СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭЛЕУТЕРОЗИДА В В КОРНЕВИЩАХ И КОРНЯХ ЭЛЕУТЕРОКОККА КОЛЮЧЕГО Российский патент 2023 года по МПК A61K36/254 B01D11/02 G01N21/00 G01N30/16 G01N30/86 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении анализа содержания элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего.

Действующая система контроля качества требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих селективно определять конкретные БАС.

Элеутерококк колючий - Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim) Maxim., синоним Acanthopanax senticosus (Rupr. et Maxim) Harms, семейство Аралиевые (Araliaceae), известный как сибирский женьшень, Ciwujia по-китайски, является одним из наиболее часто используемых адаптогенных растений (1-3). Данное растение впервые введено в научную медицину советскими учеными в виде экстракта элеутерококка жидкого (4, 5). В настоящее время элеутерококк колючий широко применяется во всем мире в качестве адаптогена с целью улучшения физических и умственных способностей для нормального физиологического функционирования человеческого организма в условиях стресса (1-3).

Сообщается о нескольких классах биологически активных соединений, включая фенилпропаноиды, лигнаны, кумарины, флавоноиды, тритерпеновые сапонины (3,4,6-8). При этом элеутерозид В (сирингин) и элеутерозиды D и E, считаются наиболее активными компонентами (3, 7).

Для определения содержания элеутерозида В (сирингина) используются спектрофотометрические, хроматоспектрофотометрические методы, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (6, 8).

В качестве прототипа нами взят фармакопейный способ определения элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего (9). Способ предусматривает дробную экстракцию элеутерозида В (сирингина) с использованием в качестве экстрагента 96 % этанолом при нагревании с обратным холодильником на водяной бане. ВЭЖХ-анализ содержания элеутерозида В (сирингина) проводится в следующих условиях (9):

- колонка из нержавеющей стали 250×4,6 мм, эндкепированный октадецилсиликагель для хроматографии, диаметр 5 мкм,

- элюирование в градиентном режиме, подвижная фаза - раствор фосфорной кислоты концентрированной в воде и ацетонитрил для хроматографии в разных соотношениях.

- детекция при длине волны 266 нм.

Продолжительность ВЭЖХ-анализа может составлять до 45 мин, общая продолжительность анализа может достигать 3 ч.

На наш взгляд, используемые в прототипе параметры экстракции не позволяют обеспечить высокий выход элеутерозида В (сирингина), так как элеутерозид В мало и медленно растворим в 96 % этаноле (7).

Кроме этого, известно, что при градиентном режиме корректировка условий является более критичной, может привести к некорректной идентификации пиков, их наложению или сдвигам, при которых анализируемые вещества могут выйти после указанного времени регистрации хроматограммы (10).

Таким образом, целью изобретения является разработка нового способа определения количественного содержания элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего, обеспечивающего увеличение выхода элеутерозида В (сирингина) и, следовательно, повышение объективности анализа, а также меньшую продолжительность анализа при сохранении правильности, специфичности и прецизионности метода.

Техническим результатом является увеличение выхода элеутерозида В (сирингина), повышение объективности анализа и уменьшение продолжительности способа количественного определения элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего.

Технический результат достигается тем, что способ осуществляют путем экстракции элеутерозида В (сирингина) из корней и корневищ элеутерококка колючего 40 % этанолом, очистки полученных извлечений путем фильтрования через слой алюминий оксида, ВЭЖХ-анализа очищенных извлечений в изократическом режиме элюирования с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила и 1% раствора уксусной кислоты в воде в соотношении 15:85 и детекцией при длине волны 266 нм.

Содержание элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

где H - среднее значение высоты пика элеутерозида В, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца;

H_о - среднее значение высоты пика элеутерозида В(сирингина), вычисленное из хроматограмм раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина);

V - объем извлечения, мл;

P - разведение;

V_о - объем раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина), мл,

V₁ - объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл;

V₂ - объем вводимой пробы раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина), мкл;

m_о - масса стандартного образца, г;

m - масса сырья, г;

W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах;

0,95 - коэффициент пересчета элеутерозида В (сирингина) на безводное вещество.

