БИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ АКТИВАЦИИ СПОР ЧЕРНОГО ТРЮФЕЛЯ Российский патент 2025 года по МПК A01G18/00 

Настоящее изобретение относится к агротехнологиям и сельскому хозяйству и может быть использовано для получения и подготовки посевного материала трюфелевых грибов.

Трюфелевые грибы являются сумчатыми грибами, плодовые тела которых образуются в почве или в листовой подстилке. Данные грибы находятся в тесных симбиотических ассоциациях с растениями. Трюфелевые грибы требуют специфичных условий для своего роста и развития. Грибы предпочитают субтропические и умеренные климаты, а также почвы с определенным содержанием минералов и уровнем влажности. Это делает трюфели редким и ценным продуктом. Из-за высокой стоимости и ограниченности их доступности, трюфели стали предметом интереса для исследований и разработок в области сельского хозяйства и грибоводства. Большое количество исследований направлено на оптимизацию и улучшение способов выращивания трюфелей, чтобы сделать грибы более доступными, а способ культивации быстрым и коммерчески выгодным. Культивации трюфеля посвящен ряд научных статей и определен сложный характер культивирования грибов, в т.ч. выделения чистых культур трюфелевых грибов ввиду развитых симбиотических отношений с другими микроскопическими и беспозвоночными организмами. Наличие дополнительной микробиоты в составе плодовых тел грибов и симбиотический характер образа жизни ведут к сложности получения мицелия грибов и культивации грибов в контролируемых условиях [Ori, 2019].

Особую актуальность разработке придает тот факт, что в настоящее время происходит сокращение числа дикорастущих трюфелей. В посевном материале коммерческого мицелия трюфеля, реализуемого в России, зачастую отмечается отсутствие трюфелевых грибов (собственные наблюдения, основанные на метагеномном анализе коммерческих образцов, 2022).

Одним из важных условий для размножения трюфелевых грибов в дикой природе является высвобождение их спор из асков (сумок), которые служат защитной оболочкой от воздействия негативных факторов. В асках происходит созревание спор. По мере созревания, трюфелевые грибы выделяют волатильные (летучие) молекулы и аттрактанты (например, андростерол и др.), которые привлекают животных. Последние потребляют грибы в пищу и с помощью ряда пищеварительных ферментов разрушают защитные оболочки спор, после чего распространяют споры в среде обитания. Зрелые споры без сумок быстрее прорастают и эффективнее образуют микоризу, что необходимо для их эффективного выращивания. Однако такой способ распространения спор трюфелевых грибов во многом зависит от перемещения животных и не позволяет обеспечить доступный и быстрый поиск грибов.

Из уровня техники известно, что существует несколько способов культивации трюфелевых грибов и получения биопрепаратов для растений на основе спор трюфелевых грибов, прошедших через пищеварительную систему различных животных. Известно, что ферментация живыми организмами используется для улучшения свойств продуктов народного потребления.

Одним из успешных примеров биологической ферментации для улучшения свойств продуктов народного потребления является производство кофе Лювак/ Копи - -Лувак и т.п. Данный сорт кофе получают из кофейных зерен, пройденных через пищеварительный тракт позвоночных животных, таких как, циветты (патент US 11344043 В2), слоны (патент KR 102093996 B1) и суматранские кошки (патент CN 106509288 A). При помощи гидролитических ферментов желудочно-кишечного тракта расщепляются оболочки кофейных зерен, в результате чего происходит высвобождение ароматических соединений, которые придают кофе его характерный вкус и аромат. Помимо этого, некоторые соединения и кислоты, придающие кофе горький вкус, распадаются, что делает кофе более мягким и сладким. Недостатком таких методов является дорогостоящее содержание и уход за животными, поскольку требуется использование специально оборудованных ферм и создание оптимальных условий для их проживания, в частности, просторные вольеры, обеспечивающие достаточное пространство для передвижения, и использование большого количества кормовой базы.

