Способ экспресс-диагностики хромосомно-интегрированного бетагерпесвируса человека 6A/B в крови пациентов Российский патент 2025 года по МПК G01N33/569 C12Q1/686 

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии, и может быть использовано для экспресс-диагностики хромосомно-интегрированного бетагерпесвируса человека 6А/В (ВГЧ-6А/В) в крови пациентов как взрослого, так и детского возраста.

Бетагерпесвирус человека 6А/В широко распространен в человеческой популяции.

Известно, что он способен интегрироваться в субтеломерную область человеческой хромосомы. Интеграция вируса может происходить в участках 1q, 6q, 9q, 10q, 11p, 17p, 18p, 19q, 22q и Xp хромосом, однако механизмы до конца не изучены. При встраивании ВГЧ-6А/В в геном половых клеток возможна передача вируса следующим поколениям с образованием унаследованной хромосомно-интегрированной формы ВГЧ-6А/В (хиВГЧ-6А/В) в соответствии с законами Менделя. Принято считать, что распространенность хиВГЧ-6А/В зависит от географических факторов и анализируемой популяции пациентов. От 0,2 до 1,5-2,0% населения в мире являются носителями хиВГЧ-6А или хиВГЧ-6В, передаваемого по наследству. Биологические и медицинские последствия хромосомной интеграции ВГЧ-6А и ВГЧ-6В в настоящее время до конца не изучены.

В клинической практике активную форму бетагерпесвирусной инфекции 6А/В (первичное инфицирование, реактивация, инфицирование другим видом ВГЧ-6А/В) устанавливают, как правило, на основании высокой вирусной нагрузки в цельной крови с определением концентрации копий ДНК в объеме исследуемого материала с помощью ПЦР в реальном времени, однако дифференциальная диагностика с хиВГЧ-6А/В, используя такие биосреды как цельная кровь, слюна, отделяемое ротоглотки, невозможна. У пациентов с хиВГЧ-6А/В очень высокое количество ДНК ВГЧ-6А/В в крови и во всех других тканях организма выявляется на протяжении всей жизни, что существенно усложняет диагностику острой инфекции ВГЧ-6А/В и решение о назначении противовирусной терапии. Существуют надежные методы подтверждения хиВГЧ-6А/В, как например, выявление ДНК вируса в ногтевых пластинах и/или волосяных фолликулах, а также выявление хромосомы, в которую встроился вирус, методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), но такие методики на практике не применяются по причине высокой трудоемкости, длительности и высокой себестоимости исследований.

Таким образом, проблема экспрессной диагностики хиВГЧ-6А/В в клинической практике для оценки острой инфекции или хромосомной интеграции вируса в одном биоматериале пациента является актуальной как для уточнения распространенности, так и значения хромосомно-интегрированного бетагерпесвируса человека 6А/В в развитии инфекционной патологии. Дифференцирование наследуемого хиВГЧ-6А/В от активной ВГЧ-6А/В инфекции, требующей в отличие от хромосомно-интегрированной формы противовирусной терапии, является актуальным для своевременного решения вопроса о дальнейшей тактике ведения пациента в плане повышения медико-социальной эффективности оказания медицинской помощи в Российской Федерации.

Известны критерии подозрения на наличие хиВГЧ-6А/В (обнаружение ДНК вируса в цельной крови в концентрации >5,5 lg копий/мл; в сыворотке - >3,5 lg копий/мл; в ликворе - >4,0 lg копий/мл) [Ward K.N., Leong H.N., Nacheva Е.Р., Howard J., Atkinson C.E., Davies N.W., Griffiths P.D., Clark D.A. Human herpesvirus 6 chromosomal integration in immunocompetent patients results in high levels of viral DNA in blood, sera, and hair follicles. J. Clin. Microbiol., 2006, Vol. 44, №4, P. 1571-1574], но данные носят предположительный характер.

ПЦР-тестирование исключительно волосяных фолликулов или ногтевых пластин в связи с тем, что только лица с хиВГЧ-6А/В имеют ВГЧ-6А/В во всех клетках и тканях, описано отечественной исследовательской группой [Хромосомно-интегрированный вирус герпеса человека 6 типа. Никольский М.А., Голубцова B.C. Инфекция и иммунитет, 2015, т.5, №1, С. 11], однако в амбулаторно-поликлинических и стационарных условиях данный тест с использованием специфических, редко используемых наборов для выделения ДНК ВГЧ-6А/В из ногтевых пластин и волосяных фолликул, применять неэффективно и экономически нецелесообразно.

