SNP-МАРКЕРЫ И ОТБОР В ОТНОШЕНИИ НИЗКОГО СОДЕРЖАНИЯ КЛЕТЧАТКИ В ПРЕДСТАВИТЕЛЯХ РОДА BRASSICA Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество предварительной заявки на патент США, серийный номер 62/782699, поданной 20 декабря 2018 г., полное содержание которой включено в данном документе посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Настоящее изобретение относится к детальному картированию локусов количественных признаков (QTL), ассоциированных с необходимыми питательными признаками в каноле (Brassica napus), включая низкое содержание клетчатки. Дополнительные варианты осуществления относятся к композициям и способам идентификации признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, в растении канолы с помощью молекулярных маркеров, тесно сцепленных с низким содержанием клетчатки. Дополнительные варианты осуществления относятся к композициям и способам введения признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, в растение канолы с помощью этих молекулярных маркеров.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Канола (Brassica napus L., 2n=4x=38, AACC), аллотетраплоид, образованный из диплоидов B. rapa (2n=2x=20, AA) и B. oleracea (2n=2x=18, CC), является одной из самых важных овощных масличных сельскохозяйственных культур в мире, особенно в Китае, Канаде, Европейском Союзе и Австралии. Каноловый шрот, фракция семени, которая остается после перемалывания и экстрагирования масла, составляет приблизительно 55% от объема семян канолы.

[0004] Каноловый шрот состоит из нескольких компонентов, включая белок, клетчатку, остаточное масло, углеводы и антипитательные факторы. Несмотря на то, что каноловый шрот имеет относительно высокое содержание белка, высокое содержание клетчатки в нем снижает его переваримость и ценность в качестве животного корма. По сравнению с соевым шротом каноловый шрот содержит высокие значения диетической клетчатки и более низкое процентное отношение белка. Из-за высокого содержания диетической клетчатки каноловый шрот имеет на приблизительно 20% меньше обменной энергии (ME), чем соевый шрот. В результате этого, ценность шрота остается низкой относительно шрота других масличных видов, как например соевого шрота, в частности в рационах для свиней и птицы. Rakow (2004a) Canola meal quality improvement through the breeding of yellow-seeded varieties-an historical perspective в AAFC Sustainable Production Systems Bulletin. Кроме того, наличие глюкозинолатов в некоторых типах канолового шрота также снижает его ценность, в связи с вредным воздействием этих соединений, оказываемым на рост и размножение скота.

[0005] Сорта канолы отличаются, отчасти, цветом своей семенной оболочки. Цвет семенной оболочки, как правило, делят на два главных класса: желтый и черный (или темно-коричневый). Также наблюдают разные оттенки этих цветов, такие как красновато-коричневый или желтовато-коричневый. У сортов канолы с более светлым цветом семенной оболочки в значительной степени наблюдают более тонкие кожицы, а следовательно меньше клетчатки и больше масла и белка, чем у сортов с темным цветом семенных оболочек. Stringam et al. (1974) Chemical and morphological characteristics associated with seed coat color in rapeseed в Proceedings of the 4th International Rapeseed Congress, Giessen, Germany, pp. 99-108; Bell and Shires (1982) Can. J. Animal Science 62:557-65; Shirzadegan and Röbbelen (1985) Götingen Fette Seifen Anstrichmittel 87:235-7; Simbaya et al. (1995) J. Agr. Food Chem. 43:2062-6; Rakow (2004b) Yellow-seeded Brassica napus canola for the Canadian canola industry в AAFC Sustainable Production Systems Bulletin. Одним возможным объяснением этого является то, что растение канолы может тратить больше энергии на производство белков и масел, если ему не требуется эта энергия на производство компонентов волокон семенной оболочки. Сообщается также, что линии канолы с желтыми семенами характеризуются меньшим содержанием глюкозинолатов, чем линии канолы с черными семенами. Rakow et al. (1999b) Proc. 10th Int. Rapeseed Congress, Canberra, Australia, Sep. 26-29, 1999, Poster #9. Таким образом, исторически развивали сорта канолы с желтыми семенами в качестве потенциального пути увеличения пищевой ценности канолового шрота. Bell (1995) Meal and by-product utilization in animal nutrition, in Brassica oilseeds, production and utilization. Eds. Kimber and McGregor, Cab International, Wallingford, Oxon, OX108DE, UK, pp. 301-37; Rakow (2004b), выше; Rakow & Raney (2003).

[0006] Как было показано, некоторые желто-семенные формы видов рода Brassica, близко родственные с B. napus (например, B. rapa и B. juncea), характеризуются более низкими уровнями клетчатки в своих семенах и последующем шроте. Ученые из Министерства сельского хозяйства и продовольствия Канады (AAFC) вывели линии с желтыми семенными оболочками (YSC) (YN86-37, YN90-1016, YN97-262 и YN01-429) с низкой пропорцией кожицы и более тонкой семенной оболочкой, низким содержанием клетчатки и высоким содержанием масел по сравнению с канолой с черными семенными оболочками (BSC) (Rakow et al., 2011). В исследованиях с питанием, в которых сравнивали желто-семенной каноловый шрот линии YN01-429 от AAFC с B. juncea, B. rapa и коричнево-семенным B. napus, были показаны преимущества линии YSC B. napus, такие как более высокое содержание белков, более низкое содержание клетчатки, повышенные перевариваемость аминокислот и содержание обменной энергии и улучшенное использование питательных веществ и энергии, на основе соотношения питания и увеличения массы курей-бройлеров и моногастрических видов животных (Hickling, 2009; Slominski et al., 2010).

[0007] Развитие идиоплазмы желто-семенных B. napus показало, что содержание клетчатки можно снизить в B. napus путем интеграции генов, которые контролируют пигментацию семян, из родственных видов Brassica. Однако неправильное представление наследования и стабильности признаков, представляющих собой низкое содержание клетчатки, а также отсутствие надежных высокопроизводительных маркеров, тесно сцепленных с признаком, сильно препятствовало выведению низкого содержания клетчатки. В связи с аллотетраплоидией, эффектом полимерных генов, материнскими эффектами и влиянием внешних условий наследование признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, является комплексным, а идентификация маркеров, тесно сцепленных с данным признаком, представляет сложность. Текущий отбор линий канолы с более низким содержанием клетчатки, получаемых из линий YSC от AAFC, в основном основывается на данных о содержании клетчатки, полученных с помощью дорогостоящих и трудоемких аналитических способов, или на цвете семенной оболочки, из-за тесной связи с низким содержанием клетчатки в линиях YSC от AAFC.

[0008] Имеется очень мало информации касательно степени изменчивости клетчатки в идиоплазме B. napus с темными семенами, а также получены немногочисленные отчеты о линиях канолы с темными семенами, которые были выведены, которые содержат пониженные уровни антипитательных факторов (например, клетчатка и полифенольные соединения), а также повышенные уровни белка. Одним таким примером являются свободно опыленные сорта (CL044864, CL065620) и гибриды (CL166102H, CL121460H и CL121466H) B. napus, которые характеризуются благоприятными характеристиками состава семян, в том числе высоким содержанием белка, низким содержание клетчатки, пониженным содержанием полифенолов и повышенным содержанием фосфора (патент США 9596871 B2). Эти необходимые питательные характеристики делают эту идиоплазму особенно ценной в качестве источников канолового шрота. Однако молекулярные маркеры, которые тесно сцеплены с этим необходимым питательным признаком в линиях канолы с темными семенами, ранее не описывали.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] В данном документе описан способ идентификации локуса количественных признаков (QTL), ассоциированного с необходимыми питательными признаками, включая низкое содержание клетчатки в каноле. Способ включает получение и выделение образца нуклеиновой кислоты из растения Brassica napus или его идиоплазмы и скрининг образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, расположенных в хромосомном интервале на хромосоме N13 в Brassica napus. Один конец хромосомного интервала N13 обозначен положением пары оснований (п. о.) 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) и включает его, а другой конец интервала N13 обозначен положением п. о. 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает его. Например, маркерный аллель, которую используют для скрининга признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, может представлять собой один или несколько маркерных аллелей под SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95 или 100. В определенных примерах способ включает получение образца нуклеиновой кислоты из растения или идиоплазмы Brassica napus и скрининг образца в отношении образца нуклеиновой кислоты, содержащего маркерный аллель, связанный с низким содержанием клетчатки, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:95 или как SEQ ID NO:90, так и SEQ ID NO:95. В другом примере способ может включать скрининг образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, расположенных в меньшем хромосомном интервале на хромосоме N13 в Brassica napus, таким образом, что один конец интервала N13 обозначен положением п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) и включает его, а другой конец интервала обозначен положением п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO: 77) и включает его. Таким образом, способ может включать скрининг меньшего интервала в отношении одного или нескольких маркерных аллелей признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, под SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100. См. примеры 1-3 в данном документе, в том числе таблицу 3, для дополнительных сведений относительно интервалов N13 и маркеров, которые применяют в раскрытых способах.

[0010] Каждый из вышеуказанных способов можно применять для скрининга в отношении одного или нескольких из раскрытых маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13 из линии CL044864 Brassica napus. Каждый из вышеуказанных раскрытых способов можно применять для скрининга одного или нескольких из раскрытых маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13 из линии CL065620 Brassica napus или ее производных. Скрининг в отношении наличия одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, в соответствии со способами, раскрытыми в данном документе, можно проводить с применением методик, таких как амплификация посредством аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенирование нуклеиновых кислот.

[0011] В конкретном примере раскрытый способ идентификации растения или его идиоплазмы включает получение и выделение образца нуклеиновой кислоты из растения или идиоплазмы Brassica napus и скрининг образца в отношении нуклеиновой кислоты, которая содержит один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13, с помощью зонда на основе нуклеиновой кислоты, содержащего SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO 96 или SEQ ID NO:97 или комбинацию вышеуказанных зондов. Например, см. пример 3 в данном документе.

[0012] Настоящее изобретение предусматривает семена растения Brassica napus, в котором идентифицировано наличие одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13, раскрытых в данном документе, с помощью способа, раскрытого в данном документе. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает шрот, полученный из таких семян растения, в котором идентифицировано наличие одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13.

[0013] Также в данном документе предусмотрен способ отбора одного или нескольких растений или их идиоплазмы из популяции, где отобранное растение содержит локус количественных признаков (QTL), ассоциированный с необходимыми питательными признаками, включая низкое содержание клетчатки в каноле. Способ включает получение и выделение образца нуклеиновой кислоты из каждого растения или его идиоплазмы среди множества растений в популяции растений Brassica napus, скрининг каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, в хромосомном интервале N13 в Brassica napus, который обозначен от положения п. о. 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) до положения п. о. 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает их, где один или несколько маркерных аллелей служат признаком низкого содержания клетчатки в Brassica napus. Настоящий способ включает последующий отбор одного или нескольких растений или их идиоплазмы из популяции, в которых идентифицировано наличие одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, на стадии скрининга. Например, одним или несколькими маркерными аллелями, применяемыми для скрининга в отношении признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, могут быть один или несколько маркерных аллелей под SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95 или 100; и в каждом из отобранных одном или нескольких растениях или их идиоплазме есть вышеуказанные один или несколько маркерных аллелей, в отношении которых проводили скрининг. В определенных примерах способ отбора включает получение образца нуклеиновой кислоты из растения или идиоплазмы Brassica napus и скрининг образца в отношении образца нуклеиновой кислоты, содержащего маркерный аллель, связанный с низким содержанием клетчатки, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:95 или как SEQ ID NO:90, так и SEQ ID NO:95; и отобранные одно или несколько растений или их идиоплазма включают один или оба из данных маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, в отношении которых проводили скрининг. В одном аспекте раскрытый способ отбора может включать скрининг каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, в меньшем хромосомном интервале N13, который обозначен положением п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) и включает его до другого конца, который обозначен положением п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77) и включает его; и способ включает отбор одного или нескольких растений или их идиоплазмы, характеризующихся одним или несколькими маркерными аллелями, связанных с низким содержанием клетчатки, в отношении которых проводили скрининг. Например, способ отбора может включать скрининг меньшего интервала в отношении одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, под SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100; и в каждом из отобранных одном или нескольких растений или их идиоплазме есть один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, под SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100. , в отношении которых проводили скрининг.

[0014] В каждом из вышеуказанных раскрытых способов отбора один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13, в отношении которых проводят скрининг и которые находят в каждом отобранном растении или его идиоплазме, могут представлять собой один или несколько маркерных аллелей из линии CL044864 Brassica napus. Дополнительно или в качестве альтернативы в каждом из вышеуказанных раскрытых способов отбора один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13, в отношении которых проводят скрининг и которые находят в каждом отобранном растении или его идиоплазме, могут представлять собой один или несколько маркерных аллелей из линии CL065620 Brassica napus или ее производной. Более того, в раскрытых способах отбора одного или нескольких растений или их идиоплазмы во множестве растений в популяции Brassica napus стадия скрининга каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, может быть выполнена с помощью методик, таких как амплификация посредством аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенирование нуклеиновых кислот.

[0015] В конкретном примере раскрытого способа отбора растения или идиоплазмы Brassica napus способ включает получение или выделение образца нуклеиновой кислоты из растения Brassica napus или его идиоплазмы, скрининг каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты с одним или несколькими маркерными аллелями, связанными с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13 с помощью зонда на основе нуклеиновой кислоты, содержащего SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO 96 или SEQ ID NO:97 или комбинацию вышеуказанных зондов.

[0016] Настоящее раскрытие также предусматривает семена растения Brassica napus, отобранного с наличием одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13 в соответствии с любым из способов отбора растений, описанных в данном документе. Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает шрот из таких семян растения, отобранного с наличием одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13.

[0017] В другом варианте осуществления в данном документе раскрыт способ получения растения или идиоплазмы канолы, которые содержат локус количественных признаков (QTL), ассоциированных с необходимыми питательными признаками, включая низкое содержание клетчатки в каноле. Способ включает получение и выделение образца нуклеиновой кислоты из каждого одного или нескольких растений Brassica napus или их идиоплазмы, скрининг каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, расположенных в хромосомном интервале N13 в Brassica napus, который обозначен от положения п. о. 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) до положения п. о. 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает их, где один или несколько маркерных аллелей служат признаком низкого содержания клетчатки в Brassica napus. Способ дополнительно включает отбор первого растения Brassica napus, в котором наличие одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, в отношении которых проводили скрининг, идентифицировано на стадии скрининга, а затем скрещивание отобранного первого растения со вторым растением для получения растений-потомков, где по меньшей мере одно из растений-потомков содержит один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, в отношении которых проводили скрининг. Например, один или несколько маркерных аллелей, используемых для скрининга в отношении признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, могут быть одним или несколькими маркерными аллелями под SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95 или 100;, таким образом, чтобы отобранное первое растение и по меньшей мере одно растение-потомок содержали вышеуказанные один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, в отношении которых проводили скрининг. В определенных примерах раскрытого способа получения растения канолы способ включает скрининг каждого образца в отношении образца нуклеиновой кислоты, содержащего маркерный аллель, связанный с низким содержанием клетчатки, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:95 или как SEQ ID NO:90, так и SEQ ID NO:95; таким образом, чтобы отобранное первое растение и по меньшей мере одно растение-потомок содержали один или оба данных маркерных аллеля, связанных с низким содержанием клетчатки, в отношении которых проводили скрининг. В одном аспекте, раскрытый способ получения растения канолы включает скрининг каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, расположенных в меньшем хромосомном интервале N13, который обозначен от положения п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) до положения п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77) и включает их; и отобранное первое растение Brassica napus и по меньшей мере одно растение-потомок содержат один или несколько искомых маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, в меньшем интервале N13. Например, способ получения растения канолы может включать скрининг меньшего интервала в отношении одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, под SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100; таким образом, что отобранное первое растение Brassica napus и по меньшей мере одно растение-потомок характеризуются одним или несколькими маркерными аллелями, связанными с низким содержанием клетчатки, в отношении которых проводили скрининг, под SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100.