Известен патент CN 115074268 A (Китай) «Biological agent for promoting synthesis of truffle mycorrhiza as well as preparation method and application of biological agent. Перевод: Биологический агент для стимуляции синтеза трюфельной микоризы, а также способ его приготовления и применения», где к посевному материалу измельченных трюфелевых грибов добавляли бактериальный штамм Burkholderia sediminicola. В патенте описано, Цит. (в переводе) «уровень микоризного заражения значительно увеличивается, стоимость микоризного синтеза трюфеля значительно снижается, период времени микоризного синтеза сокращается, а качество микоризных саженцев трюфеля улучшается». Главным недостатком такого способа является то, что бактериальные штаммы дикого типа имеют нестабильный геном, и закладка больших территорий с трюфелевыми грибами в естественной среде может пойти по непрогнозируемому сценарию при мутации данных симбиотических организмов.

Также известен ряд патентов, описывающих способы инокуляции сеянцев различных древесных и кустарниковых видов растений. В патенте CN 101328464 (Китай) «Synthetic method of truffle and bacteriorhiza. Перевод: Синтетический способ получения трюфелей и бактериоризы» описан метод образования микоризы с китайской сосной. В другом патенте CN 108029449 (Китай) «Method for Yunnan oak seed seedling inoculation with Indian truffle. Перевод: Способ инокуляции сеянцев дуба юньнань индийским трюфелем», раскрывается способ инокуляции проростков семян дуба индийским трюфелем. Недостатком таких способов является использование дополнительных растений для достижения результата, что также ведет и к удорожанию технологии культивирования грибов и не решает проблему зависимости грибов от растений, а гибель растения приведет и к гибели всей грибницы. Использование описанных методов может затруднить надлежащий контроль качества выращиваемых трюфелей, поскольку они могут зависеть от качества субстрата, процессов симбиотического развития и условий выращивания, которые могут быть достаточно трудоемкими для поддержания и контроля.

Наиболее близким изобретением является способ получение биоудобрения из спор трюфелевых грибов, отличающийся тем, что для производства биоудобрения грибы скармливают животным (кроликам, мышам, дождевым червям и др.), а их испражнения и останки собирают и используют для внесения в корневую зону растений с целью формирования микоризы, патент ES 2944619 А1 (Испания) («Biotechnological procedure for the manufacture of mycorrhizal compounds. Перевод: Биотехнологическая процедура производства микоризных соединений»). При этом, изобретение направлено именно на получение биоудобрения, а не споровой суспензии трюфелевых грибов для их проращивания. Описанное изобретение предполагает получение неких "микоризных соединений". В патенте отсутствуют примеры достижения данного изобретения и необоснованно постулируется, что, Цит. "…способ хорошо известен, очевиден и не требует графического подтверждения". В упоминаемом патенте отсутствуют примеры использования и данные, подтверждающие эффективность использования животных для ферментации сумок (асков) трюфелевых грибов. Прохождение трюфелевых спор через пищеварительный тракт млекопитающих может увеличить споропотери и длительность ферментации. Патент не может быть реализован на практике ввиду необходимости фактической организации массовых захоронений животных в корневой зоне растений. Высоко вероятно распространение инфекционных заболеваний и ухудшение эпизоотических ситуаций в регионах внедрения патента. При использовании в этих целях дождевых червей также есть существенный недостаток, заключающийся в малом количестве получаемого спорового материала и невозможности при описанном подходе определить количество и степень потребленной пищи червями, качество получаемых спор. Не представлены и способы отделения спор трюфелей от кормового субстрата.

В рамках проведенных исследований установлено, что способ предварительной работы со спорами трюфелевых грибов является значимым, поскольку методология классических микробиологических или подходов микроклонального размножения является неприменимой для работы с трюфелевыми грибами. Это проявляется в прорастании микрофлоры, обитающей внутри трюфелевых грибов, до момента набухания спор и прорастания спор трюфелей в культуре.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа активации спор черных трюфелевых грибов посредством ферментативного расщепления сумок (асков) для оптимизации способов получения чистых культур и их выращивания.