Способ осуществляют следующим образом. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 40% этанола. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (раствор А).

30 мл извлечения упаривали до объема 1-2 мл. Получившийся остаток количественно переносили на слой алюминия оксида высотой около 5 мм в стеклянном фильтре диаметром 1,5-2 см, используя в качестве растворителя 95 % этанол (не более 20 мл). Фильтрат собирали в мерную колбу вместимостью 25 мл. Объем в мерной колбе доводили этанолом 95 % до метки и перемешивали. Аликвоту полученного раствора фильтровали через мембранный фильтр Milipore (0,45 мкм). 5 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Хроматографируют в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка «КАХ-6-80-4» (2 мм × 80 мм; Separon-C18, диаметр 5 мкм), подвижная фаза - ацетонитрил : 1% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 15:85, скорость элюирования - 100 мкл/мин, объем элюента - 1000 мкл.

Проводят УФ-детектирование при длине волны 266 нм, диапазон чувствительности 0,5. Проводят не менее 3 параллельных определений.

Параллельно 1 мкл раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина) вводят в хроматограф и хроматографируют, как описано выше. Проводят определение высоты пика элеутерозида В (сирингина) и рассчитывают среднюю высоту пика по результатам трех параллельных определений.

Содержание элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

где H - среднее значение высоты пика элеутерозида В (сирингина), вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца;

H_о - среднее значение высоты пика элеутерозида В (сирингина), вычисленное из хроматограмм раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина);

V - объем извлечения, мл;

P - разведение;

V_о - объем раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина), мл,

V₁ - объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл;

V₂ - объем вводимой пробы раствора стандартного образца элеутерозида В(сирингина), мкл;

m_о - масса стандартного образца, г;

m - масса сырья, г;

W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах;

0,95 - коэффициент пересчета элеутерозида В на безводное вещество.

Примечание: Приготовление раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина). Около 0,025 г (точная навеска) государственного стандартного образца элеутерозида В (сирингина) (содержание основного вещества 98 %) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в небольшом количестве 95% этанола при нагревании на водяной бане, доводят 95% этанолом до метки, перемешивают.

Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность (открываемость), прецизионность. Специфичность методики определялась по соответствию времен удерживания стандартного образца элеутерозида В (сирингина) и соответствующего пика на ВЭЖХ-хроматограмме испытуемого раствора, а также по разрешению между наиболее близкими пиками и фактору асимметрии пиков элеутерозида В (сирингина).

На фиг. 1 представлены ВЭЖХ-хроматограммы исходного извлечения из корневищ и корней элеутерококка колючего (кривая 1) и после очистки через слой алюминия оксида (кривая 3), а также стандартного раствора элеутерозида В (кривая 2). В условиях ВЭЖХ-анализа среднее время удерживания пика элеутерозида В (сирингина) в извлечении из корней и корневищ элеутерококка колючего составляло 2,841±0,085 мин, что соответствует времени удерживания пика элеутерозида В на хроматограмме стандартного образца.

Зависимость высоты хроматографического пика от концентрации элеутерозида В (сирингина) описывалась линейной регрессией в диапазоне концентраций от 0,064 до 1,275 мг/мл, коэффициент корреляции для зависимости высоты пика от концентрации составил 0,9995. Указанный диапазон концентраций можно рассматривать как аналитическую область методики.

Правильность методики определяли методом добавок путем добавления раствора элеутерозида В (сирингина) с известной концентрацией (80 %, 100 % и 120 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент открываемости составил 98,3 %.

Исследование внутренней прецизионности методики указывает на сходимость полученных концентраций анализируемого вещества: ошибка определения среднего результата содержания элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего с доверительной вероятностью 95 % составляла ±3,28 %. При оценке внутрилабораторной прецизионности также показаны удовлетворительные результаты, так как относительная погрешность определения элеутерозида В (сирингина) в первый и второй дни анализа находится в диапазоне от 0,91 % до 1,10 %.