[0018] В каждом из вышеуказанных раскрытых способов получения растения канолы один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13, в отношении которых проводят скрининг и которые находят в первом растении Brassica napus и по меньшей мере одном растении-потомке, могут быть одним или несколькими маркерными аллелями из линии CL044864 Brassica napus. Дополнительно или в качестве альтернативы в каждом из вышеуказанных раскрытых способов получения растения канолы один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13, в отношении которых проводят скрининг и которые находят в первом растении Brassica napus и по меньшей мере одном растении-потомке, могут представлять собой один или несколько маркерных аллелей из линии CL065620Brassica napus или ее производных. Более того, в раскрытых способах получения растения канолы стадия скрининга каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, может быть выполнена с помощью методик, таких как амплификация посредством аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенирование нуклеиновых кислот.

[0019] В конкретном примере раскрытый способ получения канолы включает получение и выделение образца нуклеиновой кислоты из каждого из одного или нескольких растений Brassica napus или их идиоплазмы, скрининг каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13, с помощью зонда на основе нуклеиновой кислоты, содержащего SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO 96 или SEQ ID NO:97 или комбинацию вышеуказанных зондов.

[0020] Настоящее изобретение также предусматривает семена из растений-потомков Brassica napus, которые содержат один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13 и которые получены согласно любому из способов получения растения канолы с признаком, представляющим собой низкое содержание клетчатки, описанных в данном документе. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает получение шрота из таких семян растений с одним или несколькими маркерными аллелями, связанными с низким содержанием клетчатки, хромосомы N13.

[0021] Также описаны способы получения растения или идиоплазмы канолы, которые предусматривают признак, представляющий собой низкое содержание клетчатки. Такие способы могут включать интрогрессирование по меньшей мере одного маркерного аллеля, связанного с низким содержанием клетчатки, из первого растения канолы во второе растения канолы с получением таким образом растения-потомка канолы или его идиоплазмы с маркером, представляющим собой низкое содержание клетчатки. Интрогрессированный маркер находится в хромосомном интервале N13, который обозначен от положения п. о. 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) до положения п. о. 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает их и сцеплен с признаком, представляющим собой низкое содержание клетчатки, в первом растении канолы. Например, интрогрессированный маркер может находиться в меньшем хромосомном интервале N13, который обозначен от положения п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) до положения п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77) и включает их, где маркер сцеплен с признаком, представляющим собой низкое содержание клетчатки, в первом растении канолы. Процесс интрогрессии может включать любой из раскрытых в данном документе вышеуказанных способов идентификации, отбора или получения растения Brassica napus, содержащего один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, расположенных в хромосомном интервале N13. В определенных примерах раскрытого способа интрогрессирования первое растение, которое содержит маркер низкого содержания клетчатки в хромосомном интервале N13, скрещивают со вторым растением, которое не содержит маркер низкого содержания клетчатки, для получения растения-потомка с более низким содержанием клетчатки по отношению ко второму растению.

[0022] Вышеуказанные и другие признаки станут более очевидными за счет последующего детального описания некоторых вариантов осуществления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0023] Фиг. 1. Генетическая карта хромосомного интервала 6,2 cM на N13, где расположен QTL, ассоциированный с низким содержанием клетчатки. Положение 0,0 генетической карты, показанной на фиг. 1 соответствует 32,4 cM в таблице 3.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0024] Последовательности нуклеиновой кислоты, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, показаны с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований, как определено в § 1.822 37 C.F.R. Показана только одна нить каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но подразумевается, что комплементарная нить включена посредством любой отсылки к демонстрируемой нити. В прилагаемом перечне последовательностей показано следующее.

[0025] SEQ ID NO:1-90, 95 и 100 являются маркерными последовательностями, сцепленными с QTL, ассоциированным с низким содержанием клетчатки, расположенным в хромосомном интервале на N13.

[0026] SEQ ID NO:91-94 являются праймерами и зондами для SNP-маркера n13:58387757 (SEQ ID NO:90) анализа TAQMAN™.

[0027] SEQ ID NO:96-99 являются праймерами и зондами для SNP-маркера n13_59498877 (SEQ ID NO:95) анализа TAQMAN™.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Обзор некоторых вариантов осуществления

[0028] Настоящее изобретение предусматривает высокопроизводительные маркеры однонуклеотидного полиморфизма (SNP) и генетические карты высокой плотности для детального картирования и проверки достоверности локуса количественных признаков (QTL), лежащего в основе признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, полученного из линий канолы с черным семенем (BSC). В конкретных примерах линии BSC могут быть линиями CL044864 и CL065620 и их производными. SNP-Маркеры тесно сцеплены с признаком, представляющим собой низкое содержание клетчатки, и могут быть применены для отбора с применением маркера (MAS) признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки.

[0029] Согласно настоящему изобретению эти SNP-маркеры можно применять для интрогрессии признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, например, из источников BSC, описанных выше, в агрономично необходимые виды и сорта канолы (например, компенсировать отсутствие низкого содержания клетчатки в культивируемой каноле). Получение растения канолы с пониженным содержанием клетчатки, по сравнению с традиционными сортами, является необходимым по ряду причин. Таким образом, способы, раскрытые в данном документе, можно применять в высокопроизводительных и малозатратных стратегиях и процессах для построения и исполнения программ интрогрессии низкого содержания клетчатки в каноле.

[0030] В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает композиции и способы для идентификации, отбора и/или получения растений канолы с признаком, представляющим собой низкое содержание клетчатки, из линий CL044864 и CL065620 BSC и их производных, а также растений канолы или их частей, включая без ограничения семена и идиоплазму канолы, которые идентифицируют, отбирают и/или получают с помощью способов по настоящему изобретению. Настоящее изобретения дополнительно предусматривает анализ для выявления признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, в растении, части растения канолы и/или идиоплазме канолы.

[0031] Настоящее изобретение предусматривает способ применения SNP-маркеров и генетических карт высокой плотности, основываясь на признаке, представляющем собой низкое содержание клетчатки, линий CL044864 и CL065620 BSC с помощью широкого выбора фенотипических данных из четырех дигаплоидных (DH) популяций. Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на открытии основного QTL на N13, который объясняет от 65,9% до 71,5% изменчивости признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, в двух DH популяциях. Этот основной QTL на N13 проверили и подтвердили наличие отличий от QTL, ассоциированного с низким содержанием клетчатки, линии YN01-429 на N09 YSC (заявка на патент США № 15/731561) в двух DH популяциях.

[0032] Настоящее раскрытое изобретение также предусматривает маркерные локусы канолы и QTL хромосомного интервала, которые демонстрируют статистически достоверную косегрегацию с низким содержанием клетчатки (о чем они следовательно также предвещают и свидетельствуют). Например, раскрыты 92 маркерных локуса канолы (SEQ ID NO:1-90, 95 и 100) в интервале 6,2 cM или 2115595 п. о. на хромосоме N13 на запатентованном эталонном геноме B. napus, DH12075. Интервал может быть далее определен с помощью его локализации на хромосоме N13 от положения п. о. 7301735 до положения п. о. 9417330 на эталонном геноме B. napus, DH12075, который содержит DBSNP143552 (SEQ ID NO:1) и DBSNP243314 (SEQ ID NO:89) и фланкирован ими. В конкретных примерах маркеры в данном интервале можно применить для отбора с применением маркера признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, в линиях CL044864 и CL065620 BSC и их производных, а значит можно улучшить способ выведения линий канолы с низким содержанием клетчатки.

[0033] Настоящее изобретение также предусматривает способы идентификации первого растения или идиоплазмы канолы, в которых проявляется низкое содержание клетчатки. В некоторых примерах по меньшей мере один аллель одного или нескольких маркерных локусов, которые сцеплены (например, тесно сцеплены) с признаком, представляющим собой низкое содержание клетчатки, из линий CL044864 или CL065620 или их производных, обнаруживают в первом растении или идиоплазме канолы. В некоторых примерах маркерные локусы могут быть отобраны из локусов в таблице 3, включая SEQ ID NO: 1-90, 95, и 100.

II. Термины

[0034] Аллотетраплоид. Как используется в данном документе, "аллотетраплоид", как правило, относится к гибридному организму с хромосомным набором в четыре раза большим, чем у гаплоидного организма.

[0035] Выделенный. "Выделенным" является биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок), который по сути отделяли, получали отдельно или очищали от других биологических компонентов в клетке организма, где компонент естественно присутствует (т. е. другие хромосомные и внехромосомные ДНК и РНК и белки), подвергая компонент химическим и функциональным изменениям. Например и без ограничений нуклеиновую кислоту можно выделить из хромосомы, разрушая химические связи, соединяющие нуклеиновую кислоту с остальной ДНК в хромосоме. Молекулы нуклеиновой кислоты и белки, которые были "выделены", включают молекулы нуклеиновой кислоты и белки, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные путем рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты, белки и пептиды.

[0036] Молекула нуклеиновой кислоты. Как используется в данном документе, термин "молекула нуклеиновой кислоты" может относиться к полимерной форме нуклеотидов, которая может включать как смысловые, так и несмысловые нити РНК, cDNA, геномной ДНК и синтетических форм и смешанных полимеров всего вышеперечисленного. Нуклеотид может относиться к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированной форме обоих типов нуклеотидов. "Молекула нуклеиновой кислоты", как используется в данном документе, является синонимом "нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотида". Термин включает одно- и двухнитевые формы ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может включать одно из или оба из встречающихся в природе и модифицированных нуклеотидов, связанных вместе встречающимися в природе и/или не встречающимися в природе нуклеотидными связями.

[0037] Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы химическими или биохимическими способами, или они могут содержать не встречающиеся в природе или дериватизированные нуклеотидные основания, что будет явно понятно специалистам в данной области. Такие модификации включают, например, метки, метилирование, замену одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогами, межнуклеотидные модификации (например, незаряженные связи: например, метил фосфонаты, сложные фосфотриефиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.; незаряженные связи: например, фосфотиоаты, фосфородитиоаты и т.д.; подвешенные фрагменты: например, пептиды; интеркаляторы: например, акридин, псорален, и т.д.; хелаторы; алкиляторы; и модифицированные связи: например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Термин "молекула нуклеиновой кислоты" также включает любую топологическую конформацию, включая однонитевые, двухнитевые, частично дуплексные, триплексные, шпилечные, кольцевые и запертые конформации.

[0038] Популяция для картирования. Как используется в данном документе, термин "популяция для картирования" может относиться к популяции растений (например, популяции растений канолы), которую используют для генетического картирования. Популяции для картирования обычно получают из контролируемых скрещиваний родительских генотипов, равно как и из двух инбредных линий. Решения об отборе родителей, план спаривания для выведения популяции для картирования и тип используемых маркеров зависят от картируемого гена, доступности маркеров и молекулярной карты. Родители растений в пределах популяции для картирования должны иметь достаточную изменчивость для признака(ов), представляющего(их) интерес, как на уровне последовательностей нуклеиновых кислот, так и на уровне фенотипа. Изменчивость родительских последовательностей нуклеиновых кислот используют для отслеживания явления рекомбинации в растениях популяции для картирования.

[0039] Доступность информативных полиморфных маркеров зависит от количественного значения изменений в последовательности нуклеиновых кислот. Таким образом, конкретный информативный маркер могут не идентифицировать в конкретном скрещивании родительских генотипов, хотя такие маркеры могут существовать.

[0040] "Генетическая карта" представляет собой описание взаимоотношений генетических сцеплений среди локусов на одной или нескольких хромосомах (или группах сцеплений) в пределах отдельного вида, что можно определить с помощью анализа популяции для картирования. В некоторых примерах генетическую карту могут изображать в форме диаграммы или таблицы. Термин "генетическое картирование" может относиться к процессу определения взаимоотношений сцеплений локусов с помощью генетических маркеров, картирования популяций, которые сегрегированы в отношении маркеров, и стандартные генетические принципы частоты рекомбинаций. "Локализация на генетической карте" относится к локализации на генетической карте (относительно окружающих генетических маркеров на одной группе сцеплений или хромосоме), где можно найти конкретный маркер из данного вида. В отличие от этого, "физическая карта генома" относится к абсолютным расстояниям (например, измерения с помощью пар оснований или выделенных и перекрывающихся близких генетических фрагментов) между маркерами из данного вида. Физическая карта генома необязательно отражает действительную частоту рекомбинаций, наблюдаемых при тестовом скрещивании видов между разными точками на физической карте.

[0041] Скрещивание. Как используется в данном документе, термин "скрещивание" (или "скрещенный") относится к слиянию гамет посредством опыления для получения потомков (например, клетки, семена и растения). Этот термин охватывает как половое скрещивание (т.е. опыление одного растения другим), так и самовоспроизводство (т. е. самоопыление, например, с помощью пыльцы и семязачатка одного и того же растения).

[0042] Обратное скрещивание. Способы обратного скрещивания можно использовать для введения последовательности нуклеиновой кислоты в растения. Методика обратного скрещивания широко использовалась на протяжении десятилетий для внедрения новых признаков в растения. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. В стандартном протоколе обратного скрещивания интересующий изначальный сорт (рекуррентный родитель) скрещивают со вторым сортом (нерекуррентный родитель), который несет подлежащий передаче ген, представляющий интерес. Полученных в результате этого скрещивания потомков затем скрещивают снова с рекуррентным родителем, и процесс повторяют до получения растения, где фактически все необходимые морфологические и физиологические характеристики рекуррентного растения находятся в выведенном растении, в дополнение к перенесенному гену нерекуррентного родителя.

[0043] Интрогрессия. Как используется в данном документе, термин "интрогрессия" относится к передаче аллели в генетическом локусе в генетический фон. В некоторых вариантах осуществления интрогрессия специфичной аллельной формы в локусе может происходить путем передачи аллельной формы по меньшей мере одному потомку посредством полового скрещивания между двумя родителями одного вида, где по меньшей мере у одного из родителей есть специфичная аллельная форма в его геноме. Потомок, содержащий специфичную аллельную форму, может неоднократно обратно скрещиваться с линией с необходимым генетическим фоном. Потомка обратного скрещивания можно отбирать в отношении специфичной аллельной формы с целью получения нового сорта, где специфичная аллельная форма фиксирована в генетическом фоне. В некоторых вариантах осуществления интрогрессия специфичной аллельной формы может происходить путем рекомбинации между двумя донорными геномами (например, слитый протопласт), где по меньшей мере у одного донорного генома есть специфичная аллельная форма в геноме. Интрогрессия может включать передачу специфичной аллельной формы, которая может быть, например и без ограничения, отобранной аллельной формой маркерного аллеля; QTL и/или трансгеном. В настоящем изобретении интрогрессия может включать передачу одного или нескольких раскрытых маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки (например, раскрытых в таблице 3 данного документа), в растение-потомка.

[0044] Идиоплазма. Как используется в данном документе, термин "идиоплазма" относится к генетическому материалу отдельного растения или группы растений или из них (например, линия растения, сорт или семейство) и клону, полученному из растения или группы растений. Идиоплазма может быть частью организма или клетки или может быть отделенной (например, выделенной) от организма или клетки. Как правило, идиоплазма предусматривает генетический материал со специфичной молекулярной моделью, которая является основой для наследственных качеств растения. Как используется в данном документе, "идиоплазма" относится к клеткам конкретного растения; семенам; ткани конкретного растения (например, ткани из которой можно вырастить новые растения) и несеменным частям конкретного растения (например, лист, стебель, пыльца и клетки).

[0045] Как используется в данном документе, термин "идиоплазма" является синонимом термина "генетический материал" и может быть использован по отношению к семенам (или другому растительному материалу), из которого можно вывести растение. "Банк идиоплазмы" может относиться к организованной коллекции разных семян и другого генетического материала (где каждый генотип уникально определен), из которой можно культивировать известный сорт, и из которого можно получить новый сорт. В вариантах осуществления идиоплазма, которую используют в способе или растении, как описано в данном документе, получена из линии или сорта канолы. В конкретных примерах идиоплазмой являются семена линии или сорта канолы. В частных примерах идиоплазмой является образец нуклеиновой кислоты из линии или сорта канолы.

