БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/7048 A61P39/06 A61P43/00 

Изобретение относится к пищевым композициям и позволяет создать биологически активную композицию на основе растительных метаболитов, используемую для увеличения здоровой продолжительности жизни. Разработанные биологически активные композиции могут применяться в качестве средств, снижающих накопление пигмента старости (липофусцина) и увеличивающих выживаемость в условиях окислительного стресса Caenorhabditis elegans.

Многие развитые и развивающиеся страны сталкиваются с беспрецедентным и быстрым ростом числа пожилых людей, что имеет далеко идущие последствия для здоровья и экономики [1].

Ожидаемая продолжительность жизни почти удвоилась за последние 150 лет, увеличившись с 45 лет до 80 лет во многих промышленно развитых странах. Старение является общепризнанным фактором риска развития многих хронических заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, онкологические и нейродегенеративные заболевания, сахарный диабет 2 типа [2].

В основе процесса старения лежат различные молекулярные и физиологические процессы: повреждение белков, возникновение мутации в ДНК, уменьшение митохондриальной функции, и прочие процессы, повышающие нагрузку на стареющие клетки организма [3]. Одним из ключевых факторов повреждения клеток являются активные формы кислорода (АФК) [4]. При низких концентрациях АФК оказывают регуляторное действие на клеточные функции, включая пролиферацию, дифференцировку, миграцию и выживание клеток [5]. Однако недостаточная активность антиоксидантной системы приводит к накоплению АФК, что приводит к окислительному стрессу - стойкому состоянию дисбаланса между генерацией АФК и способностью биологической системы детоксифицировать, приводящему к нарушению окислительно-восстановительной сигнализации, контроля и/или молекулярному повреждению. АФК негативно влияют на макромолекулы (белки, липиды, нуклеиновые кислоты). В результате повреждения липидов происходит накопление неразлагаемого продукта их окисления - возрастного пигмента липофусцина, являющегося индикатором старения [4].

Липофусцин представляет собой автофлуоресцентный липопигмент, образованный липидами, металлами и неправильно свернутыми белками, который возникает в нервных клетках, клетках сердечной мышцы и кожи [6]. Результаты недавних исследований свидетельствуют о том, что липофусцин является причиной изменения клеточного метаболизма, гибели клеток и апоптоза путем ингибирования протеасом, ослабления аутофагии и лизосомальной деградации [7]. Накопление липофусцина в процессе старения обусловлено невозможностью его деградации или очищения экзоцитозом и происходит преимущественно в лизосомах и цитозоле, что является причиной специфического характера клеточного старения с одной стороны, и усугубления дефектов путей лизосомальной деградации в процессе старения с другой.

Перспективным подходом в профилактике возрастных заболеваний является систематический прием биологически активных добавок (БАД), а также функциональных продуктов питания, содержащих натуральные компоненты геропротекторного действия [8]. Такими натуральными компонентами могут являться антиоксиданты - биологически активные вещества (БАВ) растительного происхождения, обладающие способностью ингибировать образование АФК, следовательно, и старение клеток [4]. Одним из источников БАВ-геропротекторов (полифенолов, токоферолов, каротиноидов, аскорбиновой и прочих органических кислот, макромолекул) является растительная биомасса [9].

Копеечник забытый (Hedysarum neglectum Ledeb) - растение, относящееся к семейству бобовых (Fabaceae) [10], проявляющее фармакологическую активность за счет содержания полисахаридов, флавоноидов, катехинов, дубильных веществ, алкалоидов. Благодаря чему копеечник забытый является ценным сырьем для извлечения БАВ-геропротекторов [11].

Filipendula [Tourn.] Mill, (таволга) - род около 30 многолетних травянистых растений семейства розоцветных, часть из которых произрастает в России (Западная и Восточная Сибирь, европейская часть России, Южный Урал, Башкирия, Дальний Восток, Верхнее Поднепровье, Волго-Камский, Верхне-Волжский районы) [12]. Одним из наиболее распространенных видов растения является Filipendula ulmaria. Фенольные компоненты являются активными соединениями, проявляющими иммуностимулирующую, противомикробную, противоаллергическую и другие виды активности.

