СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА ЧЕРНОГО ТРЮФЕЛЯ Российский патент 2025 года по МПК A01G18/00 

Настоящее изобретение относится к агротехнологиям и сельскому хозяйству и может быть использовано для получения и подготовки посевного материала трюфелевых грибов.

Трюфелевые грибы являются сумчатыми грибами, плодовые тела которых образуются в почве или в листовой подстилке. Данные грибы находятся в тесных симбиотических ассоциациях с растениями. Трюфелевые грибы требуют специфичных условий для своего роста и развития. Они предпочитают субтропические и умеренные климаты, а также почвы с определенным содержанием минералов и уровнем влажности. Это делает трюфели редким и ценным продуктом. Из-за высокой стоимости и ограниченности их доступности, трюфели стали предметом интереса для исследований и разработок в области сельского хозяйства и грибоводства. Большое количество исследований направлено на оптимизацию и улучшение способов выращивания трюфелей, чтобы сделать грибы более доступными, а способ культивации быстрым и коммерчески выгодным. Культивации трюфеля посвящен ряд научных статей и определен сложный характер культивирования грибов, в т.ч. выделения чистых культур трюфелевых грибов ввиду развитых симбиотических отношений с другими микроскопическими и беспозвоночными организмами. Наличие дополнительной микробиоты в составе плодовых тел грибов и симбиотический характер образа жизни ведут к сложности получения мицелия грибов и культивации грибов в контролируемых условиях [Ori, 2019].

Одним из важных условий для размножения трюфелевых грибов в дикой природе является высвобождение их спор из асков (сумок), которые служат им защитной оболочкой от воздействия негативных факторов. В асках происходит созревание спор. По мере созревания, трюфелевые грибы выделяют волатильные (летучие) молекулы и аттрактанты (например, андростерол и др.), которые привлекают животных. Последние потребляют грибы в пищу и с помощью ряда пищеварительных ферментов разрушают защитные оболочки спор, после чего распространяют споры в среде обитания. Зрелые споры без сумок быстрее прорастают и эффективнее образуют микоризу, что необходимо для их эффективного выращивания. Однако такой способ распространения спор трюфелевых грибов во многом зависит от перемещения животных и не позволяет обеспечить доступный и быстрый поиск грибов.

Из уровня техники известно, что существует несколько способов получения посевного материала и культивации трюфелевых грибов.

Известен патент KZ 23874 A4 (Казахстан) «Способ и устройство для получения биомассы трюфеля и других съедобных грибов», в котором получают белковый продукт и мицелий из трюфелевых грибов. В качестве маточной культуры используют измельченные трюфелевые грибы, которые помещают в ферментер и культивируют до прироста биомассы. В изобретении не приводятся доказательства о росте грибов рода Tuber, а принимая во внимание высокоразвитые симбиотические сообщества [Ori et al., 2019] внутри плодового тела грибов, заявленное изобретение фактически не решает техническую задачу касательно упомянутых грибов.

Известен патент CN 115074268 A (Китай) «Biological agent for promoting synthesis of truffle mycorrhiza as well as preparation method and application of biological agent. Перевод: Биологический агент для стимуляции синтеза трюфельной микоризы, а также способ его приготовления и применения», где к посевному материалу измельченных трюфелевых грибов добавляли бактериальный штамм Burkholderia sediminicola В патенте описано, Цит. (в переводе) «уровень микоризного заражения значительно увеличивается, стоимость микоризного синтеза трюфеля значительно снижается, период времени микоризного синтеза сокращается, а качество микоризных саженцев трюфеля улучшается». Главным недостатком такого способа является то, что бактериальные штаммы дикого типа имеют нестабильный геном, и закладка больших территорий с трюфелевыми грибами в естественной среде может пойти по непрогнозируемому сценарию при мутации данных симбиотических организмов.