[0046] Ген. Как используется в данном документе, термин "ген" (или "генетический элемент") может относиться к наследственной последовательности геномной ДНК с функциональной значимостью. Термин "ген" также можно применять по отношению к, например и без ограничения, cDNA и/или mRNA, кодируемых наследственной последовательностью геномной ДНК.

[0047] Генотип. Как используется в данном документе, термин "генотип" относится к генетической структуре особи (или группы особей) на одном или нескольких локусах. Генотип особи или группы особей определяется и описывается аллельными формами на одном или нескольких локусах, унаследованных особями от родителей. Термин генотип можно также применять по отношению к генетической структуре особи на оном локусе, множестве локусов или на всех локусах ее генома. "Гаплотип" представляет собой генотип особи при множестве генетических локусов. В некоторых примерах генетические локусы, описанных гаплотипом, могут быть физически или генетически связаны, т. е. локусы могут быть расположены на одном и том же хромосомном сегменте.

[0048] Элитная линия. Как используется в данном документе, термин "элитная линия" означает любую линию, которая возникла в результате выведения и отбора по лучшим агрономическим характеристикам. Элитное растение представляет собой любое растение из элитной линии.

[0049] Количественный признак. Как используется в данном документе, "количественный признак" может относиться к признаку или фенотипу, которые экспрессированы в разной степени, по преимущественно непрерывному градиенту и часто сцеплены с двумя или более генами, и находятся под влиянием окружающей среды.

[0050] Локус количественных признаков или QTL. Как используется в данном документе, "локус количественных признаков" относится к сегменту или области ДНК, которые содержат или связаны с геном или генами, соответствующими количественному признаку.

[0051] Как используется в данном документе, термин "интервал QTL" может относиться к фрагменту ДНК, которые связаны с геном(ами), соответствующими признаку QTL. Интервал QTL обычно, но необязательно, больше самого QTL. Интервал QTL может содержать фрагменты ДНК, которые являются 5' и/или 3' по отношению к QTL.

[0052] Разработано множество экспериментальных парадигм для идентификации и анализа QTL. См., например, Jansen (1996) Trends Plant Sci. 1:89. Большинство литературных данных о картировании QTL в сельскохозяйственных видах основано на применении бипарентального скрещивания. См. Lynch and Walsh (1997) Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Sinauer Associates, Sunderland. Как правило, эти парадигмы включают скрещивание одной или нескольких родительских пар, которые могут быть, например, одной парой, полученной из двух инбредных линий, или множеством родственных и неродственных родителей разных инбредных линий, каждый из которых проявляет разные характеристики относительно фенотипического признака, представляющего интерес. Как правило, этот экспериментальный протокол включает выведение 100-300 сегрегированных потомков из одного скрещивания двух дивергентных инбредных линий, которые, например, отобраны для максимального увеличения фенотипических и молекулярных маркерных различий между линиями. Родители и сегрегированные потомки генотипируют в отношении маркерных локусов и оценивают по одному или нескольким количественным признакам (например, низкое содержание клетчатки). QTL затем определяют как статистически достоверные ассоциации между генотипическими значениями и фенотипической изменчивостью среди сегрегированного поколения.

[0053] Специалистам в данной области известно множество статистических способов для определения того, сцеплены ли маркеры с QTL (или с другим маркером), и которые включают, например и без ограничения, стандартные линейные модели (например, ANOVA или регрессивное картирование; Haley and Knott (1992) Heredity 69:315); и способы максимального правдоподобия (например, алгоритмы ожидание-максимизация; Lander and Botstein (1989) Genetics 121:185-99; Jansen (1992) Theor. Appl. Genet. 85:252-60; Jansen (1993) Biometrics 49:227-31; Jansen (1994) "Mapping of quantitative trait loci by using genetic markers: an overview of biometrical models," In J. W. van Ooijen and J. Jansen (eds.), Biometrics in Plant breeding: applications of molecular markers, pp. 116-24, CPRO-DLO Netherlands; Jansen (1996) Genetics 142:305-11; and Jansen and Stam (1994) Genetics 136:1447-55).

[0054] Иллюстративные статистические способы включают одноточечный маркерный анализ; картирование интервалов (Lander and Botstein (1989) Genetics 121:185); композитное картирование интервалов; анализ с регрессией со штрафом; комплексный анализ генеалогических схем; MCMC анализ; MQM анализ (Jansen (1994) Genetics 138:871); HAPLO-IM+ анализ, HAPLO-MQM анализ и HAPLO-MQM+ анализ; байесовская MCMC; гребневая регрессия; анализ идентичности по происхождению; и регрессия Хасемана-Элстона, любой из которых подходит относительно конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения. Альтернативные статистические способы, применимые к комплексным популяциям-производителям, которые можно использовать для идентификации и локализации QTL в конкретных примерах, описаны в патенте США 6399855 и публикации международной заявки согласно PCT № W00149104 A2. Все эти подходы являются вычислительно-трудоемкими и их обычно проводят с помощью компьютерных систем, включающих специализированное программное обеспечение. Соответствующие статистические пакеты доступны из множества общих и коммерческих источников и известны специалистам в данной области.

[0055] Маркер. Хотя специфичные последовательности ДНК, которые кодируют белки, в основном хорошо сохранены внутри вида, другие области ДНК (например, некодирующие ДНК и интроны) имеют склонность развивать и накапливать полиморфизм и, таким образом, могут отличаться между особями одного вида. Геномная изменчивость может иметь любое происхождение, например изменчивость может быть следствием вставок, делеций, дупликаций, элементов повторяющейся ДНК, точечных мутаций, рекомбинаций и наличия и последовательности подвижных элементов. Такие области могут содержать полезные молекулярные генетические маркеры. Как правило, любой дифференциально унаследованный полиморфный признак (включая полиморфизмы нуклеиновых кислот), который сегрегируется среди потомков, является потенциальным маркером.

[0056] Как используется в данном документе, термин "маркер" и "молекулярный маркер" относятся к нуклеиновой кислоте или ее кодируемому продукту (например, белок), которые используют в качестве контрольной точки при определении сцепленного локуса. Таким образом, маркер может относиться к гену или нуклеиновой кислоте, с помощью которых можно идентифицировать растения с определенной аллелью. Маркер можно описать как изменчивость на данном геномном локусе. Генетический маркер может быть короткой последовательностью ДНК, такой как последовательность, которая окружает одно изменение пары оснований (однонуклеотидный полиморфизм или "SNP"), или длинной, например, микросателлит/простая повторяющаяся последовательность ("SSR"). "Маркерная аллель" или "маркерная аллельная форма" относится к версии маркера, которая присуща конкретной особи. Термин "маркер", как используется в данном документе, может относиться к клонированному сегменту хромосомной ДНК, и может также или в качестве альтернативы относиться к молекуле ДНК, комплементарной клонированному сегменту хромосомной ДНК. Термин также относится к последовательностям нуклеиновых кислот, комплементарным геномным маркерным последовательностям, таким как праймеры и зонды на основе нуклеиновой кислоты.

[0057] Маркер можно описать, например, как конкретный генетический элемент в конкретной локализации в генетической карте организма. Генетическая карта может быть графическим представлением генома (или части генома, такой как хромосома), где расстояния меду отметками на хромосоме измеряются частотой рекомбинаций между отметками. Генетической отметкой может быть разнообразие известных полиморфных маркеров, например и в частности: маркеры простых повторяющихся последовательностей (SSR); маркеры полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) и маркеры однонуклеотидного полиморфизма (SNP). В качестве примера, SSR-маркеры могут быть получены из геномных или экспрессируемых нуклеиновых кислот (например, метки экспрессируемой последовательности (EST)).

[0058] Дополнительные маркеры включают, например и без ограничения, EST; маркеры полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP) (Vos et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:4407; Becker et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 249:65; Meksem et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 249:74); случайно амплифицированную полиморфную ДНК и изоферментные маркеры. Изоферментные маркеры могут быть использованы в качестве генетических маркеров, например, для отслеживания изоферментных маркеров или маркеров другого типа, которые сцеплены с определенным первым маркером. Изоферменты представляют собой множественные формы ферментов, которые отличаются друг от друга в отношении аминокислотной последовательности (и, таким образом, по отношению к их кодирующим последовательностям нуклеиновых кислот). Некоторые изоферменты являются ферментами, содержащими несколько отличающиеся субъединицы. Другие изоферменты являются либо мультимерными, либо мономерными, но были отщеплены от профермента по разным сайтам в проферментной аминокислотной последовательности. Изоферменты можно охарактеризовать и проанализировать на белковом уровне или на уровне нуклеиновых кислот. Таким образом, любой из описанных в данном документе способов, основанных на нуклеиновой кислоте, можно применить для анализа изоферментных маркеров в конкретных примерах.

[0059] "Генетические маркеры" включают аллели, которые являются полиморфными в популяции, где аллели можно выявить и отличить с помощью одного или нескольких аналитических способов (например, анализ RFLP, анализ AFLP, анализ изоферментных маркеров, анализ SNP и анализ SSR). Термин "генетический маркер" может также относиться к генетическому локусу ("маркерному локусу"), который можно применить в качестве контрольной точки, при идентификации генетически сцепленного локуса (например, QTL). Такие маркеры могут также называться "маркеры QTL".

[0060] Маркеры, соответствующие генетическим полиморфизмам между членами популяции можно выявить способами известными из уровня техники. Они включают без ограничения секвенирование нуклеиновых кислот, способы гибридизации, способы амплификации (например, специфичные в отношении последовательности способы амплификации посредством ПЦР), выявление полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (RFLP), выявление изоферментных маркеров, выявление аллель-специфичной гибридизации (ASH), выявление амплифицированных вариабельных последовательностей растительного генома, выявления самоподдерживающейся репликации последовательностей, выявление простых повторяющихся последовательностей (SSR), выявление случайно амплифицируемых полиморфных ДНК (RAPD), выявление однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и/или выявление полиморфизмов длин амплифицированных фрагментов (AFLP). Таким образом, в определенных примерах настоящего изобретения такие известные способы можно применять для выявления описанных в данном документе аллелей SNP. См., например, таблицу 3 ниже.

[0061] "Отбор с применением маркера" (MAS) представляет собой способ, с помощью которого отбирают фенотипы, исходя из маркерных генотипов. Отбор с применением маркера включает применение маркерных генотипов для идентификации растений для включения в и/или изъятия из программы отбора или посадки.

[0062] Технологии молекулярных маркеров, как правило, повышают эффективность выведения растений с помощью MAS. Аллель молекулярного маркера, которая указывает на неравновесное сцепление с необходимым фенотипическим признаком (например, QTL), предусматривает пригодное средство для отбора необходимого признака в популяции растений. Ключевыми компонентами реализации подхода с помощью MAS являются создание плотной (богатой информацией) генетической карты молекулярных маркеров в идиоплазме растения; выявление по меньшей мере одного QTL на основе статистических ассоциаций между маркером и фенотипической изменчивостью; определение набора особенно пригодных маркерных аллелей на основе результатов анализа QTL; и применение и/или экстраполяция этой информации в отношении текущего набора идиоплазмы для выведения для возможности принятия решений по отбору с применением маркера.

[0063] (Не)равновесное сцепление. Как используется в данном документе, термин "неравновесное сцепление" относится к ситуации, где два маркера независимо сегрегируются; т.е. маркеры случайно перемешиваются среди потомков. Маркеры, которые демонстрируют равновесное сцепление, считаются несцепленными (независимо от того, лежат ли они на одной и той же хромосоме). Как используется в данном документе, термин "неравновесное сцепление" относится к ситуации, где два маркера отщепляются неслучайным образом; т.е. маркеры обладают частотой рекомбинаций менее 50% (а значит, по определению, являются отщепленными менее чем на 50 cM на одной группе сцепления). В некоторых примерах маркеры, которые демонстрируют неравновесное сцепление, считаются сцепленными.

[0064] Сцепленные, тесно сцепленные и крайне тесно сцепленные. Как используется в данном документе, сцепление между генами или маркерами может относиться к феномену, при котором гены или маркеры хромосомы демонстрируют измеримую вероятность быть переданными особям следующего поколения вместе. Таким образом, сцепление одного маркера с другим маркером или геном можно измерить и/или выразить в виде частоты рекомбинаций. Чем ближе два маркера друг к другу, тем вероятность становится ближе к "1". Таким образом, термин "сцепленные" может относиться к одному или нескольким генам или маркерам, которые передаются вместе с геном с вероятностью больше 0,5 (что является закономерным для независимого множества, где маркеры/гены локализованы на разных хромосомах). Когда наличие гена вносит изменения в фенотип особи, считается, что маркеры, сцепленные с геном, являются сцепленными с фенотипом. Таким образом, термин "сцепленные" может относиться к отношениям между маркером и геном или между маркером и фенотипом.

[0065] Относительное генетическое расстояние (определяемая частотой кроссинговера и измеряемая сантиморганами (cM)) обычно пропорционально физическому расстоянию (измеряемому парами оснований), на которое два сцепленных маркера или гена отдалены друг от друга на хромосоме. Один сантиморган определяется как расстояние между двумя генетическими маркерами, которые демонстрируют 1% частоты рекомбинаций (т.е. кроссинговер между двумя маркерами случается раз в 100 клеточных делений). Как правило, чем ближе один маркер к другому маркеру или гену (вне зависимости от того измеряется ли расстояние между ними в виде генетического или физического расстояния), тем теснее они сцеплены. Поскольку хромосомное расстояние приблизительно пропорционально частоте рекомбинаций между признаками, существует приблизительное физическое расстояние, коррелирующее с частотой рекомбинаций. Как используется в данном документе, термин "сцепленные" может относиться к одному или нескольким генам или маркерам, отдаленным на генетическое расстояние менее приблизительно 50 cM. Таким образом, "сцепленные" гены или маркеры могут быть отдалены на менее чем приблизительно 45 cM; менее чем приблизительно 40 cM; менее чем приблизительно 35 cM; менее чем приблизительно 30 cM; менее чем приблизительно 25 cM; менее чем приблизительно 20 cM; менее чем приблизительно 15 cM; менее чем приблизительно 10 cM и менее чем приблизительно 5 cM.

[0066] Как используется в данном документе, термин "тесно сцепленные" может относиться к одному или нескольким генам или маркерам, которые локализованы в пределах 35 cM друг от друга. Таким образом, два "тесно сцепленных" гена или маркера могут быть отдалены на менее чем 36 cM; менее чем 35 cM; менее чем 34 cM; менее чем приблизительно 33 cM; менее чем приблизительно 32 cM; менее чем приблизительно 31 cM; менее чем приблизительно 30 cM; менее чем приблизительно 29 cM; менее чем приблизительно 28 cM; менее чем приблизительно 27 cM; менее чем приблизительно 26 cM; менее чем приблизительно 25 cM; менее чем приблизительно 24 cM; менее чем приблизительно 23 cM; менее чем приблизительно 22 cM; менее чем приблизительно 21 cM; менее чем приблизительно 20 cM; менее чем приблизительно 19 cM; менее чем приблизительно 18 cM; менее чем приблизительно 17 cM; менее чем приблизительно 16 cM; менее чем приблизительно 15 cM; менее чем приблизительно 14 cM; менее чем приблизительно 13 cM; менее чем приблизительно 12 cM; менее чем приблизительно 11 cM; менее чем приблизительно 10 cM; менее чем приблизительно 9 cM; менее чем приблизительно 8 cM; менее чем приблизительно 7 cM; менее чем приблизительно 6 cM; менее чем приблизительно 5 cM и даже меньшие генетические расстояния.

