Получение устойчивых к инфицированию ВИЧ Т-клеток Российский патент 2024 года по МПК C12N15/867 

Область техники

Изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, биомедицины и клеточных технологий. Изобретение потенциально может быть использовано для лечения ВИЧ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019 на базе Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ИБГ РАН (ЦВРГТБ ИБГ РАН).

Уровень техники

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является социально-значимым патогеном. Антиретровирусная терапия не позволяет добиться полной эрадикации вируса из организма, в связи с чем ее применение является пожизненным. При этом для ВИЧ характерно развитие устойчивости к препаратам. Генотерапия является альтернативным развивающимся направлением терапии ВИЧ-инфекции.

В терапии вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) применяются пептидные ингибиторы слияния – короткие пептиды из С-концевого гептадного повтора вирусного белка gp41 (С-пептиды). Они ингибируют проникновение ВИЧ в клетку, взаимодействуя с областью N-концевого гептадного повтора gp41 и блокируя образование 6-спирального пучка, необходимого для слияния вирусной и клеточной мембран. Первым одобренным препаратом этой группы стал Энфувиртид [1]. Этот препарат обладает рядом недостатков, включая появление резистентных штаммов ВИЧ и развитие побочных эффектов у пациентов.

Вследствие низкой эффективности растворимых форм пептидов начали развиваться технологии экспонирования пептидов на клеточной мембране. Описан метод экспонирования пептидного ингибитора слияния на мембране в контексте хемокинового корецептора ВИЧ CXCR4 [2], при котором слияние пептида с рецептором происходит через связку из двух аминокислот, лейцина и лизина, а в качестве способа доставки ингибитора используется лентивирусный вектор. Ведутся клинические испытания.

Также описан способ доставки пептида 2P23 на поверхность мембраны в контексте GPI-заякоренного белка [3], однако описанная конструкция имеет больший по сравнению с патентуемой системой размер белка, используемого для GPI-заякоривания и не оптимизированную для повышенного уровня поверхностной экспрессии пептида конфигурацию.

Ранее была разработана технология создания Т-клеточной устойчивости к ВИЧ-1 на основе генетически-кодируемых GPI-заякоренных пептидов из gp41, доставляемых в клетку с помощью системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 (патенты РФ № RU2769567C1 от 04.04.2022 и № RU2779300C1 от 05.09.2022). Экспонирование пептида на мембране клетки достигается путем размещения последовательности, кодирующей защитный пептид между сигналом экспорта и сигналом GPI-заякоривания GPI-заякоренного белка человека CD52. Данные опубликованы [4](фигура 1). Важно отметить, что уровень защитной активности экспонированного на мембране С-пептида зависит не только от его структуры, но и от уровня его поверхностной экспрессии [4].

Патентуемая технология является более эффективной по сравнению с опубликованными ранее, поскольку позволяет добиться значительно большей эффективности интеграции защитной конструкции в геном целевой клетки путем внесения защитной конструкции с помощью лентивируса третьего поколения. Помимо этого, патентуемая технология позволяет добиться более сильной защиты клеток от инфицирования ВИЧ благодаря усовершенствованной для увеличения уровня поверхностной экспрессии конфигурации защитной конструкции. Также, технология предусматривает возможность экспонирования на мембране одновременно двух разных С-пептидов, что гипотетически минимизирует вероятность развития резистентности.

Техническая задача – усовершенствование технологии создания Т-клеточной устойчивости к ВИЧ-1 на основе генетически-кодируемых GPI-заякоренных пептидов из gp41. Технический результат – повышение эффективности внесения защитной конструкции, повышение устойчивости клеток к ВИЧ-1, получение клеток, устойчивых к инфицированию ВИЧ-1, в частности CD4+ лимфоцитов человека, и также придание Т-клеткам устойчивости к инфицированию ВИЧ-1.

Безопасность технологии и эффективность доставки защитной конструкции достигаются путем использования в качестве средства доставки лентивирусного вектора третьего поколения с вынесенным в отдельную плазмиду геном Rev.

