Способ количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах Российский патент 2023 года по МПК G01N30/02 

Изобретение относится к области исследований и анализа материалов путем определения их химических и физических свойств, а именно к способам количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах с помощью метода хроматографии.

Аскорбиновая кислота (далее - АК), или витамин С, относится к классу водорастворимых витаминов и является важным элементом биохимических процессов в организме человека.

Витамины в достаточно большом количестве содержатся в лекарственном растительном сырье (ЛРС), преимущественно накапливаясь в плодах. Особый интерес, как источника витамина С, представляют собой плоды шиповника, которые применяются в виде отваров и являются компонентом многих витаминных сборов и лекарственных растительных препаратов (далее - ЛРП). Помимо витамина С в плодах шиповника содержатся витамины К, Е, Р, РР, ряд витаминов группы В, органические кислоты (яблочная, лимонная), пектиновые вещества, жирные кислоты, дубильные вещества и минеральные элементы. В современной медицинской практике плоды шиповника используются в качестве поливитаминного и желчегонного средства (Справочник лекарственных препаратов Vidal. https://www.vidal.ru).

В Государственной фармакопее Российской Федерации (далее - ГФ РФ) (ФС 2.5.0106.18. Шиповника плоды. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4, М.; 2018) и Государственной фармакопее Республики Беларусь (Шиповника плоды. Государственная фармакопея Республики Беларусь. 2 изд. Т. 2. Минск; 2016) представлены титриметрические окислительно-восстановительные способы определения содержания АК: йодатометрическое титрование и индофенольное титрование. Главными недостатками титриметрических способов количественного определения АК являются: высокая погрешность измерений, связанная с субъективностью визуального установления точки эквивалентности, особенно в окрашенных растительных вытяжках; низкая специфичность, являющаяся следствием того, что извлечения из ЛРС и ЛРП содержат сумму биологически-активных веществ с восстанавливающими свойствами.

Известен аналог предлагаемого авторами способа (Min UM Ji-Woo, KIM Jae-Won LEE Optimization of Ascorbic Acid Extraction from Rugosa Rose (Rosa rugosa Thunb.) Fruit Using Response Surface Methodology and Validation of the Analytical Method // J. Korean Wood Sci. Technol. - 2020. - №48 (3). - С. 364-375, https://doi.org/10.5658/WOOD.2020.48.3.364), недостатками которого можно отметить выбор в качестве экстрагента 50% раствора спирта этилового, что приводит к экстракции посторонних веществ и загрязнению хроматограмм; длительную экстракцию, которая не способствует более полному извлечению АК, а приводит к появлению дополнительных пиков на хроматограмме испытуемого раствора, мешающих количественному определению; изократический режим элюирования, который позволяет почти полностью исключить перенос веществ на последующие хроматограммы, но влечет за собой большой расход органического растворителя; также данный способ не учитывает проблему стабильности АК в водных растворах, что сказывается на результатах количественного определения.

В других литературных источниках встречаются способы определения АК методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) в таких объектах как лекарственные препараты, продукты питания и биологические жидкости. Прототипом заявляемого изобретения был выбран один из них (Saeed Nojavan, Faezeh Khalilian, Fatemeh Momen Kiaie, Atyeh Rahimi, Armin Arabanian, Soheila Chalavi Extraction and quantitative determination of ascorbic acid during different maturity stages of Rosa canina L. fruit // Journal of Food Composition and Analysis. - 2008. - №21 (4). - С. 300-305, https://doi.org/10.1016/j.jfca.2007.11.007). Общими признаками способа определения количественного содержания аскорбиновой кислоты согласно прототипу и предлагаемого авторами являются использование хроматографической колонки, заполненной октадецилсилильным силикагелем с размером частиц 5 мкм, с геометрией 250×4,6 мм; использование для определения стандартного образца аскорбиновой кислоты; близкая аналитическая длина волны УФ-детектора - 245 нм. Из недостатков прототипа можно указать длительную пробоподготовку; изократический режим элюирования, который не позволяет обеспечить полной очистки колонки от балластных веществ между хроматографическими вколами, что приводит к контаминации хроматограмм посторонними пиками; стабилизацию растворов 5% раствором метафосфорной кислоты, что позволяет сохранить исходные концентрации в течение лишь 4 часов, что недостаточно для проведения полного комплекса хроматографических исследований.