[0067] Как используется в данном документе, термин "крайне тесно сцепленные" может относиться к одному ли нескольким генам или маркерам, локализованным в пределах приблизительно 5,0 cM друг от друга. Таким образом, два "крайне тесно сцепленных" гена или маркера могут быть отдалены друг от друга на менее чем 6,0 cM; менее чем 5,5 cM; менее чем 5,0 cM; менее чем приблизительно 4,5 cM; менее чем приблизительно 4,0 cM; менее чем приблизительно 3,5 cM; менее чем приблизительно 3,0 cM; менее чем приблизительно 2,5 cM; менее чем приблизительно 2,0 cM; менее чем приблизительно 1,5 cM; менее чем приблизительно 1,0 cM; менее чем приблизительно 0,5 cM.

[0068] Чем ближе конкретный маркер к гену, который кодирует полипептид, который вносит изменения в конкретный фенотип (вне зависимости от того измеряется ли в виде генетического или физического расстояния), тем более тесно сцепленным является конкретный маркер с фенотипом. Исходя из вышеуказанного, следует понимать, что маркеры, сцепленные с конкретным геном или фенотипом, включают те маркеры, которые тесно сцеплены и те маркеры, которые крайне тесно сцеплены, с геном или фенотипом. В некоторых вариантах осуществления чем ближе конкретный маркер к гену, который вносит изменения в фенотип низкого содержания клетчатки (вне зависимости от того измеряется ли в виде генетического или физического расстояния), тем более тесно сцепленными являются конкретные маркеры с фенотипом низкого содержания клетчатки. Таким образом, сцепленные, тесно сцепленные и крайне тесно сцепленные генетические маркеры фенотипа низкого содержания клетчатки в каноле могут быть пригодными для программ MAS для идентификации сортов канолы с низким содержанием клетчатки (относительно родительских сортов и/или по меньшей мере одного конкретного традиционного сорта), для идентификации отдельных растений канолы с низким содержанием клетчатки, и для прививания этого признака другим сортам канолы (например, "АС" геном, такой как B. napus) для снижения содержания клетчатки.

[0069] Набор маркеров. Как используется в данном документе, "набор" маркеров или зондов относится к специфичной коллекции маркеров (или данных, полученных из них), которые можно применить для идентификации особей, содержащих искомый признак. В некоторых вариантах осуществления, набор маркеров связанных с фенотипом низкого содержания клетчатки можно применить для идентификации растения канолы с низким содержанием клетчатки. Данные, соответствующие набору маркеров (или данные, полученные от применения таких маркеров) могут храниться на электронном носителе. Вместе с тем, что каждый маркер в группе маркеров может обладать средством в отношении идентификации признаков, отдельно выбранные маркеры из группы и подгрупп, включая некоторые, но не все, маркеры, могут также эффективно идентифицировать особи с признаком, представляющим интерес.

[0070] Аллель. Как используется в данном документе, термин "аллель" относится к одной или нескольким разным нуклеотидным последовательностям, которые встречаются на конкретном локусе. Например, первая аллель может встречаться на одной хромосоме, в то время как вторая аллель может встречаться на второй гомологичной хромосоме; например, так же, как и в разных хромосомах гетерозиготной особи, или между разными гомозиготными или гетерозиготными особями в популяции. В некоторых вариантах осуществления, конкретная аллель на конкретном локусе может быть связана с агрономически необходимым фенотипом (например, низким содержанием клетчатки). В некоторых вариантах осуществления, конкретная аллель на локусе может допускать идентификацию растений без агрономически необходимого фенотипа (например, растения с высоким содержанием клетчатки), таким образом, что эти растения исключают из программы отбора или посадки. Маркерная аллель может отщепляться с предпочтительным фенотипом, таким образом предусматривая преимущество идентификации растений, содержащих фенотип. "Аллельная форма хромосомного сегмента" может относиться к хромосомному сегменту, содержащему нуклеотидную последовательность маркерного аллеля, который вносит изменения в или связан с конкретным фенотипом по одному или нескольким локусам, физически расположенным на хромосомном сегменте.

[0071] Однонуклеотидный полиморфизм. Как используется в данном документе, термин "однонуклеотидный полиморфизм" (SNP) может относиться к изменчивости последовательности ДНК, когда один нуклеотид в геноме (или другой общей последовательности) отличается между представителями одного вида или между парными хромосомами в особи. В некоторых примерах маркеры, связанные с низким содержанием клетчатки, являются SNP-маркерами. Современные высокопроизводительные методики генотипирования, такие как анализы GoldenGate® и INFINIUM® (Illumina, Сан-Диего, штат Калифорния, США) можно применить в точных и быстрых способах генотипирования с помощью мультиплексных SNP от 384-плексных до >100,000-плексных проб на образец. Другие иллюстративные технологии изучения SNP включают секвенирование нуклеиновых кислот (например, секвенирование следующего поколения или NGS), достройка праймера, аллель-специфичная ПЦР (например, KASP), H2-зависимая ПЦР (rhPCR), анализ расплава в анализах мутации амплификации с несоответствием (Melt-MAMA), Masscode™ (Qiagen, Джермантуан, штат Мэриленд.США), Invader® (Hologic, Мэдисон, штат Висконсин, США), последовательная реакция инвазивной амплификации сигнала (SISAR), SnapShot® (Applied Biosystems, Фостер Сити, штат Калифорния, США) и Taqman® (Applied Biosystems, Фостер Сити, штат Калифорния, США). Несмотря на то, что SNP-маркеры очень пригодны, для их открытия необходима доступность информации о высококачественной последовательности ДНК.

[0072] Растение. Как используется в данном документе, термин "растение" может относиться к целому растению, культуре клеток или тканей, полученных из растения, и/или любой части любого из вышеуказанного. Таким образом, термин "растение" охватывает, например и в частности, целые растения; части растения и/или органы (например, листья, стебли и корни); растительную ткань; семена и растительную клетку. Растительная клетка может быть, например и в частности, клеткой в и/или из растения, клеткой выделенной из растения и клеткой полученной с помощью культивирования клетки, выделенной из растения. Таким образом, термин "растение канолы" может относиться, например и без ограничения, к целому растению канолы, нескольким растениям канолы, клетке(ам) растения канолы, протопласту растения канолы, культуре тканей канолы (например, из которой можно регенерировать канолу), каллюсу растения канолы, частям растения канолы (например, семена канолы, цветок канолы, семядоля канолы, лист канолы, стебель канолы, почка канолы, корень канолы, кончик корня канолы) и растительным клеткам канолы, целым в растении канолы или в части растения канолы.

[0073] Растительная линия. Как используется в данном документе, "линия" относится к группе растений, демонстрирующих низкую генетическую изменчивость (например, никакой генетической изменчивости) между особями по меньшей мере одному признаку. Инбредные линии могут быть созданы несколькими поколениями самоопыления и отбора или, в качестве альтернативы, вегетативным размножением от одного родителя с помощью методик культивирования тканей или клеток. Как используется в данном документе, термины "культивар", "сорт" и "тип" являются синонимами, и эти термины относятся к линии, используемой для промышленного производства.

[0074] "Сорт" или "культивар" представляют собой растительную линию, используемую для промышленного производства, которая сохраняет четкие, стабильные и постоянные характеристики при размножении. В случае гибридного сорта или культивара родительские линии имеют четкие, стабильные и постоянные характеристики.

[0075] Пригодный для коммерческих целей. Как используется в данном документе, термин "пригодный для коммерческих целей" относится к растительным линиям и гибридам с достаточными растительной мощностью и плодовитостью, так что фермеры могут получать культуру растительной линии или гибрида с помощью традиционного фермерского оборудования. В конкретных вариантах осуществления товарные продукты растения с описанными компонентами и/или качествами можно экстрагировать из растений или растительных материалов сортов пригодных для коммерческих целей. Например, масло, содержащее необходимые жировые компоненты, можно экстрагировать из семян растительной линии или гибрида пригодных для коммерческих целей, с помощью традиционного оборудования для переработки и экстрагирования. В другом примере, улучшенный каноловый шрот (определен в данном документе) можно получить из дробленых семян растительных линий пригодных для коммерческих целей, которые предусмотрены настоящим изобретением и которые содержат один или несколько маркеров, связанных с низким содержанием клетчатки, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления, растительная линия пригодная для коммерческих целей, является инбредной линией или гибридной линией. "Агрономически элитные" линии и гибриды обычно имеют необходимые агрономические характеристики; например и без ограничения: увеличенный урожай товарного продукта, степень зрелости, устойчивость к заболеваниям и устойчивость к полеганию по меньшей мере одного растения.

[0076] Товарный продукт растения. Как используется в данном документе, термин "товарный продукт растения" относится к сырью, полученному из конкретного растения или части растения (например, растение, содержащее идиоплазму по настоящему изобретению, и часть растения, полученная из растения, содержащего идиоплазму по настоящему изобретению). Товарным продуктом может быть, например и в частности: зерно; шрот; корм; белок; выделенный белок; мука; масло; дробленое или целое зерно или семена; любой пищевой продукт, который содержит любой шрот, масло; или дробленое или целое зерно; или силос.

[0077] Улучшенный каноловый шрот. Как используется в данном документе, термин "улучшенный каноловый шрот" означает каноловый шрот, полученный из семян канолы, которая характеризуется низким содержанием клетчатки и может характеризоваться повышенным содержанием белка и истинной метаболической энергии, а также пониженным содержанием антипитательных факторов, таких как глюкозинолаты, таннины, фитиновая кислота, синапин и эруковая кислота. Шрот с некоторыми или всеми данными характеристиками может предоставить повышенную долю ввода в диету животных видов, особенно моногастричных животных. Улучшенный каноловый шрот, который в настоящем изобретении в данном документе может различным образом называться, как например "ECM", "черно-семенной каноловый ECM", "BSC ECM" или "темно-семенной каноловый ECM". Настоящее изобретение не ограничено черно-семенным каноловым и темно-семенным каноловым ECM.

[0078] Клетчатка представляет собой компонент стенок клетки растений и включает углеводные полимеры (например, целлюлозу (линейный глюкозные полимерные цепи)), гемицеллюлозу (разветвленные цепи гетерополимеров, например, галактозу, ксилозу, арабинозу, рамнозу, с присоединенными фенольными молекулами) и пектины (растворимые полимеры галактуроновой кислоты, ксилозы, арабинозы, с разной степенью метилирования). Клетчатка также включает полифенольные полимеры (например, лигнин-подобные полимеры и конденсированные таннины).

[0079] Качество шрота измеряется процентными отношениями кислотно-детергентной клетчатки (ADF) и нейтрально-детергентной клетчатки (NDF) в нем. Уровни ADF и NDF имеют решающее значение, поскольку они влияют на животную производительность и усваиваемость. ADF представляет собой меру растительных компонентов в наименее усваиваемых домашним скотом кормах, включая целлюлозу и лигнин. NDF определяет большинство структурных компонентов в растительных клетках (т.е. лигнин, гемицеллюлозу и целлюлозу), но не пектин. Пониженные уровни ADF и NDF также обеспечивают более усваиваемый, высококалорийный шрот.

[0080] В конкретных вариантах осуществления, семена растения канолы (например, темно-семенного растения канолы), которые содержат идиоплазму, описанную в данном документе, могут иметь пониженный уровень ADF по сравнению с референтным сортом канолы. В некоторых вариантах осуществления, "высокое" и "низкое" содержание компонентов относится к сравнению между семенами, полученными из референтного растения, содержащего идиоплазму, описанную в данном документе, и семенами, полученными из стандартных сортов канолы. Таким образом, растение, которое предусматривает семена с "низким" содержанием клетчатки может предусматривать семена с более низким содержанием клетчатки, чем наблюдается в семенах, полученных из стандартных сортов канолы.

[0081] Признак или фенотип. Термины "признак" и "фенотип" являются синонимичными в данном документе. Для целей настоящего изобретения признаками, представляющими особый интерес, являются низкое содержание клетчатки и, в некоторых случаях, цвет семенной оболочки. Некоторые сорта канолы проявляют желтый цвет семенной оболочки, в то время как дальнейшие сорта проявляют темный (например, черный, темный и пятнистый) цвет семенной оболочки.

[0082] Цвет семян. Сорта канолы (например, инбредные лини канолы и гибриды) могут характеризоваться цветом семян. Рейтинг цвета семян канолы обычно оценивают по шкале от 1 до 5, согласно семенам, полученным из здоровых растений при или около полной зрелости семян. "1" означает выраженный желтый цвет. "2" означает в целом желтый с вкраплениями коричневого. "3" означает смесь коричневого и желтого. "4" и "5" означают коричневый и черный соответственно.

III. Картирование и валидация признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки из CL044864 и CL065620

[0083] Генетические локусы, соответствующие конкретным фенотипам, таким как низкое содержание клетчатки, можно локализовать в геноме организма. Путем идентификации маркера или кластера маркеров, которые совместно сегрегируются с искомым признаком, селекционер может оперативно отобрать требуемый фенотип, с помощью отбора подходящего маркера (способ, называемый отбором с использованием маркера или MAS). Такие маркеры можно также использовать селекционерам для дизайна фенотипа in silico и для осуществления на практике отбора целого генома.

[0084] Настоящее изобретение предусматривает хромосомный интервал и молекулярные маркеры, ассоциированные с низким содержанием клетчатки в каноле. Определение этих маркеров и/или других сцепленных маркеров можно использовать для отбора, идентификации и/или получения растений канолы с низким содержанием клетчатки и/или для удаления растений канолы из программ отбора или из посадок, которые не предусматривают низкое содержание клетчатки.

[0085] Настоящее изобретение предусматривает способ идентификации и картирования локусов количественного признака (QTL), ассоциированных с низким содержанием клетчатки в Brassica napus, с помощью маркеров однонуклеотидного полиморфизма (SNP). В вариантах осуществления QTL определен в линиях BSC CL044864 и CL065620. В некоторых вариантах осуществления маркеры можно использовать для отбора с помощью маркера признака, представляющего собой низкое содержание клетчатки, полученного из линий BSC CL044864 и CL065620 и их производных.

[0086] Маркеры SNP и генетические карты высокой плотности оптимизировали, а признаки, представляющие собой содержание клетчатки, детально картировали и валидировали из линий BSC CL044864 и CL065620 с обширной группой данных, полученных из четырех дигаплоидных (ДГ) популяций. Эти эксперименты детально описаны в примерах 1-2.

[0087] Таблица 3 предусматривает имена 92 маркеров (SNP), ассоциированных с низким содержанием клетчатки по настоящему изобретению, физические и генетические локализации каждого маркера хромосомы N13 канолы и целевые аллели, ассоциированные с низким содержанием клетчатки. Маркеры по настоящему изобретению описаны в данном документе относительно положений локусов маркеров референтного генома DH12075 в B. napus, секвенированного в AAFC через промышленный консорциум.

[0088] В некоторых примерах настоящего изобретения маркеры и маркерные аллели, ассоциированные с низким содержанием клетчатки, как представлено в таблице 3, можно локализовать в хромосомном интервале, включая без ограничения (a) хромосомный интервал на хромосоме N13, который обозначен от положения пар оснований (п. о.) 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) и до положения пар оснований (п. о.) 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает их; и (b) хромосомный интервал на хромосоме N13, который определен и включает донорный аллель для каждого маркера, представленного в таблице 3. В других примерах маркерные аллели, ассоциированные с низким содержанием клетчатки, включают маркеры, представленные в таблице 3, локализованные на меньшем хромосомном интервале на хромосоме N13 в Brassica napus, который обозначен от положения п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) до положения п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77) и включает их. Как будет понятно специалисту в данной области дополнительные хромосомные интервалы можно выявить с помощью маркеров SNP, предусмотренных в данном документе в таблице 3.

IV. Выявление маркеров низкого содержания клетчатки в каноле

[0089] Варианты осуществления настоящего изобретения включают маркеры, связанные с низким содержанием клетчатки, например в каноле, полученном из линий BSC CL044864 и CL065620 и их производных. Такие маркеры можно использовать, например и без ограничения для идентификации растений или идиоплазмы канолы с повышенной вероятностью содержания фенотипа с низким содержанием клетчатки; для отбора таких растений и идиоплазмы канолы (например, в программе отбора с использованием маркера) и для идентификации и отбора растений и идиоплазмы канолы, не имеющих высокой вероятности содержания фенотипа с низким содержанием клетчатки. Использование одного или нескольких маркеров, описанных в данном документе, может предусматривать преимущества относительно времени, цены и трудоемкости выведения канолы для селекционеров растений по сравнению с ныне доступными композициями и способами в данной области. Например, один или несколько маркеров, описанных в данном документе, могут предусматривать лучшие результаты при выведении с использованием маркера в отношении низкого содержания клетчатки в каноле по сравнению с ныне доступными маркерами для данной цели.

