Способ получения унифицированной кишечной среды для культивирования кишечных бактерий Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 G09B23/28 

Изобретение относится к относится к области медицинской и сельскохозяйственной микробиологии.

Цель предлагаемого изобретения заключается в том, чтобы создавать модели приближенные к внутреннему содержимому кишечника человека и животного для проведения доклинических исследований; культивировать различные виды бактерий, которые не культивируются на стандартных питательных средах.

Технический результат заключается в культивировании микроорганизмов, которые не растут на стандартных питательных средах; оптимизации крупных исследований за счет замены in vivo, ex vivo моделей на in vitro; изучении фармакокинетики, фармакодинамики лекарственных веществ без использования моделей ex vivo; проведении микробиологических, физиологических, фармакологических, вирусологических, микологических исследований на микробиоте и толстом кишечнике без использования моделей ex vivo.

Новизна и преимущество предлагаемой разработки по сравнению с существующими аналогами заключается в том, что разработка является единственной кишечной средой, способной культивировать не только микроорганизмы кишечника курицы и других сельскохозяйственных животных, но и человека, а также является максимально схожей по составу с субстратами для жизнедеятельности кишечных бактерий в содержимом кишечника животных и человека, является первой универсальной валидированной кишечной средой в России.

Известны состав искусственной кишечной среды для исследования микробиоты слепой кишки курицы (см. RU 2772350 C1, 18.09.2021 RU) и Способ моделирования микробиоты курицы в условиях искусственной слепой кишки (см. RU 2773094 C1, 18.09.2021 RU).

В настоящее время стандартные питательные среды имеют ряд недостатков. Стандартные питательные среды не воспроизводят условия настоящего кишечника, поэтому на них невозможно культивировать 335 видов микроорганизмов [3]. Невозможность определять некультивируемые микроорганизмы в условиях стандартных питательных сред приводит к ложноотрицательной диагностике и огромным экономическим убыткам. Кроме того, некультивируемые виды «передают» R-плазмиды возбудителям тяжелых инфекций MRSA и наоборот, следовательно, антибиотикорезистентность распространяется, снижается эффективность медикаментозного лечения, повышается нагрузка на общественное здравоохранение, тяжесть течения инфекционных заболеваний и смертность.

Стоить отметить, что в 2022 году в России была зарегистрирована искусственная кишечная среда курицы (см. RU 2772350 C1, 18.09.2021 RU), однако данная среда не является валидированной. Отсутствие адекватной валидации делает полученные при использовании искусственной кишечной среды данные нерепрезентативными, что снижает чувствительность и специфичность лабораторных исследований, повышается риск ложноотрицательных и ложноположительных заключений. Ориентированность этой модели на кишечник курицы делает эту кишечную среду узконаправленной, полученные на ней данные не могут быть экстраполированы на другие виды животных и человека.

Предлагаемое изобретение описывает унифицированную кишечную среду, которая воспроизводит оптимальный биохимический состав внутреннего кишечного содержимого и является первой валидированной кишечной средой в России как для человека, так и для сельскохозяйственных животных. Валидация была произведена посредством метагеномного секвенирования ампликонов гена 16S рРНК ДНК, выделенной из естественных образцов микробиоты и культивируемой микробиоты при помощи заявляемой среды, что позволило оценить изобилие всего спектра кишечных бактерий в исследуемых образцах. Также на основе полученных данных была произведена оценка относительного изобилия кишечных бактерий, культивируемых в заявляемой среде, в результате чего было отмечено отсутствие статистически значимых результатов между естественными образцами кишечной микробиоты и кишечной микробиотой культивируемой, что свидетельствует о стабильном воспроизведении состава микробиоты в течение длительного времени культивирования.

Благодаря этому полученные при использовании предлагаемой универсальной кишечной среды данные являются более значимыми и позволяют определить более широкий спектр микроорганизмов. Разработка имеет изобретательский уровень, так как заявляемая универсальная кишечная среда способна культивировать широкий спектр тех микроорганизмов, которые не растут на стандартных питательных средах.