Известен патент на изобретение CN 108934768 В (Китай) «Tuber melanosporum inoculant agent, treatment method thereof and cultivation method of mycorrhiza. Перевод: Инокуляционный микробный посевной материал из спор черного трюфеля, метод его обработки и метод культивирования микоризы», где описано, что для активации спор Tuber melanosporum были добавлены влагоудерживающие агенты, гиббереллин, форхлорфенурон, вермикулитовый, известняковый порошок и другие агенты. Недостатком данного патента является большое количество добавляемых компонентов к инокуляту из спор трюфелевых грибов. Гормоны и факторы роста выступают дорогостоящими агентами, а их внесение в состав значительно усложняет и удорожает данный процесс.

Семейство патентов UA 102123 U, UA 104215 U, UA 125722 U, UA 126556 U (Украина) предлагают способы активации спор трюфеля с добавлением другого микоризообразующего гриба - веселки обыкновенной и ряда микробиологических компонентов, используемых в качестве микробиологических питательных сред. Недостатком такого способа является то, что данный метод является многокомпонентным и многостадийным и во многом зависит от формирования микоризы между трюфелем, веселкой обыкновенной и растениями. Каждый биологический объект, являясь живым организмом, зависит от климатических факторов и для каждого места произрастания грибов требуется подбор специфических условий для микоризации между не менее чем тремя компонентами (трюфель, веселка, растение).

Патент FR 2867019 (Франция) «Production of truffle Tuber melanosporum Vittadini by association of two mycorrhizing fungi, mixes fungi and seed with chalky soil, and awaits symbiotic development. Перевод: Производство трюфеля Tuber Melanosporum Vittadini путем объединения двух микоризирующих грибов, смешивания грибов и семян с известковой почвой и ожидания симбиотического развития» описывает способ выращивания трюфелей путем объединения двух микоризирующих грибов, их смешивание с семенами Manginia ampelina и меловой почвой. Недостатком такого метода является непредсказуемый процесс производства трюфелевых грибов ввиду высокой зависимости от биотических агентов и климатических факторов. М. ampelina требует специфических условий и растение подвержено заболеваниям и вредителям, что может оказать влияние на характер микоризации и ее устойчивость.

Также известен ряд патентов, описывающих способы инокуляции сеянцев различных древесных и кустарниковых видов растений. В патенте CN 101328464 (Китай) «Synthetic method of truffle and bacteriorhiza. Перевод: Синтетический способ получения трюфелей и бактериоризы» описан метод образования микоризы с китайской сосной. В другом патенте CN 108029449 (Китай) «Method for Yunnan oak seed seedling inoculation with Indian truffle. Перевод: Способ инокуляции сеянцев дуба юньнань индийским трюфелем», раскрывается способ инокуляции проростков семян дуба индийским трюфелем. Недостатком таких способов является использование дополнительных растений для достижения результата, что также ведет и к удорожанию технологии культивирования грибов и не решает проблему зависимости грибов от растений, а гибель растения приведет и к гибели всей грибницы. Использование описанных методов может затруднить надлежащий контроль качества выращиваемых трюфелей, поскольку они могут зависеть от качества субстрата, процессов симбиотического развития и условий выращивания, которые могут быть достаточно трудоемкими для поддержания и контроля.

Известен способ, описанный в патенте TW 202038705 A (Тайвань) - ((Preparation method of truffle strain liquid and cultivation method of truffle mycorrhizal seedling. Перевод: Способ приготовления жидкости штамма трюфеля и способ выращивания микоризной рассады трюфеля», в котором споросодержащее плодовое тело гриба измельчают с помощью блендера и добавляют активаторы. Для реализации изобретения проводят микроскопирование полученной споровой суспензии, чтобы убедиться, что не менее 20% спор свободны от сумок (асков). Далее для получения суспензии добавляют экстракт морских водорослей, в состав которого входят нитрат аммония, альгиновая, фосфорная кислота и др. К полученной смеси добавляют порошок метилцеллюлозы, который используется как влагоудерживающий агент и эмульгатор для суспензии спор, а также подавляет развитие простейших. Для получения более эффективного результата микоризации добавляют китайские лекарственные препараты на основе растений (лимонник, дягиль). По мнению авторов изобретения, с помощью препаратов на основе растений, возможно предотвратить массовое размножение простейших, присутствующих в плодовых телах. В патенте описано, что 10-15 мл споровой суспензии трюфеля выливают на субстрат для выращивания, после чего в споровую суспензию погружают сеянец растения-хозяина, который затем высаживают в грунт. Варианты реализации изобретения предусматривают использование в качестве субстрата смеси торфяного грунта, раствора экстракта морских водорослей и метилцеллюлозы, либо смеси торфяного грунта, вермикулита, воды, раствора экстракта морских водорослей и метилцеллюлозы. Изобретением достигаются преимущества по ингибированию плавания латентных простейших в асках, поддержанию концентрации аск и спор, повышению микоризации. Недостатком известного изобретения является то, что для получения посевного материала трюфелей нужны дополнительные биологические и химические агенты, что делает данный способ более дорогим, усложняет технологический процесс. Помимо этого, в патенте нет информации о виде используемых водорослей, что не обеспечивает возможности воспроизводимости изобретения.