Раскрытие сущности изобретения

Настоящее изобретение представляет собой технологию генотерапии ВИЧ, при которой два одинаковых или различающихся защитных пептида (они же пептидные ингибиторы слияния или С-пептиды) из субъединицы gp41 вирусного белка слияния доставляются на поверхность плазматической мембраны клетки-мишени с помощью лентивирусной трансдукции. Это осуществляется за счет внесения нуклеотидных последовательностей, кодирующих защитные пептиды, в геном в контексте самого короткого GPI-заякоренного белка человека – CD52.

В частном случае изобретение касается защитного пептида МТ-С34, кодируемого последовательностью SEQ ID № 1, и/или защитного пептида 2Р23, кодируемого последовательностью SEQ ID № 2, из субъединицы gp41 вирусного белка слияния, которые доставляются на поверхность плазматической мембраны клетки-мишени за счет внесения кодирующих их нуклеотидных последовательностей в геном в контексте самого короткого GPI-заякоренного белка человека – CD52.

Защитная конструкция интегрируется в геном с помощью лентивирусной трансдукции. Интеграция защитной конструкции в геном целевой клетки осуществляется путем внесения защитной конструкции с помощью лентивируса третьего поколения.

Для наработки лентивируса используется набор (панель) лентивирусных векторов третьего поколения:

• один из векторов, кодирующий защитную конструкцию: pCDH- Ef1-MT-C34-P2A-MT-C34, pCDH- Ef1-2Р23-P2A-2Р23 или pCDH- Ef1-2Р23-P2A-MT-C34, сконструированный на базе коммерческого вектора pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP cDNA Cloning and Expression Lentivector,

• Упаковочный вектор pMDLg-pRRE (Addgene #12251),

• Вектор, кодирующий ген RevpRSV-Rev (Addgene #12253),

• Вектор, кодирующий энвелоп вируса везикулярного стоматита pCMV-VSVG (Addgene # 8454).

Соотношение векторов в мкг: 1,3 : 2 : 1 : 1.

Уровень защитной активности GPI-заякоренного пептида коррелирует с уровнем его поверхностной экспрессии [4]. Для повышения и стабилизации уровня поверхностной экспрессии, защитная конструкция помещена под промотором Ef1α SEQ ID № 3.

Векторы, кодирующие защитную конструкцию, – рекомбинантные бицистронные векторы на основе лентивируса. Векторы сконструированы на базе коммерческого вектора pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP cDNA Cloning and Expression Lentivector и кодируют защитную конструкцию, расположенную под единым промотором.

В частном случае изобретение касается векторов pCDH-Ef1-MT-C34-P2A-MT-C34, pCDH-Ef1-2Р23-P2A-2Р23 или pCDH-Ef1-2Р23-P2A-MT-C34, сконструированных на базе коммерческого вектора pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP cDNA Cloning and Expression Lentivector и несущих защитную конструкцию под единым промотором Ef1α SEQ ID № 3.

Защитная конструкция представляет собой 2 одинаковые или 2 различающиеся по последовательности С-пептида защитные последовательности, разделенные последовательностью для раздельной трансляции Р2А SEQ ID № 4, при этом защитные последовательности расположены между сигналом экспорта белка CD52 SEQ ID №5 и сигналом GPI-заякоривания белка CD52 SEQ ID № 6.

В частном случае защитные последовательности – это последовательности, кодирующие С-пептид МТ-С34 SEQ ID № 1 и/или С-пептид 2Р23 SEQ ID № 2, расположенные между сигналом экспорта SEQ ID №5и сигналом GPI-заякоривания SEQ ID № 6 белка CD52. Схема защитной конструкции представлена на фигуре 2. Описанная конфигурация позволяет добиться повышения и стабилизации уровня поверхностной экспрессии защитного пептида по сравнению с неоптимизированной конструкцией. Данные о повышении и стабилизации уровня поверхностной экспрессии защитного С-пептида по сравнению с не оптимизированной конфигурацией представлены на фигуре 3. В результате уровень защитной активности генетической конструкции достигает 99,9% (фигура 4).

