Способ фармакологической коррекции оксидативных нарушений при переломах на фоне остеопороза в эксперименте хондроитином сульфатом Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 A61K31/726 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и остеологии, и может быть использовано в коррекции оксидативных нарушений при моделированных переломах на фоне экспериментального остеопороза.

По известным литературным источникам, хондроитин сульфат способен оказывать позитивное влияние на процессы репаративной регенерации и ремоделирования костной ткани (Аникин С.Г., Алексеева Л.И. Хондроитина сульфат: механизмы действия, эффективность и безопасность при терапии остеоартроза. - Современная ревматология. Фармакотерапия. – № 3. – 2012. – с 78-82; Toshiyasu K., Tadahisa М., S. Miharu, [et al]. Chondroitin sulfate-E mediates estrogen-induced osteoanablism. – Scientific reports. – 11 March 2015 | 5: 8994 | DOI: 10.1038/srep08994).

Известен метод коррекции гипоэстрогенного остеопороза и профилактики возникновения остеопоротических переломов стронцием ранелатом («Способ терапии постменопаузального остеопороза» (патент RU 2423982 C2, публ. 20.07.2011) Ростиславиной И.О., Пешехоновой Л.К., Пешехонова Д.В.). Этот способ характеризуется тем, что пациенткам с постменопаузальным остеопорозом назначается препарат Бивалос (стронций ранелат) по 1 саше в сутки на ночь, который назначается в сочетании с альфа-D₃ по 1,0 мкг один раз в сутки на ночь в течение шести месяцев (Рожинская Л.Я. Исследование эффективности и безопасности лечения Бивалосом (стронцием ранелатом) постменопаузального остеопороза: результаты Российского многоцентрового исследования / Л.Я. Рожинская, С.Д. Арапова, Л.К. Дзеранова // Терапевтический архив. - 2008. - №5. - С. 47-52). Недостатком данного способа является то, что комбинация данных препаратов подразумевает длительную терапию, а также не продемонстрировано антиоксидантного влияния препарата Бивалос.

Наиболее близким к заявленному решению является способ коррекции микроциркуляторных нарушений в костной ткани при экспериментальном остеопорозе и переломах на его фоне L-норвалином (О.С. Гудырев, Д.С.Р. Раджкумар, П.П. Ремизов, М.С. Соболев, М.В. Покровский, [и др.], патент RU № 2541181 C1, публ. 10.02.2015 г.). Этот метод характеризуется тем, что у самок крыс линии Wistar моделируют гипоэстроген-индуцированный остеопороз путем проведения двусторонней овариэктомии, после которой через 8 недель выполняется межвертельная остеотомия бедренной кости, тем самым макетируются остеопоротические переломы проксимальных отделов бедра. Проводят фармакологическую коррекцию данных патологических состояний L-норвалином в дозе 10 мг/кг внутрижелудочно, ежедневно, однократно в сутки: при модели остеопороза в течение восьми недель, а при переломах бедра на фоне остеопороза в течение двенадцати недель. Оценка степени формирования морфофункциональных нарушений при остеопорозе и остеопоротических переломах, а также эффективность их фармакологической коррекции L-норвалином производится путем измерения уровня микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедра и гистоморфометрическими исследованиями указанной зоны.

Основным недостатком способа является то, что не представлено влияние L-норвалина на значения оксидативного стресса и минеральной плотности костной ткани при остеопорозе.

Исходя из накопленных научных знаний, окислительно-модифицированные белки (ОМБ) являются наиболее ранними симптомами поражения органов при различных заболеваниях. Было выявлено, что процессы резорбции костой ткани интенсифицируются при оксидативном стрессе (Захаров И. С., Колпинский Г. И., Ушакова Г. А., Вавин Г. В. Роль оксидативного стресса в формировании постменопаузального остеопороза. – Гинекология. – 2014. – Т. 16. – № 1. – с. 41-43; Chen L., Wang G., Wang Q, Liu Q., Sun Q. N-acetylcysteine prevents orchiectomy-induced osteoporosis by inhibiting oxidative stress and osteocyte senescence //American journal of Translational Research. 2019. Is. 11(7). P. 433747.). Известно, что на более поздних этапах окислительных реакций в организме наблюдается агрегация белков, что характерно при формировании остеопоротических изменений в костях скелета. Маркерами этих процессов при анализе сыворотки крови при спектрофотометрии выступают показатели концентрации кетон-динитрофинилгидрозонов (КДНФГ).

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа фармакологической коррекции оксидантного стресса при моделированных переломах длинных трубчатых костей на фоне экспериментального остеопороза хондроитин сульфатом.