Свободно живущая нематода Caenorhabditis elegans является хорошо изученным модельным объектом для изучения процесса старения, возрастных заболеваний, а также геропротекторного потенциала различных веществ. С.elegans является небольшой по размеру (взрослая особь достигает 1,5 мм в длину) почвенной нематодой [13]. Данный модельный организм не требует больших затрат при лабораторном выращивании; имеет короткий жизненный цикл (продолжительность жизни составляет 2-3 недели); является гермафродитом и способен размножаться путем самооплодотворения [14]. Другими ключевыми особенностями являются анатомическая простота (<1000 клеток) и маленький геном, который состоит из 19000 генов, половина из которых совпадают с геномом человека. Тело животного прозрачно, что является характеристикой, позволяющей оценивать изменения клеток с течением времени in vivo и флуоресцентную визуализацию меченых белков.

Известна композиция (патент CN 115093403 А, опубл. 23.09.2022), состоящая из катехинов I и II, выделенных из листьев азалии Camellia sinensis var. assamica (J.W.Mast.) Kitam. Установлено, что разработанная композиция в концентрации 100 мкМ снижает накопление липофусцина у нематод на 27,1-37,7%.

Недостаток данной композиции заключается в относительно низкой активности разработанной композиции, нестабильной структуре катехинов. К тому же не указана чистота выделенных БАВ.

Известна композиция на основе терпеноида номилина (патент CN 116265018 А, опубл. 20.06.2023), снижающего накопление липофусцина. Установлено, что при концентрации композиции в 100 мкг/мл достигается максимальное снижение накопления пигмента старения (интенсивность флуоресценции липофусцина составляла около 75%), однако данная концентрация не обеспечивала высокую выживаемость нематод в условиях окислительного стресса по окончании исследования.

Недостатком данного способа являлась низкая биологическая активность выделенного БАВ как в отношении снижения липофусцина, так и в увеличении продолжительности жизни в условиях окислительного стресса.

Известен способ получения композиции, содержащей в качестве активного компонента 4-гидроксибензойную кислоту растения Veronica peregrina L., которая снижала интенсивность флуоресценции липофусцина в кишечнике нематод по сравнению с контрольной группой (на 16,7%) [15]. Кроме того, было показано, что нематоды, обработанные данным компонентом, в условиях окислительного стресса, вызванного паракватом 60 мМ, имеют большую продолжительность жизни, чем контрольные нематоды. Максимальное время выживаемости в контрольной группе составило 22 часа, в то время как в группе, обработанной 4-гидроксибензойной кислотой в концентрации 20 мкМ увеличилось до 26 часов, при обработке 40 мкМ - до 31 часа.

Недостатком данного способа является отсутствие числовых данных о проценте выживших нематод, подвергшихся окислительному стрессу.

Известна композиция, обладающая геропротекторными свойствами, на основе лигнана сохинона, выделенного из растения Saururus Chinensis (патент KR 101887631 В1, опубл. 13.08.2018). Сообщается, что данный лигнан снижал накопление биомаркера старения липофусцина на 22,8% (50 мкМ) и 29,8% (100 мкМ). При этом сохинон увеличивал выживаемость нематод при окислительном стрессе на 34,4% при обработке 50 мкМ БАВ.

Недостатком данного изобретения является использование растительного сырья-эндемика Saururus Chinensis (риск сокращения биоразнообразия растений, ограниченное количество растительного сырья), из которого выделялся БАВ; а также относительно невысокая активность сохинона при изучении накопления липофусцина.

Данное техническое решение выбрано в качестве ближайшего аналога.

Таким образом, несмотря на имеющиеся изобретения, в данной области техники существует потребность в дополнительных пищевых композициях, направленных на снижение накопления липофусцина и увеличение выживаемости в условиях окислительного стресса.

