Способ выделения и очистки рутина из каллусных культур таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.) Российский патент 2025 года по МПК A61K31/352 A61K36/73 B01D11/02 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности для получения рутина высокой степени очистки из клеточных культур растений, также может быть использовано для очистки флавоноидов, выделенных из каллусных культур таволги вязолистной.

Рутин является основным представителем подкласса флавонолов флавоноидов, проявляющий широкий спектр биологических активностей. Интерес к рутину связан с широтой его биологических эффектов. Рутин также называют рутозидом, кверцетин-3-рутинозидом, софорином и витамином Р. Химически это гликозид, состоящий из флавонольного агликона кверцетина наряду с дисахаридом рутинозой (рамнозой и глюкозой), химическое название (ИЮПАК) 2-(3,4-дигидроксифенил)-5,7-дигидрокси-3-[α-L-рамнопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозилокси]-4Н-хромен-4-он. Рутин обнаружен во многих растениях (таких как семена гречихи), фруктах (таких как цитрусовые) и овощах [1, 2]. На основании множества фармакологических свойств, которыми обладает рутин, который включает антибактериальную, противоопухолевую, противодиарейную, противодиабетическую, противоязвенную, антимутагенную, антитромбоцитарную, антитромбическую, цитопротекторную, вазопротекторную, гепатопротекторную и кардиопротекторную активности, он рассматривается как значимое лечебно-профилактическое вещество и нутрицевтическая добавка [3, 4, 5]. Более того, сообщалось о клеточных защитных эффектах рутина после ишемического повреждения органов, включая сердце, головной мозг и почки [6, 7]. Сообщалось, что противовоспалительные эффекты рутина проявляются через подавление провоспалительных цитокинов и ингибирование TNF-α и NF-кВ, снижая окислительный стресс на различных экспериментальных моделях колита [8]. Рутин действует как эффективный ингибитор свободных радикалов [9].

Фармакологические исследования рутина показали, что терапевтический эффект при лечении рутином значительно снижал апоптотическую гибель клеток, вызванную окислительным стрессом (H₂O₂) в клетках Н9 с2 in vitro [10].

На основе рутина производят целый ряд комбинированных витаминных препаратов, в том числе аскорутин, профилактин (рутин+аскорбиновая кислота), гептавит, ундевит, компливит и др. Из рутина получают также различные производные, например, венорутон, троксевазин, представляющие собой смесь три- и тетрагидроксиэтилрутина. Известно большое количество растений, из которых выделяют рутин.

В настоящее время биологически активные вторичные метаболиты в основном извлекают издикорастущих и культивируемых растений. Однако данная сырьевая основа имеет различные проблемы, такие, как медленные темпы роста растения, низкое и нестабильное содержания в нем веществ. Современные методы биотехнологии позволяют создавать экологически чистое сырье в течение короткого периода времени, которое включает в свой состав повышенное содержание БАВ. К преимуществам их использования можно также отнести контроль условий выращивания, независимость от экологических и сезонных изменений [11].

Перспективным источником для производства рутина является таволга вязолистная (лабазник вязолистный) Filipendula ulmaria (L.) Maxim.; семейство Розоцветные - Rosaceae, которая является многолетним травянистым растением.

Из существующего уровня техники известен способ получения суммы флавоноидов из травы лабазника вязолистного (патент RU № 2811264, опубл. 11.01.2024). Способ предусматривает однократную экстракцию воздушно- сухого сырья органическим растворителем с последующей пробоподготовкой и определением оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии, причем экстракцию сырья осуществляют этиловым спиртом в концентрации 40% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1 г сырья к 50 мл спирта, время экстракции на кипящей водяной бане составляет 90 минут, степень измельчения сырья - 1 мм; количественное определение суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного проводят при длине волны 412±2 нм в пересчете на рутин.

К недостатку данного способа следует отнести низкий уровень очистки экстракта и недостаточный выход флавоноидов. В экстракте присутствуют неразделенные флавоноиды.

