Способ получения посевного материала для культивирования грибов рода ASpeRGILLUS, продуцирующих экзоферменты Советский патент 1989 года по МПК C12N13/00 C12N3/00 C12N13/00 C12R1/66 

,Изобретение относится к биотехно- , а именно к способу получения фе()ментов с помощью микромицетов - грибов рода Aspergillus,

Цель изобретения - повышение вы- хоДа посевного материала, сокращение времени культивирования, повышение ак|гивности ферментов.

I Твердую .среду (например, сусло- ip) засевают культурой гриба рода jergillus, выращенной на сусло-агаи культивирование проводят при 1учении светом люминесцентных ламп -65 с ,

:тью освещения I 3,8-4,6 Вт/м

аг As ре об ЛК но

при 27-33 С в течение 2-7 суток. Полученный споровьш материал в количе стВе спор в 1 мл среды вносят

ллакс

670 нм и интенсив-

ё

производственную среду и процесс

20

купьтивирования проводят на качалке

течение 3-8 суток. После окончания процесса получают на Третьи сутки вьращиван ия по предлагаемому способу до 2,010 спор/см. Активность фер- ментов составляет, ед/мп: целлобиаз- ная 12,2-17,3J эндоглюканазная 0,38- 0,i42j целлобиогидролазная 0,8-5- 0,|92 мг глюкозы/мл; пектолитйческая 9,15-9,9{ экзоглюкозидазная 0,28-0,31, экзополигалактуроназная 130-140. В зависимости от продолжительности ферме нтации можно осуществлять направлю нный биосинтез ферментов. Например, для А. awamori на пятые сутки культив poвaния получают более высокую цел- лсбиазную активность (10,2 ед/мл), нг шестые - эндоглюканазную (1,8 ед/ /фл)«

I Уменьшение интенсивности светово- гф потока ниже 3,8 Вт/м снижает вы- хфд спорового материала. Например, А. japonicus на четвертые сутки в Фащивания спорового материала вмес- тф (140-145)10 спор получают 90 х X 10 спор при снижении I с 4,2 до 3,5. Вт/м2 .(табл. 1 и 3). Как .след- ctBKe, снижается активность получае- Mi)ix ферментов. Так, например, целло- б)азная активность при .продолжительности ферментации в течение вЬсьми суток при использовании п0севного материала, вьфащенного под действием освещения с I 3,5 Вт/м, н& 30-35% ниже, чем при оптимальном в&рианте воздействия света на посев- нЬй материал.

Увеличение интенсивности светового потока больше 4,6 Вт/м также сни

0 5

0 5 j

0

жает выход спорового материала. Так, увеличение до 4,9 Вт/м уменьшает количество получаемых спор на четвертые сутки выращивания до () х X 10 спор/см вместо (140-145) х . X 10 спор/см2 при I 4,2 Вт/м (табл. 1 и 4). Как следствие, активность целлобиазы снижается на 20-25%. Оптимальной температурой для получения спорового материала является t 27-33 С. Выход спор при. этом для А. japonicus (15-18)- 10 спор на 1 см на вторые сутки культивирования . Повьш1ение и понижение температуры культивирования (выше 33 и ниже 27°С) приводит к снижению выхода спор. Например, при t 20 С на вторые сутки спор не образуется, при t 24-25°С образуется. 3,5-4,5 спор на 1 см, при t 35 3б с на вторые сутки культивирования образуются единичные споры.

Используемые в, настоящее время продуценты ферментов (А, japonicus, А. awamori, А. foetidus) имеют раз- личну.|р скорость процесса спорообразования. В указанных условиях два первых продуцента образуют споры уже на вторые сутки выращивания. У А. foetidus образование спор происходит в более поздние сроки выращивания и споровый материал собирают соответственно на пятые-седьмъ е сутки. Таким образом, указанньй интервал выращивания спорового материала (2- 7 суток) объясняется различной способностью трех взятых: продуцентов к накоплению спорового материала.

В связи с тем, что в известном способе количество посевного материала рассчитано на 1 г воздушно-сухой культуры, а в предлагаемом - в общепринятых в настоящее время единицах - количество спор в 1 см среды, введен коэффициент пересчета, соответствующий 0,01. По известному способу на седьмые сутки культивирования А. awamori получают 5,510 спор на 1 г воздушно-с ухой культуры, что в пересчете на 1 см среды составляет 5,5х X 10 спор. По предлагаемому способу уже на третьи сутки получают 2 х X 10 спор в 1 см среды.