В связи с этим актуальной технической задачей является разработка способа количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах методом ВЭЖХ, обладающего высокой чувствительностью, селективностью, точностью с учетом специфики количественного определения аскорбиновой кислоты (необходимости полноты экстракции и лабильности растворов).

Предлагаемый авторами способ, в сравнении с указанными выше аналогом и прототипом, позволяет повысить чувствительность, точность и селективность количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах.

Поставленная задача решается способом количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах, который включает этап пробоподготовки, при этом для приготовления испытуемого раствора 2,5-5 г лекарственного растительного препарата измельчают до размера частиц менее 1 мм и смешивают с 100 мл 0,01 М щавелевой кислоты, центрифугируют со скоростью 5000 об/мин в течение 5 минут и фильтруют; для приготовления стандартного раствора 10 мг - 20 мг стандартного образца аскорбиновой кислоты растворяют в 50 мл 0,01 М щавелевой кислоты, затем 5 мл полученного раствора переносят в мерную колбу темного стекла объемом 25 мл, доводят объем раствора 0,01 М щавелевой кислоты до метки. Затем проводят хроматографирование методом ВЭЖХ с градиентным режимом элюирования.

Математический расчет количества аскорбиновой кислоты в испытуемом лекарственном растительном препарате осуществляют по формуле:

, где:

S - площадь пиков аскорбиновой кислоты на хроматограмме раствора испытуемого образца,

а₀ - навеска стандартного образца аскорбиновой кислоты, г,

Р - содержание основного вещества в стандартном образце аскорбиновой кислоты, %,

S₀ - площадь пика аскорбиновой кислоты на хроматограмме раствора стандартного образца,

W - содержание влаги в лекарственных растительных препаратах, %,

а - навеска испытуемого лекарственного растительного препарата, г.

Технический результат предложенного авторами изобретения достигается за счет отличительных от прототипа признаков, а именно за счет подбора авторами условий пробоподготовки, обеспечивающих полноту экстракции; использования в качестве экстрагента и растворителя 0,01 М водного раствора щавелевой кислоты, способного стабилизировать аскорбиновую кислоту в растворах в течение 8 часов, что достаточно для проведения полного комплекса хроматографических испытаний; использования подвижной фазы определенного качественного и количественного состава в условиях градиентного режима, позволяющего избежать переноса веществ перед последующим хроматографическим вколом.

Осуществляют предлагаемый способ следующим образом.

Этап пробоподготовки включает приготовление растворителя, испытуемого раствора, стандартного раствора, подвижной фазы А и подвижной фазы Б.

Растворитель получают с помощью растворения в воде 1,26 г щавелевой кислоты, затем доводят объем раствора водой до 1000,0 мл, получая 0,01 М раствор щавелевой кислоты.

Для получения испытуемого раствора 2,5-5 г (точная навеска) ЛРП измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в мерную колбу темного стекла объемом 250 мл и прибавляют 100,0 мл растворителя. Полученный раствор встряхивают на орбитальном шейкере в течение 20 минут, затем центрифугируют со скоростью 5000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант фильтруют через мембранный фильтр из регенерированной целлюлозы (размер пор 0,45 мкм), отбрасывая первые 1-2 мл фильтрата.

Для получения стандартного раствора 10-20 мг (точная навеска) стандартного образца аскорбиновой кислоты помещают в мерную колбу темного стекла объемом 50 мл, прибавляют 40 мл растворителя, перемешивают до растворения, доводят объем раствора растворителем до метки, перемешивают. 5,0 мл полученного раствора переносят в мерную колбу темного стекла объемом 25 мл, доводят объем раствора растворителем до метки, перемешивают.