Технический результат - улучшение качества посадочного материала черных трюфелевых грибов, получение активированной суспензии спор, пригодной для размножения. Это достигается тем, что что споры трюфелевых грибов получают посредством смешивания измельченных плодовых тел трюфелевых грибов с картофельным пюре в соотношении 1 к 5, полученной субстанцией кормят брюхоногих моллюсков родов Achatina sp., либо Helix sp., в результате чего происходит ферментация сумок (асков) трюфелей в пищеварительном тракте брюхоногих моллюсков, обеспечивается повреждение защитной оболочки сумок (асков) и высвобождение спор, которые собирают в составе экскрементов животных, очищают посредством многократной отмывки споровой суспензии водой и 3% раствором перекиси водорода, проращивают на твердых питательных микробиологических средах, пригодных для культивирования грибов, при температурах от +23°С до +25°С на протяжении не менее чем 10 суток в условиях повышенной влажности на уровне 50-85%.

Разработанный способ обладает рядом преимуществ ввиду получения споровой суспензии трюфелевых грибов за счет следующих факторов:

- брюхоногие моллюски являются доступными и широко распространенными организмами. Содержание моллюсков не требует использования больших площадей и особого ухода, что позволяет снизить затраты на получение активированной споровой суспензии и дальнейшей культивации трюфелевых грибов;

- биологический способ активации спор позволяет получить значительное количество спор трюфелевых грибов за короткий промежуток времени, измерить и нормировать объем инокулята, требуемый на растение;

- разработанный биологический способ активации спор является экологически безопасным и устойчивым, поскольку не требует использования редких или труднодоступных химических реактивов, экстрактов редких растений, вытяжек, выжимок и др., что снижает его воздействие на окружающую среду.

- способ обеспечивает контролируемое производство активированных спор и не предполагает распространение каких-либо патогенных агентов, полученных в результате гниения, естественной гибели, или захоронений.

Способ иллюстрируется следующими чертежами:

Фиг. 1 - Микрофотографии асков (сумок) трюфеля до (А) и после ферментации брюхоногими моллюсками рода Achatina sp. (Б) и Helix sp. до (В).

Фиг. 2 - Микрофотография застывшей капли агара с инокулированной суспензией спор трюфелевого гриба после ферментации асков брюхоногими моллюсками рода Achatina sp. на 7-е (А) и 14-е сутки (Б) проращивания в термостатируемых условиях.

Пример осуществления изобретения.

Для достижения технического результата отбирают взрослых, здоровых и активных брюхоногих моллюсков родов Achatina sp.либо Helix sp.(виноградная улитка) в возрасте не менее трех месяцев и кормят их только вареным картофелем в течение семи дней для полного очищения пищеварительного тракта от пищи и растительных полимеров неясной этиологии. В рамках регулярных санитарно-гигиенических мероприятий моллюсков моют теплой водой и содержат в аквариумах либо пластиковых контейнерах. Контейнер, в который помещают моллюсков, предварительно стерилизуют либо очищают с применением горячей воды и моющих средств. Почву заменяют на предварительно стерилизованный стерильный мат из кокосового волокна, что необходимо для отбора экскрементов без грунта. Также для моллюсков обеспечивается постоянный доступ к свежей (чистой либо стерильной) воде и естественная циркуляция воздуха. Перед экспериментом моллюскам обеспечивают очищение кишечника.

Зрелое (плотное, упругое) плодовое тело черного трюфеля рода Tuber измельчают с помощью бленд ера и смешивают с вареным картофелем в соотношении 1:5 (трюфель:картофель). Кормление моллюсков трюфелем, смешанным с картофельным пюре в соотношении 1:10; 1:100 приводит к сложности выявления спор трюфелей ввиду их низкой концентрации. Кормление моллюсков чистым трюфелем приводит к тому, что моллюск не потребляет грибы и голодает. Экскременты моллюсков собирают, и не менее 5 раз отмывают в стерильной дистиллированной воде, чередуя отмывку центрифугированием при 3000 об/мин и удалением супернатанта. На заключительном этапе споровую суспензию ресуспендируют в растворе 3% перекиси водорода в течение 1 минуты и промывают трехкратным объемом стерильной воды, что приводит к получению высокоочищенной стерильной суспензии спор трюфелевых грибов.

