СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КСАНТАНА Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12P19/06 C12R1/64 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биотехнологическому получению экзополисахаридов, и может быть использовано при получении ксантана.

Ксантан представляет собой микробиологический полимер, широко применяемый в пищевой, фармацевтической, косметической промышленности, а также при добыче нефти. Ксантановая камедь или ксантан - это разветвленный внеклеточный гетерополисахарид, получаемый культивированием бактерий Xanthomonas campestris в аэробных условиях на питательных средах, содержащих углеводы.

Известен способ получения ксантана с использованием бактерий Xanthomonas campestris. Известный способ предусматривает культивирование бактерий Xanthomonas campestris с введением в состав питательной среды, кроме источника углерода (сахароза), ионов железа и хелатообразующих соединений. Выделение ксантана из культуральной жидкости не производят (патент US 3485719, С12Р 19/06, опуб. 23.12.1969).

Недостатками указанного способа являются недостаточная чистота ксантана, сложность регулирования вязкости продукта, ограниченные сроки хранения культуральной жидкости, содержащей ксантан и высокие затраты на ее транспортировку.

Известен способ получения ксантановой камеди, включающий культивирование бактерий Xanthomonas в питательной среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу и гидролизат рыбокостной муки, источники азота, минеральные соли, с отделением после завершения ферментации ксантановой камеди. Культивирование проводят в две стадии, на первой стадии выращивают посевной материал, на второй стадии осуществляют ферментацию с получением культуральной жидкости, содержащей ксантановую камедь, причем на первой стадии для приготовления питательной среды используют воду с пониженным содержанием дейтерия (патент RU 2746229, С12Р 19/06, C12R 1/64, опуб. 9.04.2021).

Недостатком указанного способа является сложность технологического процесса получения воды с пониженным содержанием дейтерия, используемой для приготовления питательной среды для культивирования бактерий-продуцентов ксантановой камеди.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения ксантана, включающий культивирование бактерий Xanthomonas campestris ВКПМ-2228 на питательной среде в условиях аэрации, где в качестве питательной среды используют предварительно гидролизованную низкосортную древесину, источники азота, минеральные соли (патент RU 2559553, C12N 1/20, С12Р 19/06, C12R 1/64, 10.08.2015). Выделяют ксантан из культуральной жидкости путем экстракции низшим одноатомным спиртом.

Недостатком указанного способа является низкий выход ксантана при выращивании культуры продуцента на гидролизатах древесины из-за наличия токсичных для микроорганизмов компонентов, образующихся в процессе гидролизной обработки древесины.

Из уровня техники известно, что гидролизаты, полученные в результате кислотного гидролиза древесины содержат токсичные вещества, являющиеся продуктами распада Сахаров и лигнина, а именно производных фурана, органических кислот и фенольных соединений. Данные соединения повреждают клеточную мембрану микроорганизмов, ингибируют ключевые ферменты их метаболизма, и тем самым могут полностью остановить биотехнологические процессы. В связи чем перед использованием гидролизатов древесины в качестве субстратов для культивирования микроорганизмов требуется тщательная их очистка (1. Корольков И.И. Перколяционный гидролиз растительного сырья. 3-е изд., перераб. - Москва: Лесная промышленность, 1990. - 272 с. 2. Mussatto S.I., Roberto I.С. Alternatives for detoxification of diluted-acid lignocellulosic hydrolyzates for use in fermentative processes: a review. Bioresource technology vol. 93, 1 (2004): 1-10. doi: 10.1016/j.biortech.2003.10.005. 3. L.J., Martin C. Pretreatment of lignocellulose: Formation of inhibitory by-products and strategies for minimizing their effects. Bioresource technology, 199, (2016) 103-112. https://doi.org/10.1016/j.biortech. 2015.10.009.).

Технической проблемой является увеличение выхода ксантана.

Техническая проблема решается тем, что в способе получения ксантана, включающем культивирование бактерий Xanthomonas campestris на питательной среде, содержащей источник углерода, в качестве которого используют гидролизат, полученный в результате гидролиза древесины неорганической кислотой, источники азота, витаминов и микроэлементов, в условиях аэрации, выделение ксантана из культуральной жидкости низшим одноатомным спиртом и высушивание ксантана, согласно изобретению гидролизат перед приготовлением питательной среды очищают от фенольных соединений и ионов и нейтрализуют до рН 6,0-7,5 путем обработки при температуре 70-80°С сначала слабоосновной анионообменной смолой Resinex ТРХ-4503, затем активным осветляющим щелочным углем ОУ-А, причем обработку слабоосновной анионообменной смолой ведут в две ступени, а обработку активным осветляющим щелочным углем однократно.