Приготовление испытуемого и стандартного растворов проводится в защищенном от света месте, с использованием мерных колб темного стекла. Готовые растворы немедленно переносят в хроматографические виалы для светочувствительных образцов и отправляют в термостат автосамплера, где поддерживается необходимая для проведения испытания температура.

Подвижную фазу А получают с помощью растворения 3,40 г калия дигидрофосфата в 900 мл воды, затем доводят рН раствора до 3,00 (±0,05) потенциометрически с помощью ортофосфорной кислоты концентрированной и доводят объем раствор водой до 1000,0 мл. Подвижная фаза Б - ацетонитрил.

Этап хроматографирования проводят при следующих условиях:

- хроматографическая колонка, заполненная октадецилсилильным силикагелем с размером частиц 5 мкм, размер 250×4,6 мм;

- УФ-детектор, 244 нм;

- скорость потока: 1 мл/мин;

- температура колонки: 30°С;

- температура термостата автосамплера: 4°С;

- объем вводимой пробы: 10 мкл;

- программа градиентного элюирования:

Время, мин ПФ А, % ПФ Б, % 0 100 0 8 100 0 10 50 50 17 50 50 19 100 0 25 100 0

Время удерживания пика аскорбиновой кислоты в описанных условиях составляет около 5,5 мин, пика щавелевой кислоты - около 2,7 мин.

Проверку пригодности хроматографической системы проводят следующим образом.

Хроматографируют стандартный раствор не менее 6 раз. Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:

- относительное стандартное отклонение площади пика аскорбиновой кислоты при повторных инъекциях - не более 2%;

- фактор асимметрии пика аскорбиновой кислоты - от 0,8 до 1,5;

- разрешение между пиками аскорбиновой кислоты и щавелевой кислоты - не менее 10.

Содержание АК в ЛРП в процентах, в пересчете на абсолютно сухое сырье (Х) вычисляют по формуле:

, где:

S - площадь пиков аскорбиновой кислоты на хроматограмме раствора испытуемого образца; а₀ - навеска стандартного образца аскорбиновой кислоты, г; а - навеска испытуемого лекарственных растительных препаратов, г; Р - содержание основного вещества в стандартном образце аскорбиновой кислоты, %; S₀ - площадь пика аскорбиновой кислоты на хроматограмме раствора стандартного образца; W - содержание влаги в лекарственных растительных препаратах, %.

На фиг. 1 приведена хроматограмма раствора стандартного образца аскорбиновой кислоты (по заявленному способу); на фиг. 2 - хроматограмма раствора испытуемого образца ЛРП «Плоды шиповника» (по заявленному способу); на фиг. 3 - хроматограмма раствора испытуемого образца ЛРП «Плоды шиповника» (по способу, выбранному за прототип); на фиг. 4 - хроматограмма растворителя до и после проведения испытания (по способу, выбранному за прототип); на фиг. 5 - хроматограмма раствора испытуемого образца ЛРП «Плоды шиповника» (по способу аналогу); на фиг. 6 - хроматограмма растворителя до и после проведения испытания (по способу аналогу); на фиг. 7 - хроматограмма растворителя до и после проведения испытания (по заявленному способу).

Пример 1. Определение аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном препарате «Шиповника плоды» (АО «Красногорсклексредства») заявляемым способом.

Растворитель получали с помощью растворения в воде 1,26 г щавелевой кислоты, затем доводили объем раствора водой до 1000,0 мл, получая 0,01 М раствор щавелевой кислоты.

Для приготовления испытуемых растворов брали отдельно точные навески 2,51015 г, 2,50981 г, 2,50068 г, 3,00500 г, 3,00126 г, 3,00419 г, 5,00254 г, 5,00122 г и 5,00126 г образца лекарственного растительного препарата «Шиповника плоды» (АО «Красногорсклексредства»), измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещали в мерные колбы темного стекла объемом 250 мл и прибавляли по 100,0 мл (для каждой навески) 0,01 М раствора щавелевой кислоты. Полученные растворы встряхивали на орбитальном шейкере в течение 20 минут, затем центрифугировали со скоростью 5000 об/мин в течение 5 минут. Супернатанты фильтровали через мембранные фильтры из регенерированной целлюлозы (размер пор 0,45 мкм), отбрасывая первые 1-2 мл фильтратов.