Известен способ получения рутина из вегетативной массы гречихи посевной (RU 2505307, опубл. 27.01.2014), который включает следующие стадии: высушенную, измельченную гречиху посевную экстрагируют 70%-ным этиловым спиртом, сгущают, фильтруют, сушат, очищают от примесей органическими растворителями, растворяют, проводят горячее фильтрование, кристаллизуют, при этом дополнительно перед экстракцией измельченную вегетативную массу гречихи обезжиривают, экстрагируют 70%-ным этиловым спиртом на кипящей водяной бане, фильтруют и повторно экстрагируют 70%-ным этиловым спиртом, снова фильтруют, полученные спиртовые экстракты концентрируют на водяной бане под вакуумом и высушивают, очищают от примесей органическими растворителями дважды, а в качестве органических растворителей используют диэтиловый эфир и этилацетат, при этом после кристаллизации проводят перекристаллизацию горячим 70%-ным этиловым спиртом с горячим фильтрованием через бумажный фильтр, с последующим охлаждением до выпадения кристаллов рутина, фильтрацией под вакуумом и сушкой на воздухе.

Недостатками данного метода является длительность и трудоемкость процесса, а также невысокая чистота полученного рутина. Также в методе недостаточно описываются параметры процесса очистки и использование для очистки рутина только перекристаллизацию и фильтрование с помощью бумажного фильтра.

Наиболее близким к заявленному является способ извлечения рутина из наземных частей амаранта (патент RU № 2041232, опубл. 09.08.1995), который включает следующие стадии: экстракция сухих наземных частей амаранта 70-95-ным низшим спиртом при нагревании с последующей обработкой экстракта этилацетатом и перекристаллизацией остатка из воды. В этом случае достигается степень извлечения до 85%.

Техническая проблема, решаемая использованием настоящего технического решения, состоит в разработке нового способа выделения и очистки рутина из каллусных культур таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.).

Техническим результатом, полученным при реализации заявленного способа, является выделение и очистка рутина из каллусных культур таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.).

Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ выделения и очистки рутина из каллусных культур таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.), включающий следующие этапы.

1. Измельчение клеточной культуры таволги вязолистной.

2. Экстрагирование измельченного сырья с 70% этилового спирта на водяной бане при 30°С с обратным холодильником в течение 6 ч дважды. Экстракты фильтруют и объединяют.

3. Упаривание полученного этанольного экстракта под вакуумом при температуре 40°С досуха с применением роторного испарителя.

4. Обработка сухого остатка смесью хлороформ: этилацетат в объемном соотношении 3:7 трехкратно по 5 минут. Объединение экстрактов, добавление к ним безводного натрия сульфат в количестве 2,0 г на каждые 100 мл экстракта. Отстойка в течение 3-х часов при +4°С.

5. Смесь фильтруют через бумажный фильтр, промывают водой на фильтре и растворяют в 50% этиловом спирте.

6. Адсорбируют на угле активированном и осуществляют вакуум-упаривание до сухого остатка с применением роторного испарителя.

7. Последовательно по 100 мл производят элюцию изопропанолом, водой, 15%-ным раствором фенола в изопропаноле, 7%-ным водным раствором фенола.

8. Фракцию, экстрагированную 7%-ным водным фенолом, обрабатывают трехкратно по 100 мл петролейным эфиром.

9. Полученную очищенную фракцию флавоноидов упаривают с сорбентом под вакуумом с применением роторного испарителя.

10. Элюция смесью хлороформ:этанол градиентом от 90:10 до 20:80.

11. Целевую фракцию, содержащую рутин, упаривают в вакууме с применением роторного испарителя.

Данный способ позволяет достигать 90-92% степени выделения рутина с достижением степени чистоты рутина не менее 95%.

Определяющими существенными отличительными признаками заявляемого способа, по сравнению с ближайшим аналогом, являются:

- элюирование осуществляют раствором хлороформ-этанол в градиентных соотношениях, что позволяет получить максимальный эффект отделения рутина от сопутствующих примесей и родственных флавоноидов;

- применение водного раствора фенола и раствора фенола в изопропаноле, что обеспечивает извлечение балластных веществ белково-липидной природы;

- расширение сырьевой базы источников рутина, так как в качестве сырья используются каллусные культуры таволги вязолистной, выращенные в экологически чистых условиях;

- элюат на всех стадиях упаривают до полного удаления растворителя с применением роторного испарителя, что позволяет исключить возможность наличия остаточного растворителя, которое регламентируется ОФС.1.1.0008.15 Остаточные органические растворители.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Клеточную культуру таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.) измельчают в мельнице и порошок просеивают через сито с размером отверстия 1 мм. Навеску 3,0 г клеточной культуры таволги вязолистной, взвешенную с точностью до 0,001 г, помещают в круглодонную колбу объемом 250 мл, добавляют 120 мл 70% этилового спирта, экстрагируют на водяной бане при 30°С с обратным холодильником в течение 6 часов. Экстракцию проводят дважды, вытяжки фильтруют и объединяют. Упаривают этанольный экстракт под вакуумом при температуре 40°С. К упаренному остатку до 1/4 начального объема концентрата добавляется вода деионизированная, предварительно барботированная инертным газом, и продолжается вакуум-упаривание до густого остатка с применением роторного испарителя IKA RV 8.