Наиболее близким аналогом (прототипом) был выбран способ, описанный в заявке на изобретение CN 108370830 А (Китай) - «А kind of artificial culture method of black pine strain. Перевод: Разновидность способа искусственного выращивания сорта черного трюфеля». Согласно данному способу, зрелое плодовое тело черного трюфеля Tuber melanosporum измельчают. Затем готовят питательный субстрат, состоящий из 40-50 частей сухой золы кукурузных стеблей, 20-30 частей древесной золы, 30-40 частей измельченной травы, 20-30 частей сухой глины, 15-20 частей мелкого песка, 8-10 частей коровьего навоза. Питательный субстрат подвергают высокотемпературной стерилизации, нагревая до 70-80°С, а затем температура естественным образом снижается через несколько часов до 20°С-30°С. Далее питательный субстрат размещают в теплице слоем 20-30 см, на него рассыпают измельченные плодовые тела черных трюфелей, сверху добавляют порошок конидий гриба Lasiosphaera fenzlii, далее сверху добавляют еще 30-20 см питательного субстрата и высаживают семена огурцов. Влажность почвы поддерживают не менее 16%, при высыхании опрыскивают водой; температуру внутри теплицы поддерживают в пределах 25-30°С, что способствует росту грибов, наилучшее время для выращивания черного трюфеля составляет 35-40 дней. Выкапывать созревшие плодовые тела трюфелей предлагается после сбора плодов огурцов. По мнению автора заявки, выращивание трюфелей в теплице в симбиозе с огурцами создает подходящие условия для прорастания грибов: ботва огурцов дает затенение, а корни растений сохраняют необходимый уровень влажности почвы. Можно выделить следующие недостатки способа-прототипа: необходимость постройки теплицы и поддержания на ее площади оптимальной температуры 25-30°С, необходимость подготовки и высокотемпературной стерилизации питательного субстрата, необходимость использования второго вида гриба - Lasiosphaera fenzlii, следовательно, все эти действия существенно усложняют и удорожают процесс; получение пророщенного посевного материала черного трюфеля (как и его зрелых плодовых тел) предлагается только после сбора плодов огурца.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа получения посевного материала трюфелевых грибов без использования редких или труднодоступных химических реактивов, экстрактов, вытяжек и выжимок редких растений, с обеспечением высокой чистоты получаемого посевного материала.

Технический результат - получение посевного материала трюфелевых грибов (на примере черного трюфеля рода Tuber) и улучшение качества посадочного материала трюфелевых грибов.

Технический результат достигается с помощью интенсивного механического измельчения плодового тела черного трюфеля рода Tuber в жидкости с помощью шаровой мельницы, или с помощью комбинации измельчителя и шаровой мельницы в условиях, исключающих нагрев споровой суспензии выше 50°С, в результате чего обеспечивается повреждение мембраны асков и высвобождение спор, очистку спор проводят посредством многократной отмывки и центрифугирования споровой суспензии в растворе 3% перекиси водорода, проращивание осуществляют на твердых питательных микробиологических средах на предметных стеклах, обеспечивающих возможность микроскопического визуального контроля, при температурах 24-26°С на протяжении не менее чем 10 суток в условиях повышения влажности не менее чем до 50%.