Пример 1. Мицелий А. japonicus (хранится в BKMF, № 2632-Д) выращивают на косяках с сусло-агаром в течение шести суток при t 30 С до обильного спороношения. Для полу

чения посевного материала твердую среду, например сусло-агар или.известную среду, засевают споровой суспензией, смытой с косяков сусло-ага- ра. Выращивание спорового материала проводят при t в течение Четырех суток при постоянном освещении люминесцентными лампами ЛК-65 с Mdkc 6 О И и интенсивноЬтью освещения 4,2 Вт/м.

В качестве контроля используют посевной материал, полученный по известному способу..

Результаты вьфащивания посевного материала по известному способу и по предлагаемому, разница в количестве получаемого посевного материала наглядно представлены в табл. 1,

,Таблица

Пример 2. То же, что пример 1, но для получения посевного материала используют освещение мицелия светом с I 3,5 Вт/м.

Различие в количестве получаемого посевного материала при выращивании по известному способу и по предлагаемому, но при I 3,5 Вт/м, представлено в . 3.

Таблиц а 3

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу пот лучения ферментов с помощью микроми- цетов - грибов рода Aspergillus. Целью изобретения является повьшение выхода посевного материала, сокращение времени культивирования, повышение активности ферментов. Способ заключается в том, что агаризованную среду (например, сусло-агар) засевают культурой гриба рода Aspergillus (например, А. awamori F-122, А. ja- poriieus 2632-D, А. foetidus М-45), выращенной на сусло-ari pe, и культивирование проводят при облучении светом люминесцентных ламп ЛК-65 с AioKc 670 нм и интенсивностью освещения 3,8-4,6 Вт/м при температуре . 27-33°С в течение 2-7 сут. Полученный споровый материал вносят в про- изводственную среду и процесс культивирования проводят на качалке в течение 3-8 сут. По окончании процесса получают на третьи сутки выращивания до 2-10 спор/см. Активность ментов составляет: целлобиазная 12,2- 17,3 ед/мл, эндоглюканазная 0,38- 0,42 ед/мл, целлобиогидролазная 0,85- 0,92 мг глюкозы/мл, пектолитическая 9,5-9,9 ед/мл, экзоглюкозидазная 0,28-0,31 ед/мл , экзополигалактуро- назная 130-140 ед/мл. В зависимости от продолжительности ферментации можно осуществлять направленный биосинтез ферментов. Способ позволяет значительно усилить процесс спорообразования, не увеличивая объема питательной среды, упростить процесс культивирования и повысить активность ферментов. 11 табл. (Л со ел

3-10

П р и м е р 3. То же, что пример 2 но для получения посевного материала (60-55)-Ш (80-90) 10 используют интенсивность светового

30 потока I 4,9 Вт/м.

90-10 (140-145)х X 10

Различие между количеством спор, полученных по известному способу и по предлагаемому, но при I 4,9 Вт/м представлено в табл. 4.

Различие между количеством спор, полученных по известному способу и по предлагаемому, но при I 4,9 Вт/м представлено в табл. 4.

45

Активированный светом трехсуточ- ный посевной мaтepиaлv в количестве

спор/см вносят в жидкую пита- 5Т а б л и ц а 4

тельную производственную среду состава, %: -свекловичный жом 4, шпенич- ныё отруби 0,5; солодовые ростки 1,43; КН,,Р04 0,2; MgSO 0,06; (NH)S04 0,6. Культивирование проводят на качалке, работающей со скоростью 190 об/мин при t -ЗЦ в течение восьми суток.

Различие в активности ферментов в зависимости от получения посевного материала по известному и предлагаемому способам представлено в табл. 2.

Т а 6 л и ц а 2

Таким образом, для получения ожидаемого эффекта (увеличения выхода посевного материала по предлагаемому способу) интенсивность облучения вы- пр едлагаемомдг ращиваемого посевного материала долж- tO, 9 55 лежать в пределах 3,8-4,6 Вт/м.

Пример4. Тоже, что при17,3 : мер 1, но .используют штамм А. awamo- ri (хранится в коллекции культур ВНИИГенетика № F-122) и для засева

Время от начала ферментации, сут

Целлобиазная активность, ед/мл (6), по способу

50

известному

9,0

1з;о

8

J

Различие между количеством спор, полученных по известному способу и по предлагаемому, но при I 4,9 Вт/м представлено в табл. 4.

45

55

50

51449584

питательной среды берут двух- сут4чный ПОСЕВНОЙ материал, облученный :светом.