[0090] Способы выявления (идентификации) растений или идиоплазмы канолы, содержащих конкретные аллели маркеров низкого содержания клетчатки, являются признаком некоторых вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления любой из множества протоколов выявления маркеров, доступных из уровня техники, можно использовать для выявления маркерного аллеля, в зависимости от типа выявляемого маркера. В примерах подходящие способы выявления маркеров могут включать амплификацию и идентификацию полученного в результате амплифицированного маркера с помощью, например и без ограничения, ПЦР, LCR; и способы амплификации, основанные на транскрипции (например, выявления SNP, выявление SSR, анализ RFLP и многие другие).

[0091] Как правило, генетический маркер основывается на одном или нескольких свойствах нуклеиновых кислот для его выявления. Например, в некоторых методиках выявления генетических маркеров используется гибридизация зонда нуклеиновой кислоты к нуклеиновой кислоте, соответствующей генетическому маркеру (например, амплифицированная нуклеиновая кислота, полученная с помощью геномной молекулы ДНК канолы в качестве матрицы). Форматы гибридизации, включая, например и без ограничения, анализы жидкой фазы, твердой фазы, смешанной фазы и гибридизации in situ, могут быть пригодными для выявления аллеля в конкретных вариантах осуществления. Обстоятельную инструкцию по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти, например, в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes Elsevier, NY.

[0092] Маркеры, которые соответствуют генетическим полиморфизмам между членами популяции, можно выявить с помощью многочисленных способов, включая, например и без ограничения, способы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, и секвенирование нуклеотидов полиморфной маркерной области. Многие способы выявления (включая способы, основанные на амплификации, и основанные на секвенировании) можно легко приспособить для высокопроизводительного анализа в некоторых примерах, например, с помощью доступных высокопроизводительных способов, таких как секвенирование с помощью гибридизации.

[0093] Соответственно, настоящее изобретение дополнительно предусматривает способы идентификации и/или отбора растения или идиоплазмы с низким содержанием клетчатки, которые включают: (a) выявление в указанном растении или идиоплазме наличия одного или нескольких генетических маркеров, ассоциированных с низким содержанием клетчатки в растении канолы, как описано в данном документе; и (b) отбор указанного растения или идиоплазмы канолы на основе наличия одного или нескольких генетических маркеров, ассоциированных с низким содержанием клетчатки в растении канолы.

[0094] Дополнительно, способы настоящего изобретения включают выявление амплифицированного фрагмента ДНК, ассоциированного с наличием конкретного аллеля SNP. В некоторых вариантах осуществления амплифицированный фрагмент, ассоциированный с конкретным аллелем SNP, имеет спрогнозированную последовательность нуклеиновых кислот, и выявление амплифицированного фрагмента ДНК, имеющего спрогнозированную последовательность нуклеиновых кислот, осуществляют таким образом, что амплифицированный фрагмент ДНК имеет последовательность нуклеиновых кислот, которая соответствует (например, гомологична на по меньшей мере приблизительно 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше) ожидаемой последовательности на основе последовательности маркера, ассоциированного с тем SNP в растении, в котором маркер был выявлен впервые.

[0095] Выявление конкретного аллеля SNP можно осуществлять с помощью любого ряда методик, включая без ограничения использование выявляемых меток. Выявляемые метки, подходящие для применения, включают любую композицию, выявляемую с помощью спектроскопических, радиоскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, электрических, оптических или химических средств. Таким образом, конкретный аллель SNP можно выявить с помощью, например, авторадиографии, флюорографии или других идентичных методик выявления, в зависимости от конкретной метки, подлежащей выявлению. Пригодные метки включают биотин (для окрашивания меченным конъюгатом стрептавидина), магнитные микроносители, флуоресцентные красители, радиометки, ферменты и колориметрические метки. Другие метки включают лиганды, которые связываются с антителами или специфическими мишенями связывания, меченые флуорофорами, хемилюминесцентными агентами и ферментами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения методики выявления включают использование флуоресцентных красителей.

[0096] Для генотипирования SNP доступны несколько способов, включая без ограничения гибридизацию, элонгацию праймера, лигирование олигонуклеотидов, расщепление нуклеазами, минисеквенирование и кодирующие сферы. Такие способы рассматриваются в нескольких публикациях: Gut, Hum. Mutat. 17:475 (2001); Shi, Clin. Chem. 47:164 (2001); Kwok, Pharmacogenomics 1:95 (2000); Bhattramakki and Rafalski, Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants, в PLANT GENOTYPING: THE DNA FINGERPRINTING OF PLANTS, CABI Publishing, Wallingford (2001). Широкий спектр доступных в продаже технологий применяют эти и другие способы для изучения SNP, включая Masscode™ (Qiagen, Джермантаун, штат Мэриленд, США), Invader® (Hologic, Мадисон, штат Висконсин, США), SnapShot® (Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния, США), Taqman® (Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния, США) и Infinium Bead Chip™ (Illumina, Сан-Диего, штат Калифорния, США). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы генотипирования SNP включают применение Infinium Bead Chip™.

[0097] Маркеры SNP по настоящему изобретению и их соответствующие аллели SNP раскрыты в таблице 3 и ассоциированы с низким содержанием клетчатки. Один маркер или комбинацию маркеров можно использовать для выявления наличия растения с низким содержанием клетчатки. Например, маркер может быть расположен в хромосомном интервале, который определяет QTL, или присутствовать в геноме растения в качестве гаплотипа, определенного в данном документе. Хромосомный интервал по настоящему изобретению включает интервал на хромосоме N13, который обозначен от положения пар оснований (п.о.) 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) и до положения п. о. 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает их. Хромосомный интервал по настоящему изобретению также может быть меньшим хромосомным интервалом на хромосоме N13, который обозначен от положения п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) до положения п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77) и включает их.

[0098] Соответственно, в некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрен способ отбора, выявления и/или идентификации растения или идиоплазмы канолы с низким содержанием клетчатки, при этом способ предусматривает: выявление в указанном растении или идиоплазме канолы наличия маркера (например, маркерного аллеля), ассоциированного с низким содержанием клетчатки в растении канолы, где указанный маркер расположен в хромосомном интервале. Хромосомный интервал может содержать, по сути состоять или состоять из хромосомного интервала на хромосоме N13, который обозначен от положения п. о. 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) до положения п. о. 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает их, таким образом идентифицируя и/или отбирая растения или идиоплазму с низким содержанием клетчатки. Также, хромосомный интервал может содержать, по сути состоять или состоять из хромосомного интервала на хромосоме N13, который обозначен от положения п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) до положения п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77) и включает их. В некоторых примерах каждый маркер, описанный в данном документе, можно определить с помощью донорного аллеля, который может представлять собой донорный аллель для каждой маркерной последовательности SEQ ID NO:1-89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:95 и SEQ ID NO:100, описанных в таблице 3.

V. Интрогрессия маркеров для низкого содержания клетчатки в каноле

[0099] Как указано выше, идентификация растений или идиоплазмы канолы, которые включают маркерный аллель или аллели, которые связаны с фенотипом низкого содержания клетчатки, предусматривает базу для осуществления отбора с использованием маркера канолы. Например, отобрано по меньшей мере одно растение канолы, которое содержит по меньшей мере один маркерный аллель, который положительно коррелирует с низким содержанием клетчатки. Для сравнения могут быть отобраны растения канолы, которые содержат маркерные аллели, которые отрицательно коррелируют с низким содержанием клетчатки.

[0100] Таким образом, настоящее изобретение предусматривает способы отбора растений канолы, демонстрирующих низкое содержание клетчатки, предусматривающие выявление в растении наличия одного или нескольких генетических маркеров, ассоциированных с низким содержанием клетчатки, как описано в данном документе. Настоящее изобретение предусматривает (a) способ отбора такого растения, при этом способ предусматривает получение образца геномной ДНК из растения канолы; и (b) выявление образца геномной ДНК по меньшей мере одного генетического маркера, ассоциированного с низким содержанием клетчатки, как описано в данном документе. Выявление может предусматривать выявление одного или нескольких SNP, комбинации SNP (гаплотип) и/или SNP, локализованных в хромосомных интервалах, которые ассоциированы с низким содержанием клетчатки. В некоторых примерах настоящего изобретения интервалом является хромосома N13, который обозначен от положения п.о. 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) до положения п. о. 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает их, включающая генетические маркеры SNP, предусмотренные как SEQ ID NO:1-89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:95 и SEQ ID NO:100, с донорными аллелями, раскрытыми в таблице 3. В другом примере настоящего изобретения способ включает выявление в образце геномной ДНК по меньшей мере одного генетического маркера, локализованного в меньшем интервале N13, который определен и включает от положения п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) до положения п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77), включающий генетические маркеры (SNP), предусмотренные как SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100, имеющие донорные аллели, раскрытые в таблице 3.

[0101] Настоящее изобретение предусматривает способ, предусматривающий перенос с помощью интрогрессии последовательности нуклеиновой кислоты из одного донорного растения канолы с низким содержанием клетчатки в реципиентное растение канолы с высоким содержанием клетчатки с помощью скрещивания растений. Этот перенос можно выполнить с помощью традиционных методик скрещивания. Локусы, ассоциированные с низким содержанием клетчатки, интрогрессируют в некоторые варианты осуществления в коммерческие сорта канолы с помощью отбора с использованием маркера (MAS) или выведения с использованием маркера (MAB). MAS и MAB включают использование одного или нескольких молекулярных маркеров, в которых идентифицирована значительная вероятность совместной сегрегации с требуемым признаком, и которые используются для идентификации и отбора тех растений-потомков, которые содержат один или несколько генов, кодирующих требуемый признак. Как описано в данном документе, такие идентификация и отбор основаны на отборе одного или нескольких аллелей SNP, локализованных в одном из интервалов N13, раскрытом в данном документе, или одного или нескольких маркеров, ассоциированных с аллелями SNP. MAB также можно использовать для выведения почти изогенных линий (NIL), содержащих один или несколько представляющих интерес аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, предоставляя более детализированное исследование эффекта такого(-их) аллеля(-ей), и также является эффективным способом для выведения популяций обратно скрещенных инбредных линий. Растения канолы, выведенные согласно этим вариантам осуществления, могут в некоторых вариантах осуществления приобретать большинство своих признаков из реципиентного растения и получать признак, представляющий собой низкое содержание клетчатки, из донорного растения. Методики MAB/MAS увеличивают эффективность генов обратного скрещивания и интрогрессирования с помощью отбора с использованием маркера (MAS) или выведения с использованием маркера (MAB).

[0102] Таким образом, традиционные методики скрещивания можно использовать для интрогрессии последовательности нуклеиновых кислот, ассоциированной с низким содержанием клетчатки, в реципиентное растение канолы с высоким содержанием клетчатки. Например, инбредные лини растений канолы с низким содержанием клетчатки можно вывести с помощью методик рекуррентного отбора и обратного скрещивания, самоопыления и/или дигаплоидов или любой другой методики, с помощью которой получают родительские линии. В способе рекуррентного отбора и обратного скрещивания низкое содержание клетчатки можно интрогрессировать в реципиентное растение-мишень (рекуррентный родитель) с помощью скрещивания рекуррентного родителя с первым донорным растением, которое отличается от рекуррентного родителя и называется в данном документе "нерекуррентным родителем". Рекуррентный родитель представляет собой растение с высоким содержанием клетчатки и, в некоторых случаях, содержит коммерчески требуемые характеристики, такие как без ограничения сопротивляемость болезням и/или насекомым, ценные питательные характеристики, ценная устойчивость к абиотическому стрессу (включая без ограничения засухоустойчивость, солеустойчивость) и т. п. В некоторых случаях нерекуррентный родитель проявляет низкое содержание клетчатки и включает последовательность нуклеиновых кислот, ассоциированную с низким содержанием клетчатки. Нерекуррентным родителем может быть любой сорт растения или инбредная линия, которые являются перекрестно фертильными с рекуррентным родителем.

[0103] В некоторых примерах раскрытого способа интрогрессии потомка, полученного от скрещивания между рекуррентным и нерекуррентным родителем, обратно скрещивают с рекуррентным родителем. В полученной в результате популяции растений затем осуществляют скрининг в отношении требуемых характеристик, который может происходить несколькими разными путями. Например, можно провести скрининг популяции с помощью схем отбора фенотипических патологий или количественных биотестов, известных из уровня техники. Альтернативно, вместо применения биотестов можно осуществлять MAB с помощью один или несколько вышеописанных в данном документе молекулярных маркеров для выявления того потомка, который содержит последовательность нуклеиновых кислот, ассоциированную с низким содержанием клетчатки. Также можно использовать MAB для подтверждения результата, полученного из количественных биотестов. В некоторых вариантах осуществления маркеры, определенные в данном документе, подходят для отбора подходящих растений-потомков с помощью генотипического скрининга.

[0104] Следуя скринингу гибридные растения F1 с выраженным фенотипом или, в некоторых вариантах осуществления, генотипом с низким содержанием клетчатки, и, таким образом, содержащие необходимую последовательность нуклеиновых кислот, ассоциированную с низким содержанием клетчатки, можно отбирать и обратно скрещивать с рекуррентным родителем на протяжении одного или нескольких поколений для того, чтобы растение канолы становилось все более инбредным. Этот процесс можно осуществлять для одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или более поколений.

[0105] Соответственно, маркеры по настоящему изобретению можно использовать в способах MAS для идентификации, и/или отбора, и/или получения потомка с генетическим маркером, ассоциированным с низким количеством клетчатки. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает способ отбора растения канолы с низким содержанием клетчатки, при этом способ предусматривает выявление в идиоплазме канолы наличие маркера, ассоциированного с низким содержанием клетчатки в растении канолы, где указанный маркер расположен в хромосомном интервале, описанном в данном документе; и отбор растения из указанной идиоплазмы, обирая таким образом растение канолы с низким содержанием клетчатки. Раскрытым хромосомным интервалом может быть интервал N13, который обозначен от положения п. о. 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) до положения п. о. 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает их, включающий генетические маркеры (SNP), предусмотренные как SEQ ID NO:1-89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:95 и SEQ ID NO:100, имеющие донорные аллели, описанные в таблице 3. Раскрытым с помощью способа интервалом также может являться интервал N13, который обозначен от положения п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) до положения п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77) и включает их, включающий генетические маркеры (SNP), предусмотренные как SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100, имеющие донорные аллели, описанные в таблице 3.

[0106] Настоящее изобретение также предусматривает способ получения растения и/или идиоплазмы с низким содержанием клетчатки, при этом способ предусматривает скрещивание первого растения или идиоплазмы канолы со вторым растением или идиоплазмой канолы, где указанное первое растение или идиоплазма канолы содержат внутри своего генома маркер, ассоциированный с низким содержанием клетчатки в растении канолы, где указанный маркер расположен в хромосомном интервале, описанном в данном документе, осуществление сбора семян после скрещивания и выращивание растения-потомка канолы из семени, где указанное растение-потомка канолы содержит в своем геноме указанный маркер, ассоциированный с низким содержанием клетчатки, с получением таким образом растения канолы с низким содержанием канолы. Раскрытым хромосомным интервалом может быть интервал N13, который обозначен от положения п. о. 7301735 (DBSNP143552; SEQ ID NO:1) до положения п. о. 9417330 (DBSNP243314; SEQ ID NO:89) и включает их, включающий генетические маркеры (SNP), предусмотренные как SEQ ID NO:1-89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:95 и SEQ ID NO:100, имеющие донорные аллели, описанные в таблице 3. Раскрытым с помощью способа интервалом также может являться интервал N13, который обозначен от положения п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) до положения п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77) и включает их, включающий генетические маркеры (SNP), предусмотренные как SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100, имеющие донорные аллели, описанные в таблице 3.