Между тем, унифицированную кишечную среду используют в искусственных моделях ЖКТ (иЖКТ). Это сосуды, которые имитируют работу конкретного и/или целого ЖКТ за счет контроля pH, наличия ферментов, перистальтических сокращений и других факторов. При помещении унифицированной кишечной среды в иЖКТ образуется искусственная модель приближенная к настоящему кишечнику, способная тем самым, сократить расходы на исследования за счет сокращения закупок in vivo моделей. Также унифицированная среда служит средой для транспортировки образца фекалий. Так как животные и человек имеют схожую микробиоту, то разработка подходит для культивирования широкого спектра бактерий кишечной группы.

Использование заявляемого изобретения позволяет решить следующие задачи:

1. Позволяет культивировать микроорганизмы, которые не растут на стандартных питательных средах. Эти микроорганизмы ответственны за распространение антибиотикорезистентности в популяции человека [3] и животных, что снижает эффективность антибиотикотерапии, повышает смертность, тяжесть течения инфекционных заболеваний и нагрузку на общественное здравоохранение в том числе экономическую. В связи с этим важно исследовать некультивируемые виды микроорганизмов в стандартных кишечных средах в целях выбора эффективной стратегии борьбы с данными микроорганизмами, которая позволит снизить смертность, тяжесть течения и экономическую нагрузку на систему общественного здравоохранения и население.

В рамках разработки унифицированной кишечной среды была установлена возможность культивирования некультивируемой в стандартных кишечных средах микробиоты. Определение состава некультивируемой микробиоты было определено на основе данных таксономической идентификации вариантов прочтений ампликонов гена 16S рРНК и определения относительного изобилия бактериальных таксонов на основе подсчёта вариантов прочтений ампликонов. Для этого для каждого идентифицированного таксона была определена пропорция его изобилия относительно прочтений всех таксонов в одном образце. Далее для поиска различий в составе микробиоты был использован пакет «MaAsLin2» для языка статистического программирования R. Корректировка результатов множественных проверок статистических гипотез была произведена с использованием метода Беньямини-Хохберга для контроля доли ложных отклонений гипотез.

В результате не было обнаружено статистически значимых различий (p-значение> 0.05) в изобилии идентифицированных бактерий на рангах «Тип», «Класс», «Порядок», «Семейство» и «Род» (Фиг.1).

2. Проводить изучение фармакокинетики, фармакодинамики лекарственных веществ без использования моделей ex vivo. Благодаря возможности воспроизведения естественного состава кишечных микроорганизмов в разработанной кишечной среде подробно изучаются параметры фармакодинамики и фармакокинетики ряда фармакологических препаратов, в первую очередь с бактерицидным действием. Например исследователь при разработке нового антибиотика воспользовавшись унифицированной кишечной средой, на которой он культивирует патогенную микробиоту, затем может протестировать эффективность разрабатываемого антибиотика в условиях in vitro.

3. Оптимизировать крупные исследования за счет замены in vivo, ex vivo моделей на in vitro. Культивирование кишечных бактерий с использованием разработанной кишечной среды позволит воспроизвести естественный состав и биоразнообразие микробиоты и поддерживать эти параметры в течение длительного времени (до 21 дня). Из-за специфики in vivo (лабораторные животные) моделей возможно действие на них непредвиденного фактора. Например, лабораторное животное может заболеть, что повлияет на результаты эксперимента, тогда как унифицированная кишечная среда является более управляемой базой для проведения научного-исследования.

4. Проводить микробиологические, физиологические, фармакологические, вирусологические, микологические на микробиоте и толстом кишечнике без использования моделей ex vivo. Модели ex vivo являются выделенными живым тканями (например, выделенный кишечник кролика, жизнь которого поддерживается вне организма). Многие компании придерживаются концепции animal friendly и стараются избегать использования моделей ex vivo из-за гуманистических соображений. Более того, унифицированная кишечная среда является более оптимальным выбором для проведения доклинических исследований, чем модели ex vivo, потому что она позволяет увеличить точность и стабильность исследований, так как она не подвержена воздействию неожиданных факторов, которые могут повлиять на результаты исследования. Таким образом, универсальная кишечная среда позволяет заменять модели ex vivo на использование универсальной кишечной среды, что делает исследование более гуманным, позволяет снизить расход живого материала и защитить исследователя от непредвиденных факторов, риски которых существуют при работе с живыми объектами.

