СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОДНОЯДЕРНЫХ СПОР ШАМПИНЬОНА Советский патент 1996 года по МПК C12N3/00 C12N1/14 

Изобретение относится и способам получения биологического материала и может быть применено в растениеводстве (грибоводстве), биотехнологии, пищевой и микробиологической промышленности.

Цель изобретения упрощение способа и повышение выхода одноядерных спор.

Цель достигается тем, что берут плодовое тело шампиньона на стадии зрелого частного покрывала и получают односуточный споровый отпечаток. Использование более старых плодовых тел недопустимо, так как при созревании спор на базидии ядра митотически делятся и почти все споры становятся многоядерными. Делают смыв спор водой в количестве 1-2 мл на один отпечаток. Полученную суспензию наслаивают на раствор сахарозы с градиентом 4-х слоев снизу: 65-70, 55-60, 45-50, 25-30 весовых процента. Далее смесь центрифугируют при 2900-3000 об/мин при температуре 0-2^oС 15-20 мин, затем отделяют верхнюю водную фракцию, содержащую одноядерные споры, и окрашивают ядра в спорах азур-эозином после обесцвечивания пигмента спор в растворе перекиси водорода.

Предлагаемый способ является упрощенным, так как не имеет трудоемкой операции изолирования спор с четырехспоровых базидий при использовании микроманипулятора.

Из таблицы видно, что предлагаемый способ позволяет увеличить количество одноядерных спор в исходном материале в пять-шесть раз, что позволяет изолировать на 104 одноядерных спор больше, чем в прототипе.

П р и м е р 1. Берут 10 плодовых тел шампиньона на стадии зрелого частного покрывала и обрабатывают каждый гриб следующим образом: сухой ватой спихивают остатки земли; подрезают ножку так, чтобы она выступала за пределы шляпки на 1 см; скальпелем снимают частное покрывало и помещают плодовое тело на дно чашки Петри ( диаметр 10 см). На поверхность шляпки помещают матрасик из ваты, по размерам превышающий диаметр чашки, и неплотно закрывают чашку Петри крышкой. Чашки помещают в термостате температурой 24^oС на 24 ч. После чего плодовое тело и вату удаляют и делают смыв спор водой в количестве 1 мл на один отпечаток. Каждую споровую суспензию наслаивают на охлажденный при 4^oС раствор сахарозы с градиентом 4-х слоев снизу: 65, 55, 45, 25 вес. Слои сахарозы наслаивают последовательно снизу вверх по 1 мл автоматической пипеткой в стеклянные центрифужные пробирки. Растворы центрифугируют при 2900 об/мин при 0^oС 15 мин на центрифуге "К-70" с крестообразным ротором. Затем из каждой центрифужной пробирки осторожно отделяют автоматической пипеткой 1 мл верхней водной фракции и переносят в чистую пробирку. В каждую пробу (0,5 мл), содержащую споры, добавляют перекись водорода до конечной концентрации 7,5% Полученные растворы прогревают при 60^oС в течение 10 мин. Дважды отмывают споры центрифугированием (режим тот же) в воде и наносят на предметное стекло тонким слоем. После подсыхания препарата, его фиксируют в жидкости Карнуа и окрашивают по методу Романовского-Гимза азур-эозином с предварительным гидролизом в 1 н. HCl. Препараты микроскопируют и подсчитывают споры, содержащие одно и больше ядер. Получают 10 споровых суспензий, содержащих в среднем 50% одноядерных спор от общего числа спор в исходной споровой суспензии.

П р и м е р 2. Получают 10 односуточных споровых отпечатков (см.пример 1) и делают смыв спор водой в количестве 2 мл на один отпечаток. Каждую споровую суспензию наслаивают на раствор сахарозы с градиентом 4-х слоев снизу: 70, 60, 50, 30 вес. Растворы центрифугируют при 3000 об/мин при 2^oС 20 мин на центрифуге "К-70". Осторожно отделяют 2 мл верхней водной фракции из каждой пробирки для центрифугирования и переносят в чистые пробирки. Дальнейшие операции аналогичны примеру 1. Получают 10 споровых суспензий, содержащих в среднем 65% одноядерных спор от общего количества спор в исходной споровой суспензии.

П р и м е р 3. Получают 10 односуточных споровых отпечатков (см.пример 1 ) и делают смыв спор водой в количестве 0,5 мл на один споровый отпечаток. Каждую споровую суспензию наслаивают на раствор сахарозы с градиентом четырех слоев снизу: 60, 50, 40, 20 вес.). Растворы центрифугируют при 2000 об/мин при -1^oС 10 мин (центрифуга та же). Осторожно отделяют 0,5 мл верхней водной фракции из каждой пробирки для центрифугирования. Дальнейшие операции аналогичны примеру 1. Получают 10 споровых суспензий, содержащих в среднем 10% одноядерных спор, то есть то же количество, что в исходной суспензии.

П р и м е р 4. Получают 10 односуточных споровых отпечатков (см. пример 1) и делают смыв спор водой в количестве 2,5 мл на один споровый отпечаток. Каждую споровую суспензию наслаивают на раствор сахарозы с градиентом 4-х слоев снизу: 75,65, 55, 35 вес. растворы центрифугируют при 3500 об/мин при 3^oС 25 мин (центрифуга та же). Осторожно отделяют 2,5 мл верхней водной фракции из каждой пробирки. Дальнейшие операции аналогичны примеру 1. В полученных 10 споровых суспензиях споры отсутствуют, так как они попали в нижние слои сахарозы. ТТТ1

Использование: биотехнология, грибоводство, пищевая и микробиологическая промышленности, при получении одноядерных спор шампиньона. Сущность изобретения: из плодового тела шампиньона на стадии зрелого частного покрывала изолируют споры, готовят отпечаток, для чего на поверхность шляпки без частного покрывала помещают матрасик из ваты и помещают в термостат с температурой 24^oС на 24 ч. Затем с полученного отпечатка делают смыв спор водой. Полученную таким образом споровую суспензию наслаивают на охлажденный раствор сахарозы с градиентом 4-х слоев снизу: 65-70, 55-60, 45-50 и 25-30%, раствор центрифугируют при скорости вращения ротора 2900-3000 об/мин при температуре 0-2^oС в течение 15-20 мин, отделяют верхнюю фракцию, содержащую одноядерные споры, окрашивают споры по методу Романовского-Гимза, микроскопируют и подсчитывают количество спор. 1 табл.

Способ получения одноядерных спор шампиньона путем изолирования спор из плодового тела, приготовления отпечатка и суспензии спор с отпечатка с последующим микроскопированием, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода спор, изолируют споры на стадии зрелого частного покрывала плодового тела, получают односуточный споровый отпечаток, полученную суспензию центрифугируют в градиенте сахарозы в концентрации (мас.): 65-70, 55-60, 45-50 и 25-30 при скорости вращения ротора центрифуги 2900-3000 об/мин, температуре 0-2°С в течение 15-20 мин, затем отделяют верхнюю фракцию, содержащую одноядерные споры, окрашивают их ядра и подсчитывают число одноядерных спор.