Далее в ходе работ суспензию спор трюфеля инокулируют на твердую (агаризованную) питательную среду, пригодную для культивирования грибов (например, среда Сабуро, Гетчинсона, КГА, Чапека, сусло-агара). Как показали практические испытания, состав среды не является определяющим для проращивания спор. В рамках проведенных работ выявлен рост грибов на всех перечисленных выше микробиологических средах. Споры проращивают на покровных стеклах с питательной средой для возможности мониторинга проращивания спор. Для этого подготавливают предметное стекло, очищая его от пыли и обезжиривая в течение 15-20 минут в 70% растворе спирта. Стекло промывают дистиллированной водой и сушат, после чего стерилизуют. Далее каплю теплой агаризованной питательной среды наносят на предметные стекла, дожидаются ее полимеризации и в стерильных условиях инокулируют полученный гомогенат из спор. Предметные стекла помещают в стерильные чашки Петри в термостатируемые условия (от +18°С до +30°С) на две недели для того, чтобы споры начали прорастать и образовывать мицелий. Предметные стекла укладывают на влажную губку, обеспечивающую достаточную повышенную влажность (на уровне 50-85%). В это же время проводят микроскопирование спор трюфеля сразу после гомогенизации, а также на 7, 10 и 14 сутки. Инокулированную споровую суспензию микроскопируют, а изменения в морфологии спор и асков регистрируют с помощью светового микроскопа, например, Микромед 2 (вар. 3-20).

На фиг. 1. приведены микрофотографии асков (сумок) трюфелевых грибов до (А) и после ферментации трюфелевых грибов рода Tuber sp.с помощью моллюсков родов Achatina sp. (Б) и Helix sp. (В). Так, в экскрементах моллюсков детектируют одиночные споры трюфелевых грибов. Количество одиночных спор, полученных таким способом увеличивается с 7±2% до 90±4%. Показано, что под воздействием ферментов пищеварительного тракта брюхоногих моллюсков происходит разрушение асков и высвобождение спор в пищеварительном тракте брюхоногих моллюсков. Также обнаружено, что споры набухают во время ферментации в пищеварительном тракте моллюсков на 20±7%.

На фиг. 2. представлены микрофотографии застывшей капли твердой питательной среды Сабуро с инокулированной суспензией спор трюфелевого гриба на 7-е (А) и 14-е (Б) сутки проращивания в термостатированных условиях (+23°С -+25°С). Подобные изображения получены и для питательной среды Гетчинсона, КГА, Чапека и сусло-агара, что указывает на то, что состав среды не является определяющим для проращивания спор. На практике обнаружено, что споры по истечении одной недели не образовывают мицелий. Споры сохраняются объемными и набухшими до 10 суток, и уже по истечению двух недель формируют грибные гифы из спор трюфеля. Споры, проращиваемые на предметных стеклах, инкубируемых при температурах 18-22°С, набухают в объеме на 10-20% к 14 сут. эксперимента, но не прорастают (следов прорастания спор не выявлено). Споры, проращиваемые на предметных стеклах, инкубируемых при температурах 26-30°С, не изменяют своей морфологии.

Список литературы:

1. Ori F. Truffles and morels: two different evolutionary strategies of fungal-plant interactions in the Pezizales // Plant microbe interface. - 2019. - P. 69-93.

2. Патент US 11344043 B2 - «Method for producing fermented coffee using enteric bacteria of Kopi Luwak». Author: Y. Y. Song.

3. Патент KR102093996B1 - «Method for processing coffee bean using Elephas Maximus». Author: W. H. Kang.

4. Патент CN 106509288 A - «Making method of Kopi Luwak coffee». Author: Y. Z. Cai.

5. Патент KZ23874A4 - «Способ и устройство для получения биомассы трюфеля и других съедобных грибов». Авторы: Р. К. Блиева, Д. Н. Козыбаева, Е. Н. Блиев, Д. Н. Блиев, Ж. Б. Сулейменова.

6. Патент CN 115074268 A - «Biological agent for promoting synthesis of truffle mycorrhiza as well as preparation method and application of biological agent». Authors: Wan S., Yu F., Liu M., Zhao J., Wang R., Huang L., Liu P.