Техническая задача данного изобретения заключается в расширении ассортимента биологически активных композиции на основе растительных метаболитов с геропротекторной активностью.

Технический результат достигается путем создания геропротекторной биологически активной композиции на основе растительных метаболитов - рутина из Filipendula ulmaria и мангиферина из Hedysarum neglectum, характеризующейся способностью снижать накопление липофусцина и увеличивать процент выживания нематод в условиях окислительного стресса.

Поставленная задача решается за счет разработки биологически активной композиции в виде сухой смеси на основе рутина, выделенного из таволги вязолистной Filipendula ulmaria, и мангиферина, выделенного из копеечника забытого Hedysarum neglectum. Разработанная композиция проявляет геропротекторный потенциал: способность снижать накопление пигмента старения - липофусцина и увеличивать процент выживания нематод в условиях окислительного стресса.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Биологически активная композиция на основе растительных метаболитов при следующем соотношении компонентов, мас.%:

рутин 50 мангиферин 50

Рутин и мангиферин были получены путем экстракции из растительного сырья таволги вязолистной Filipendula ulmaria копеечника забытого Hedysarum neglectum соответственно с последующей хроматографической очисткой при степени очистки не менее 95%. Выделение целевых метаболитов проводили согласно схеме, описанной в работе авторов изобретения [16]. Для исследования готовили стоковые растворы рутина, мангиферина, композиции по примеру и композиции по ближайшему аналогу (патент KR 101887631 В1) в диметилсульфоксиде (ДМСО) концентрацией 10 мМ. Затем получали растворы концентрацией 2000 мкМ, 1000 мкМ, 500 мкМ и 100 мкМ (в дистиллированной воде). Данные растворы в количестве 15 мм³ добавляли в лунки планшета, тем самым получая тестируемые растворы БАВ концентрацией 200 мкМ, 100 мкМ, 50 мкМ и 10 мкМ соответсвенно.

Исследования проводились на модели Caenorhabditis elegans дикого типа, штамм N2 Bristol. Популяция взрослых особей С.elegans во всех экспериментах была синхронизирована. Количество С.elegans, используемых в экспериментах - 100 особой для каждой тестируемой концентрации объекта исследования [17].

Эксперименты ставили в 96-луночных планшетах (Эппендорф, США) в жидкой S-среде для культивирования нематод в объеме 150 мкл, при температуре +20°С в климатической камере Binder (Германия). В качестве питательного субстрата для нематод использовали бактерии Escherichia coli ОР-50, которые вносили один раз в начале эксперимента до конечной концентрации 5 мг/мл.

Постановку эксперимента проводили в стерильных условиях в ламинаре FastFlow (Италия).

Измерение липофусцина в организме нематод осуществлялось с помощью спектрофлуореметрического метода на спектрофотометре BMG Clariostar при длине волн возбуждения и излучения 340/420 нм [18]. Контрольные нематоды инкубировались без добавления исследуемых БАВ.

Для оценки влияния объектов исследования на стрессоустойчивость С.elegans к окислительному стрессу в каждую лунку планшета добавляли 15 мм³ 1 М параквата - вещества, моделирующего окислительный стресс, и продолжали культивирование при 20 ±0,5°С в течение 48 ч с шагом в 6 ч. После истечения вышеуказанного времени делали подсчеты живых и мертвых нематод. Контрольные нематоды инкубировались без добавления исследуемых БАВ. Оценка осуществлялась с помощью микроскопа Axio Observer Z1 (Karl Zeiss, Германия).

Пример 2. Аналогичен примеру 1, но биологически активная композиция имеет следующий состав, мас.%:

рутин 30 мангиферин 70

Пример 3. Аналогичен примеру 1, но биологически активная композиция имеет следующий состав, мас.%:

рутин 70 мангиферин 30

В ходе исследования получены следующие результаты.

Установлено, что мангиферин и рутин в концентрации 100 мкМ проявляют наибольшую активность в снижении накопления липофусцина по сравнению с контролем - активность выше в 1,9 и 2,0 раз соответственно.

