СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Советский патент 1995 года по МПК C12N9/36 C12N9/36 C12R1/64 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности для получения ферментных препаратов медицинского назначения.

Цель изобретения повышение протеолитической активности комплекса литических ферметов.

Способ заключается в том, что штамм-продуцент Хаnthomonas campestris ВКПМ В-4102 культивируют на жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, бактопептон, белково-витаминный концентрат в количестве 2,5-6,0 г/л и минеральные соли, в условиях аэрации и перемешивания, при этом часть белково-витаминного концентрата вносят в исходную питательную среду, а оставшуюся, из расчета 40-60 мас. вносят одноразово или несколько раз в процессе культивирования в период от начала экспоненциальной фазы до начала стационарной фазы роста. Продукт выделяют из фильтрата культуральной жидкости известными способами.

Наибольший эффект достигается при дополнительном внесении белково-витаминного концентрата (БВК) в экспоненциальной фазе роста культуры (через 10-12 ч культивирования) в количестве 40-60 мас. (табл. 1 и 2).

Готовый препарат комплекса литических ферментов, полученного по предлагаемому способу, имеет протеолитическую активность 2,4-3,2 ед./мг препарата и бактериолитическую 37-50 ед./мг препарата.

Протеолитическую активность измеряют по скорости гидролиза казеина. За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое при 37^оС в течение 10 мин превращают в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние казеин в количестве, соответствующем повышению оптической плотности реакционной смеси при 280 нм на 1,0.

Бактериолитическую активность определяют следующим образом. К 2 мл суспензии лиофилизированных клеток Micrococcus Iysodeikticus в 0,01 М Трис-буфере рН 8,4-8,5 с концентрацией 0,5-0,6 ед. оптической плотности (ФЭК-56М, δ 3 мм, с/ф N 6), прогретой в течение 10 мин при 37^оС, добавляют 0,1 мл пробы, смесь инкубируют 5 мин при 37^оС. Активность рассчитывают по формуле
E(ед./мл) где D_o оптическая плотность контроля;
D оптическая плотность пробы после инкубации;
t время инкубации, мин.

Р разведение пробы.

0,01 оптическая плотность, соответствующая 1 ед. активности;
0,1 объем пробы, мл.

За единицу бактериолитической активности принимают такое количество фермента, которое при 37^оС в течение 1 мин уменьшает оптическую плотность 0,06% суспензии клеток Micrococcus Iysodeikticus при измерении на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре в кювете с толщиной слоя 3 мм на 0,01.

П р и м е р 1. В ферментер емкостью 250 л вносят 130 л питательной среды, содержащей, г/л: глюкоза 10,00; пептон 5,00; белково-витаминный концентрат (БВК) 3,00; Na₂HPO₄^.12H₂O 1,50; КН₂РО₄^. 0,35; NaCl 0,35; FeSO₄^.7H₂O 0,05; MgSO₄^.7Н₂О 0,35; стерилизуют и засевают 3% посевной культуры штамма Xanthomonas campestris ВКПМ В-4102. Культивирование ведут при t 30±1^оС, числе оборотов мешалки 200 об/мин, подаче воздуха 0,3 объема на 1 объем среды в мин. В процессе культивирования величину рН поддерживают не ниже 7,0 с помощью раствора NaOH, рО₂ поддерживают на уровне 30-40% от насыщения, изменяя число оборотов мешалки и расход воздуха. Через 12 ч роста стерильно вносят суспензию БВК из расчета 2 г/л среды. Процесс заканчивают через 24 ч. Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет 4,8 ед./мл, бактериолитическая 59 ед./мл.

П р и м е р 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1, но культивирование проводят в ферментере емкостью 10 л, куда вносят 6 л питательной среды, а БВК добавляют через 10 ч роста в количестве 3 г/л. Через 24 ч культивирования протеолитическая активность культуральной жидкости составляет 5,1 ед./мл, бактериолитическая 61 ед./мл.

П р и м е р 3. Способ осуществляют, как описано в примере 2, но, начиная с 7 ч роста в ферментер вносят небольшими порциями в течение 5 ч водную суспензию БВК (из расчета суммарного количества БВК 3 г на 1 л среды в ферментере). Через 24 ч культивирования протеолитическая активность культуральной жидкости составляет 4,5 ед./мл, бактериолитическая 62 ед./мл.

Таким образом, предлагаемый способ получения комплекса литических ферментов позволяет повысить протеолитическую активность комплекса, и, соответственно, протеолитическую активность готового препарата в 1,5 раза по сравнению с активностью комплекса, полученного по способу-прототипу.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской и микробиологической отраслях промышленности. С целью повышения протеолитической активности комплекса литических ферментов штамм-продуцент Xanthomonas campnstris ВКПМ. В-4102 культивируют на среде, содержащей глюкозу, бактопептон, белково-витаминный концентрат (БВК) в количестве 2,5 6,0 г/л в условиях аэрации и перемешивания, при этом часть БВК вносят в питательную среду, а остальные 40 60% вносят в экспоценциальной фазе и/или в фазе замедления роста культуры. Продукт выделяют известными методами. 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, включающий культивирование штамма-продуцента xanthomonas samprestris ВКПМ4 В-4102 на жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, бактолептон, белково-витаминный концентрат в количестве 2,5 6,0 г/л и минеральные соли, в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения протеолитической активности комплекса, часть белково-витаминного концентрата вносят в исходную питательную среду, а оставшуюся, из расчета 40 60 мас. вносят в процессе культивирования в экспоненциальной фазе и/или в фазе замедления роста культуры.