7. Патент CN 108934768 B - «Black spore truffle inoculation microbial inoculum, treatment method thereof and mycorrhiza cultivation method». Authors: L. Xiaolin, Y. Lei, Z. Jiekang, Z. Jing, W. Di, H. Xiaolan, C. Ying, M. Renyun, T. Wei, W. Yong, J. Lin, P. Weihong, H. Zhonggan, G. Bingcheng, Z. Bo, T.Hao.

8. Патент UA 102123 U - «Споровый грибной концентрат "Микотаб"». Авторы: Т.З. Матюхiна, В П. Мацькiв, I.Б. Шипак, А..Д., Ю. В. Клименко.

9. Патент UA 104215U - «Споровий грибний концентрат "Мжотаб агро"». Авторы: Т.З. Матюхiна, В. П. Мацькiв, I. Б. Шипак, А..Д., Ю. В. Клименко.

10. Патент UA 125722 U - «Споровий грибний концентрат "Mikoagri"». Авторы: Т.З. Матюхiна.

11. Патент UA 126556 U - «Споровий грибний концентрат "Fungiradix"». Авторы: Т.З. Матюхiна.

12. Патент FR 2867019 - «Tuber Melanosporum Vittad. by association of two mycorrhizing fungi, mixes fungi and seed with chalky soil, and awaits symbiotic development)). Authors: V. Francois, V. Pascale, C. Andre.

13. Патент CN 101328464 - «Synthetic method of truffle and bacteriorhiza». Authors: L. Peigui, W. Xianghua, Y. Fuqiang, D. Xiaojuan, C. Juan, G. Liying, T. Xiaofei.

14. Патент CN 108029449 - «Method for Yunnan oak seed seedling inoculation with Indian truffle». Authors: Z. Xiaolei, L. Shuhong, S. Kaimei, W. Yun, L. Yongjun.

15. Патент TW 202038705 A- «Preparation method of truffle strain liquid and cultivation method of truffle mycorrhizal seedling)). Authors: Chen С.M., Huang H. W., Lin Т. C, Lin S. B.

16. Патент KZ 23874 A4 - «Способ и устройство для получения биомассы трюфеля и других съедобных грибов». Авторы: Блиева Р.К., Козыбаева Д.Н., Сулейменова Ж.Б., Блиев Б.Н., Блиев Д.Н.

17. Патент ES 2944619 A1 - «Procedimiento biotecnologico de de compuestos micorrizantes». Authors: B. Moreno-Arroyo, G. Alonso-Pedrosa.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Предложен биологический способ активации спор черного трюфеля, согласно которому споры трюфелевых грибов получают посредством смешивания измельченных плодовых тел трюфелевых грибов рода Tuber sp. с картофельным пюре. Полученной субстанцией кормят брюхоногих моллюсков родов Achatina sp. либо Helix sp., в результате чего происходит ферментация асков трюфелей в пищеварительном тракте брюхоногих моллюсков, обеспечивается повреждение защитной оболочки асков и высвобождение спор, которые собирают в составе экскрементов животных, очищают посредством их отмывки водой и 3% раствором перекиси водорода. Проращивают на твердых питательных микробиологических средах при температурах от +23°С до +25°С на протяжении не менее чем 10 суток в условиях повышенной влажности 50-85%. Изобретение обеспечивает активацию прорастания спор. 2 ил.

Биологический способ активации спор черного трюфеля, характеризующийся тем, что споры трюфелевых грибов получают посредством смешивания измельченных плодовых тел трюфелевых грибов рода Tuber sp. с картофельным пюре в соотношении 1 к 5, полученной субстанцией кормят брюхоногих моллюсков родов Achatina sp. либо Helix sp., в результате чего происходит ферментация асков трюфелей в пищеварительном тракте брюхоногих моллюсков, обеспечивается повреждение защитной оболочки асков и высвобождение спор, которые собирают в составе экскрементов животных, очищают посредством многократной отмывки споровой суспензии водой и 3% раствором перекиси водорода, проращивают на твердых питательных микробиологических средах, пригодных для культивирования грибов, при температурах от +23°С до +25°С на протяжении не менее чем 10 суток в условиях повышенной влажности 50-85%.