Биологически активная композиция №1, в сравнении с контролем, снижала накопление липофусцина в 2,5 раза.

Биологически активная композиция №2, в сравнении с контролем, снижала накопление липофусцина в 2,3 раза.

Биологически активная композиция №3, в сравнении с контролем, снижала накопление липофусцина в 2,2 раза.

По методике ближайшего аналога (патент KR 101887631 В1) композиция снижала накопление липофусцина в 1,4 раза в сравнении с контролем.

Вышеперечисленные результаты представлены таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что биологически активная композиция №1 по примеру 1 обладает максимальной эффективностью в снижении накопления пигмента липофусцина в организме С.elegans по сравнению с контролем. Результаты проведенных исследований позволяют выявить снижение флуоресценции биомаркера старения липофусцина на 60,1%.

Обнаружено, что рутин и мангиферин в концентрации 100 мкМ увеличивает процент выживших нематод в условиях окислительного стресса в сравнении с контролем приблизительно в 3,9 и 5,2 раз соответственно.

Установлено, что биологически активная композиция №1 увеличивает процент выживших нематод в 6,8 раз в сравнении с контролем.

Биологически активная композиция №2 увеличивает процент выживших нематод в 6,4 раза в сравнении с контролем.

Биологически активная композиция №3 увеличивает процент выживших нематод в 6,3 раза в сравнении с контролем.

По методике ближайшего аналога (патент KR 101887631 В1) процент выживших нематод увеличился на 27,9% в сравнении с контролем.

При исследовании выживаемости нематод в условиях окислительного стресса установлено, что процент выживших контрольных нематод через 48 ч составил 10,3%.

Вышеперечисленные результаты представлены таблице 2.

Как видно из таблицы 2, наибольшую эффективность в увеличении выживаемости нематод в условиях окислительного стресса через 48 ч наблюдений также обеспечила композиция №1 по примеру 1.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет получить биологически активные композиции, проявляющие геропротекторные свойства, на основе рутина, выделенного из таволги вязолистной (Filipendula ulmaria) и мангиферина, выделенного из копеечника забытого (Hedysarum neglectum). Геропротекторная активность разработанных композиций заключается в способности снижать уровень накопления липофусцина и увеличивать процент выживших нематод в условиях окислительного стресса.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Trends in age-related disease burden and healthcare utilization / V. Atella, J. Kopinska, F. Belotti, etc. // Wiley Online Library. - 2019. - Vol. 18 (1). - P. e12861. https://doi.org/10.111l/acel.12861

2. Optimal body weight for health and longevity: Bridging basic, clinical, and population research / L. Fontana, F.B. Hu // Aging Cell. - 2014. - Vol. 13 (3). - P. 391-400. https://doi.org/10.111l/acel.12207

3. Mitochondrial and Nuclear DNA Oxidative Damage in Physiological and Pathological Aging / M. Kowalska, T. Piekut, M. Prendecki, etc. // DNA and Cell Biology. - 2020. - Vol. 39 (№8) - P. 1410-1420. https://doi.org/10.1089/dna.2019.5347

4. Free radical properties, source and targets, antioxidant consumption and health / G. Martemucci, C. Costagliola, M. Mariano, etc. // Oxygen. - 2022. - Vol. 2 (2). - P. 48-78. https://doi.org/10.3390/oxygen2020006

5. Oxidative Stress and Advanced Lipoxidation and Glycation End Products (ALEs and AGEs) in Aging and Age-Related Diseases / N.T. Moldogazieva, I.M. Mokhosoev, Т.I. Mel'nikova, etc. // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019. - Vol. 2019. - 14 p. https://doi.org/10.1155/2019/3085756

6. Flavonoids-Natural Gifts to Promote Health and Longevity / X. Fan, Z. Fan, Z. Yang, etc. // International Journal of Molecular Sciences. - 2022. - V. 23 (4). - P. 2176. https://doi.org/10.3390/ijms23042176

7. An Overview of the Role of Lipofuscin in Age-Related Neurodegeneration / A. Moreno-García, A. Kun, O. Calero, etc. // Front. Neurosci. - 2018. - Vol. 12. - P. 464. https://doi.org/10.3389/fnins.2018.00464

8. Jalilovna K.D., Usmonovna U.M. The Effect of Biologically Active Additives on the Human Body / K.D. Jalilovna, U.M. Usmonovna // Scholastic: Journal of Natural and Medical Education. - 2023. - V. 2 (6). - P 228-232.

