ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОСТАГЛАНДИНА Е1 (АЛПРОСТАДИЛА) ДЛЯ АКТИВАЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ Российский патент 2025 года по МПК C12N5/786 A61K31/5575 

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения макрофагов, способных уничтожать опухолевые клетки.

С развитием иммунологии широкое распространение получили исследования, направленные на иммунотерапию опухолей, особенно адоптивную иммунотерапию. Адоптивная иммунотерапия - это метод лечения опухолей путем адоптивного переливания лимфоцитов, культивированных in vitro под стимуляцией, обратно опухолевым пациентам. Т-клетки, несущие химерный антигенный рецептор (chimeric antigen receptor, CAR), - это новый метод адоптивной иммунотерапии опухолей, который быстро развивается в последние годы. Наличие CAR позволяет Т-клеткам иметь повышенную способность к распознанию опухолевых клеток, более сильную цитотоксическую активность и длительную жизнеспособность, что улучшает терапевтический эффект. Однако в использовании CAR-T-клеток есть несколько больших проблем: (1) низкая эффективность редактирования генов и недостаточная амплификация CAR-T-клеток, что приводит к чрезвычайно высокой стоимости лечения, и (2) опухоль, особенно солидная, имеет внутри сложное микроокружение, включающее не только сами опухолевые клетки и Т-клетки, но и макрофаги, фибробласты и т.д.; сложное микроокружение солидной опухоли ограничивает контакт CAR-T-клеток с опухолевыми клетками, и даже если CAR-T-клетки проникают в солидную опухоль, многие типы клеток будут ингибировать эффект CAR-T-клеток по уничтожению опухолевых клеток, что еще больше способствует возникновению и развитию опухоли и ослабляет противоопухолевый эффект CAR-T-клеток. Поэтому крайне необходимо создать клеточный продукт, который позволял бы получать большое количество клеток, способных эффективно воздействовать на опухолевые клетки при низкой стоимости.

Макрофаги являются ключевыми клетками врожденного и адаптивного иммунитета и известны своей замечательной фенотипической пластичностью и функциональным разнообразием (Murray P.J., Allen J.E., Biswas S.K., Fisher E.A., Gilroy D.W., Goerdt S. et al. Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines [Internet]. Vol. 41, Immunity. 2014. p. 14-20. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25035950). Под пластичностью макрофагов обычно понимают непрерывный спектр фенотипов, на одном из концов которого находятся так называемые классически активированные макрофаги (фенотип M1), обладающие провоспалительной и противоопухолевой активности, а на другом - альтернативно активированные (фенотип М2), демонстрирующие противовоспалительную и проопухолевую активности. Макрофаги также являются самыми многочисленными иммунными клетками, присутствующими в опухоли (tumor-associated macrophages, ТАМ), и могут составлять до 50% клеточной массы солидных опухолей, поэтому противоопухолевая терапия, основанная на использовании макрофагов, в настоящий момент считается одной из самых перспективных (Zhu S., Luo Z., Li X., Han X., Shi S., Zhang T. Tumor-associated macrophages: role in tumorigenesis and immunotherapy implications. J Cancer [Internet]. 2021; 12 (l): 54-64. Available from: https://www.jcancer.org/vl2p0054.htm). В частности, реполяризация ТАМ в сторону противоопухолевого M1-подобного состояния может оказаться эффективным подходом к иммунотерапии рака либо отдельно, либо в сочетании с терапевтическими антителами. В более широком контексте, поскольку нарушение регуляции активации макрофагов стало ключевым фактором, определяющим развитие и прогресс многих заболеваний (Schultze, J.L. Reprogramming of macrophages-new opportunities for therapeutic targeting. Curr. Opin. Pharm. 26, 10-15 (2016)), модуляция активации макрофагов может быть плодотворным подходом к терапии различных заболеваний. Таким образом, поиск молекул, способных к репрограммированию макрофагов на тот или иной терапевтический фенотип представляет собой чрезвычайно актуальную задачу.