Известен способ подтверждения наследуемого хромосомно-интегрируемого бетагерпесвируса человека 6А/В по выявлению высоких концентраций ДНК ВГЧ-6А/В от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток в цельной крови. При этом необходимо параллельно обнаружить ДНК ВГЧ-6А/В в ногтевых пластинах в концентрации не менее 4,91 lg копий/10⁵ клеток и/или в волосяных фолликулах - не менее 4,70 lg копий/10⁵ клеток [RU 2739997 С1]. Метод трудозатратен, требует дополнительных расходных материалов и тест-систем для выделения ДНК из волосяных фолликул и ногтевых пластин, а также занимает большое количество времени в ходе подтверждения хромосомной интеграции.

Наиболее близким к предлагаемому авторами способу является способ идентификации вариантов А и В вируса герпеса человека 6-го типа с использованием ПЦР для определения ДНК ВГЧ-6А/В в крови [RU 2627607 С1]. Метод нацелен на одномоментное выявление и дифференциальное определение вида ВГЧ-6А или ВГЧ-6 В. Авторы показали, что идентификация ВГЧ-6А/В с определением вида вируса ВГЧ-6А/ВГЧ-6 В возможна при использовании специфических для ВГЧ-6А и ВГЧ-6 В расщепляемых зондов TaqMan методом ПЦР в формате реального времени. С учетом выявленных у ВГЧ-6А и ВГЧ-6В двух однонуклеотидных полиморфизмов на участке гена U67, ограниченного последовательностями 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и 5'-ACGTAAGCTTGCACAATGC-3', авторами предлагаемого ПЦР-способа были сконструированы специфические праймеры HHV6F 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и HHV6R 5'-ACGTAAGCTTGCACAATGC-3' для амплификации участка гена U67, использованы зонды, меченные флуорофорами (F1 и F2), и соответствующими им гасителями (Q1 и Q2) - HHV6AZ F1-GCAATAGATTTGGAAACGCGGCAT-Q1 и HHV6BZ F2-GCAATAGATTCGGAAATGCGGCAT-Q2 для выявления ВГЧ-6А и ВГЧ-6В соответственно. Определение вида ВГЧ-6А/В осуществляли по наличию экспоненциального роста флуоресцентного сигнала в соответствующем канале детектирующего амплификатора: вид ВГЧ-6А - канал F1, вид ВГЧ-6В - канал F2. Существенным недостатком метода является невозможность выявления хромосомной интеграции ВГЧ-6А/В в рамках данного анализа. Таким образом, указанный способ не обеспечивает точности дифференциальной диагностики хиВГЧ-6А/В с приобретенными активными формами бетагерпесвирусной инфекции 6А/В.

С целью устранения указанных недостатков нами предложен принципиально новый способ экспресс-диагностики хромосомно-интегрированного бетагерпесвируса человека 6А/В в крови пациентов.

Технический результат, достигаемый в данном способе, заключается в повышении точности экспресс-диагностики хромосомно-интегрированного бетагерпесвируса человека 6А/В в крови пациентов за счет проведения клинических и лабораторных исследований. Авторы определяют вирусную нагрузку вида вируса ВГЧ-6А/ВГЧ-6В в ПЦР в цельной крови, затем при вирусной нагрузке ВГЧ-6А/В от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток из крови выделяют лейкоцитарные фракции: лимфоциты, нейтрофилы и при выявлении ДНК ВГЧ-6А/В в лимфоцитах и нейтрофилах диагностируют хромосомную интеграцию вируса, а при выявлении ДНК ВГЧ-6А/В в лимфоцитах - активную инфекцию, ассоциированную с ВГЧ-6А/В.

В результате многолетнего опыта работы в области диагностики острых респираторных инфекций (ОРИ) авторами было обнаружено, что как и при активной вирусной инфекции, характеризующейся высокой вирусной нагрузкой в крови пациентов, у лиц с хиВГЧ-6В также наблюдается стойкая высокая вирусная нагрузка (>5,5 lg копий/10⁵ клеток) как цельной крови, так и в других биоматериалах.

Авторы впервые определили, что без дополнительной дифференциальной диагностики с приобретенной формой вирусной инфекции, хиВГЧ-6А/В расценивается как активный острый вирусный процесс, вызванный ВГЧ-6А/Ц, зачастую с неверным принятием решения о применении противовирусной терапии. Авторами также доказано, что такие пациенты без лабораторного подтверждения хромосомной интеграции вируса проходят неоднократные курсы необоснованной, неэффективной противовирусной терапии, что является экономически нецелесообразным расходованием лекарственных средств, дополнительно оказывающих влияние на здоровье пациента.