9. Estimated dietary intake and major food sources of polyphenols in elderly of Viçosa, Brazil: a population-based study / M.A. Nascimento-Souza, P.G. de Paiva, J. Pérez-Jiménez, S. etc. // European journal of nutrition. - 2018. - Vol. 57(2). - P. 617-627. https://doi.org/10.1007/s00394-016-1348-0

10. Molecular Cytogenetics of Eurasian Species of the Genus Hedysarum L. (Fabaceae) / O.Y. Yurkevich, Т.E. Samatadze, I.Y. Selyutina, etc. // Plants. - 2021. - Vol. 10. - P. 89. https://doi.org/10.3390/plants10010089

11. Bajtenov, M.S. Flora of Kazakhstan. Generic Complex of Flora / M.S. Bajtenov // Gylym: Almaty, Kazakhstan. - 2001. - Vol. 2.

12. Study of the Antioxidant Properties of Filipendula ulmaria and Alnus glutinosa / S. Sukhikh, S. Ivanova, L. Skrypnik, etc. // Plants. - 2022. - Vol. 11. - P. 2415. https://doi.org/10.3390/plants11182415

13. Liao V. H. C. Use of Caenorhabditis elegans to study the potential bioactivity of natural compounds / V.H.C. Liao // Journal of agricultural and food chemistry. - 2018. - V. 66 (8). - P. 1737-1742. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.7b05700

14. Caenorhabditis elegans as a model for obesity research / Yue Y. Li S. Shen P., Y. Park // Current Research in Food Science. - 2021. - V. 4. - P. 692-697. https://doi.org/10.1016/j.crfs.2021.09.008

15. 4-Hydroxybenzoic acid-mediated lifespan extension in Caenorhabditis elegans / D.K. Kim, H. Jeon, D.S. Cha // Journal of Functional Foods. - 2014. - Vol. 7. - P. 630-640. https://doi.org/10.1016/j.jff.2013.12.022

16. Effects of bioactive substances isolated from Siberian medicinal plants on the lifespan of Caenorhabditis elegans / E.R. Faskhutdinova, A.S. Sukhikh, V.M. Le // Foods and Raw Materials. - 2022. - Vol. 10 (2). - P. 340-352. https://doi.org/10.21603/2308-4057-2022-2-544

17. Curcumin-mediated lifespan extension in Caenorhabditis elegans / V.H.C. Liao, C.W. Yu, Y.J. Chu, etc. // Mechanisms of ageing and development. - 2011. - Vol. 132 (10). - P. 480-487. https://doi.org/10.1016/j.mad.2011.07.008

18. Rathor, L., Pandey, R. Age-induced diminution of free radicals by Boeravinone В in Caenorhabditis elegans // Experimental Gerontology. - 2018. - Vol. 111. - P. 94-106. https://doi.org/10.1016/j.exger.2018.07.005

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к применению биологически активной композиции на основе растительных метаболитов, состоящей из рутина и мангиферина, при следующем соотношении компонентов, мас.%: рутин - 50; мангиферин - 50, в качестве геропротекторного средства. Биологически активная композиция снижает накопление липофусцина и увеличивает процент выживания нематод в условиях окислительного стресса. 2 табл., 1 пр.

Применение биологически активной композиции на основе растительных метаболитов, состоящей из рутина и мангиферина, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

рутин 50 мангиферин 50,

в качестве геропротекторного средства.