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFIKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2

Формула (II-3),

которая представлена в SEQ ID NO: 5,

YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LLAGG PSSGA PPPS-NH2

Формула (II-4),

которая представлена в SEQ ID NO: 6,

YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH2

Формула (III-6),

которая представлена в SEQ ID NO: 7,

YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVQW LIAGG PSSGA PPPS-NH2

Формула (IV-7),

которая представлена в SEQ ID NO: 8,

YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVAW LIAGG PSSGA PPPS-NH2

Формула (IV-8),

которая представлена в SEQ ID NO: 9,

YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVIW LIAGG PSSGA PPPS-NH2

Формула (IV-9),

которая представлена в SEQ ID NO: 10 и

YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK EFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH2

Формула (IV-10),

которая представлена в SEQ ID NO: 11,

которые имеют модификации, представленные ниже:

аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях 17 и 20 или аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях 20 и 24 присоединены к ,

при этом Aib, X, X₁ и Х₂ принимают такие значения, которые определены в п. 1.

5. Полипептид по любому из пп. 1-4, в котором R₁ выбирают из Н.

6. Полипептид по любому из пп. 1-4, в котором X₁ выбирают из группы, которую составляют простая связь, -С(=О)-, -О-С(=О)- и -NH-C(=О)-.

7. Полипептид по любому из пп. 1-4, в котором m выбирают из 2.

8. Полипептид по любому из пп. 1-4, в котором n выбирают из 15 и 17.

9. Полипептид по любому из пп. 1-4, в котором р выбирают из 2.

10. Полипептид по любому из пп. 1-4, в котором Х₂ выбирают из группы, которую составляют

, ,

и .

11. Полипептид по п. 10, в котором Х₂ выбирают из группы, которую составляют

12. Полипептид по любому из пп. 1-4, в котором аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях j и j+4 присоединены к с образованием ,

13. Полипептид по любому из пп. 1-4, в котором аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях i и i+3 или аминогруппы на боковых цепях лизина в положениях j и j+4 присоединены к с образованием ,

14. Полипептид по любому из пп. 1-4, в котором структурное звено выбирают из группы, которую составляют

15. Полипептид по п. 14, в котором структурное звено выбирают из группы, которую составляют

16. Полипептид с агонистической активностью в отношении GLP-1R/GIPR, имеющий формулу, выбранную из группы, которую составляют формулы, которые представлены ниже:

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7,

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и

имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

17. Фармацевтическая композиция для лечения неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) или неалкогольного стеатогепатита (NASH), содержащая терапевтически эффективное количество полипептида по любому из пп. 1-16 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли в качестве активного ингредиента, а также фармацевтически приемлемый носитель.

18. Применение полипептида по любому из пп. 1-16 или соответствующей фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции по п. 17 в получении лекарственных средств для лечения неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) или неалкогольного стеатогепатита (NASH).

19. Полипептид по любому из пп. 1-16 или соответствующая фармацевтически приемлемая соль или фармацевтическая композиция по п. 17, которые вводятся одной порцией раз в трое суток, раз в четверо суток, раз в неделю или раз в две недели.

название	год	авторы	номер документа
КОНЪЮГИРОВАННОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ТРИЦИКЛИЧЕСКОГО ПОЛИПЕПТИДА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ	2022	Ли, Хуэйнин Ся, Цзяньхуа Цзян, Чжигань Хэ, Хайин Чэнь, Шухуэй	RU2837445C2
СОЛЬ (СОЛИ) ДИМЕТИЛАМИДА 7-ЦИКЛОПЕНТИЛ-2-(5-ПИПЕРАЗИН-1-ИЛ-ПИРИДИН-2-ИЛАМИНО)-7Н-ПИРРОЛО[2,3-d]ПИРИМИДИН-6-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ	2011	Кальенни, Джон Винсент Чэнь, Гуан-Пэй Гун, Баоцин Капа, Прасад Котесвара Саксена, Вишал	RU2631243C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕГАРЕЛИКСА	2010	Чзан Хайсян Фомсгард Енс Старкар Гюннар	RU2515555C2
КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛА С АМАТОКСИНОМ НЕПРИРОДНОГО ТИПА	2018	Чжу, И Ли, Цзе Юй, Юнго Вань, Вэйли Лю, Вэйцзя Чжо, Ши	RU2798981C2
НОВЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БАРУСИБАНА И ЕГО ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ	2016	Малик Лэйла Висневский Казимеж Девен Шанталь	RU2726414C2
СИНТЕЗ ИНСУЛИНОТРОПНЫХ ПЕПТИДОВ	2007	Чэнь Линь Хан Йен-Квэй Робертс Кристофер Р.	RU2448978C2
ПРОИЗВОДНОЕ АНАЛОГА GLP-1 ИЛИ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2010	Ван Яли Люй Айфен Сунь Чаньгань Юань Хэнли	RU2565536C2
СПОСОБ СИНТЕЗА ЦИКЛИЧЕСКИХ ДЕПСИПЕПТИДОВ	2018	Хаймбах, Дирк Омура, Сатоси Суназука, Тосиаки Хиросе, Томоясу Ногути, Кебберлинг, Йоханнес У, Чжицзе Фу, Шуйбяо У, Вей Цю, Цзиньфэн Хэ, Лю Вей, Сюйдун	RU2817013C1
КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛА С АМАТОКСИНОМ НЕПРИРОДНОГО ТИПА	2018	Чжу, И Ли, Цзе Юй, Юнго Вань, Вэйли Лю, Вэйцзя Чжо, Ши	RU2840926C2
1-[1-(4-БЕНЗИЛОКСИ-3,5-ДИФТОР-БЕНЗОИЛ)-4-ФТОР-ПИРРОЛИДИН-2-КАРБОНИЛ]-ПИРРОЛИДИН-2-КАРБОНИТРИЛ	2021	Тарраго Клуа, Тереса Прадес Косано, Рохер	RU2841064C1

CN 107207576 A, 26.09.2017
CN 110684082 A, 14.01.2020
WO 2020067575 A1, 02.04.2020
WO 2018181864 A1, 04.10.2018
CN 111410686 A, 14.07.2020
WO 2011119657 A1, 29.09.2011
Мясорубка	1928	Моисеев А.Я. Моисеева С.И.	SU31230A1
ПЕПТИДЫ ГЛЮКАГОНОВОГО СУПЕРСЕМЕЙСТВА, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ОТНОСИТЕЛЬНО ЯДЕРНЫХ ГОРМОНАЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ	2011	Димарчи Ричард Д. Ян Бинь Файнэн Брайан	RU2604067C2

ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДА Российский патент 2024 года по МПК C07K14/605 C07K14/575 A61K38/26 A61P3/00 A61P1/16

Описание патента на изобретение RU2830694C2

Похожие патенты RU2830694C2

Реферат патента 2024 года ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДА

Формула изобретения RU 2 830 694 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2830694C2

RU 2 830 694 C2