Авторы впервые установили, что экспресс-диагностика осуществляется за счет анализа лейкоцитарных фракций (лимфоцитов, нейтрофилов), выделенных из цельной крови пациентов с высокой вирусной нагрузки ВГЧ-6А/В от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток при скрининговых исследованиях, с последующим определением в этих фракциях вида ВГЧ-6А/ВГЧ-6В. Такой способ основывается на результатах многочисленных исследований об избирательном инфицировании и репликации ВГЧ-6А/В в Т-лимфоцитах, в частности тропности вируса к кластеру CD4+Т-клеток. Учитывая, что лица с хиВГЧ-6А/В содержат одну копию вирусного генома в каждой зародышевой клетке, постоянная высокая вирусная нагрузка во всех клетках крови является надежным доказательством данной формы вирусного существования, в то время как присутствие вируса только в лимфоцитах указывает на наличие приобретенной формы ВГЧ-6А/В инфекции.

Учитывая вышеизложенное, авторы впервые обнаружили, что использование лейкоцитарных фракций цельной крови обеспечит точную, быструю, простую дифференциальную диагностику наследуемого хиВГЧ-6А/В от активной ВГЧ-6А/В инфекции, требующей назначения противовирусной терапии, что является актуальным для своевременного решения вопроса о дальнейшей тактике ведения пациента в плане повышения медико-социальной эффективности оказания медицинской помощи в Российской Федерации. Это принципиально новый способ, описание которого в доступной литературе нами обнаружено не было.

Способ осуществляется следующим образом.

При обращении за медицинской помощью амбулаторно или при поступлении в стационар пациента с подозрением на активную ВГЧ-6А/В инфекцию (лихорадка, катаральный, лимфопролиферативный синдромы, клинические проявления внезапной экзантемы, инфекционного мононуклеоза, наличие рекуррентных респираторных инфекций и инфицированность ВГЧ-6А/В в анамнезе, повторное выявление ВГЧ-6А/В в крови в высокой вирусной нагрузке, особенно при отсутствии снижения показателя на фоне проводимой противовирусной терапии) проводят стандартный скрининг - ПЦР-тест с определением вида вируса и количественными характеристиками, и при выявлении у больного ВГЧ-6А/В с количеством ДНК от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток, свежую (не более 12 часов после взятия) цельную кровь пациента дополнительно разделяют на лейкоцитарные фракции (лимфоциты; нейтрофилы). Для этого в пробирку вносят раствор фиколл-урографина, имеющий плотность р=1,119 г/см³, затем на него аккуратно наслаивают раствор фиколла с плотностью р=1,077 г/см³. Кровь с ЭДТА разводят в 3 раза средой (1 часть крови+2 части среды (0,9% S. NaCl, PBS, Хенкс и т.д.)) и наслаивают на двойной градиент фиколл-урографина (в соотношении фиколл: кровь -1:3), центрифугируют 45 мин при 400 g. После центрифугирования получают кольца мононуклеарных клеток (верхнее) и нейтрофилов (нижнее, часто на поверхности осадка эритроцитов), в осадке - эритроциты. Полученное кольцо мононуклеарных клеток отбирают в чистую центрифужную пробирку и отмывают кулыуральной средой. Нейтрофильное кольцо отбирают в чистую пробирку, содержащую среду, свободную от ионов Са2+и Mg2+. Клетки дважды отмывают, центрифугируя 10 мин при 200g. Присутствующие эритроциты лизируют. Клеточный состав лейкоцитарных фракций подтверждают на гематологическом анализаторе CELL-DYN (Abbot, США), или его аналогах. Критерием правильного выделения фракций на градиенте плотностей фиколл-урографин является процентный показатель нейтрофилов и лимфоцитов NEUT%>75,0% и LYM%>75% (соответственно).