Перепрофилирование лекарств - это стратегия выявления новых областей применения уже одобренных лекарственных препаратов или препаратов в процессе исследования. Эта стратегия имеет существенные преимущества по сравнению с разработкой полностью нового препарата для терапии того или иного заболевания. Первое и, пожалуй, самое главное преимущество состоит в значительно более низком риске неудачи, так как перепрофилированное лекарство уже показало достаточную безопасность в ходе доклинических и клинических испытаний и, таким образом, вероятность отсева по причине токсичности в последующих испытаниях эффективности значительно снижается.

В последние годы, на волне интереса к перепрофилированию лекарств, были предприняты усилия по поиску молекул, представляющих собой действующие вещества лекарственных препаратов, уже присутствующих на рынке, и обладающих активностью в отношении активации/фенотипа макрофагов в различных условиях. Простагландин Е1 - препарат, применяемый для лечения эректильной дисфункции и разрешенный к применению на территории РФ под названием Алпростадил. Из уровня техники известно, что простагландин Е1 вызывает морфологические изменения макрофагов, а именно, изменение формы клетки из продолговатой в округлую (Oropeza-Rendon R.L., Speth V., Hiller G., Weber К., Fischer H. Prostaglandin E1 reversibly induces morphological changes in macrophages and inhibits phagocytosis. Exp Cell Res. 1979 Mar 15; 119 (2): 365-71. doi: 10.1016/0014-4827(79)90365-3. PMID: 570928). Изменение формы клеток является достоверным фенотипическим признаком активации макрофагов. Хорошо известно, что как мышиные, так и человеческие макрофаги демонстрируют совершенно разные формы клеток после активации в разные фенотипы in vitro: удлиненную форму для М2-подобных макрофагов и круглую форму для M1-подобных макрофагов (McWhorter, F.Y., Wang, Т., Nguyen, P., Chung, Т. & Liu, W.F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 17253-17258 (2013)). Таким образом, есть основания полагать, что Алпростадил способен репрограммировать макрофаги на противоопухолевый M1-подобный фенотип.

Главным содержанием настоящего патента является преодоление недостатков предшествующего уровня техники и разработка способа активации противоопухолевой активности макрофагов путем in vitro культивирования макрофагов в присутствии простагландин Е1 (Алпростадила). Наиболее близким к заявляемому является способ использования Алпростадила для терапии миелоидной лейкемии, описанный в 2015 году (WO/2015/187847, Use of Prostaglandin E1 and Misoprostol for Treating Chronic Myelogenous / Myeloid Leukemia (inventor: Xue, H-H; applicant: Cure-It, LLC; published: December 10, 2015). В этой заявке на патент мышиная модель хронической миелоидной лейкемии использовалась для демонстрации эффективности синтетического аналога простагландина Е1 мизопростола (2.5 мг/кг/сут). Выживаемость мышей была достоверно выше, чем в случае применения стандартного препарата иматиниб. Алпростадил (синтетический немодифицированный PGE1) имел сопоставимый эффект. Главным отличием нашей разработки является использование Алпростадила для репрограммирования макрофагов в противоопухолевый M1-подобный фенотип.

Изобретение поясняется подробным описанием и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - Стратегия гейтирования.

Фиг. 2 - Макрофаги, дифференцированные из клеток костного мозга мыши. Имеют характерную форму "косыночек".

Фиг. 3 - Фенотип М0-Ал имеет отчетливо выраженную округлую форму, которая является признаком M1-подобного противоопухолевого фенотипа.

Фиг. 4 - Определение цитотоксического эффекта макрофагов на опухолевые клетки. 1 - макрофаги живые (F4/80+7AAD-), 2 - макрофаги мертвые (F4/80+7AAD+), 3 - СТ26 живые (F4/80-7AAD-), 4 - СТ26 мертвые (F4/80-7AAD+).

Фиг. 5 - Определение цитотоксического эффекта макрофагов на опухолевые клетки для макрофагов фенотипа М0 (слева) и М0-Ал (справа).

1. Задача изобретения

Задачей изобретения является повышение эффективности биотехнологических вакцин на основе макрофагов путем репрограммирования макрофагов в противоопухолевый M1-подобный фенотип при помощи Алпростадила.