Разработанный способ обладает рядом преимуществ в виду упрощения технологии и удешевления процессов получения посадочного материала (споровой суспензии) трюфелевых грибов за счет следующих факторов:

- при механическом способе высвобождения спор можно более точно контролировать и распределить споры трюфелей на необходимые площади или в сеянцы растений. Это полезно для создания трюфелевых плантаций и контроля над процессом выращивания трюфелей;

- механический способ высвобождения спор позволяет получить значительное количество спор трюфелевых грибов за короткий промежуток времени и оптимизировать объем инокулята, требуемый на растение;

- механический способ высвобождения спор не требует использования редких или труднодоступных химических реактивов, экстрактов редких растений, вытяжек, выжимок и др.;

- механическое высвобождение спор из сумок (асков) вместе с центрифугированием и очисткой споровой суспензии позволяет получить высокую чистоту споровой суспензии, так как снижает возможность смешивания с другими микроорганизмами-симбионтами или контаминацию другими видами грибов или бактерий в ходе отмывки.

Способ иллюстрируется следующими чертежами:

Фиг. 1 - Типовая микрофотографии асков (сумок) трюфеля до (А) и после гомогенизации с помощью погружного блендера (Б), после гомогенизации с помощью шаровой мельницы (В), и после гомогенизации с помощью погружного блендера в тандеме с шаровой мельницей (Г).

Фиг. 2 - Типовые микрофотографии надосадочной жидкости споровой суспензии трюфеля (А) и осадка (Б) после центрифугирования.

Фиг. 3 - Типовая микрофотография застывшей капли твердых питательных сред с инокулированной суспензией спор трюфелевого гриба на 7-е (А) и 14-е сутки (Б) проращивания в термостатируемых условиях.

Пример осуществления изобретения

Для достижения технического результата зрелое (плотное, упругое) плодовое тело черного трюфеля рода Tuber разрезают и измельчают. Часть гриба переносят в микропробирки. К полученному образцу добавляют половину объема пробирки дистиллированной воды/физраствора или распространенных и доступных жидких микробиологических питательных сред (1-5% LB, TSB, Сабуро, Гетчинсона, КГА, среда Чапека и др.) и несколько (3-5 шт.) металлических шариков, диаметром 2-4 мм, после чего проводят гомогенизацию с помощью лабораторной шаровой мельницы посредством интенсивного встряхивания при интенсивности от 2000 об/мин до 3000 об/мин. Данный образец гомогенизируют и в течение трех-пяти минут, повторяя процесс четырехкратно, периодически отбирая образцы спор для морфологического контроля измельчения. В перерывах пробы охлаждают, исключая нагрев образца до 50°С.

К оставшемуся плодовому телу черного трюфеля рода Tuber добавляют небольшой объем воды/физраствора или распространенных и доступных жидких микробиологических питательных сред (1-5% LB, TSB, Сабуро, Гетчинсона, КГА, среда Чапека и др.), достаточный для работы погружного бытового блендера (в нашем случае - 50-200 мл) и проводят измельчение. После этого отбирают наиболее мелкую фракцию плодового тела в микропробирки. Часть образца микроскопируют, а часть - продолжают измельчать уже на шаровой мельнице в соответствии с условиями, приведенными выше (при интенсивности от 2000 об/мин до 3000 об/мин в течение 3-5 минут, повторяя данный процесс четырехкратно, в перерывах пробы охлаждают, исключая нагрев образца до 50°С).

Изменения в морфологии спор и асков трюфеля во всех образцах регистрируют с помощью светового микроскопа, например, Микромед 2 (вар. 3-20).