Нами было также изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 - фиг. 2 представлено влияние различных параметров экстракции на полноту извлечения элеутерозида В (сирингина) из исследуемого лекарственного растительного сырья (табл. 3). 40 % и 70 % этанол показали сопоставимую эффективность (t-критерий Стьюдента (рассч.) = 3,20 > t-критерий Стьюдента (табл.) = 2,13 (ƒ = 15; α = 0,05) в отношении извлечения элеутерозида В. Однако для методики нами был выбран 40 % этанол, так как он используется для получения лекарственных препаратов из сырья элеутерококка колючего. Другие параметры экстракции включают нагрев на кипящей водяной бане в течение 60 минут при соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50.

Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.

Предлагаемый способ поясняется следующим примером.

Пример.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 40% этанола. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (раствор А).

30 мл извлечения упаривали до объема 1-2 мл. Получившийся остаток количественно переносили на слой алюминия оксида высотой около 5 мм в стеклянном фильтре диаметром 1,5-2 см, используя в качестве растворителя 95 % этанол (не более 20 мл). Фильтрат собирали в мерную колбу вместимостью 25 мл. Объем в мерной колбе доводили этанолом 95 % до метки и перемешивали. Аликвоту полученного раствора фильтровали через мембранный фильтр Milipore (0,45 мкм). 5 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Хроматографируют в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка «КАХ-6-80-4» (2 мм × 80 мм; Separon-C18, диаметр 5 мкм), подвижная фаза - ацетонитрил : 1% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 15:85, скорость элюирования - 100 мкл/мин, объем элюента - 1000 мкл.

Проводят УФ-детектирование при длине волны 266 нм, диапазон чувствительности 0,5. Проводят не менее 3 параллельных определений.

Параллельно 1 мкл раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина) вводят в хроматограф и хроматографируют, как описано выше. Проводят определение высоты пика элеутерозида В (сирингина) и рассчитывают среднюю высоту пика по результатам трех параллельных определений.

Содержание элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

где:

H = 472,7941 - среднее значение высоты пика элеутерозида В (сирингина), вычисленное из хроматограмм раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина);

H_о = 102,087 - среднее значение высоты пика элеутерозида В (сирингина), вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого раствора корней и корневищ элеутерококка колючего после очистки через слой алюминия оксида;

m = 1,0070 - масса сырья, г;

m_о = 0,0249 - масса стандартного образца, г;

W = 11 - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах;

Примечание: Приготовление раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина). Около 0,025 г (точная навеска) государственного стандартного образца элеутерозида В (сирингина) (содержание основного вещества 95 %) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в небольшом количестве 95% этанола при нагревании на водяной бане, доводят 95% этанолом до метки, перемешивают.

Испытание проведено в трех повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание элеутерозида В (сирингина) составило 0,095 % ± 0,002 %.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего обладает следующими преимуществами:

1. Элюирование в изократическом режиме позволяет избежать проблем (некорректная идентификация пиков, их наложение или сдвиги, при которых интересующие вещества могут выйти после указанного времени регистрации хроматограммы), возникающих при проведении хроматографического анализа в градиентном режиме.

2. Продолжительность хроматографического анализа составляет 10 мин по сравнению с 45 мин в прототипе, общая продолжительность анализа - около 2 ч по сравнению с примерно 3 ч в прототипе.

3. Использование в разработанном способе 40 % этанола позволяет повысить эффективность экстракции в 2 раза (при сравнении результатов анализа элеутерозида В (сирингина) при использовании в качестве экстрагентов 40 % этанола и 95 % этанола, как в прототипе) (таблица 1).

4. Ошибка определения среднего результата содержания элеутерозида В (сирингина) с доверительной вероятностью 95 % составляет +3,28 %, что свидетельствует о высокой воспроизводимости методики.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Jia, A. A review of Acanthopanax senticosus (Rupr and Maxim.) Harms: From ethnopharmacological use to modern application / A. Jia, Y. Zhang, H. Gao et al. // J. Ethnopharmacol. - 2021. - Vol. 268. - P. 113586. DOI: 10.1016/j.jep.2020.113586.

2. Huang, L. Acanthopanax senticosus: review of botany, chemistry and pharmacology / L. Huang, H. Zhao, B. Huang, C. Zheng, W. Peng, L. Qin // Pharmazie. - 2011. - Vol. 66, N. 2. - P. 83-97.