Полученные таким образом фракции используют для проведения повторного ПЦР-анализа и при выявлении ДНК ВГЧ-6А/В в лимфоцитах и нейтрофилах диагностируют хромосомную интеграцию вируса, а при выявлении ДНК ВГЧ-6А/В только в лимфоцитах - активную инфекцию, ассоциированную с ВГЧ-6А/В. В общей сложности процесс от момента выделения лейкоцитарных фракций до проведения ПЦР-детекции с получением результата по наличию или отсутствию вируса в лимфоцитах и нейтрофилах, выделенных из свежей крови пациента с подозрением на хромосомно-интегрированный ВГЧ-6А/В, занимает порядка 3 часов, что определяет экспрессность данной методики. Также способ не требует дополнительного сбора ногтевых пластин и волосяных фолликул, которые, как правило, собирают в последующие визиты пациента. Это способствует существенному сокращению времени проведения исследований и повышению качества оказания медицинской помощи.

Таким образом, было проанализировано 36 образцов цельной крови пациентов с высокими вирусными нагрузками ВГЧ-6А/В, поступивших в стационар в острый период заболевания с диагнозом острая респираторная инфекция, ассоциированная с ВГЧ-6А/В.

Высокая эффективность заявляемого способа проиллюстрирована нижеследующими примерами.

Пример 1.

Пациент С.С., 6 л. 4 мес, обратился в отделение дневного стационара ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России 25.04.2023 г. с жалобами на ринорею и затрудненное носовое дыхание. При поступлении состояние удовлетворительное, носовое дыхание выраженно затруднено. Слизистые носо-, ротоглотки гиперемированы, отечны, гипертрофия носоглоточной миндалины III ст. Содержимое носовой полости слизистое. Клинически ребенок переносил ОРИ (острый ринофарингит, аденоидит), осложненную двусторонним экссудативным отитом на фоне гипертрофии аденоидов 3 степени.

В клиническом анализе крови отмечали повышение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) до 28 мм/ч. В цельной крови методом ПЦР обнаружена ДНК ВГЧ-6 В в концентрации 4,8 lg копий/10⁵ клеток, в мазке из ротоглотки - ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации 5,5 lg копий/мл. При ИФА крови обнаружены IgG-антитела к ВГЧ-6А/В (коэффициент позитивности (КП) - 3,5), IgM - к ВГЧ-6А/В - отрицательно. В посеве отделяемого из носо-, ротоглотки отмечали рост нормобиоты.

Учитывая клинические и параклинические данные, установлен диагноз острая респираторная инфекция, протекающая в сочетании с герпесвирусной инфекцией, вызванной ВГЧ-6 В. Высокие концентрации ВГЧ-6А/В во взятых на анализ биоматериалах определили проведение дополнительной дифференциальной диагностики с хромосомно-интегрированным ВГЧ-6А/В для определения дальнейшей терапевтической тактики. Кровь сразу после результатов скринингового ПЦР на ВГЧ-6А/В была разделена на фракции лимфоцитов и нейтрофилов, которые также были проанализированы на содержание ДНК ВГЧ-6А/В. В лимфоцитах вирусная нагрузка ВГЧ-6А/В составила 4,2 lg копий/10⁵ клеток; нейтрофилах - вирусная нагрузка ВГЧ-6А/В отсутствовала. При проведении ПЦР волосяных фолликул, взятых параллельно на анализ с целью исключения хиВГЧ-6А/В, также получен отрицательный результат, доказывающий отсутствие хромосомной интеграции вируса у пациента и адекватность проведения разработанного авторами метода.

Таким образом, инфекционный процесс был обусловлен вирусной этиологией, в том числе герпесвирусной (ВГЧ-6 В), что было учтено при назначении терапии. Спустя 5 дней был выписан в удовлетворительном состоянии под амбулаторное наблюдение.

Пример 2.

Пациентка С.Е., 16 лет, планово находилась с 26.03.23 по 05.04.23 в ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России на детском психоневрологическом отделении для обследования и подбора лечения.

В анамнезе с 7 лет отмечают периодические головные боли, двоение в глазах по утрам. В течение последних 3 лет беспокоит тремор рук, усиливающийся при волнении. Осенью 2022 года при плановом выполнении МРТ шейного отдела в связи с кифозом грудного отдела позвоночника и двукратным компрессионным переломом позвоночника в анамнезе выявлены многочисленные очаги демиелинизации спинного мозга. В плане дообследования проведено МРТ головного мозга, где обнаружено многоочаговое поражение головного мозга. С 21.12.22 по 13.01.23 находилась на обследовании и лечении в ДНКЦИБ, где установлен диагноз «Рассеянный склероз, рецидивирующе-ремиттирующие течение, EDSS 4ур.». Ребенок состоит на учете в Центре рассеянного склероза.