Трехкратно обрабатывают остаток смесью хлороформ: этилацетат в объемном соотношении 3:7 по 5 минут при интенсивном перемешивании. Вытяжки объединяются, добавляется безводный натрия сульфат в количестве 2,0 г на каждые 100 мл вытяжки. Отстоявшаяся в течение 3-х часов при +4°С смесь фильтруется через бумажный фильтр. Осадок со всех стадий используется для выделения флавоноидной фракции. Для этого осадок растворяют в 50%)-ном этаноле и добавляют уголь активированный 50,0 г, и осуществляют вакуум-упаривание до сухого остатка с применением роторного испарителя IKA RV 8.

Адсорбент с остатком экстракта переносят на шот фильтр и последовательно по 100 мл производят элюцию изопропанолом, водой, 15-ным раствором фенола в изопропаноле и 7%-ным водным фенолом.

Фракцию, экстрагированную 7%-ным водным раствором фенола, обрабатывают трехкратно по 100 мл петролейным эфиром. Получают очищенную фракцию флавоноидов. Полученную фракцию флавоноидов упаривают под вакуумом с применением роторного испарителя до густого остатка, который смешивают с 40 г силикагель Силохром С120, затем окончательно высушивают и переносят в хроматографическую колонку (5x6 см BioRad) в виде взвеси в хлороформе. Вещества элюируют смесью хлороформ: этанол в градиентном соотношении от 90:10 до 20:80. Целевую фракцию, содержащую рутин, упаривают в вакууме с применением роторного испарителя. Чистота выделенного рутина составляет не менее 95%.

Для контроля степени чистоты, регистрировали ИК-спектр рутина, полученного по примеру 1 на приборе ФСМ-2202 (ОКБ СПЕКТР, Россия) (фиг.1).

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает технический результат - выделение и очистка рутина из каллусных культур таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.), характеризующегося высокой чистотой.

Список литературы:

1. Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety / J. A. Ross, С.M. Kasum //Annual review of nutrition. - 2002. - V. 22. p 19 -34.

2. Механизмыфармакологическогодействиярутина (обзор) / И.В. Ковальский, И.И. Краснюк, И.И. Краснюк (мл.), О.И. Никулина, А.В. Беляцкая, Ю.Я. Харитонов, Н.Б. Фельдман, С.В. Луценко // Химико-фармацевтическийжурнал. - 2014. - том 48. - №2

3. Protective effect of rutin on paracetamol- and CCl₄-induced hepatotoxicity in rodents / К. H Janbaz, S. A. Saeed, A. H. Gilani // Fitoterapia. - 2002. - V. 73/ - p.557-563.

4. Evidence for protective and antioxidantproperties of rutin, a natural flavone, against ethanol inducedgastric lesions / La Casa, С, I. Villegas, С.Alarco' n de la Lastra, V. Motilva, M.J. Marti'n Calero// J. Ethnopharmacol. - 2000. V. 71. - p.45-53.

5. Protective effect of rutin on humoral and cell mediated immunity in rat model / A. Ganeshpurkar, A. K. Saluja // Chem Biol Interact. - 2017. -V. 273. -p.154-159. doi: 10.1016/j.cbi.2017.06.006.

6. Rutin protects the neural damage induced bytransient focal ischemia in rats / M. M. Khan, A. Ahmad, T. Ishrat, G. Khuwaja, P. Srivastawa,M. B. Khan, S. S. Raza, H. Javed, K. Vaibhav, A. Khan, F. Islam // Brain Res. -2009. V. 1292. P. 123-135.

7. Protective effect of rutin on the ischemia/reperfusion induced damage in rat kidney / A. Korkmaz, D. Kolankaya // Journal of Surgical Research. -V. 164, p.309-315. doi:10.1016/j.jss.2009.03.022

8. Rutin has intestinal antiinflammatory effects in the CD4+CD62L+T cell transfer model of colitis / C. Mascaraque, C. Aranda, В. Ocón, M. J. Monte, M. D. Suárez, A. Zarzuelo, J. J. García Marín, O. Martínez-Augustin, F. S. de Medina // Pharmacological Research. - 2014. - Vol.90.-p.48-57

9. Therapeutic and preventive properties of quercetin in experimental arthritis correlate with decreased macrophage inflammatory mediators / M. Mamani-Matsuda, T. Kauss, A. Al-Kharrat, et al.// Biochem. Pharmacol. - 2006. - V. 72. - p.1304 - 1310.