[0107] В некоторых примерах второе растение или идиоплазма канолы, используемые в способе по настоящему изобретению, является элитным сортом канолы. В некоторых примерах с помощью скрещивания первого и второго растений канолы, получают растение-потомок канолы или его идиоплазму, имеющие маркер низкого содержания клетчатки, который интрогрессирован в геном таким образом, что он по на меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% идентичный такому элитного сорта канолы.

[0108] Раскрытый способ можно применять для интрогрессии генетического маркера, ассоциированного с низким содержанием клетчатки, описанного в данном документе, в генетический фон без указанного маркера, при этом способ предусматривает скрещивание донора, содержащего указанный маркер, с рекуррентным родителем без указанного маркера; и обратное скрещивание потомка, содержащего указанный маркер, с рекуррентным родителем, где указанного потомка определяют с помощью выявления в его геноме наличия маркера, ассоциированного с низким содержанием клетчатки в растении канолы. Указанный маркер расположен в хромосомном интервале на хромосоме N13, который обозначен от маркера DBSNP143552 (SEQ ID NO:1) на п. о. 7301735 до маркера DBSNP243314 (SEQ ID NO:89) на п. о. 9417330 и включает их. В некоторых примерах указанный маркер локализован на интервале N13, который обозначен от положения п. о. 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:61) до положения п. о. 9375623 (DBSNP243323, SEQ ID NO:77) и включает их. Донорные аллели указанных маркеров определены в таблице 3. Способ предусматривает растение или идиоплазму канолы с низким содержанием клетчатки, содержащие указанный генетический маркер, ассоциированный с низким содержанием клетчатки, в генетическом фоне рекуррентного родителя, интрогрессируя таким образом генетический маркер, ассоциированный с низким содержанием клетчатки, в генетический фон без указанного маркера.

[0109] Настоящее изобретение предусматривает растения и идиоплазмы канолы с низким содержанием клетчатки. Как обсуждалось выше, способы настоящего изобретения можно применять для идентификации, отбора и/или получения растения или идиоплазмы канолы с низким содержанием клетчатки. В дополнение к описанным выше способам растение или идиоплазму с низким содержанием клетчатки можно получить с помощью любого способа при условии, что маркер, ассоциированный с низким содержанием клетчатки в растении канолы, вводят в растение или идиоплазму канолы такими способами, которые включают без ограничения трансформацию (включая без ограничения опосредованную бактерией доставку нуклеиновой кислоты (например, посредством агробактерии)), опосредованную вирусом доставку нуклеиновой кислоты, опосредованную карбидокремниевыми вискерами или вискерами нуклеиновых кислот доставку нуклеиновых кислот, опосредованную липосомами доставку нуклеиновых кислот, микроинъекцию, бомбардровку микрочастицами, электропорацию, соникацию, инфильтрацию, опосредованное ПЭГ поглощение нуклеиновых кислот, а также любой другой электрический, химический, физический (механический) и/или биологический механизм, которые приводят к введению нуклеиновой кислоты в растительную клетку, или любую их комбинацию, трансформацию или слияние протопластов, методику двойных гаплоидов, спасение эмбриона или с помощью любой другой системы переноса нуклеиновых кислот.

[0110] "Введение" в контексте растительной клетки, растения и/или части растения означает приведение нуклеиновой кислоты в контакт с растением, частью растения и/или растительной клеткой таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты получит доступ к внутренней части растительной клетки, и/или клетки растения, и/или части растения. Когда вводят более чем одну молекулу нуклеиновой кислоты, - эти молекулы нуклеиновых кислот можно собрать в качестве части одной полинуклеотидной конструкции или конструкции нуклеиновых кислот, или в качестве отдельных полинуклеотидных конструкций или конструкций нуклеиновых кислот, и можно локализовать на тех же или разных конструкциях нуклеиновых кислот. Соответственно, эти полинуклеотиды можно ввести в растительные клетки единичной трансформацией, отдельными трансформациями или, например, в качестве части протокола скрещивания. Таким образом, термин "трансформация", как используется в данном документе, относится к введению гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку.

[0111] Таким образом, растение канолы ли его часть с генетическим маркером, ассоциированным с низким содержанием клетчатки, которое можно получить с помощью способов, раскрытого в данном случае предмета исследования, являются аспектами раскрытого в данном случае объекта исследования.

[0112] Растение или идиоплазма канолы могут быть потомками от скрещивания между элитным сортом канолы и сортом канолы, содержащим аллель, ассоциированный с низким содержанием клетчатки. В некоторых вариантах осуществления растение или идиоплазма канолы являются на по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичными элитному сорту канолы.

[0113] Растение или идиоплазма канолы могут быть потомками интрогрессии, где рекуррентный родитель является элитным сортом канолы, а донор содержит генетический маркер, ассоциированный (например, SNP, комбинация SNP, SNP, локализованные в хромосомном интервале) с низким содержанием клетчатки в каноле, как описано в данном документе.

[0114] Растение или идиоплазма канолы могут быть потомками от скрещивания между первым элитным сортом канолы (например, контрольной линией) и потомками от скрещивания между вторым элитным сортом канолы (например, рекуррентным родителем) и сортом канолы, содержащем генетический маркер, ассоциированный с низким содержанием клетчатки в растении канолы, как описано в данном документе (например, доноре).

[0115] Другой аспект раскрытого в данном случае объекта исследования относится к способу получения семян, из которых можно вырастить растения канолы с низким содержанием клетчатки. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение растения канолы с низким содержанием клетчатки по настоящему изобретению, скрещивание растения канолы с низким содержанием клетчатки с другим растением канолы и сбор семян, полученных от скрещивания, которые в случае высаживания производят растения канолы с низким содержанием клетчатки.

[0116] Соответственно, настоящее изобретение предусматривает растения, семена и/или культуру тканей канолы, полученную с помощью способов, описанных в данном документе.

[0117] В некоторых вариантах осуществления раскрытый в данном случае объект исследования предусматривает способы анализа геномов растений/идиоплазм канолы для идентификации тех, которые включают требуемые маркеры, ассоциированные с низким содержанием клетчатки. В некоторых вариантах осуществления способы анализа включают амплификацию последовательностей геномов растений/идиоплазм канолы и определение нуклеотидов, присутствующих в одной, нескольких или всех положениях амплифицированных последовательностей.

[0118] Таким образом, настоящее изобретение предусматривает способы выявления аллелей, ассоциированных с низким содержанием клетчатки в каноле. В некоторых примерах распознавание аллеля осуществляют в микротитрационном планшете с помощью технологии Infinium Bead Chip™ и анализа GoldenGate™ аллель-специфичного удлиняющего сегмента на основе ПЦР (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), которым идентифицируют каждый SNP с дискретной флуоресцентной меткой и уникальным адресом для нацеливания на конкретный микроноситель в наборе. В дальнейших вариантах осуществления захватывают продукты реакции или флуоресцентные скопления на микроносителях и определяют аллель SNP, ассоциированный с низким содержанием клетчатки. В некоторых вариантах осуществления аллели SNP канолы соответствуют SNP-маркерам канолы, содержащим нуклеотидную последовательность любой из SEQ ID NO: 1-89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:95 и SEQ ID NO:100.

[0119] Все литературные источники, в том числе публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном документе, настоящим включены посредством ссылки в той мере, в которой они не противоречат явно указанным деталям настоящего изобретения, и, таким образом, включены в той же степени, как если бы каждый литературный источник был отдельно и специально указан как включенный посредством ссылки и был изложен в данном документе в полном объеме. Все литературные источники, обсуждаемые в данном документе, предусмотрены исключительно для их раскрытия перед датой подачи настоящей заявки. Ничего в данном документе не стоит рассматривать как допущение, что изобретатели имеют право на датирование такого изобретения задним числом за счет предыдущего изобретения.

[0120] Следующие примеры включены для демонстрации различных вариантов осуществления настоящего изобретения и рассматриваются как детализированный каталог всех различных путей, которыми настоящее изобретение можно осуществлять, или всех отличительных частей, которые можно добавлять в настоящее изобретение. Специалисты в данной области оценят многократные вариации, и при этом можно сделать дополнения к различным вариантам осуществления без отклонения от настоящего изобретения. Следовательно, дальнейшие описания предназначены для иллюстрирования конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, а не для основательной спецификации всех пермутаций, комбинаций и их вариаций.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Растительные материалы

[0121] Две популяции DH, PG803 и PG818, были выведены из скрещенных линий молодой канолы для идентификации и подтверждения QTL низкого содержания клетчатки. 363 линии DH популяции PG803 были выведены от скрещивания между референтной линией с черными семенами/высоким содержанием клетчатки DH12075 и сортом NEXERA с черными семенами/низким содержанием клетчатки CL044864. Были выведены 367 линий DH популяции PG818 от скрещивания между линиями с черными семенами/низким содержанием клетчатки NEXERA, CL044864 и CL065620 для подтверждения того, что BSC линии имели одинаковый QTL низкого содержания клетчатки на N13. Еще две популяции, PG856 и PG872, также были выведены скрещиванием с желтыми семенами с низким содержанием клетчатки YN01-429 от Министерства сельского хозяйства и продовольствия Канады с CL044864 и CL065620, соответственно, для валидации и подтверждения того, что QTL низкого содержания клетчатки, найденный в CL044864 и CL065620, отличается от QTL низкого содержания клетчатки, найденный в YSC YN01-429. Картирование популяций, используемых в данном исследовании, их цель и результаты описаны в таблице 1 (BSC=семена с черной оболочкой; YSC=семена с желтой оболочкой; HFC=высокое содержание клетчатки; LFC=низкое содержание клетчатки; QTL=локус количественного признака).

Таблица 1 Поп Женский родитель Мужской родитель Размер популяции Количество локализованных маркеров Цель Результат PG803 DH12075 (BSC/HFC) CL044864 (BSC/LFC) 363 (DH) 16,216 Картирование признака LFC из линии BSC CL044864 Выявили QTL LFC из линии BSC CL044864 и детально картировали на 6,2 cM области на N13. PG818 CL044864 (BSC/LFC) CL065620 (BSC/LFC) 367 (DH) 1,427 Проверка аллелизма и взаимодействия между двумя источниками BSC признака LFC. Подтвердили, что CL044864 и CL065620 имели одинаковый LFC QTL на N13. PG856 YN01-429 (YSC/LFC) CL044864 (BSC/LFC) 403 (DH) 3,003 Валидация QTL. Проверка аллелизма и взаимодействия между источниками BSC и YSC признака LFC. Валидировали и подтвердили, что QTL LFC из линии BSC CL044864 и линии YSC YN01-429 отличались. QTL либо BSC, либо YSC достаточно для получения признака LFC. PG872 CL065620 (BSC/LFC) YN01-429 (YSC/LFC) 392 (DH) 2,529 Валидация QTL. Проверка аллелизма и взаимодействия между источниками BSC и YSC признака LFC. Подтвердили QTL LFC из YN01-429 на N09 и QTL LFC из CL065620 на N13. PG2015-1278 DH12075 CL044864 395 (F2) 981 Рекомбинантный отбор для детального картирования N13. Рекомбинанты, отобранные для дальнейшего размножения. PG2017-1514 DH12075/
CL044864 DH12075/CL044864 2845 (F2:F3) 48 Детальное картирование локуса N13 на низкое содержание клетчатки. Сводили локус N13 до области примерно 400 т. п. о.

[0122] Все линии DH из четырех популяций выращивали в полевых условиях в Pike Lake, Saskatchewan, Канада, во время полевых сезонов 2013 и 2014 годов. Все линии DH высаживали в единичные рассадники, где каждая линия имела по участку в 2 рядах. Линии DH выращивали и собирали с помощью стандартных агрономических практик.

Пример 2. Фенотипические, генотипические данные, построение карты сцеплений и локализация QTL.

[0123] Урожай семян, собранный для каждой линии DH, очищали и подвергали химическому анализу для определения содержания ADF с помощью референтного способа AOAC (AOAC официальный способ 973.18). Собирали фенотипические данные за два года в 2013 и 2014 годах. Выделяли геномную ДНК из четырех популяций, описанных в таблице 1. Выведенные из всех четырех популяций линии DH генотипировали с помощью чипа с микроносителями 60K SNP Illumina Infinium® на BeadStation 500 G согласно протоколу производителя (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).

[0124] Индивидуальные локализации для четырех популяций DH, PG803, PG818, PG856 и PG872 строили с помощью MAPMAKER/EXP 3,0 (Lander et al. 1987; Lincoln et al. 1992) при LOD показателе 10,0 и функцией кратирования Холдейна. Карту консенсуса строили с помощью Phenomap Enterprise 3,0 (GeneFlow Inc., Сентервилл, Вирджиния, США). Локализовали в целом 16216 SNP-маркеров. Использовали составное интервальное картирование (CIM) для локализации QTL согласно имплементированной программе QTL Cartographer V2,5 (Wang et al. 2011). LOD показатель 3,0 использовали в качестве порога для идентификации геномных областей, которые значительно влияют на признак, представляющий собой содержание кислотно-детергентной клетчатки.

[0125] Карту для популяции PG803 (CL044864) строили с помощью 363 линий DH и 16216 SNP-маркеров. Выявили один основной QTL, который объяснял 71,5% (2013) и 65,9% (2014) фенотипических вариаций % ADF на хромосоме N13. Этот локус представляет QTL низкого содержания клетчатки из линии BSC CL044864.

[0126] Карту для популяции PG818 (CL044864 x CL065620) строили с помощью 367 линий DH и 1427 SNP-маркеров. Таблица 2 показывает иллюстративные маркеры, полученные с помощью локализации QTL в PG818: CL044864 x CL065620 для изучения аллели и взаимодействия двух QTL признака LFC. Выявили один основной QTL низкого содержания клетчатки на хромосоме N13 в той же области, где был идентифицирован в популяции PG803. Два года данных картирования QTL подтвердили, что в линиях CL044864 и CL065620 BSC имелся такой же QTL низкого содержания клетчатки на N13.

[0127] Использовали популяции PG856 (YN01-429 x CL044864) и PG872 (CL065620 x YN01-429) для изучения взаимодействия между QTL низкого содержания клетчатки YSC N09 из YN01-429 и QTL низкого содержания клетчатки BSC N13 из CL044864 и CL065620 и для дальнейшей валидации QTL BSC N13. Карту для популяции PG856 строили с помощью 403 линий DH и 3003 SNP-маркеров. Карту для популяции PG872 строили с помощью 392 линий DH и 2 529 SNP-маркеров. Подтвердили наличие двух QTL на N09 для YSC и N13 для BSC. Локализовали 92 SNP-маркера в области 6,2 cM возле QTL низкого содержания клетчатки на хромосоме N13, как показано на фиг. 1 и таблице 3.

[0128] Этот пример демонстрирует использование SNP-маркеров и запатентованных генетических карт высокой плотности и валидацию низкого содержания ADF из линий NEXERA BSC CL044864 и CL065620 с помощью двухлетних фенотипических данных из четырех разных популяций DH. Основной QTL, который объясняет ~70% изменчивости ADF, выявили на хромосоме N13 и валидировали в двух разных популяциях. Маркеры внутри этого интервала возле основного QTL содержания ADF можно использовать для MAS при отборе канолы.

[0129] Дополнительное детальное картирование сузило интервал QTL на N13 до области в приблизительно 400 т. п. о., которая фланкировалась и включала маркеры SNP DBSNP02056 (SEQ ID NO:61) и DBSNP243323 (SEQ ID NO:77).