В других аспектах изобретения раскрыто, что используют гидролизат, полученный гидролизом древесины сосны сернистой кислотой, для приготовления питательной среды в качестве источника азота используют бактопептон, в качестве источника витаминов и минералов дрожжевой экстракт, в качестве продуцента ксантана используют штамм бактерий Xanthomonas campestris ВКПМ-6720, процесс культивирования проводят в асептическом режиме, для выделения ксантана из культуральной жидкости используют изопропиловй спирт.

Решение технической проблемы позволяет повысить выход ксантана в 6 раз по сравнению с прототипом за счет повышения доброкачественности среды для культивирования, что выражается в снижении содержания токсичных для микроорганизмов фенольных соединений в гидролизате, цветности гидролизата, косвенно характеризующей содержание растворенных органических соединений, электропроводности гидролизата, характеризующей содержание ионов в гидролизате и приведении его рН в соответствие с физиологическими нормами бактерий вида Xanthomonas campestris.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве источника углерода для приготовления питательной среды может быть использован любой гидролизат, полученный кислотным гидролизом древесины.

Очистку и нейтрализацию полученного гидролизата осуществляют слабоосновной анионообменной смолой Resinex ТРХ-4503 (производства Jacobi Carbons АВ, Швеция) и активным осветляющим щелочным углем ОУ-А (ГОСТ 4453-74) при температуре 70-80°С, так как при температуре ниже 70°С в гидролизате начинается развитие микроорганизмов, а при температуре выше 80°С увеличиваются потери глюкозы в результате химических реакций с компонентами гидролизата (Петрушевский В.В. Производство сахаристых веществ. / В.В. Петрушевский, Е.Г. Бондарь, Е.В. Винокурова - К.: Урожай, 1989. - 168 с).

Очистку и нейтрализацию гидролизата можно вести путем пропускания его через адсорберы, заполненные ионообменными смолами или активным углем, либо смешивая гидролизат с ионообменными смолами или активным углем в реакторе-смесителе и выдерживании его при перемешивании в течение заданного времени с последующим отделением адсорбента фильтрацией (Петрушевский В.В. Производство сахаристых веществ. / В.В. Петрушевский, Е.Г. Бондарь, Е.В. Винокурова - К.: Урожай, 1989. - 168 с.).

Для приготовления питательной среды гидролизат после очистки и нейтрализации разбавляли до содержания глюкозы 1 мас. %, вносили источники азота, витаминов и микроэлементов и стерилизовали. В качестве источника азота использовали бактопептон (ГОСТ 13805-76), а в качестве источника витаминов и минералов дрожжевой экстракт (ТУ 9385-007-39484474-2003, производства ООО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», г. Санкт-Петербург).

Для культивирования использовали штамм Xanthomonas campestris ВКПМ В-6720, полученный из коллекции НИЦ «Курчатовский институт» (ГосНИИгенетика).

Выращивание посевного материала штамма Xanthomonas campestris ВКПМ-6720 проводят на скошенной агаризованной среде. В качестве среды для твердофазного культивирования используют среду №353: мальт-экстракт 3 г/л, дрожжевой экстракт 3 г/л, бактопептон 5 г/л, глюкоза 10 г/л, агар 20 г/л, вода водопроводная 1 л. Перед посевом на основную питательную среду культуру бактерий в асептических условиях переносили на жидкую питательную среду №353 (без агара) и культивировали в течении 24 ч при 28-30°С на орбитальном шейкере.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Во всех примерах в качестве источника углерода для приготовления питательной среды использовали гидролизат, полученный кислотным гидролизом древесины сосны. Для этого предварительно измельченную и высушенную древесину гидролизуют в автоклаве сернистой кислотой при ее концентрации в гидролизуемой массе 4 мас. % при температуре 165-175°С в течение 20-30 мин при перемешивании и гидромодуле 1:10. Гидролизат отделяют фильтрованием и определяют физико-химические показатели.

Очистку и нейтрализацию исходного гидролизата осуществляли путем перемешивания со слабоосновной анионообменной смолой Resinex ТРХ-4503 и осветляющим щелочным активным углем ОУ-А. Необходимое количество реагентов и время обработки зависит от степени загрязненности исходного гидролизата и в каждом конкретном случае подбирается опытным путем. Во всех приведенных ниже примерах количество слабоосновной анионообменной смолы Resinex ТРХ-4503 составило 5 мас. % к массе гидролизата при времени обработки на каждой ступени 30 мин, количество осветляющего щелочного активного угля ОУ-А составило 2 мас. % к массе гидролизата при времени обработки 60 минут на каждой ступени.

Во всех примерах очистку и нейтрализацию исходного гидролизата проводили при температуре 70°С. Примеры при других температурах из заявленного диапазона не приведены, так как после очистки и нейтрализации получали гидролизат с такими же физико-химическими характеристиками.