10. Rutin from Lonicera japonica inhibits myocardial ischemia/reperfusion-induced apoptosis in vivo and protects H9c2 cells against hydrogen peroxide-mediated injury via ERK1/2 and PI3K/Akt signals in vitro /J.J.Jeong, Y. M. Ha, Y.Ch.Jin, E. J. Lee, J.S.Kim, H.J.Kim, H.G.Seo, J. H. Lee, S. S. Kang, Y. Sh. Kim, K. Ch. Chang / Food and Chemical Toxicology // 2009. - V. 47 - Issue 7. - p.1569-1576.

11.Establishment of adventitious root cultures from leaf explants of Tripterygium wilfordii (thunder god vine) for the production of celastrol / В. Zhang, L. Chen, Y. Huo, et al. // Industrial Crops and Products. -2020. -V. 155. - P. 112834.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности для получения рутина высокой степени очистки из клеточных культур растений. Способ выделения и очистки рутина из каллусной культуры таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.), включающий экстрагирование измельченного растительного сырья 70%-ным этиловым спиртом, обработку органическими растворителями, фильтрацию, сушку, при этом в качестве растительного сырья используют каллусную культуру таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.)Maxim.), экстрагирование измельченного сырья проводят дважды 70 % этиловым спиртом на водяной бане при 30°С с обратным холодильником в течение 6 ч, экстракты фильтруют и объединяют, упаривают под вакуумом при температуре 40°С досуха с применением роторного испарителя, сухой остаток трехкратно по 5 мин обрабатывают смесью хлороформ:этилацетат в объемном соотношении 3:7, экстракты объединяют, добавляют к ним безводный натрия сульфат в количестве 2,0 г на каждые 100 мл экстракта, смесь отстаивают в течение 3-х ч при +4°С, фильтруют, осадок на фильтре промывают водой и растворяют в 50% этиловом спирте, адсорбируют на угле активированном и осуществляют вакуум-упаривание до сухого остатка с применением роторного испарителя, последовательно по 100 мл производят элюцию изопропанолом, водой, 15%-ным раствором фенола в изопропаноле, 7%-ным водным раствором фенола, экстракт обрабатывают трехкратно по 100 мл петролейным эфиром, упаривают остаток под вакуумом с применением роторного испарителя, проводят элюцию смесью хлороформ:этанол градиентом от 90:10 до 20:80, упаривают в вакууме с применением роторного испарителя. Вышеописанный способ позволяет выделить и очистить рутин из каллусных культур таволги вязолистной, со степенью выделения рутина 90-92 %, с достижением степени чистоты рутина не менее 95%. 1 ил., 1 пр.

Способ выделения и очистки рутина из каллусной культуры таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.), включающий экстрагирование измельченного растительного сырья 70%-ным этиловым спиртом, обработку органическими растворителями, фильтрацию, сушку, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют каллусную культуру таволги вязолистной (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.), экстрагирование измельченного сырья проводят дважды 70 % этиловым спиртом на водяной бане при 30°С с обратным холодильником в течение 6 ч, экстракты фильтруют и объединяют, упаривают под вакуумом при температуре 40°С досуха с применением роторного испарителя, сухой остаток трехкратно по 5 мин обрабатывают смесью хлороформ:этилацетат в объемном соотношении 3:7, экстракты объединяют, добавляют к ним безводный натрия сульфат в количестве 2,0 г на каждые 100 мл экстракта, смесь отстаивают в течение 3-х ч при +4°С, фильтруют, осадок на фильтре промывают водой и растворяют в 50% этиловом спирте, адсорбируют на угле активированном и осуществляют вакуум-упаривание до сухого остатка с применением роторного испарителя, последовательно по 100 мл производят элюцию изопропанолом, водой, 15%-ным раствором фенола в изопропаноле, 7%-ным водным раствором фенола, экстракт обрабатывают трехкратно по 100 мл петролейным эфиром, упаривают остаток под вакуумом с применением роторного испарителя, проводят элюцию смесью хлороформ:этанол градиентом от 90:10 до 20:80, упаривают в вакууме с применением роторного испарителя.