Поставленная задача решается с помощью предлагаемого способа, включающего введение лабораторному животному фармакологических средств после моделирования остеопороза с помощью билатеральной овариэктомии и остеопоротических переломов бедренных и плечевых костей у самок крыс линии Wistar. Причем в качестве такого средства используют хондроитин сульфат в дозе 68,6 мг/кг, который вводят ежедневно внутрижелудочно, однократно в сутки в течение 12 недель.

Внутрижелудочное введение хондроитина сульфата в указанной дозировке ведет к предупреждению повышения уровней общего и нейтрального кетон-динитрофинилгидрозона, которые являются маркерами окислительного стресса, также исследуемый препарат способствует предотвращению уменьшения ширины трабекул в метафизарных отделах длинных трубчатых костей и снижению минеральной плотности костной ткани при рентгеновской денситометрии при остеопорозе.

Основным преимуществом предлагаемого способа является его антиоксидантная эффективность хондроитин сульфата при генерализованном остеопорозе, что оказывает позитивное влияние на сращение экспериментальных остеопоротических переломов метафизарных отделов длинных трубчатых костей.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Опыты выполняют на крысах-самках линии Wistar массой 250±30 г. Овариэктомия производится под общим наркозом (раствор хлоралгидрата внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг). Внутрижелудочное введение хондроитина сульфата в дозе 68,6 мг/кг начинали на следующий день после операции и осуществляли ежедневно в течение восьми недель (до 56 дня эксперимента включительно). На 57 день крысы экспериментальных групп распределялись на две равные по количеству (распределение путем случайной выборки). В первой группе (после наркотизации раствором хлоралгидрата внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг) моделируется закрытый перелом проксимального метафиза бедренной кости с фиксацией спицей Киршнера и продолжается терапия хондроитин сульфата в указанной дозе до 12 недель после начала эксперимента. Во второй группе под тем же наркозом проводится хирургический доступ к проксимальному метафизу плечевой кости, выполняется остеотомия плечевой кости, тем самым имитируется метафизарный перелом плечевой кости, с последующей фиксацией спицей, и тоже продолжается введение хондроитина сульфата. На 24 день после моделирования переломов плеча и бедра крысам под наркозом (хлоралгидрат внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг) производилась цифровая рентгеновская денситометрия с использованием системы молекулярной визуализации In-Vivo FX Pro производства компании Bruker (США) при помощи лицензированного программного обеспечения - Bone Density Software.

Полученные значения сравниваются с интактными животными (ложная операция овариэктомии), а также контрольными животными, у которых посредством проведения билатеральной овариэктомии моделировали генерализованный остеопороз, а через 8 недель производились остеотомии в верхних метафизарных отделах бедренных и плечевых костей. При статистической обработке данных рассчитывается среднее значение, величина стандартной ошибки. Различия считаются статистически значимыми при р<0,05.

После эвтаназии у подопытных животных производился забор костного биоматериала исследуемых локализаций для гистоморфометрии исследования. Гистологические препараты проксимальных метафизов бедренных и плечевых костей окрашивали гематоксилином и эозином. Осуществлялась оптическая микроскопия препаратов с помощью микроскопа Микромед-1 (увеличение х100: объектив х10, окуляр х10) с фотографированием препаратов при помощи цифровой камеры Levenhuk M800 PLUS (разрешение 2592х1944). Морфометрическое исследование полученных фотоснимков производили при помощи программы ImageJ версии 1.39, в ходе которого оценивали ширину костных трабекул. Для этого использовалось одно и то же оснащение, что и для получения фотографий костных структур, а также фотографировали микрометровую «линейку» (объект-микрометра) длиной 1 мм, которой измеряли ширину костных трабекул и полученные значения выражали в микрометрах (мкм).

Для определения степени тяжести окислительного стресса индуктированными свободными радикалами кислорода, в экспериментальной и клинической биохимии использовался способ измерения значений количества окислительно-модифицированных белков (Артюшкова Е. Б., Фурман Ю. В., Жеребилов Н. И., Недзведский В. С., Крюков А. А., [и др.], патент RU 2754434 С1, публ. 02.09.2021 г.). Для точности расчета количества окислительно-модифицированных белков (ОМБ) применен способ комплексной оценки количества данных маркеров в биологических жидкостях (Артюшкова Е. Б., Фурман Ю. В., Жеребилов Н. И., Крюков А. А., Щербаков А. М., [и др.], патент RU № 2770562 С1, публ. 18.04.2022 г.). Перед выведением животных из эксперимента производился забор крови с последующим спектрофотометрическим исследованием сыворотки крови. Полученные значения оптической плотности исследуемых образцов выражали в оптических единицах (ОЕ).