3. European medicines agency. Assessment report on Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.) Maxim., radix. EMA/HMPC/680615/2013. 25 March 2014. Accessed October 13, 2021. Available from:: https://www.ema.europa.eu/en/documents/herbal-report/final-assessment-report-eleutherococcus-senticosus-rupr-et-maxim-maxim-radix_en.pdf

4. Дардымов, И.В. Женьщень, элеутерококк (к механизму биологического действия) / И.В Дардымов // М.: Наука, 1976. - 184 с.

5. Государственный реестр лекарственных средств. 2021. [дата обращения: 13.10.2021]. Доступно на: http://www.grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx.

6. Климова, И.Ю. Аналитические и технические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной / Инна Юрьевна Климова // Дисс. на соискание … уч. степени канд. фармац. наук. - Самара, 2005. - 159 с.

7. Куркин, В.А. Фенольные соединения корней Eleutherococcus senticosus / В.А. Куркин, Р.И. Евстратова, Г.Г. Запесочная // Химия природ. соединений. - 1991 - № 6. - С. 854-856.

8. Авдеева, Е.В. Фитохимические и аналитические исследования по созданию галеновых препаратов на основе лекарственного растительного сырья, содержащего производные коричных спиртов / Е.В. Авдеева // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2007. - № 2. - С. 129-136.

9. ФС.2.5.0053.15 Элеутерококка колючего корневища и корни (Eleutherococci senticosi rhizomata et radices) / Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд., Т. IV. - Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2018. URL:http://resource.rucml.ru/feml/pharmacopia/14_4/HTML/1467/index.html#zoom=z.

10. ОФС.1.2.1.2.0001.15 Хроматография / Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. - Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2018. URL: http://www.femb.ru/femb/pharmacopea.php.

Изобретение относиться к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу количественного элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего. Способ заключается в получении экстракта элеутерозида В (сирингина) из корневищ и корней элеутерококка колючего 40% этанолом в течение 60 мин при соотношении «сырье-экстрагент» 1:50, дальнейшем хроматографическом разделении в изократическом режиме, в качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила с 1% раствором уксусной кислоты в воде в соотношении 15:85; содержание элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах X вычисляют по формуле:

где H – среднее значение высоты пика элеутерозида В (сирингина), вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца; H_о – среднее значение высоты пика элеутерозида В (сирингина), вычисленное из хроматограмм раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина); V – объем извлечения, мл; P – разведение; V_о – объем раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина), мл, V₁ – объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл; V₂ – объем вводимой пробы раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина), мкл; m_о – масса стандартного образца, г; m – масса сырья, г; W – потеря в массе при высушивании сырья, %; 0,95 – коэффициент пересчета элеутерозида В (сирингина) на безводное вещество. Вышеуказанный способ позволяет увеличить выход элеутерозида В (сирингина), повысить объективность анализа и уменьшить продолжительность способа количественного определения элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего. 2 ил., 1 пр.

Способ количественного определения элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего, заключающийся в получении извлечения из растительного сырья и его последующего анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что экстракцию элеутерозида В (сирингина) из корневищ и корней элеутерококка колючего проводят 40% этанолом в течение 60 мин при соотношении «сырье-экстрагент» 1:50, хроматографическое разделение осуществляют в изократическом режиме и в качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила с 1% раствором уксусной кислоты в воде в соотношении 15:85; содержание элеутерозида В (сирингина) в корневищах и корнях элеутерококка колючего в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах X вычисляют по формуле:

где H – среднее значение высоты пика элеутерозида В (сирингина), вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца;

H_о – среднее значение высоты пика элеутерозида В (сирингина), вычисленное из хроматограмм раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина);

V – объем извлечения, мл;

P – разведение;

V_о – объем раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина), мл,

V₁ – объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл;

V₂ – объем вводимой пробы раствора стандартного образца элеутерозида В (сирингина), мкл;

m_о – масса стандартного образца, г;

m – масса сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании сырья, %;

0,95 – коэффициент пересчета элеутерозида В (сирингина) на безводное вещество.