различие между количеством полу- чаеф11Х спор и активностью ферментов, пол::1 чаёмых по известному и предлага- eMoijjy способам, представлены в табл. 5 и 6 соответственно,

IТаблицаЗ

g Время от начала ферментации J сут

10

2 3

6S 20

(30-60) -10 (100-200) ИО

Вреня от начала фер |{ентации, сут

Из примера 5 следует, что вьфащи- вание посевного материала в условиях освещения не только увеличивает ак. тивность ферментов, но и способствует

,-. направленному биосинтезу. Так, на

Активность, ед/мл (б), 25 пятые сутки ферментации ..можно полуТаблица 6

по способу

известному

предлагав

емоку

7 7 8

Целлобиазная 10,2 12,2 ЭнДоглюканазная 0,19 0,24

0,33

0,42

чить наиболее высокую целлобиазную активность, на шестые - эндоглюканйз ную (табл. 7)«

Примере, То же, что при30 мер 1, но тапько используют кул&туру, гриба А, foetidus (хранится в коллек- 1ЩИ ВНИИГенетика М-43) и для засева жидкой питательной среды берут пяти- суточный посевной материал, облучен35 ный светом, .

р и м е р 5. То же, что приРазличия между количеством получаемых спор и активностью ферментов мер1 4, но для засева производственной получаемых по известному способу и жид{кой питательной среды берут трех- , Q предлагаемому, представлены в табл 8 суч очный посевной материал, активи- 9 соответственно. рбв|анный светом.

|Различие между активностью,фермен-ТаблицаВ

той, полученных по .известному спссо бу и предлагаемому, представлено в

таил. 7.

с

Таблица

Экзоглюкозидазная 0,25 0,31

Эндоглюканаз ная П1 ЬА

55

1,2

Продолжение табл.7

Активность, ед/нл (6), по способу

известному предлагаемому

Целлобиогидролазная, мг глюкозы/мл (7)

0,&6 0,92 Целлобиазная

5,9

10,2

9,0

(0,005-0,007)х (2,0-2,5) х

X 10

10«

6

7

(0,2-0,3)-10 (2,3-3,0)-10 (0,17-0,4)МО (5,5-5,0) 10

Т..-а б л и ц а 9

Эндополигалактуранаэ- ная активность, ед/мл, s по способу

известному

предлагаемому

160

Пример. То же, что пример 6, но для засева жидкой питательной среды берут шестисуточньш посевной материалу , облученный светом.

Различие между активностью ферментов, полученных по известному способу и по предлагаемому, представлено в табл. 10.

Т а б л и ц а 10

ГГектрлитическая 7,0 8,8 Экзополигалактураназная 72,0 78,0

П р и м е р 8, То же, что пример 5, но для засева жидкой производственной среды использзтот семисуточ- ный посевной материал.

Различие между активностью ферментов, полученных по известному способу и по предлагаемому, представлено в табл.11.,

Таблица 11

BHICinii Заказ 6934/28 Тираж 52П

Произв.-пслигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

s

0

Таким образом, по известному способу для А. awamori на шестые-седьмые сутки получают 5, спор на 1 см или 5,510 спор в 1 г воздушно-сухой культуры. По предлагаемому способу уже на третьи сутки получают 2-10 спор/см2, для А. japonicus - на вторые сутки в 5-6 раз больше спорового материала и на /третьи сутки в 1,5-2 раза, для А. foetidus - ..на шестые сутки в 8-11 раз и на седьмые сутки в 14-15 раз.

Предлагаемый способ сокращает сро5 ки вырап(ивания и упрощает процесс

культивирования, так как отсутствует

стадия предварительного подращивания

в течение 12 ч. Кроме того, получают

более активные ферменты и осуществля0 ют .их направленный биосинтез. Например, на пятые сутки ферментации можно получить, используя трехсуточный посевной материал А. awamori, наиболее высокую целлобиазную активность, на

S шестые сутки - эндоглюканазную . У трех грибов - продуцентов экзофермен- тов рода Aspergillus удается значительно усилить процесс спорообразования, не увеличивая объема питатель0 ной среды, и получать большие количества посевного материала, например для А. foetidus в 14-15 раз больше, чем в известном способе, а также упростить процесс культивирования и по5 высить активность экзоферментов.

Формула из

обретения

Способ получения посевного матери- 40 ала для культивирования грибов рода Aspergillus, продуцирующих экзофёр- менты, включающий посев мицелия продуцента на твердую питательную среду и выращивание до обильного спрроноше- 45 ния с последующим активированием/- культуры, отличающийся тем, что, с целью повьш ения выхода посевного материала, сокращения времени культивирования и повьш1ения ак- 50 тивности ферментов, активирование культуры осуществляют облучением светом с -Л 670 нм, интенсивностью освещения 3,8-4,6 Вт/м при температуре 27-33 С в течение 2-7 сут.

Подписное