Следующие иллюстрации наглядным образом демонстрируют среднее относительное изобилие. Показатели изобилия идентифицированных бактерий в метагеномных прочтениях ампликонов V3-V4 гена 16S рРНК. ЕО - естественный образец (свежая взвесь фекалий курицы), ТП1 - техническая повторность 1, ТП2 - техническая повторность 2, ТП3 - техническая повторность 3. Технические повторности - образцы микробиоты культивируемые с использованием унифицированной кишечной среды. Статистически значимых различий в изобилии идентифицированных таксонов не обнаружено (p-значение> 0.05).

На фиг. 1 представлены показатели изобилия идентифицированных бактерий в метагеномных прочтениях ампликонов V3-V4 гена 16S рРНК.

На фиг. 2 представлено среднее относительное изобилие по рангу тип.

На фиг. 3 представлено среднее относительное изобилие по рангу класс.

На фиг. 4 представлено среднее относительное изобилие по рангу порядок.

На фиг. 5 представлено среднее относительное изобилие по рангу семейство.

На фиг. 6 представлено среднее относительное изобилие по рангу род.

При этом показатели индикатора оранжевого цвета на фиг. 2 превышают значения индикатора голубого цвета, что показывает превалирование рода Bacillota над родом Bacteroidota во всех образцах (EO, Т1, Т2, Т3). Остальные диаграммы читаются аналогичным образом.

Иллюстрации наглядно демонстрируют, что заявляемая универсальная кишечная среда (Т1, Т2, Т3) культивирует кишечную микробиоту курицы (EO) в тех же объемах, что и в настоящем кишечнике (EO). Была проведена статистическая обработка данных для дополнительно подтверждения эффективности и качества заявляемого изобретения использовался метод Беньямини-Хохберга для контроля доли ложных отклонений гипотез.

В результате статистической обработки данных статистически значимых различий в микробиоте (p-значение>0.05) обнаружено не было, что подтверждает, что заявляемая разработка действительно культивирует кишечную микробиоту в тех пропорциях, которые растут в настоящем кишечнике курицы.

Для приготовления 1 л унифицированной кишечной среды к 1 литру дистиллированной воды необходимо (в граммах) 9,0 г пектина, 9,0 г ксилана, 9,0 г арабиногалактана, 9,0 г амилопектина, 43,7 г казеина, 74,6 г крахмала, 31,5 г твина 80, 43,7 г бактопептона, 0,7 г бычьей желчи стерильной, 4,7 г K₂HPO₄x3H₂О, 8,4 г NaCl, 0,009 г FeSO₄x7H₂O, 0,7 г MgSO₄x7H₂O, 0,8 г CaCl₂,2H₂O, 0,02 г гемина 0,2 г п-аминобензойной кислоты, затем полученную смесь автоклавировали с режимом температуры 134 °С и давлением 2 атмосферы в течение 30 минут, после автоклавирования добавлялись 2,5 г никотинамида, 0,004 г тиамина 0,003 г цистеин⋅HCl для избежания их разрушения, в случае использования унифицированной кишечной среды свыше 72 часов рекомендуется добавлять 1,5 г витаминной смеси, содержащей (на литр): 0,001 г менадиона, 0,002 г D-биотина, 0,0005 г витамина B12, 0,01 г пантотената, кислоты, 0,004 г тиамина, 0,005 г никотинамидной кислоты.