Все животные были разделены на 6 групп. Количество животных в каждой группе составляло двадцать особей. Крысам первой и второй групп проводили ложную овариэктомию. В первой группе выполняли остеотомию бедренной кости в вертельной области, тем самым моделировался перелом бедра. Во второй группе производилась остеотомия плечевой кости в дистальном метафизе - модель перелома плеча. Животные в этих группах получали ежедневно внутрижелудочно посредством орогастрального зондового кормления 1% крахмальный кисель в дозе 10 мл/кг. Крысам третьей группы (модель остеопоротических переломом вертельной области бедренной кости) и животным четвертой группы (модель остеопоротических переломов проксимального метафиза плеча) медикаментозная коррекция остеопороза не проводилась. Особи этих групп получали ежедневно внутрижелудочно 1% крахмальный кисель в дозе 10 мл/кг. Подопытным животным пятой группы (модель остеопоротического перелома бедра) и шестой группы (модель перелома плеча на фоне остеопороза) весь период эксперимента проводилась фармакологическая коррекция остеопоротической патологии ежедневным внутрижелудочным введением хондроитин сульфата дозе 68,6 мг/кг в виде суспензии в 1% крахмальном киселе.

Анализ всех экспериментальных данных выполнялся с помощью описательной статистики (пакет анализа Micrоsоft Excel). В групповых значениях определялись средние значения показателей и ошибки среднего значения. Разбор статистически значимых различий при межгрупповых сравнениях производился при помощи гетероскедастического двухвыборочного теста Стьюдента. Различия считаются статистически значимыми при р<0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Согласно дизайну исследования, изучались антиоксидантные и остеопротективные эффекты корректора метаболизма костной и хрящевой ткани – хондроитин сульфата дозе 68,6 мг/кг в виде суспензии в 1% крахмальном клейстере, который вводили с помощью специального зонда внутрижелудочно ежедневно однократно в сутки в течение 12 недель. Спустя три месяца после начала эксперимента у подопытных животных определяли минеральную плотность костной ткани в изучаемых локализациях с помощью метода цифровой рентгеновской денситометрии, также гистоморфометрически измерялась ширина костных трабекул.

При цифровой рентгеновской денситометрии было установлено: средний показатель МПКТ в проксимальных метафизах бедер у крыс с моделью остеопоротических переломов бедер составил 2,332±0,01 г/см³, что на 10 % меньше аналогичного значения у ложнооперированных животных (2.584±0,02 г/см³). В зонах проксимальных метафизарных отделах плечевых костей крыс плотность костной ткани в группе крыс после овариэктомии была равна 2,007±0.02 г/см³, что на 9,9 % меньше, чем у животных контрольной группы (2,208±0,03 г/см³). Полученные значения в обеих группах крыс имеют достоверные различия (p<0,05).

Среднее значения МПКТ у крыс с моделью остеопоротических переломов, которым проводилось терапия хондроитина сульфата дозе 68,6 мг/кг, составила: в вертельной области бедра – 2,415±0.03 г/см3, в проксимальном метафизе плечевой кости – 2,174±0.015 г/см3. Следовательно, под влиянием внутрижелудочного введения исследуемого препарата в указанной ранее дозе плотность костной ткани в метафизарной части бедра увеличивается на 4,5 %, а в проксимальной части плеча на 8 % в сравнении с животными с моделированными остеопоротическими переломами без лечения (различия достоверны, p<0,01). Также стоит отметить, что коррекция указанным лекарственным веществом не позволяет достичь уровня МПК ложнооперированных здоровых особей из контрольной группы, при этом различия с указанными группами являются статистически значимыми (p<0,01).

По данным морфометрии было выявлено, что у животных контрольной группы средняя ширина костных трабекул в костных мозолях вертельных областей бедер составила 81,15±3,6 мкм, в то же время у крыс с моделью остеопороза это значение снижается на 29% (57,74±2,3 мкм). При статистическом анализе выявлено достоверное различие средних значений по этим группам крыс (t-критерий Стьюдента) больше 2,77 (р=0,01). В межотломковой мозоли проксимальных метафизах плечевых костей этот параметр составил у ложнооперированных животных – 71,13±1,9 мкм, а у животных с экспериментальным остеопорозом – 50,49±0,9 мкм, то есть на 29 % меньше, чем у крыс без остеопороза, t-критерий Стьюдента больше 2,771 (р=0,01).