На фиг. 1. представлены микрофотографии до гомогенизации (А) и после гомогенизации: с помощью погружного блендера (Б), после гомогенизации с помощью шаровой мельницы (В), и после гомогенизации с помощью погружного блендера в тандеме с шаровой мельницей (Г). Из материалов фигур видно, что до гомогенизации все споры находятся внутри асков. Гомогенизация погружным бленд ером показала худший результат, лишь небольшое количество сумок (асков) было разрушено. После измельчения плодового тела трюфеля с помощью шаровой мельницы было показано большее количество разрушенных сумок (асков), однако 90% спор находились внутри них. Только гомогенизация с помощью погружного блендера в тандеме с шаровой мельницей показывает наивысший процент поврежденных сумок (асков), а также некоторое количество одиночных спор. Измельчение спор без температурного контроля (в случае перетирания при 3000 об/мин более 10 минут) приводит к повреждению (перегреву) спор и их механическому измельчению, что проявляется в повышенном числе разрушенных фрагментов и выявлении спор неправильных форм.

Состав жидкости (вода, физраствор, 1-5% LB, TSB, Сабуро, Гетчинсона, КГА, среда Чапека) не является существенным признаком и служит средой для высвобождения спор. Морфологических изменений или зависимости состояния спор от использования той или иной питательной среды не отмечается.

Для очистки высвобожденных спор зрелый черный трюфель рода Tuber измельчают в лабораторной шаровой мельнице при 20000-3000 об/мин в присутствии нескольких (3-5 шт.) стальных шаров. Полученную суспензию переносят в микропробирку и центрифугируют при скорости вращения 10000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отделяют от осадка и микроскопируют.

На фиг. 2. показано, что споры трюфелевых грибов оседают на дно микроцентрифужной пробирки, а обломки гифов его симбионтов и патогенов остаются в надосадочной жидкости (супернатанте). Отмывка спор посредством пятикратного ресуспендирования в стерильных растворах приводит к очистке от ассоциированной микробиоты.

Ресуспендирование споровой суспензии на заключительных этапах в растворе 3% перекиси водорода в течение 1 минуты с нейтрализацией трехкратным объемом стерильного растворителя, центрифугированием и переносом в жидкую питательную среду, используемую на этапе измельчения, приводит к получению высокоочищенной стерильной суспензии спор трюфелевых грибов.

Затем в ходе работ проводят инокуляцию спор черного трюфеля на твердую (агаризованную) питательную среду. Для этого подготавливают предметное стекло, очищая его от пыли и обезжиривая в течение 15-20 минут в 70% растворе спирта. Стекло промывают дистиллированной водой и сушат, после чего стерилизуют. Далее каплю твердой питательной среды наносят на предметные стекла и в стерильных условиях инокулируют полученный гомогенат из спор. Предметные стекла помещают в стерильные чашки Петри в термостатируемые условия (от +18°С до 30°С) на две недели для того, чтобы споры начали прорастать и образовывать мицелий. Предметные стекла укладывают на влажную губку, обеспечивающую достаточную повышенную влажность (на уровне 50-85%). В это же время проводят микроскопирование спор трюфеля сразу после гомогенизации, а также на 7, 10 и 14 сутки.

На фиг. 3. представлены микрофотографии застывшей капли твердых питательных сред с инокулированной суспензией спор трюфелевого гриба на 7-е (А) и 14-е (Б) сутки проращивания в термостатируемых условиях (+24°С - 26°С). В результате выполненных работ установлено, что споры черного трюфеля по истечении одной недели не образовывают мицелий. Споры сохраняются объемными и набухшими до 10 суток, и уже по истечению двух недель формируют грибные гифы из спор трюфеля. Споры, проращиваемые на предметных стеклах, инкубируемых при температурах 18-22°С, набухают в объеме на 10-20%) к 14 сут. эксперимента, но не прорастают (следов прорастания спор не выявлено). Споры, проращиваемые на предметных стеклах, инкубируемых при температурах 26-30°С, не изменяют своей морфологии.

Список литературы:

1. Патент KZ 23874 A4 - «Способ и устройство для получения биомассы трюфеля и других съедобных грибов». Авторы: Р.К. Блиева, Д.Н. Козыбаева, Е.Н. Блиев, Д.Н. Блиев, Ж.Б. Сулейменова.

2. Патент CN 115074268 A - «Biological agent for promoting synthesis of truffle mycorrhiza as well as preparation method and application of biological agent». Authors: Wan S., Yu F., Liu M., Zhao J., Wang R., Huang L., Liu P.