Для приготовления стандартных растворов брали отдельно точные навески 0,01023, 0,01520 и 0,02015 г стандартного образца аскорбиновой кислоты растворяли каждую в 50 мл 0,01 М раствора щавелевой кислоты. 5,0 мл каждого из полученных растворов переносили в отдельные мерные колбы темного стекла вместимостью 25 мл, доводили объемы растворов 0,01 М раствором щавелевой кислоты до метки и перемешивали.

Проводили хроматографирование методом ВЭЖХ при следующих условиях:

- хроматографическая колонка, заполненная октадецилсилильным силикагелем с размером частиц 5 мкм, размер 250×4,6 мм;

- УФ-детектор, 244 нм;

- скорость потока: 1 мл/мин;

- температура колонки: 30°С;

- температура термостата автосамплера: 4°С;

- объем вводимой пробы: 10 мкл;

- программа градиентного элюирования:

Время, мин ПФ А, % ПФ Б, % 0 100 0 8 100 0 10 50 50 17 50 50 19 100 0 25 100 0

Время удерживания пика аскорбиновой кислоты в описанных условиях составляет около 5,5 мин, пика щавелевой кислоты - около 2,7 мин.

Хроматографировали стандартный раствор, получив 6 хроматограмм. Результаты были признаны достоверными, так как выполнялись требования теста «Проверка пригодности хроматографической системы». Хроматограмма раствора стандартного образца аскорбиновой кислоты представлена на Фиг. 1.

Хроматографировали испытуемые растворы. Хроматограмма испытуемого раствора представлена на Фиг. 2.

Содержание АК в ЛРП в процентах, в пересчете на абсолютно сухое сырье (Х) вычисляли следующим образом:

где Х₁, Х₂, Х_3, Х₄, Х₅, Х_6, Х₇, Х₈, Х₉ - содержание АК в испытуемом образце ЛРП; в расчетах использовали средние значения площадей пиков.

Результаты количественного определения АК в испытуемом образце ЛРП «Плоды шиповника» приведены в Таблице 1.

Таблица 1 Определяемая величина Стандартный образец аскорбиновой кислоты Испытуемый образец Аскорбиновая кислота Площадь пика 1224,536
1224,981
1224,556
1224,502
1224,951
1225,362
Среднее значение: 1224,815 1. 1441,762
1441,531 2. 1432,588
1432,580 3. 1425,393
1425,112 Содержание аскорбиновой кислоты, % 0,2076
0,2063
0,2060 Среднее значение содержания аскорбиновой кислоты, % 0,2066 RSD, % 0,41 Площадь пика 1817,011
1817,115
1817,364
1817,915
1816,531
1817,025
Среднее значение:
1817,16 4. 1715,711
1716,099 5. 1720,694
1720,624 6. 1725,607
1725,769 Содержание аскорбиновой кислоты, % 0,2067
0,2076
0,2080 Среднее значение содержания аскорбиновой кислоты, % 0,2074 RSD, % 0,32 Площадь пика 2439,165
2440,559
2439,264
2441,097
2441,655
2439,851
Среднее значение:
2440,265 7. 2902,664
2900,473 8. 2891,829
2889,821 9. 2881,489
2879,519 Содержание аскорбиновой кислоты, % 0,2073
0,2066
0,2058 Среднее значение содержания аскорбиновой кислоты, % 0,2066 RSD, % 0,36

Содержание АК в испытуемом образце лекарственном растительном препарате «Шиповника плоды» (АО «Красногорсклексредства») составило 0,2066 % (RSD = 0,41%), 0,2074 % (RSD = 0,32%), 0,2066 (RSD = 0,36%).

Определение содержания АК в идентичных образцах плодов шиповника титриметрическими методиками показало завышенные результаты по сравнению с методикой ВЭЖХ (Таблица 2). Необходимо отметить, что при титровании окрашенных водных извлечений нечеткий интервал перехода окраски приводил к затруднению установки конечной точки титрования, что в свою очередь приводило к увеличению погрешности измерений и сказывалось соответствующим образом на результатах определения.