2. Технический результат изобретения

Технический результат изобретения заключается в опосредуемом Алпростадилом увеличении цитотоксичности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам. Цитотоксичность макрофагов определялась как соотношение нежизнеспособных опухолевых клеток мыши линии СТ26 и жизнеспособных макрофагов после ко-культивирования в течение 12 часов при исходном соотношении мишень (СТ26) : эффектор (макрофаги) 1:1.

3. Объяснение приемов

Настоящее изобретение включает метод использования Алпростадила для репрограммирования макрофагов в противоопухолевый Ml-подобный фенотип.

Метод предполагает идентификацию пациента. Этим пациентом является человек или животное с показаниями к применению адоптивного переноса макрофагов с терапевтическим фенотипом, одной из характеристик которого является противоопухолевый M1-подобный фенотип.

Метод включает различные способы получения аутологичных макрофагов: (1) путем дифференцировки из аутологичных моноцитов ex vivo и (2) путем выделения готовых макрофагов из жидкостей и тканей пациента.

Метод включает различные способы выделения аутологичных моноцитов: (1) венозный забор крови с последующим выделением моноцитов из венозной крови, (2) адсорбционный аферезис, (3) выделение предшественников моноцитов из костного мозга, (4) выделение моноцитов из замороженной пуповинной крови пациента, (5) получение моноцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациента и другие способы, дающие возможность получить достаточное количество моноцитов.

Метод включает способ дифференцировки макрофагов из аутологичных моноцитов ex vivo любым из стандартных способов.

Метод включает способ репрограммирования аутологичных макрофагов ex vivo на терапевтический фенотип с использованием Алпростадила в концентрации 10 мкмоль в течение 24 часов.

4. Пример 1

Эксперименты проводили на самцах мышей линии Balb весом 21±2 г, полученных из вивария МГМСУ им. А.И. Евдокимова. Цитотоксичность макрофагов определяли с использованием метода проточной цитометрии.

Клетки

Макрофаги получали из клеток костного мозга мыши по протоколу (S.R. Amend, К.С. Valkenburg, К.J. Pienta, J. Vis. Exp. 2016, 3-6 (2016)) с использованием M-CSF (20 нг/мл; Peprotech).

Опухолевые клетки представляли собой клетки аденокарциномы прямой кишки мыши линии СТ26.

Приготовление проб

Пробы (0.5-1×10^∧6/мл) инкубировались с моноклональными антителами и красителями, перечисленными в Таблице 1, согласно инструкции производителя. Условия окрашивания для каждого маркера были определены по результатам титрования. Каждое антитело индивидуально титровали до насыщения, и оптимальные концентрации определялись на основе наименьшего количества антитела, которое обеспечивало наибольшее разделение сигналов при минимальном фоновом (без антител) окрашивании.

Цитометрический анализ

Цитометрическое исследование проводили на цитометре FC500 (Beckman Coulter), оснащенном одним лазером (Argon 488) и возможностью 4-цветного исследования. Подбор антител с флюорохромами проводили с использованием электронного ресурса Flow Cytometry Panel Builder (https://www.thermofisher.eom/order/panel-builder/#!/). Анализ данных проводили с использованием программы FlowJo (Tristar Inc). Предварительная обработка первичных файлов FCS проводилась путем проверки уровня каждого физического (FSC, SSC) и флюоресцентного параметра с течением времени для устранения всех нерегулярных событий. Неспецифическое связывание блокировали при помощи Mouse BD Fc-block (BD). Эффективность блокады неспецифического связывания подтверждали при помощи изотопических контролей. При определения гейтов в качестве негативного контроля использовали Fluorescence Minus One контроли. Определение коэффициентов компенсации проводили при помощи одноцветных контролей на UltraComp eBeads Compensation Beads (Invitrogen) и Мастера компенсации FlowJo. В отличие от традиционных цитометрических панелей нежизнеспособные клетки не удалялись, так как в панели для определения цитотоксичности именно мертвые клетки являются предметом исследования. Агрегаты клеток были удалены с помощью ручного гейтирования на основе свойств FSC. Стратегия гейтирования показана на Фиг. 1. Обычно набирали от 100 до 150 тыс. событий.