3. Патент CN 108934768 B - «Black spore truffle inoculation microbial inoculum, treatment method thereof and mycorrhiza cultivation method». Authors: L. Xiaolin, Y. Lei, Z. Jiekang, Z. Jing, W. Di, H. Xiaolan, C. Ying, M. Renyun, T. Wei, W. Yong, J. Lin, P. Weihong, H. Zhonggan, G. Bingcheng, Z. Bo, T. Hao.

4. Патент UA 102123 U - «Споровый грибной концентрат "Микотаб"». Авторы: Т.3. Матюхiна, В.П. Мацькiв, I.Б. Шипак, Ю.В. Клименко.

5. Патент UA 104215 U - «Споровий грибний концентрат "Мкотаб агро"». Авторы: Т.3. Матюхша, В.П. Мацыав, I.Б. Шипак, Ю.В. Клименко.

6. Патент UA 125722 U - «Споровий грибний концентрат "Mikoagri"». Авторы: Т.3. Матюхша.

7. Патент UA 126556 U - «Споровий грибний концентрат "Fungiradix"». Авторы: Т.3. Матюхша.

8. Патент FR 2867019 - «Tuber Melanosporum Vittad. by association of two mycorrhizing fungi, mixes fungi and seed with chalky soil, and awaits symbiotic development)). Authors: V. Francois, V. Pascale, C. Andre.

9. Патент CN 101328464 - «Synthetic method of truffle and bacteriorhiza». Authors: L. Peigui, W. Xianghua, Y. Fuqiang, D. Xiaojuan, C. Juan, G. Liying, T. Xiaofei.

10. Патент CN 108029449 - «Method for Yunnan oak seed seedling inoculation with Indian truffle». Authors: Z. Xiaolei, L. Shuhong, S. Kaimei, W. Yun, L. Yongjun.

11. Патент TW 202038705 A - ((Preparation method of truffle strain liquid and cultivation method of truffle mycorrhizal seedling)). Authors: Chen С.M., Huang H.W., Lin Т C, Lin S.B.

12. Заявка на изобретение CN 108370830 - «A kind of artificial culture method of black pine strain», опубл. 07.08.2018.

13. Патент KZ 23874 A4 - «Способ и устройство для получения биомассы трюфеля и других съедобных грибов». Авторы: Блиева Р.К., Козыбаева Д.Н., Сулейменова Ж.Б., Блиев Б.Н., Блиев Д.Н.

14. Ori F. Truffles and morels: two different evolutionary strategies of fungal-plant interactions in the Pezizales // Plant microbe interface. - 2019. - P. 69-93.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Предложен способ получения посадочного материала черного трюфеля, согласно которому споры грибов получают с помощью механического измельчения плодового тела в жидкости, а проращивание осуществляют при температурах 24-26°С на протяжении не менее чем 10 суток в условиях повышения влажности не менее чем до 50%. При этом измельчение плодового тела гриба осуществляют с помощью шаровой мельницы или с помощью комбинации измельчителя и шаровой мельницы в условиях, исключающих нагрев споровой суспензии выше 50°С. Очистку спор проводят посредством многократной отмывки и центрифугирования споровой суспензии в растворе 3% перекиси водорода. Проращивание осуществляют на твердых питательных микробиологических средах на предметных стеклах с возможностью микроскопического визуального контроля. Изобретение направлено на получение высокой чистоты посевного материала. 3 ил.

Способ получения посадочного материала черного трюфеля, характеризующийся тем, что споры грибов получают с помощью интенсивного механического измельчения плодового тела в жидкости, а проращивание осуществляют при температурах 24-26°С на протяжении не менее чем 10 суток в условиях повышения влажности не менее чем до 50%, отличающийся тем, что измельчение плодового тела гриба осуществляют с помощью шаровой мельницы или с помощью комбинации измельчителя и шаровой мельницы в условиях, исключающих нагрев споровой суспензии выше 50°С, очистку спор проводят посредством многократной отмывки и центрифугирования споровой суспензии в растворе 3% перекиси водорода, проращивание осуществляют на твердых питательных микробиологических средах на предметных стеклах с возможностью микроскопического визуального контроля.