Пример 1.

В емкость с исходным гидролизатом добавляли слабоосновную анионообменную смолу Resinex ТРХ-4503, нагревали до температуры 70°С и перемешивали в течение 30 мин, затем гидролизат отфильтровывали, снова добавляли слабоосновную анионообменную смолу Resinex ТРХ-4503, перемешивали при температуре 70°С в течение 30 мин и отфильтровывали. Затем в отфильтрованный гидролизат добавляли осветляющий щелочной активный уголь ОУ-А и обрабатывали им в течение 60 мин при 70°С и постоянном перемешивании. Далее уголь отфильтровывали.

Конечное значение рН гидролизата после данной схемы очистки и нейтрализации составило 7,03.

Очищенный и нейтрализованный гидролизат разбавляли до содержания глюкозы 1 мас. %, вносили бактопептон в количестве 5 г/л, дрожжевой экстракт в количестве 3 г/л и стерилизовали при давлении 0,5 атм. в течение 30 мин.

Культуру бактерий Xanthomonas campestris штамм ВКПМ В-6720, выращенную в течение 24 ч на жидкой среде №353 в асептических условиях, содержащую 1,0-2,5⋅10⁹ КОЕ/мл, вносили в основную среду в количестве 10 об. % и проводили ферментацию в условиях аэрации стерильным воздухом в течение 72 ч при температуре 28-30°С.

Для осаждения ксантана в культуральную жидкость добавляли 3 объема изопропилового спирта. Ксантан отфильтровывали через тканевый фильтр 180 меш (0,083 мм) и высушивали при температуре 40°С.

Пример 2 (по прототипу).

Готовили основную питательную среду на основе гидролизата древесины сосны. Гидролизат нейтрализовали Са(ОН)₂ до рН 6,51. Образовавшийся осадок отфильтровывали. Далее процесс осуществляли по примеру 1.

Пример 3.

Очистку и нейтрализацию исходного гидролизата проводили следующим образом: слабоосновной анионообменной смолой Resinex ТРХ-4503 в одну ступень, активным осветляющим щелочным углем ОУ-А в одну ступень. Конечное значение рН гидролизата после данной схемы очистки и нейтрализации составило 4,62.

Так как данная схема подготовки питательной среды не обеспечила требуемое значение для развития бактерий Xanthomonas campestris значение рН культивирование на этой среде не проводили.

Пример 4.

Очистку и нейтрализацию исходного гидролизата проводили следующим образом: слабоосновной анионообменной смолой Resinex ТРХ-4503 в одну ступень, активным осветляющим щелочным углем ОУ-А в две ступени.

Конечное значение рН гидролизата после данной схемы очистки и нейтрализации составило 5,79. Так как данная схема подготовки питательной среды не обеспечила требуемое значение для развития бактерий Xanthomonas campestris значение рН культивирование на этой среде не проводили.

Пример 5.

Очистку и нейтрализацию исходного гидролизата проводили следующим образом: слабоосновной анионообменной смолой Resinex ТРХ-4503 в одну ступень, активным осветляющим щелочным углем ОУ-А в три ступени.

Конечное значение рН гидролизата после данной схемы чистки и нейтрализации составило рН 6,77. Далее процесс осуществляли по примеру 1.

У исходного гидролизата и гидролизатов после очистки и нейтрализации определяли физико-химические показатели:

- значения рН и электропроводности - рН-метром-кондуктометром Extech ЕС 600,

- содержание сухих веществ - рефрактометрическим методом,

- цветность - по ICUMSA по ГОСТ 12572-2015 «Сахар. Метод определения цветности»,

- содержание фенольных соединений - спектрофотометрическим методом с реагентом Фолина-Чокальтеу (Singleton, V.L. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteau reagent / V.L. Singleton, R. Orthofer, R.M. Lamuela-Raventos // Method. Enzymol. - 1999. - Vol. 299. - P. 152-178.),

- содержание редуцирующих веществ фенол-сернокислотным методом (Dubois М., Gilles K.А., Hamilton J., Robers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. No 3, P. 350-356.),

- содержание глюкозы глюкозооксидазным методом со спектрофотометрическим детектированием с использование набора реагентов «Глюкоза Агат» по ТУ 9398-233-11498242-01.

В таблице 1 представлены физико-химические показатели гидролизатов после очистки и нейтрализации в сравнении с исходным гидролизатом.

Анализ таблицы 1 показал, что нейтрализация гидролизата Са(ОН)₂ (пример 2 по прототипу), повысила рН до 6,51 и снизила электропроводность в 9 раз до 2,26 мСм/см, по сравнению с исходным гидролизатом, однако содержание фенольных веществ снизилось незначительно, а цветность даже возросла.