ИСТОЧНИКИ:

1. Кочиш И.И., Мясникова О.В., Мартынов В.В., Смоленский В.И. МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА КУР И ЭКСПРЕССИЯ СВЯЗАННЫХ С ИММУНИТЕТОМ ГЕНОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ И ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВЫХ ДОБАВОК // С.-х. биол., Сельхозбиология, S-h biol, Sel-hoz biol, Sel'skokhozyaistvennaya biologiya, Agricultural Biology. 2020. №2. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/mikroflora-kishechnika-kur-i-ekspressiya-svyazannyh-s-immunitetom-genov-pod-vliyaniem-probioticheskoy-i-prebioticheskoy-kormovyh.

2. Харитонова Л.А., Григорьев К.И., Борзакова С.Н. Микробиота человека: как новая научная парадигма меняет медицинскую практику // ЭиКГ. 2019. №1 (161). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/mikrobiota-cheloveka-kak-novaya-nauchnaya-paradigma-menyaet-meditsinskuyu-praktiku.

3. Khabthani S, Rolain JM, Merhej V. Whole Genome Analysis of 335 New Bacterial Species from Human Microbiota Reveals a Huge Reservoir of Transferable Antibiotic Resistance Determinants. Int J Mol Sci. 2022 Feb 15;23(4):2137. doi: 10.3390/ijms23042137. PMID: 35216256; PMCID: PMC8874588.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения унифицированной кишечной среды для культивирования кишечных бактерий для медицинской и сельскохозяйственной микробиологии, включающий добавление к 1 л дистиллированной воды 9,0 г пектина, 9,0 г ксилана, 9,0 г арабиногалактана, 9,0 г амилопектина, 43,7 г казеина, 74,6 г крахмала, 31,5 г твина 80, 43,7 г бактопептона, 0,7 г бычьей желчи стерильной, 4,7 г K₂HPO₄х3Н₂О, 8,4 г NaCl, 0,009 г FeSO₄х7H₂О, 0,7 г MgSO₄х7Н₂О, 0,8 г CaCl₂х2Н₂О, 0,02 г гемина, 0,2 г п-аминобензойной кислоты. Полученную смесь автоклавируют 30 мин при 134°С и давлением 2 атм, затем добавляют 2,5 г никотинамида, 0,004 г тиамина, 0,003 г цистеин⋅HCl. В случае использования унифицированной кишечной среды свыше 72 ч добавляют 1,5 г витаминной смеси, содержащей на 1 л: 0,001 г менадиона, 0,002 г D-биотина, 0,0005 г витамина В12, 0,01 г пантотеновой кислоты, 0,004 г тиамина, 0,005 г никотинамидной кислоты. Изобретение обеспечивает культивирование кишечной микробиоты, некультивируемой в стандартных кишечных средах, и воспроизведение состава микробиоты в течение длительного времени культивирования. 6 ил.

Способ получения унифицированной кишечной среды для культивирования кишечных бактерий для медицинской и сельскохозяйственной микробиологии, включающий приготовление 1 л унифицированной кишечной среды, для получения которой к 1 литру дистиллированной воды добавляют 9,0 г пектина, 9,0 г ксилана, 9,0 г арабиногалактана, 9,0 г амилопектина, 43,7 г казеина, 74,6 г крахмала, 31,5 г твина 80, 43,7 г бактопептона, 0,7 г бычьей желчи стерильной, 4,7 г K₂HPO₄x3Н₂О, 8,4 г NaCl, 0,009 г FeSO₄x7H₂O, 0,7 г MgSO₄x7Н₂O, 0,8 г CaCl₂x2Н₂О, 0,02 г гемина, 0,2 г п-аминобензойной кислоты, затем полученную смесь автоклавируют с режимом температуры 134°С и давлением 2 атмосферы в течение 30 мин, после автоклавирования добавляют 2,5 г никотинамида, 0,004 г тиамина 0,003 г цистеин⋅HCl, а в случае использования унифицированной кишечной среды свыше 72 ч добавляют 1,5 г витаминной смеси, содержащей на 1 л: 0,001 г менадиона, 0,002 г D-биотина, 0,0005 г витамина В12, 0,01 г пантотеновой кислоты, 0,004 г тиамина, 0,005 г никотинамидной кислоты.