Таблица 2 Хром Генетическое расстояние (cM) Количество маркеров Плотность Покрытие N01 4,0 9 0,50 0,02 N02 73,1 96 0,77 0,89 N03 132,5 180 0,74 0,77 N04 50,0 23 2,27 0,97 N05 12,0 17 0,75 0,04 N06 57,9 79 0,74 0,61 N07 85,4 171 0,50 0,99 N08 23,0 24 1,00 0,60 N09 106,4 71 1,52 0,84 N10 54,9 17 3,43 0,43 N11 80,0 102 0,79 0,83 N12 44,3 88 0,51 0,54 N13 146,9 120 1,23 0,98 N14 74,0 31 2,47 0,96 N15 18,3 20 0,96 0,07 N16 75,8 159 0,48 0,74 N17 30,5 8 4,36 0,13 N18 109,9 135 0,82 0,94 N19 121,1 77 1,59 0,99 Всего 1300,0 1427 0,92 0,68

Таблица 3. SEQ ID NO: Название SNP Положение на карте (cM) Прямой SNP Донорный аллель Физическое расстояние на референтной карте DH12075 1 DBSNP143552 32,4 [A/Г] A N13:7301735..7302454 2 DBSNP251670 32,7 [A/Ц] A N13:7316677..7316877 3 DBSNP251668 33,2 [T/Ц] C N13:7321551..7321669 4 BN_N13_7417614 33,8 [Г/T] T N13:7417464..7417765 5 BN_N13_7425239 33,8 [A/Ц] C N13:7425089..7425389 6 BN_N13_7444161 33,8 [Г/A] A N13:7444061..7444232 7 BN_N13_7444297 33,8 [A/Ц] C N13:7444212..7444364 8 DBSNP229192 34,1 [A/Ц] C N13:7478063..7478364 9 DBSNP00916 34,3 [Ц/Г] G N13:7575499..7576632 10 BN_N13_7600067 34,3 [A/Г] G N13:7599917..7600217 11 BN_N13_7612265 34,9 [A/Г] G N13:7612115..7612415 12 DBSNP153623 34,9 [T/Ц] T N13:7623876..7624441 13 BN_N13_7741311 35,2 [T/Ц] C N13:7741161..7741461 14 BN_N13_7751728 35,2 [T/Ц] C N13:7751578..7751878 15 BN_N13_7793316 35,2 [A/Г] G N13:7793166..7793466 16 BN_N13_7793323 35,2 [A/T] T N13:7793173..7793473 17 DBSNP105065 35,5 [T/Ц] C N13:7856559..7857277 18 DBSNP106640 36,6 [T/Ц] T N13:8233323..8234075 19 DBSNP243494 36,8 [A/Г] A N13:8256200..8256318 20 BN_N13_8260263 36,8 [A/Г] G N13:8260113..8260413 21 DBSNP08830 36,8 [T/Г] T N13:8262111..8262320 22 DBSNP243489 36,8 [A/Г] G N13:8262292..8262408 23 BN_N13_8262719 36,8 [T/A] A N13:8262569..8262869 24 BN_N13_8262755 36,8 [Ц/T] T N13:8262605..8362905 25 BN_N13_8262822 36,8 [Г/T] T N13:8262672..8262972 26 BN_N13_8264765 36,8 [T/Ц] C N13:8264615..8264915 27 BN_N13_8271530 36,8 [Ц/Г] G N13:8271380..8271680 28 BN_N13_8271544 36,8 [T/Ц] C N13:8271394..8271649 29 BN_N13_8271575 36,8 [Г/A] A N13:8271425..8271725 95 n13_59498877 36,8 [Г/T] T N13:8275781..8276181 30 DBSNP243485 36,8 [A/Г] A N13:8300501..8300621 31 DBSNP243479 37,1 [A/Г] A N13:8365919..8366215 32 DBSNP03099 37,1 [T/Ц] C N13:8440074..8440543 33 DBSNP243444 37,1 [T/Ц] T N13:8654910..8655030 34 DBSNP243439 37,7 [T/Ц] C N13:8747789..8748089 35 DBSNP25950 38,1 [A/T] A N13:8845683..8845980 36 DBSNP243419 38,1 [T/Ц] C N13:8865083..8865203 37 DBSNP243415 38,1 [T/Ц] T N13:8877820..8877939 38 DBSNP243386 38,1 [T/Г] T N13:8900069..8900190 39 DBSNP243385 38,1 [A/Г] A N13:8900956..8901076 40 DBSNP243383 38,1 [T/Ц] T N13:8901534..8901657 41 BN_N13_8902116 38,1 [T/Ц] C N13:8901966..8902266 42 BN_N13_8906796 38,1 [A/Г] A N13:8906646..8906946 43 BN_N13_8908503 38,1 [A/T] T N13:8908353..8908653 44 BN_N13_8908557 38,1 [A/T] T N13:8908407..8908707 45 BN_N13_8922223 38,1 [T/Ц] T N13:8922073..8922373 46 BN_N13_8933300 38,1 [A/Г] G N13:8933150..8933450 47 DBSNP243381 38,1 [A/Г] G N13:8936136..8936256 48 BN_N13_8956349 38,1 [A/Г] A N13:8956199..8956499 49 BN_N13_8956369 38,1 [Ц/Г] G N13;8956219..8956519 50 BN_N13_8956470 38,1 [A/Г] G N13:8956320..8956620 51 BN_N13_8956480 38,1 [T/Ц] T N13:8956330..8956630 52 DBSNP243379 38,1 [A/Г] G N13:8956767..8956887 53 DBSNP243378 38,1 [T/Ц] T N13:8961669..8961790 54 DBSNP324221 38,1 [T/Г] T N13:8962358..8963294 55 BN_N13_8965169 38,1 [Г/Ц] C N13:8965019..8965319 56 DBSNP243377 38,1 [A/Ц] C N13:8965871..8965991 57 DBSNP243376 38,1 [T/Г] T N13:8970906..8971026 58 DBSNP243374 38,1 [T/Ц] T N13:8971421..8971541 59 BN_N13_8976803 38,1 [A/T] A N13:8976653..8976953 60 DBSNP243372 38,1 [T/Ц] C N13:8977625..8977777 61 DBSNP02056 38,1 [T/Ц] T N13:8978949..8979328 62 DBSNP90385 38,4 [A/T] T N13:9018526..9018974 63 DBSNP204410 38,4 [T/Ц] T N13:9028926..9029213 64 DBSNP243362 38,4 [T/Г] G N13:9029169..9029469 65 BN_N13_9045055 38,4 [Г/A] A N13:9044905..9045205 66 BN_N13_9054936 38,4 [A/Г] G N13:9054786..9055086 67 DBSNP243360 38,4 [T/Г] G N13:9055229..9055429 68 BN_N13_9055540 38,4 [A/Ц] C N13:9055390..9055690 69 BN_N13_9057319 38,4 [A/Г] A N13:9057169..9057469 70 BN_N13_9057331 38,4 [A/Г] G N13:9057181..9057481 100 DBSNP53263 38,5 [A/Ц] C N13:9086988..9087562 71 BN_N13_9089148 38,5 [T/Г] T N13:9088998..9089298 72 BN_N13_9089216 38,5 [Ц/Г] G N13:9089066..9089366 73 BN_N13_9091158 38,5 [A/Ц] A N13:9091008..9091308 74 BN_N13_9095137 38,5 [A/T] T N13:9094987..9095287 75 BN_N13_9123132 38,5 [A/Г] G N13:9122982..9123282 76 BN_N13_9189237 38,5 [Г/T] G N13:9189087..9189278 77 DBSNP243323 38,6 [T/Ц] C N13:9375506..9375623 78 DBSNP243322 38,6 [A/Г] G N13:9375578..9375698 79 BN_N13_9376703 38,6 [A/Г] A N13:9376553..9376853 80 BN_N13_9378935 38,6 [T/Г] G N13:9378785..9379085 81 DBSNP243321 38,6 [A/Ц] C N13:9379162..9379281 82 DBSNP243319 38,6 [A/Ц] A N13:9379565..9379685 83 DBSNP243318 38,6 [T/Ц] T N13:9379638..9379758 90 n13:58387757 38,6 [Ц/T] T N13:9386901..9387301 84 BN_N13_9388558 38,6 [Ц/Г] G N13:9388408..9388708 85 DBSNP243317 38,6 [A/Г] A N13:9389728..9389846 86 DBSNP243316 38,6 [A/Г] G N13:9414794..9414914 87 DBSNP38517 38,6 [T/Ц] T N13:9416209..9417209 88 DBSNP243315 38,6 [T/Ц] T N13:9416609..9416809 89 DBSNP243314 38,6 [A/T] A N13:9417130..9417330

Пример 3. Анализы TAQMAN™

[0130] Анализы TAQMAN™ были разработаны для двух SNP, которые были высокоспецифичными к донору в зоне-мишени: SNP-маркеры n13:58387757 (SEQ ID NO:90) и n13_59498877 (SEQ ID NO:95). Праймеры и зонды TAQMAN™ для обоих анализов указаны в таблице 4. В аналитической смеси использовали 1,5 мкл ~6 нг/мкл ДНК. Соединяли 18 мкM каждого зонда и 4 мкM каждого праймера для осуществления каждого анализа. Соединяли 13,6 мкл анализа с 1000 мкл мастер-смеси TOUGHMIX (Quanta Beverly, штат Массачусетс, США). Жидкостным манипулятором MERIDIAN (LGC Genomics, Hoddesdon, Хартфордшир, Великобритания) наливали 1,3 мкл смеси на планшет 1536, содержащий ~6 нг сухой ДНК. Планшет запечатывали с помощью лазерного герметизатора Phusion (LGC Genomics, Hoddesdon, Хартфордшир, Великобритания) и подвергали термоциклированию с помощью гидроциклера (от LGC Genomics) со следующими условиями: 94°C в течение 15 мин., 40 циклов при 94°C в течение 30 с, 60°C в течение 1 мин. Продукты ПЦР измеряли при длинах волн 485 (FAM) и 520 (VIC) с использованием планшетного ридера Pherastar (BMG Labtech, Оффенбург, Германия). Значения нормализовали относительно ROX, и строили, и отмечали на диаграмме разброса с помощью программного обеспечение KRAKEN (LGC Genomics, Hoddesdon, Хартфордшир, Великобритания). Генотип определяли с помощью наличия или отсутствия флуоресцентной специфики к SNP, которые анализировали.

Таблица 4 Название SNP Последовательность Функция SEQ ID NO: n13:58387757 CCAAATGAGATTTTC Зонд FAM 91 CCAAATGAAATTTTC Зонд VIC 92 TCTAAAGAAACTATGCAATGTTGTAGAGACAAA Прямой праймер 93 CACAGTTTTTGCTATCTGAGATGTTGT Обратный праймер 94 n13_59498877 ATGAGAGCATTCATATTT Зонд FAM 96 TGAGAGCATGCATATTT Зонд VIC 97 GCAACATAACTAACAAGTTAAACTCCAATATTCA Прямой праймер 98 ACGCAACAAAAGCAACGATTAATCA Обратный праймер 99

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Agrigenetics, Inc.