Таблица 2 Номер образца Результат, % Йодатометрия Индофенольная методика 1 0,3103 0,3156 2 0,3186 0,3091 3 0,3021 0,3024 Среднее значение содержания аскорбиновой кислоты, % 0,3103 0,3090 RSD, % 2,66 2,14

Затем стандартный раствор и испытуемые растворы хроматографировали в условиях ВЭЖХ в соответствии со способами, выбранными за аналог и прототип. Полученные результаты в сравнении с результатами заявляемого изобретения приведены в таблице 3.

Таблица 3 № определения Результаты, % Заявляемый метод Прототип Аналог 1 0,2076 0,2067 0,2073 0,2016 0,1812 2 0,2063 0,2076 0,2066 0,2031 0,1755 3 0,2060 0,2080 0,2058 0,2059 0,1863 Среднее значение 0,2066 0,2074 0,2065 0,2053 0,181 RSD, % 0,41 0,32 0,36 1,07 2,98

Таким образом, данный пример показывает, что заявляемый способ позволяет получать результаты количественного определения, достоверно отражающие количественное содержание аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном препарате, что подтверждается другими способами ВЭЖХ определения. Титриметрические способы дают завышенные результаты.

Пример 2. Влияние выбора экстрагента на полноту извлечения аскорбиновой кислоты из лекарственного растительного препарата и стабильность растворов аскорбиновой кислоты в процессе испытания.

Сравнили эффективность экстрагентов, используемых в заявляемом изобретении, в способе, выбранном за прототип и способе аналоге. Выполняли экстракцию АК из модельного раствора АК с известным содержанием АК в условиях заявляемого изобретения, прототипа и аналога с изменением времени экстракции - использовали 4 значения времени: 10, 20, 30 и 240 минут. Полученные растворы затем хроматографировали в хроматографических условиях заявляемого изобретения. Полученные результаты анализировали относительно известного содержания АК (Таблица 4).

Таблица 4 Время экстракции, мин Содержание аскорбиновой кислоты относительно известного значения в модельном растворе, % Заявляемое изобретение
(0,01 М раствор щавелевой кислоты) Прототип
(5% раствор метафосфорной кислоты) Аналог
(50% раствор спирта этилового) 10 95,5 94,2 90,1 20 99,8 98,7 92,6 30 99,7 98,5 93,7 240 100,0 97,8 83,3

Затем выполнили экстракцию АК из модельного раствора АК с известным содержанием АК в условиях заявляемого изобретения, прототипа и аналога. В этот раз строго соблюдали время экстракции, полученные растворы хроматографировали в хроматографических условиях заявляемого изобретения с разницей во времени хранения 1 час. На время проведения эксперимента, полученные растворы хранились в хроматографических виалах в самплере пробоотборника при температуре 4°С.

Таблица 5 Время хранения, часы Содержание аскорбиновой кислоты относительно известного значения в модельном растворе, % Согласно заявляемому способу
(0,01 М раствор щавелевой кислоты) Согласно способу, выбранному за прототип
(5% раствор метафосфорной кислоты) Согласно способу аналогу
(50% раствор спирта этилового) 1 99,7 98,5 92,6 2 100 98,6 90,5 3 100 98,4 83,4 4 99,6 98,4 80,5 5 99,5 93,0 78,6 6 99,7 93,5 77,6 7 99,7 92,8 76,4 8 99,6 92,4 65,8

Максимальное извлечение АК наблюдали при использовании 0,01 М раствора щавелевой кислоты. Колебания определяемой концентрации растворов находились в пределах допустимой погрешности заявленного способа. Раствор метафосфорной кислоты 5%, используемый в прототипе, также достаточно эффективен как экстрагент. Однако исходные концентрации АК сохраняются в течение лишь 4 часов, этого времени недостаточно для проведения полного комплекса хроматографических исследований. Аналогичный способ, где экстрагентом является 50% раствор спирта этилового, показал наихудшие результаты, как по экстракции АК, так и по стабильности растворов АК в процессе испытания и хранения.