В патентуемом изобретении с целью уменьшения иммуногенности, из генетической конструкции был исключен зеленый флюоресцентный белок mClover, который в более ранних конфигурациях использовался для сортировки трансдуцированных клеток [4].

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Механизм блокирования слияния ВИЧ с клеткой GPI-заякоренным пептидом МТ-С34 или 2Р23

Верхний ряд: Белок слияния ВИЧ состоит из двух субъединиц: gp41 и gp120. Субъединица gp120 взаимодействует с клеточным рецептором CD4, после чего она меняет свою конформацию и взаимодействует с корецептором CCR5 или CXCR4 на поверхности клетки-мишени. После этого субъединица gp41 меняет свою конформацию и встраивается в мембрану целевой клетки. Gp41 имеет N- и С- концевой гептадные повторы, обозначенные на схеме как CHR и NHR. Каждый из них представлен тремя α-спиралями. В результате того, что эти повторы связываются друг с другом происходит формирование шестиспирального пучка с дальнейшим сближением и слиянием мембран.

Нижний ряд: Экспонированный на поверхности клетки посредством GPI-заякоревания С-пептид МТ-С34 или 2Р23 конкурирует с СHR за связывание с NHR, и таким образом не дает сформироваться шестиспиральному пучку, в результате проникновение ВИЧ в клетку блокируется.

Фигура 2: Схема защитной конструкции

Защитная конструкция размещена под промотором Ef1α. Защитная конструкция состоит из 2 защитных последовательностей, разделенных последовательностью для раздельной трансляции Р2А. Защитные последовательности – это последовательность пептида МТ-С34 или 2Р23, расположенная между сигналом экспорта и сигналом GPI-заякоривания белка CD52.

Фигура 3: Повышение и стабилизация уровня поверхностной экспрессии защитного С-пептида по сравнению с не оптимизированной конфигурацией А – верхний ряд - сравнение генетических конструкций моно- и бицистронного векторов. Нижний ряд – типичные цитофлюорограммы клеточных линий CEM/R5, экспрессирующих конструкцию из моно- или бицистронного вектора. Показано увеличение и стабилизация уровня поверхностной экспрессии пептида при использовании бицистронного вектора по сравнению с моноцистронным. Б – графическое представление уровня поверхностной экспрессии пептидов МТ-С34 и 2Р23 после лентивирусной трансдукции и клеточной сортировки клеточной линии CEM/R5, определенное методом проточной цитометрии. Представлены данные трех независимых экспериментов. Использование бицистронного вектора позволяет добиться более высокого уровня поверхностной экспрессии защитного пептида. Отличия статистически значимы *р<0,05.

Фигура 4. Уровень защищенности клеток CEM/R5 в инфекционном тесте на межклеточную передачу вируса. Графическое представление результатов инфекционных тестов на межклеточную передачу вируса от клеток-продуцентов к тестируемым клеточным линиям CEM/R5, экспрессирующим защитную конструкцию после лентивирусной трансдукции и клеточной сортировки по наличию целевого пептида, которая проводилась до чистоты популяции >98%. Показаны результаты инфекционных тестов с тремя разными штаммами ВИЧ: R5-тропными pJRFL и ZM-135 и Х4-тропным NL4-3. Клетки продемонстрировали высокую, до 99,9%, устойчивость к инфицированию ВИЧ.

Фигура 5. Графическое представление результатов инфекционных тестов с первичными CD4⁺ лимфоцитами человека. CD4⁺ лимфоциты, выделенные от трех разных доноров, трансдуцировали одним из лентивирусов: МТ-С34-Р2А-МТ-С34 или 2Р23-Р2А-МТ-С34. Клетки однократно сортировали по наличию пептида, среднее содержание клеток, несущих целевую конструкцию указано для каждой серии экспериментов (µ). Клетки тестировали в инфекционных тестах на межклеточную передачу ВИЧ с двумя разными штаммами ВИЧ: R5-тропным ZM-135 или Х4-тропным NL4-3. Клетки показали высокую устойчивость к ВИЧ инфекции не зависимо от донора и штамма ВИЧ.