Как указано в таблице 1, для окрашивания макрофагов использовали пан-макрофагальный маркер F4/80, жизнеспособность клеток определяли при помощи LIVE/DEAD реагента 7AAD. Показано, что в условиях ко-культивирования макрофагов мыши, полученных из клеток костного мозга с использованием M-CSF, и опухолевых клеток линии СТ26 методом цитометрии можно отчетливо различить 4 субпопуляции клеток: макрофаги - живые (F4/80+7AAD-) и мертвые (F4/80+7AAD+) и опухолевые клетки - живые (F4/80-7AAD-) и мертвые (F4/80-7AAD+) (Фиг. 1), а также определить их соотношение (цитотоксичность макрофагов).

Клетки костного мозга мыши были успешно дифференцированы в макрофаги (Фиг. 2).

Макрофаги фенотипа М0 были репрограммированы с использованием Алпростадила (10 мкмоль/мл в течение 24 часов) на фенотип М0-Алпростадил (М0-Ал). Репрограммирование проводили в культуральных сосудах Т75 на шестой день дифференцировки макрофагов из клеток костного мозга мыши.

Мы рассматривали изменение формы клеток макрофагов как достоверный фенотипический признак активации макрофагов. Действительно, мышиные и человеческие макрофаги, как известно, демонстрируют резко различающиеся формы клеток после репрограммирования в различные фенотипы in vitro: удлиненную форму для М2-подобных макрофагов и круглую форму для М1-подобных макрофагов (McWhorter, F.Y., Wang, Т., Nguyen, P., Chung, Т. & Liu, W.F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 17253-17258 (2013)). Фенотип М0-Ал имеет отчетливо выраженную округлую форму, которая является характерным признаком M1-подобного противоопухолевого фенотипа (Фиг. 3).

Определение противоопухолевой активности макрофагов, репрограммированных с использованием Алпростадила на фенотип М0-Ал, проводили in vitro путем измерения цитотоксического эффекта макрофагов на клетки опухолевой линии СТ26. Макрофаги фенотипов М0 и М0-Ал и опухолевые СТ26 клетки были ко-культивированы в соотношении 1:1 в течение 12 часов в 6-луночном планшете по 5×10⁵ клеток каждого вида. После инкубации клетки были окрашены пан-макрофагальным маркером F4/80 и LIVE/DEAD реагентом (7AAD) и проанализированы методом проточной цитометрии. Клетки-мишени СТ26, которые были уничтожены макрофагами, были идентифицированы как F4/80-7AAD+ (Фиг. 4).

Количественно, цитотоксический эффект макрофагов определяли как соотношение мертвых клеток-мишеней (опухолевых клеток F4/80-7AAD+) и клеток-эффекторов (живых макрофагов (F4/80+7AAD-)). Было показано, что указанное соотношение было в 1.85 раза выше в случае макрофагов с фенотипом М0-Ал по сравнению с макрофагами фенотипа М0 (Фиг. 5).

Основной результат проведенных экспериментов продемонстрировал, что количество мертвых опухолевых клеток выше в случае ко-культивирования с макрофагами М0-Ал фенотипа по сравнению с макрофагами М0 фенотипа, что подтверждает гипотезу о возможности использования Алпростадила в качестве репрограммирующего фактора для получения макрофагов с противоопухолевым M1-подобным фенотипом.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу повышения цитотоксичности неактивированных макрофагов фенотипа М0, дифференцированных из клеток костного мозга мыши. Способ включает использование M-CSF в концентрации 20 нг/мл по отношению к опухолевым клеткам путем воздействия Алпростадила и характеризуется тем, что макрофаги культивируют в течение 24 часов в присутствии Алпростадила в концентрации 10 мкмоль. Изобретение эффективно в опосредуемом Алпростадилом увеличении цитотоксичности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам. 5 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ повышения цитотоксичности неактивированных макрофагов фенотипа М0, дифференцированных из клеток костного мозга мыши с использованием M-CSF в концентрации 20 нг/мл, по отношению к опухолевым клеткам путем воздействия Алпростадила, характеризующийся тем, что макрофаги культивируют в течение 24 часов в присутствии Алпростадила в концентрации 10 мкмоль.