Таким образом, данный пример подтверждает, что заявляемый способ позволяет обеспечить лучшие результаты экстракции АК из ЛРП и стабилизировать испытуемые растворы в течение 8 часов, что достаточно для проведения полного комплекса хроматографических испытаний.

Пример 3. Использование подвижной фазы определенного качественного и количественного состава и градиентных условий элюирования.

Извлечения из ЛРП содержат большое количество биологически активных и балластных веществ, которые могут мешать количественному определению АК, а также приводить к постепенному элюированию интенсивных пиков компонентов уже проанализированных проб и их накладыванию на рабочие хроматограммы.

Выполнили испытания по определению количественного содержания аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном препарате «Плоды шиповника» в условиях заявляемого изобретения, прототипа и аналога. До и после каждого хроматографического вкола испытуемого раствора осуществляли хроматографический вкол растворителя, полученные хроматограммы сравнивали на предмет наличия посторонних пиков.

Как видно на Фиг. 3, 4 (прототип), 5, 6 (аналог) и 7 (заявляемое изобретение), экстракционные и хроматографические условия прототипа и аналога приводят к контаминации хроматографических вколов, непосредственно следующих за хроматографическими вколами испытуемых растворов. При этом условия заявляемого изобретения позволяют полностью избежать данной проблемы.

Данный пример показывает, что заявляемый способ позволяет избежать контаминации хроматограмм посторонними пиками, препятствующими достоверному определению.

Таким образом, созданный авторами способ количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах позволяет повысить чувствительность, точность и селективность количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах. Способ количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах включает этап пробоподготовки, хроматографирование методом ВЭЖХ и математический расчет количественного содержания аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном препарате. Для приготовления испытуемого раствора 2,5-5 г лекарственного растительного препарата измельчают до размера частиц менее 1 мм и смешивают с 100 мл 0,01 М щавелевой кислоты, центрифугируют со скоростью 5000 об/мин в течение 5 минут и фильтруют. Для приготовления стандартного раствора 10 мг - 20 мг стандартного образца аскорбиновой кислоты растворяют в 50 мл 0,01 М щавелевой кислоты, затем 5 мл полученного раствора переносят в мерную колбу темного стекла объемом 25 мл, доводят объем раствора 0,01 М щавелевой кислоты до метки. Хроматографируют образец в градиентный режим. Рассчитывают количество аскорбиновой кислоты в испытуемом лекарственном растительном препарате. Техническим результатом является повышение чувствительности, точности и селективности количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах. 7 ил., 5 табл., 3 пр.

Способ количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных растительных препаратах, включающий этап пробоподготовки, хроматографирование методом ВЭЖХ и математический расчет количественного содержания аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном препарате, отличающийся тем, что для приготовления испытуемого раствора 2,5-5 г лекарственного растительного препарата измельчают до размера частиц менее 1 мм и смешивают с 100 мл 0,01 М щавелевой кислоты, центрифугируют со скоростью 5000 об/мин в течение 5 минут и фильтруют; для приготовления стандартного раствора 10 мг - 20 мг стандартного образца аскорбиновой кислоты растворяют в 50 мл 0,01 М щавелевой кислоты, затем 5 мл полученного раствора переносят в мерную колбу темного стекла объемом 25 мл, доводят объем раствора 0,01 М щавелевой кислоты до метки; этап хроматографирования включает градиентный режим элюирования; расчет количества аскорбиновой кислоты в испытуемом лекарственном растительном препарате осуществляют по формуле:

, где:

S – площадь пиков аскорбиновой кислоты на хроматограмме раствора испытуемого образца,

а₀ – навеска стандартного образца аскорбиновой кислоты, г,

Р – содержание основного вещества в стандартном образце аскорбиновой кислоты, %,

S₀ – площадь пика аскорбиновой кислоты на хроматограмме раствора стандартного образца,

W – содержание влаги в лекарственных растительных препаратах, %,

а – навеска испытуемого лекарственного растительного препарата, г.