Осуществление изобретения

В описании данного изобретения, если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Под бицистронным вектором понимают векторы, которые генерируют множество нативных белков из одного транскрипта мРНК.

Используемый здесь термин «лентивирусы» эквивалентен термину «векторы, основанные на лентивирусах», «лентивирусные векторные системы» или «лентивирусные векторы» и относится к вирусам из рода Lentivirinae семейства Retroviridae, к которому принадлежит и вирус иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1).

Под рекомбинантными лентивирусами понимают лентивирусы, в которых вирусные мембранные гликопротеины gp120 и gp41 заменены на такие гликопротеины, как гликопротеин вируса везикулярного стоматита VSV-G. Лентивирусные векторные системы третьего поколений включают целый комплекс модификаций и улучшений, гарантирующих их безопасность (в плане рекомбинации и появления вируса дикого типа).

Под «защитным пептидом» понимают С-пептиды, пептидные ингибиторы слияния, короткие пептиды из С-концевого гептадного повтора вирусного белка gp41.

Для осуществления изобретения проводится лентивирусная трансдукция путем добавления лентивируса третьего поколения к клеткам-мишеням.

Пример 1. Наработка лентивируса третьего поколения

Вирус нарабатывается в клетках HEK293T путем трансфекции ДНК. Смесь для трансфекции содержит трансфекционный реагент Lipofectaminep2000 (ThermoFisher) и следующие векторы:

• один из векторов, кодирующий защитную конструкцию: pCDH- Ef1-MT-C34-P2A-MT-C34, pCDH- Ef1-2Р23-P2A-2Р23 или pCDH- Ef1-2Р23-P2A-MT-C34, сконструированный на базе коммерческого вектора pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPcDNACloningandExpressionLentivector,

• Упаковочный вектор pMDLg-pRRE (Addgene #12251),

• Вектор, кодирующий ген RevpRSV-Rev (Addgene #12253),

• Вектор, кодирующий энвелоп вируса везикулярного стоматита pCMV-VSVG (Addgene # 8454).

Соотношение векторов в мкг: 1,3 : 2 : 1 : 1.

Вектор, кодирующий защитную конструкцию, нарабатывается в бактериях, как и все остальные векторы.

Через 48 часов после трансфекции супернатант с вирусными частицами собирается, фильтруется через фильтр с порой 4 мкм, концентрируется методом ультрацентрифугирования и замораживается при температуре -70 С^о. Готовый вирус хранится при температуре -70 С^о, после размораживания повторное замораживание не допускается.

Протокол ультрацентрифугирования:

Вирусный супернатант переносится в пробирку для ультрацентрифугирования. С помощью пипетатора под вирусный супернатант подслаивается 2 мл раствора 20% сахарозы в PBS. Ультрацентрифугирование проводится при следующих параметрах: скорость - 91 000 RCF, время - 1:30, температура 4C^о. После ультрацентрифугирования супернатант отбирается, в пробирку добавляется 300 мкл PBS, смесь инкубируется 1 час при температуре 4C^о, после чего ресуспендируется. Готовый вирус необходимо хранить при температуре -70С^о.

Пример 2. Получение устойчивых к инфицированию ВИЧ клеток.

С целью получения устойчивых к инфицированию ВИЧ клеток, наработанный лентивирус добавляется к клеткам Т-клеточной линии CEM-R5, пермиссивной к инфицированию ВИЧ [4], или первичным CD4⁺ лимфоцитам человека. Через 48 часов клетки сортируются по наличию пептида с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания.

Для оценки степени защиты клеток от ВИЧ, полученные клетки анализируются в одноцикловом инфекционном тесте на межклеточную передачу ВИЧ-1 с штаммами ВИЧ с разным тропизмом. Для этого клетки Raji электропорируются смесью плазмид: pUCHR-inLuc-mR, pCMV-d8.2R и плазмиды, кодирующей один из оболочечных белков Env из штаммов ВИЧ-1 NL4-3, JRFL или ZM135. Трансфицированные клетки инкубируются 6 часов и смешиваются с тестируемыми клетками-мишенями CEM/R5/MT-C34-MT-C34, CEM/R5/2Р23-2Р23 или CD4+/MT-C34-MT-C34, CD4⁺/2Р23-MT-C34. Соотношение клеток Raji и тестируемых клеток составляет 2:1. Через 72 часа совместного культивирования уровень инфекции измеряется по активности люциферазы. Результаты инфекционных тестов для клеточных линий CEM/R5 представлены на фигуре 4, для первичных CD4⁺ человека - на фигуре 5.