Текущая госпитализация обусловлена течением ОРИ на фоне рассеянного склероза, рецидивирующе-ремиттирующие течение. При лабораторном обследовании в клиническом анализе крови СОЭ повышена до 18 мм/ч; методом ПЦР обнаружена ДНК ВГЧ-6А/В в крови (5,5 lg копий/10⁵ клеток, вид ВГЧ-6 В), в мазке из ротоглотки (6,5 lg копий/мл) и в ликворе (4,7 lg копий/мл). В сыворотке крови методом ИФА обнаружены IgG-антитела к аденовирусу (КП=2,9). Специфические антитела класса IgM, IgG к ВГЧ-6А/В не обнаружены.

Выполнена дифференциальная диагностика хромосомно-интегрированного ВГЧ-6А/В для определения последующей терапевтической тактики. Свежая цельная кровь после результатов ПЦР на ВГЧ-6А/В была разделена на фракции лимфоцитов и нейтрофилов для обнаружения ДНК ВГЧ-6А/В. В выделенных лимфоцитах вирусная нагрузка ВГЧ-6А/В составила 4,7 lg копий/10⁵ клеток; нейтрофилах - 2,5 lg копий/10⁵ клеток. При проведении ПЦР ногтевых пластин, взятых через 3 дня после госпитализации с целью определения хиВГЧ-6А/В, получен положительный результат, подтверждающий наличие хромосомной интеграции вируса у пациента. Для уточнения источника хиВГЧ-6А/В, параллельно на лабораторные исследования были взяты биоматериалы (кровь, ногтевые пластины) отца пациентки, который находился в этот момент в клинике по уходу за ребенком. В разделенных на лейкоцитарные фракции образцах крови родителя вирусная нагрузка ВГЧ-6А/В в лимфоцитах составила 4,3 lg копий/10⁵ клеток, в нейтрофилах - 3,7 lg копий/10⁵ клеток. При анализе ногтевых пластин отца ребенка с применением качественного ПЦР-теста получен положительный результат наличия ДНК ВГЧ-6А/В. Таким образом, выделение ВГЧ-6В у ребенка в различных биосредах (кровь, ликвор, отделяемое из ротоглотки) было связано с наследуемой хромосомно-интегрированной формой вируса, применение противовирусных препаратов против которой является нецелесообразным. После проведения симптоматической терапии ОРИ ребенок был выписан под амбулаторное наблюдение.

Использование данного способа, а именно лейкоцитарных фракций цельной крови, обеспечивает точную, быструю, экспрессную и простую дифференциальную диагностику наследуемого хиВГЧ-6А/В от активной ВГЧ-6А/В инфекции, требующей назначения противовирусной терапии, что является актуальным для своевременного решения вопроса о дальнейшей тактике ведения пациента в плане повышения медико-социальной эффективности оказания медицинской помощи в Российской Федерации.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу экспресс-диагностики хромосомно-интегрированного бетагерпесвируса человека 6А/В в крови пациентов. Для этого проводят клинические и лабораторные исследования, определяют вирусную нагрузку вида вируса ВГЧ-6А/ВГЧ-6В в ПЦР в цельной крови, затем при вирусной нагрузке ВГЧ-6А/В от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток, из крови выделяют лейкоцитарные фракции: лимфоциты, нейтрофилы, и при выявлении ДНК ВГЧ-6А/В в лимфоцитах и нейтрофилах диагностируют хромосомную интеграцию вируса, а при выявлении ДНК ВГЧ-6А/В в лимфоцитах - активную инфекцию, ассоциированную с ВГЧ-6А/В. Изобретение обеспечивает повышение точности экспресс-диагностики хромосомно-интегрированного бетагерпесвируса человека 6А/В в крови пациентов за счет проведения клинических и лабораторных исследований. 2 пр.

Способ экспресс-диагностики хромосомно-интегрированного бетагерпесвируса человека 6А/В в крови пациентов путем проведения клинических и лабораторных исследований, отличающийся тем, что определяют вирусную нагрузку вида вируса ВГЧ-6А/ВГЧ-6В в ПЦР в цельной крови, затем при вирусной нагрузке ВГЧ-6А/В от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток из крови выделяют лейкоцитарные фракции: лимфоциты, нейтрофилы и при выявлении ДНК ВГЧ-6А/В в лимфоцитах и нейтрофилах диагностируют хромосомную интеграцию вируса, а при выявлении ДНК ВГЧ-6А/В в лимфоцитах - активную инфекцию, ассоциированную с ВГЧ-6А/В.