При гистоморфометрическом исследовании костной мозоли в изучаемых локализациях в группе крыс с индуцированным остеопорозом, которым проводилось лечения хондроитин сульфатом в дозе 68,6 мг/кг, было выявлено, что исследуемый препарат препятствовал снижению средней ширины костных трабекул. Указанный показатель был достоверно выше, чем у животных с экспериментальными остеопоротическими переломами без фармакотерапии: в вертельном зоне бедра – 68,02±2,7 мкм, в проксимальной области плеча – 62,26±1,3 мкм. Исходя из этих данных, средняя ширина костных трабекул под влиянием препарата хондроитина сульфата была в бедре на 15 %, в плече на 19 % больше, чем у животных с остеопорозом, которым не проводилась фармакотерапия. При этом полученные значения были ниже, чем у крыс без остеопороза. Показатели средней ширины костных трабекул в проксимальных метафизах бедренной и плечевой костей у крыс, получавших хондроитин сульфат, статистически значимо превышали значения животных с остеопоротическими переломами (р <0,01), но были статистически значимо ниже, чем у животных с переломами без остеопороза (p<0,01).

При спектрофотометрии получены показатели оптической плотности в диапазонах длин волн, согласно им построили график и рассчитали площади методом численного интегрирования при помощи формулы Симпсона (Петров И. Б., Лобанов А. И. Лекции по вычислительной математике. – М.: Интуит, Бином, 2006. – 523 с). В группе ложнооперированных крыс среднее значение общих кетон-динитрофинилгидрозонов (КДНФГо) составило 21,29±5,8 оптических единиц (ОЕ), а нейтральных кетон-динитрофинилгидрозонов (КДНФГн) – 12,13±2,5 ОЕ. У животных с моделью остеопороза аналогичные значения составили 29,15±1,7 ОЕ и 30,58±1,2 ОЕ, соответственно. То есть показатели (КДНФГо) у животных с экспериментальным генерализованным остеопорозом почти на 27 % выше, чем у животных без остеопороза, а (КДНФГн) на 60 %. Эти результаты исследований доказывают доминирование первичных маркеров окислительного стресса при гипоэстроген-индуцированном остеопорозе, что свидетельствует о том, что преобладает процесс агрегации белковых молекул. Различие средних значений по группам достоверно, коэффициент Стьюдента составил 4,10, что больше стандартного значения р=0,01. Также спектрофотометрическое исследование маркеров оксидативного стресса выявило, что в группах крыс с моделью остеопоротических переломов бедра и плеча, которым проводилась терапия хондроитин сульфатом в дозе 68,6мг/кг, средний показатель КДНФГо составил 6,85± 09 ОЕ, а КДНФГн – 8,18±2,6 ОЕ. То есть значения общей кетон-динитрофинилгидрозоны у животных с экспериментальными остеопоротическими переломами почти на 76,5 % выше, чем у животных, получавших лечение исследуемым препаратом, а нейтральной кетон-динитрофинилгидрозоны на 73 %. Данные результаты свидетельствуют о снижении маркеров окислительного стресса при гипоэстроген-индуцированном нарушении при метафизарных переломах длинных трубчатых костей. Отличие средних значений по группам достоверно, коэффициент Стьюдента равен 5,15, что больше стандартного значения р=0,01.

Таким образом, хондроитин сульфат в дозе 68,6мг/кг, у крыс-самок линии Wistar на фоне билатеральной овариэктомии и моделированных переломов проксимальных метафизарных зон бедренных и плечевых костей вводимый ежедневно внутрижелудочно в течение 12 недель, обладает антиоксидантным эффектом, проявляющимся статистически значимым предотвращением повышения маркеров окислительного стресса – кетон-динитрофинилгидрозонов. Благодаря своим антиоксидантным свойствам изучаемый препарат замедляет развитие остеопоротических нарушений в костной ткани при гипоэстрогенных состояниях и тем самым создаёт благоприятные условия для успешной консолидации переломов.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к фармакологии и травматологии. Самкам крыс линии Wistar выполняют билатеральную овариэктомию. На следующий день после операции вводят внутрижелудочно 1 раз в сутки хондроитин сульфат в дозе 68,6 мг/кг в течение 8 недель. На 57 день эксперимента моделируют остеопоротические переломы бедра и плеча и продолжают введение хондроитина сульфата в указанной дозе до 12 недель после начала эксперимента. Способ, благодаря антиоксидантным свойствам препарата, позволяет замедлить развитие остеопоротических нарушений в костной ткани при гипоэстрогенных состояниях, что в свою очередь создает благоприятные условия для успешной консолидации переломов. 1 пр.

Способ фармакологической коррекции оксидативных нарушений при переломах на фоне остеопороза в эксперименте хондроитином сульфатом, включающий выполнение билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Wistar с последующим моделированием остеопоротических переломов и фармакологической коррекцией, отличающийся тем, что крысам на следующий день после овариэктомии вводят внутрижелудочно 1 раз в сутки хондроитина сульфат в дозе 68,6 мг/кг в течение 8 недель, на 57 день эксперимента моделируют остеопоротические переломы бедра и плеча, продолжают введение хондроитина сульфата в указанной дозе до 12 недель после начала эксперимента.