Результаты тестов показали, что каждый лентивирусный вектор из панели эффективно защищает клетки от проникновения ВИЧ не зависимо от тропности штамма. Все представленные результаты получены как минимум в трех независимых экспериментах, что подтверждает описанные эффекты и их статистическую значимость.

Изобретение позволило получить устойчивые к инфицированию ВИЧ первичные CD4⁺ лимфоциты человека с высокой эффективностью: эффективность трансдукции составляет более 80%.

Изобретение потенциально может быть использовано для получения устойчивых к инфицированию ВИЧ CD4⁺ лимфоцитов человека для терапии ВИЧ.

Цитируемая литература

[1] J. P. Lalezarietal., “AcontrolledPhaseIItrialassessingthreedosesofenfuvirtide (T-20) incombinationwithabacavir, amprenavir, ritonavirandefavirenzinnon-nucleosidereversetranscriptaseinhibitor-naiveHIV-infectedadults.,” AntivirTher, vol. 8, no. 4, pp. 279–87, Aug. 2003.

[2] G. J. Leslie et al., “Potent and Broad Inhibition of HIV-1 by a Peptide from the gp41 Heptad Repeat-2 Domain Conjugated to the CXCR4 Amino Terminus,” PLoS Pathog, vol. 12, no. 11, p. e1005983, Nov. 2016, doi: 10.1371/journal.ppat.1005983.

[3] X. Tang et al., “A Membrane-Anchored Short-Peptide Fusion Inhibitor Fully Protects Target Cells from Infections of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1), HIV-2, and Simian Immunodeficiency Virus,” J Virol, vol. 93, no. 22, Nov. 2019, doi: 10.1128/JVI.01177-19.

[4] A. Maslennikova et al., “Engineering T-Cell Resistance to HIV-1 Infection via Knock-In of Peptides from the Heptad Repeat 2 Domain of gp41,” mBio, vol. 13, no. 1, Feb. 2022, doi: 10.1128/mbio.03589-21.

This XML file does not appear to have any style information associated with it. The document tree is shown below.

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="HIV-1.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-12-06">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate/>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>non</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биологии гена Российской академии наук </ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Institute of Gene Biology Russian Academy

of Sciences</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Панель бицистронных лентивирусов третьего поколения

для придания Т-клеткам устойчивости к инфицированию ВИЧ-1 </InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>108</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..108</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgacctggatggagtgggaccgggagatcaataactacac

ctcactgatccacagcctgatcgaggagtcccagaaccagcaggagaagaacgagcaggagct

cctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>69</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..69</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagatgacctgggaagagtgggaaaagaaggtcgaggaactggag

aagaaaatcgaagagctgctcaag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>544</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..544</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatc

gcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtgg

cgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggaga

accgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacac

agctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccgccat

ccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgt

ctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctag

actcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttc

tgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>66</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..66</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggatccggcgcaacaaacttctctctgctgaaacaagccggaga

tgtcgaagagaatcctggaccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>69</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..69</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aagcgcttcctcttcctcctactcaccatcagcctcctggtta

tggtacagatacaaactggactctca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>78</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..78</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcagcatccagcaacataagcggaggcattttccttttcttc

gtggccaatgccataatccacctcttctgcttcagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, биомедицины и к области клеточных технологий. Описана конструкция для получения устойчивых к инфицированию ВИЧ CD4⁺ лимфоцитов человека, представляющая собой одинаковые или различающиеся две последовательности пептида из С-концевого гептадного повтора вирусного белка gp41, разделенные последовательностью для раздельной трансляции Р2А SEQ ID № 4, при этом указанные последовательности расположены между сигналом экспорта белка CD52 SEQ ID №5 и сигналом GPI-заякоривания белка CD52 SEQ ID № 6. Изобретение расширяет арсенал средств для терапии ВИЧ-1. Также описан рекомбинантный бицистронный лентивирусный вектор для получения устойчивых к инфицированию ВИЧ Т-клеток, кодирующий конструкцию по пп.1, 2, расположенную под единым промотором, сконструированный на базе коммерческого вектора лентивектора pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP. Способ получения устойчивых к инфицированию ВИЧ CD4⁺ лимфоцитов человека, включающий следующие стадии: наработки лентивируса в клетках HEK293T после трансфекции лентивирусными векторами третьего поколения, включая вектор по изобретению; фильтрацю; добавление наработанного лентивируса третьего поколения к клеткам Т-клеточной линии CEM/R5 или первичным CD4+ лимфоцитам человека; интеграцию заявленной конструкции в геном целевой клетки; сортировку клеток через 48 часов по наличию пептида с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения ВИЧ. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

1. Конструкция для получения устойчивых к инфицированию ВИЧ CD4⁺ лимфоцитов человека, представляющая собой одинаковые или различающиеся две последовательности пептида из С-концевого гептадного повтора вирусного белка gp41, разделенные последовательностью для раздельной трансляции Р2А SEQ ID № 4, при этом указанные последовательности расположены между сигналом экспорта белка CD52 SEQ ID №5 и сигналом GPI-заякоривания белка CD52 SEQ ID № 6.

2. Конструкция по п.1, в которой последовательности С-концевого гептадного повтора вирусного белка gp41 представлены последовательностью ДНК SEQ ID № 1, кодирующей С-пептид МТ-С34, или последовательностью ДНК SEQ ID № 2, кодирующей С-пептид 2Р23.

3. Рекомбинантный бицистронный лентивирусный вектор для получения устойчивых к инфицированию ВИЧ Т-клеток, кодирующий конструкцию по пп.1, 2, расположенную под единым промотором, сконструированный на базе коммерческого вектора лентивектора pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP.

4. Вектор по п.3, в котором конструкция помещена под промотор Ef1α SEQ ID № 3.

5. Вектор по п.3, представляющий собой вектор pCDH-Ef1α-MT-C34-P2A-MT-C34, pCDH-Ef1α-2Р23-P2A-2Р23 или pCDH-Ef1α-2Р23-P2A-MT-C34.

6. Способ получения устойчивых к инфицированию ВИЧ CD4⁺ лимфоцитов человека, включающий следующие стадии:

1) наработка лентивируса в клетках HEK293T путем трансфекции ДНК смесью для трансфекции, содержащей трансфекционный реагент Lipofectamine p2000 Thermo Fisher и следующие лентивирусные векторы третьего поколения:

- вектор по пп.3-5;

- упаковочный вектор pMDLg-pRRE (Addgene #12251);

- вектор, кодирующий ген Rev, pRSV-Rev (Addgene # 12253);

- вектор, кодирующий энвелоп вируса везикулярного стоматита, pCMV-VSV-G (Addgene # 8454);

2) фильтрация через фильтр с порой 4 мкм, концентрация методом ультрацентрифугирования и замораживание при температуре -70 С^о;

3) добавление наработанного лентивируса третьего поколения к клеткам Т-клеточной линии CEM/R5 или первичным CD4+ лимфоцитам человека;

4) интеграции конструкции по пп.1,2 в геном целевой клетки;

5) сортировка клеток через 48 часов по наличию пептида с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания.

7. Способ по п.6, в котором векторы используются в следующем соотношении, указанном в мкг: 1,3 : 2 : 1 : 1, где в 1,3 мкг используется вектор по пп.3-5; в 2 мкг – упаковочный вектор pMDLg-pRRE (Addgene #12251), в 1 мкг – вектор, кодирующий ген Rev, pRSV-Rev (Addgene # 12253) и вектор, кодирующий энвелоп вируса везикулярного стоматита, pCMV-VSV-G (Addgene # 8454).