Обработка гидролизата по примеру 3 приводила к получению продукта с рН 4,62 и снижала цветность гидролизата в 72 раза, содержание фенольных соединений в 47 раз, а электропроводность в 1,35 раз (здесь и далее - по отношению к прототипу). Пример 4 был аналогичен примеру 3, но очистка активным осветляющим щелочным углем ОУ-А происходила в две ступени, что позволило получить продукт с рН до 5,79 и электропроводностью 1,95 мСм/см.

Однократная очистка гидролизата анионообменной смолой Resinex ТРХ-4503 и трехступенчатая очистка активным осветляющим щелочным углем ОУ-А по примеру 5 обеспечивали получение продукта с рН до 6,77 и электропроводностью в 2,37 мСм/см, при этом в 99 раз снижалось содержание фенольных соединений и в 103 раза цветность гидролизата.

При обработке гидролизата по примеру 1 (заявленный способ) значение рН достигло 7,03, электропроводности - 1,12 мСм/см, содержание фенольных соединений снизилось в 167 раз, а цветность в 268 раз. Двухступенчатая очистка анионообменной смолой Resinex ТРХ-4503 и однократная очистка активным осветляющим щелочным углем ОУ-А (пример 1) обеспечили оптимальный уровень рН, поэтому дальнейшее увеличение стадий очистки анионообменной смолой Resinex ТРХ-4503 и активным осветляющим щелочным углем ОУ-А нецелесообразно.

Данные по параметрам процесса получения ксантана представлены в таблице 2. Так как гидролизат древесины содержит несколько углеводов, которые могут быть утилизированы бактериями Xanthomonas campestris, то выход ксантана рассчитывали, как на глюкозу, так и на общее содержание редуцирующих веществ в гидролизате.

Как видно из табличных данных по окончании культивирования по примеру 2 на гидролизате, нейтрализованном Са(ОН)₂ (пример 2 прототип), выход ксантана по глюкозе был в 6 раз ниже (12,1 мас. %), чем при культивировании по примеру 1 (заявленный способ), вследствие токсичности питательной среды. Очистка и нейтрализация гидролизата по примеру 5 приводила к потерям большого количества глюкозы (табл. 1) и меньшему, чем в примере 1, выходу ксантана, поэтому проведение очистки и нейтрализации по данному примеру нецелесообразно.

Таким образом, заявленный способ позволяет повысить выход ксантана в 6 раз по сравнению с прототипом при минимальных потерях глюкозы на стадиях очистки и нейтрализации за счет снижения содержания токсичных для микроорганизмов фенольных соединений и солей в гидролизате.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения ксантана, включающий культивирование бактерий Xanthomonas campestris ВКПМ-6720 на питательной среде, содержащей источник углерода, в качестве которого используют гидролизат древесины сосны, полученный в результате гидролиза древесины неорганической кислотой, в качестве источника азота - бактопептон, в качестве источника витаминов и минералов - дрожжевой экстракт; при этом гидролизат древесины перед приготовлением питательной среды очищают от фенольных соединений и ионов и нейтрализуют до pH 6,0-7,5 путем обработки в две ступени слабоосновной анионообменной смолой Resinex TPX-4503 при 70-80°C, затем однократно активным осветляющим щелочным углем ОУ-А. Изобретение обеспечивает повышение выхода целевого продукта. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр.

1. Способ получения ксантана, включающий культивирование бактерий Xanthomonas cаmpestris на питательной среде, содержащей источник углерода, в качестве которого используют гидролизат, полученный в результате гидролиза древесины неорганической кислотой, источники азота, витаминов и микроэлементов, в условиях аэрации, выделение ксантана из культуральной жидкости низшим одноатомным спиртом и высушивание ксантана, отличающийся тем, что в качестве продуцента ксантана используют штамм бактерий Xanthomonas campestris ВКПМ-6720, в качестве древесины используют древесину сосны, а для приготовления питательной среды используют в качестве источника азота бактопептон, в качестве источника витаминов и минералов - дрожжевой экстракт; при этом гидролизат древесины перед приготовлением питательной среды очищают от фенольных соединений и ионов и нейтрализуют до pH 6,0-7,5 путем обработки при температуре 70-80°C сначала слабоосновной анионообменной смолой Resinex TPX-4503, затем активным осветляющим щелочным углем ОУ-А, причем обработку слабоосновной анионообменной смолой ведут в две ступени, а обработку активным осветляющим щелочным углем однократно.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют гидролизат, полученный гидролизом древесины сосны сернистой кислотой.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс культивирования проводят в асептическом режиме.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения ксантана из культуральной жидкости используют изопропиловый спирт.