Buyyarapu, Ramesh

Jetty, Raju

Patterson, Thomas G

Preuss, Ryan

Ripley, Van

Rizvi, Masood

Rounsley, Steve

Tahir, Muhammad

<120> SNP-МАРКЕРЫ И ОТБОР В ОТНОШЕНИИ НИЗКОГО СОДЕРЖАНИЯ КЛЕТЧАТКИ

В ПРЕДСТАВИТЕЛЯХ РОДА BRASSICA

<130> 78760-WO-PCT

<160> 100

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 520

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 1

agcttattag cctcaaaaga agttcttcac aagggtctcc ggaagaagat aggaaatgga 60

catacaacga aagtatggga ggagccctgg ctcccaacgc aaccagcgag agcaccactt 120

agcattgaca acgtctgaga cgaagacttc cgcgttcatc atctaattga tgctcagaat 180

cagtcttgga atctagagat actaaacgca gtcatcgccr cggaggatat tcccaggatt 240

acatcactcc gggtgagccg cacaggtcga catgatagtt acttctggga ttttacgaag 300

tccggagtat actcggtgcg atcaggctac aaaagagccc acgagctcca ctctgcggcc 360

aacccgaacg ttgtaacgga acctagtaca acggaactga agaaagcaac atggaagctc 420

aaagccccat gaaaacttaa acactttcta tggcaagtta caacatgata cctagcgacg 480

gcgaagcaac ttaaagtgag acattgtgct aatgaaagta 520

<210> 2

<211> 201

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 2

gaaggatgat ttattttttg gcgacataag cacactatat aaaggtcaaa acaccattgt 60

tgatctgaaa atcgacagcc actcaagtgt aagtaaatat mtgtagtgat gcatgctttc 120

tgatcttttg caccttaact gtccttaaac catattaccg aaacgtattt atgcaggtgt 180

cgacaaaagt aactgtcaaa a 201

<210> 3

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 3

atggcattgc atgcgttaca tgaaggtagc gagatgtctg aaaccgtttg caattatcca 60

ytatcgtctt agtgcgagaa tcatgtgtgt tctttagagc tttaggtact atagtaatca 120

g 121

<210> 4

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 4

ctccgccgtg ggatttgttg aacgatgaga tcatcgatga ggcagcgctt gatcttcgga 60

ccaccacgtg gagctttccg tcgtcaccta tctccgcatc ggtctgatta acaaaacgat 120

gtttttagtc actaggaaat aaaccggaca kaaccaaatt aataaccgaa ccggaagttc 180

aatgccgttt actcgaaatt tctactttgt ccattaatca agctaaatga aagtcaaaat 240

atttctaata agttgatata tatagaaacc caacaacgac atttgattaa ttaagtacta 300

t 301

<210> 5

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 5

atttattggt tgtgtttggt acttagatta tggagttgta ggggttcacc atgtgggtct 60

gctgtgtgaa aacctagaac ggtcactaga gttttaccag aacattctag gccttgagat 120

caacgaggcg aggccacacg ataagcttcc mtatagagga gcatggttat gggtaggttc 180

agagatgatt catctaatgg agcttccaaa tcctgatcca ttaactggta gacccgagca 240

cggtggtcga gatagacatg cttgtatcgc aatccgagat gtttcagttc tgaaagagat 300

t 301

<210> 6

<211> 172

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 6

gtgtcttcca cccttctaaa atatctaccg agtcaaaagt aatacgcacg tgatgcatat 60

tttccaccgt attttgactt tgctggtcta aattctaatc rtacgtcgta cgaggagatt 120

taaataattg tacagtggtc ggttggaata ataactggtt tcgaggagca at 172

<210> 7

<211> 192

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 7

taactggttt cgaggagcaa ttaatcatac attaacatgg agtatgatct aaacattttc 60

tacatccggc attcatactc aaattmtata tttctatgtg aatctaccgt taagaagagt 120

atgtgtgatt ctattataat tgttctaaca aggttttttt tttgaattct ttctaactag 180

gttttataaa ac 192

<210> 8

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 8

attttctttc ttttggcttg cgtaataaca gaaaaaaccc aactttttga tcaataaaaa 60

aaaactgtac ataaagaaat tgcttcaatg ttttatgcaa caacataaac aagtcaagaa 120

gctaaaaaag atcaaagctt tttctttatt magagtttat ttgacgagtt tatccaacaa 180

cataagcaac cggccctaaa cacctcgatg cagcaacaaa aaaaacccac caaaaaaact 240

cagacgatga aaattttttt tgtcagagat tgcatttgag gatttcatca agcaacaaaa 300

a 301

<210> 9

<211> 451

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 9

tggaagttaa ttttcgcaca aatggaacaa gcgttaaggt taacgttcca gttggtggtg 60

atttgacatt tcacattaac cctgttggcg gactcgtacc acagattgac ggcagattat 120

acgtaaatgg agcccgtgtt tatcctcagg stagcggtgg attcacaata aacgttaacc 180

ctgttgacct gctcgtacct caggctggtg gtggcgtcaa agatgaatat ggatctgaaa 240

accctaaact atctgatcca tctccaggaa tggctaaccc taaggttttc tttgatatga 300

cggtgtgcgg caaaacggtt ggtcggatcg tgatggagct ctttgccgac acgaccccac 360

ggacggcaga gaatttccgc gccctctgta caggcgagaa aggcatgggg aagcttggta 420

agccactcca ttacaaagga tcaatcatcc a 451

<210> 10

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 10

aacggagagt agtattttat tattgggcct tatgcctcct aaaagtatgt tttactatgg 60

gtctatattt ataacctcac gtacctaaaa gctcttaaaa tgttctttac tataaggccc 120

aagaaatctc actgtcaggt ataaatacat rttatcagct ccaaaaccct aactctgaga 180

ttagtagatt acgcactcct ttaagcttat tgtagccgtg ggaagaaaaa gcagagaagc 240

aaatcagcag ccatgggtaa tcgtcctcat agtttatagt ataatttgcc attagattga 300

a 301

<210> 11

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 11

ttctacacaa gaaattaaag gaatcaatgg attgaatgct gagcaaaata caggcttttc 60

tttttgatat ctgtccataa ataccggaga taaccgaggg aatattttta aaccgtgctt 120

agactaatgg gttgattaag ggcccattta ratcttacta tgcgcgtctt aatttccgta 180

attatatact aattaatttt cccggtctca cgcgttcaaa ataatatccg ttaccacgaa 240

gaatcgtctt cttctctcca cttctcactt tctctttcta aaaaactgct tatttagaga 300

g 301

<210> 12

<211> 450

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 12

agctttgact cttcacccta tgtgatctcg acacgctgac tcagtcgtta tcgtgcataa 60

gatgtggggg tttcaatgtt taacacttta ctaatattct agtcgcaatc aattcatttt 120

gttggacacg atcgttgcaa ctttttatcy tatttattag tttatttcaa aaatattgtg 180

taactaacac gtatgaaaac ccatgcctat cgttaaatcc tgggcatccc attaattcat 240

tactcctctt tttaacaaac taggtgctga gaccccccgc gcaagcgcag agctggttac 300

tttggatatc ggtggggcgg tataatttac ggaatgttgg tgttgtttaa gatttgtgta 360

aattaaaaaa taaaatttat tggaaataag acaacaaaat tgatcctagc ttttgacgat 420

taactcaagt tagagacatc tcccaaaacg 450

<210> 13

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 13

cagctctctc aaaggggaac gtggtaataa ttaataaaat ttcttaggtc ttgagacgat 60

aacatattgt tctggtgtca gagagaccgc actttcggat acggtagtgc atggacgtct 120

ctttccacga ttccactcaa aagccaagtt ygttagcttc tcctaggtct acgtagctac 180

atcttatata aaaatgtacc ctaattaata ttttcgttat gtttgtggtc cactaccttc 240

ttcttccttt ttatgattgt tacctctatg gtcttttagg tttaggtcca tagaggaacc 300

t 301

<210> 14

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 14

tactcttttt accttactat ggttttttcc attgggtttt cctggaaagg tttttaacga 60

ggcaacaaag acgttaagcg agagcggata gtgacaccgg cccccaaggg ggagtgttac 120

gaaagtcaaa gaaaaaaaag cagcagccac ygcaattgtt gaaaatataa aaatgtgggg 180

cccgttgcac tatttgcaca gtaaatttct ttctatatat acgaacgttt tcgttcattt 240

gtaatcgcac atcaaccttc tcctctctct ataataaact cttcctatca gtgttaaaaa 300

t 301

<210> 15

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 15

tttccatgca taagtcctta tcaggtgttg gagagagttt catgatgaac tctgtgcccc 60

aaggagtgtt ttgatgccca aagaatgtag atgagtcgtt gaaggatcct agcggccagg 120

cgtagcagca aatgctggtc gctacagaag rtatagcaga aaacctgagg cacccaagta 180

ccatagcggg agtgtgtagc gggctagaga gaccgctagt attgaagcgc tttctacagc 240

ggccagccat agcgacttcg cgaggtcgct atgcgttcaa gacttctaaa atctcccaag 300

t 301

<210> 16

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 16

gcataagtcc ttatcaggtg ttggagagag tttcatgatg aactctgtgc cccaaggagt 60

gttttgatgc ccaaagaatg tagatgagtc gttgaaggat cctagcggcc aggcgtagca 120

gcaaatgctg gtcgctacag aagatatagc wgaaaacctg aggcacccaa gtaccatagc 180

gggagtgtgt agcgggctag agagaccgct agtattgaag cgctttctac agcggccagc 240

catagcgact tcgcgaggtc gctatgcgtt caagacttct aaaatctccc aagtatccta 300

g 301

<210> 17

<211> 519

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 17

atctgttggg gccttttcta gtgattcaat ttgtttaaat ctctttggtt gcactttgat 60

tatatagttg gaatgaaagc tttgctttat ttggttgttc tttttagaat tttcagaagt 120

acatagttaa atcctaaagg catgaaaccc tttcgggcag cactctgtct gcatcaacct 180

taaaacacag gacaaccttt aacgacaaca cctttggcyg tcgggcartg cgctagattg 240

caatggtctg aattctcaag cccccaccaa tcaggcaagc ttacgtcatt gttctgaaac 300

acaaagaata tcaacactcc cataatcgcg gtccctgcat caagcgctgc agagaggatg 360

tagttgtgcc tcgcccacca actcttaaac ctcctgaaga tgtagtagtt gaacacaacc 420

ccaacgatgg tccaggacca atagtgcaca gccttggctt gtggcattga gcttactgca 480

gagaagatca atggaatatg gatgtgtttt agccatttc 519

<210> 18

<211> 750

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 18

atctgttgct gctctttttg tttttttttg gtcaaatttc aggaaatctt agctatgagt 60

atccatatga ttagcaggac tgttcgcaga aattcaatag gagtggcgtt catatgtgca 120

tgtgacaaac gcattggtgc tcaagtcttc cggaacaagc tattcttcat tcttgttagt 180

tcagagatta atcttgtgat gctgttgaat gggttggaga agaaggaatg gaagtgacag 240

tggtttgtcy gcattgccat agcggatgca aatacaaagg caccgctggt tctaggacat 300

ttcacgttat tagctgagtt tgtttttgtg taatatgctt ttattactat aaaaaaagct 360

caatgtttgt ttagtatgct tagaaaacaa tcaaaaactt ttgtgtgttt ggatcttttg 420

tatatttttg tttggataac aatcaaaata tgataatgtc cccaacattt gcacatcaca 480

caaaacaagc tgtcagctaa atcaatgttt acctagtgca tggtagattg atgagcctaa 540

tgcaattgtc accaagggcg tattggttat gctgcatagt gactgagtta agttaagaac 600

caccaaaaac aaatccacaa gagatcaagt taagagacgt tattattgtt ctgttttcat 660

ggtttggaga tgtaattgtt tatcattgac aatggaattt tggaaagaaa aaagcccatt 720

cattatttgg gaattagact tgggacttaa 750

<210> 19

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 19

ggttttatat aactttartt ttcatgaaat tgtatttcgt tragtttttc gggaaaaatt 60

rtacaaagct attttcagca tcttttatct ttaattaatc gtcgttaagt tmggcatggt 120

g 121

<210> 20

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 20

atgtggtgta atcttttaca tttcttacct taaaaaggga ttcagtacat ccattaatta 60

catatgccca ttagtctaca aactgaaagt gcaatgaaga agacatatca aataagtaag 120

atgctaagat gcggaggaaa ctgcaacttg rgttgttctt tctttatcct ttgcctccct 180

aagttgcttc cacttctcaa tggaattagt tcccccgttt tgatcaggta tcttaccatc 240

atcaaggacc ttgtgacacc cggcttacca cctcctttta ttttgaatac agcatcacat 300

t 301

<210> 21

<211> 240

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 21

cgtaggtcgg agtagtatag taggtcctga ttaaatcgcc ttgcgtagaa cggatatgac 60

gaaggtagaa gtagaaaaaa caagtgttag ctcacttggc agcgaaagtt gcagagcgag 120

agagaacaag gttgagaaaa atggcgagca tgtctgcttt ccccgttttc cctctccgct 180

gcttctccgg taactckcat tttcgaatcg cagttctaat ctctcgaaga gtgcctgcag 240

<210> 22

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 22

agatatcgat ttgttaagga attaaaagtt caatttattc tgrttataac ccmgtaaaga 60

racccattaa acgatgtcgt ttcctattca cgttaaatcg ccttgcgtag aacggrtatg 120

a 121

<210> 23

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 23

agctcctgtt aaccaaattt catttaacat caacaccagt gtattcctcc taaccaaatc 60

tacaaatcat cctaaaaccc acccaaaaat aaataaaaat tcaataaaag caataataag 120

aaacttaaaa cacacatttt gttttaacaa wagtcttcaa gtgtactgtc catggagtta 180

tctctcctct gattttccga ccgaactgat ctatttccag tctgctcacc accagactcc 240

accgtagggg gaagcggaga aggcgaggca gactttttct gacgttttct ggagtgtctc 300

a 301

<210> 24

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 24

cagtgtattc ctcctaacca aatctacaaa tcatcctaaa acccacccaa aaataaataa 60

aaattcaata aaagcaataa taagaaactt aaaacacaca ttttgtttta acaatagtct 120

tcaagtgtac tgtccatgga gttatctctc ytctgatttt ccgaccgaac tgatctattt 180

ccagtctgct caccaccaga ctccaccgta gggggaagcg gagaaggcga ggcagacttt 240

ttctgacgtt ttctggagtg tctcacctta atgacacgag tcaaaacctg cacaacgtcc 300

c 301

<210> 25

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 25

ataaaagcaa taataagaaa cttaaaacac acattttgtt ttaacaatag tcttcaagtg 60

tactgtccat ggagttatct ctcctctgat tttccgaccg aactgatcta tttccagtct 120

gctcaccacc agactccacc gtagggggaa kcggagaagg cgaggcagac tttttctgac 180

gttttctgga gtgtctcacc ttaatgacac gagtcaaaac ctgcacaacg tccctcatgt 240

agggacgttt cctcggtgca cgagagatgc atttataagc aaaagccgca acttcattca 300

c 301

<210> 26

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 26

aagatataac atcataaatc cgtcaagatt gaatcaacta aacactgtaa aacaagatcc 60

atatatctcc ttagaagaaa agtctaatct ttatcagtca agagacagtt aaaccaagaa 120

tgcaagatgt atgatcatat cagtcaacat ytaacattaa aaacaaacca aacactctaa 180

aaacattata cattccaata atgtataatc ttttatcagc taagagacaa taaacaaaca 240

aaataagaca ttgcagagga aacacagaga caaacctgta agaatattcc aaaatgccag 300

a 301

<210> 27

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 27

ataatctcac caactcatca tatgaaggta aattggagta atttaattgt gtcaaggatt 60

gatgacagaa aactatatta tccaaatatc cggtttatct tatgaatgca gttgagagtt 120

tggaggttaa taggtgagaa gataaaatgt saaactatat atacttccat atccagttgc 180

aagcagttac aatatgttca cctaaaactc acctaatctc atattcagga ttattagtta 240

tagttcattt tcatccaagg cgacataaat aatgacacca gttcaaaagg acaatatgat 300

g 301

<210> 28

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 28

tcatcatatg aaggtaaatt ggagtaattt aattgtgtca aggattgatg acagaaaact 60

atattatcca aatatccggt ttatcttatg aatgcagttg agagtttgga ggttaatagg 120

tgagaagata aaatgtcaaa ctatatatac ytccatatcc agttgcaagc agttacaata 180

tgttcaccta aaactcacct aatctcatat tcaggattat tagttatagt tcattttcat 240

ccaaggcgac ataaataatg acaccagttc aaaaggacaa tatgatgttc ttgcttattt 300

c 301

<210> 29

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 29

attgtgtcaa ggattgatga cagaaaacta tattatccaa atatccggtt tatcttatga 60

atgcagttga gagtttggag gttaataggt gagaagataa aatgtcaaac tatatatact 120

tccatatcca gttgcaagca gttacaatat rttcacctaa aactcaccta atctcatatt 180

caggattatt agttatagtt cattttcatc caaggcgaca taaataatga caccagttca 240

aaaggacaat atgatgttct tgcttatttc tccaccacca ttctaacaat tccttgatac 300

c 301

<210> 30

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 30

ataatataag tttttaacaa acattagttt gatttcatgt taaactttta ggtttgatat 60

rgttcagctt tcccattaga ctactacggt aaaactaaga atttcttctt ttttytaaag 120

t 121

<210> 31

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 31

ctaaatttta tatagaatca aatgccatag ggtagtgttt tctgctttgc ttgtaaaatg 60

aaaagtttca gtggaaaatt atttttactt aattatttac aggaaatgat ttggaacgaa 120

taaaatgttt gtattggtcc ctgagaaatt rttttcataa tgctagctac tctagttttg 180

taaagaaaaa tgtacctaat agaccacatg cactatcatt taacattgtc ttcactgtca 240

ctattttcct aataatwaat aacatacaaa gtaaggaaaa aacagatttt tatttattta 300

g 301

<210> 32

<211> 1332

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<220>

<221> другой_признак

<222> (1)..(1)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (2)..(2)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (3)..(3)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(4)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (5)..(5)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (6)..(6)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (7)..(7)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (8)..(8)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (9)..(9)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (10)..(10)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (11)..(11)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (28)..(28)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (400)..(400)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (821)..(821)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1285)..(1285)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1286)..(1286)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1287)..(1287)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1288)..(1288)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1289)..(1289)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1290)..(1290)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1291)..(1291)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1292)..(1292)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1293)..(1293)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1294)..(1294)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1295)..(1295)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1296)..(1296)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1297)..(1297)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1298)..(1298)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1299)..(1299)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1300)..(1300)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1301)..(1301)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1302)..(1302)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1303)..(1303)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1304)..(1304)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1305)..(1305)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1306)..(1306)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1307)..(1307)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1308)..(1308)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1309)..(1309)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1310)..(1310)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1311)..(1311)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1312)..(1312)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1313)..(1313)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1314)..(1314)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1315)..(1315)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1316)..(1316)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1317)..(1317)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1318)..(1318)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1319)..(1319)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1320)..(1320)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1321)..(1321)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1322)..(1322)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1323)..(1323)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1324)..(1324)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1325)..(1325)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1326)..(1326)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1327)..(1327)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1328)..(1328)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1329)..(1329)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1330)..(1330)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1331)..(1331)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (1332)..(1332)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 32

nnnnnnnnnn ncagagaaac aaaagaanaa agaaacattc caagaatatc ttagagattt 60

caagaaaaat gggatcaacg gcggagacac agataactcc ggtacaagtc accgacgacg 120

aagccgctct ctttgccatg cagctagcca gcgcctccgt ccttcccatg gttttaaagt 180

ccgcgctaga ccttgatctt ctcgagatca tggccaagaa ctcttctccg atgtctccct 240

ctgagattgc ttctaaactt cagaccaaaa accccgaagc tccggtcatg ctcgaccgaa 300

tcctccgtct tctcacgtct tactccatcc tcacctgctc caaccgaacc attcccggcg 360

gagacagcgt cgagaggaty tacgggcttg gtccggtttn gcaagtactt gaccaagaac 420

gaagatggtg tctctatagc tgctctttgt cttatgaacc aagacaaggt tctcatggaa 480

agctggtacc atttgaaaga tgcaattctt gatggtggga ttccattcaa caaggcttat 540

ggaatgagcg cttttgagta ccacgggaag gatctaaggt tcaacacggt attcaacaat 600

ggaatgtcta accattcaac cattacaatg aagaagattc tcgagaccta taagggtttt 660

gagggtttga cttctttggt tgacgttggt ggtggcattg gtgctactct caaaatgatt 720

gtctctaagt accctgacct taaaggcatc aactttgatc tcccacatgt catcgaagaa 780

gctacttctc atcccggtat tgatcatgtt ggaggagata ntgtttgtaa gtgtccctaa 840

aggtgatgca attttcatga agtggatatg ccacgactgg agcgatgaac actgcgtgaa 900

attcttgaag aactgctacg aggcgcttcc agaggatgga aaagtgatac tagcagagtg 960

tatacttcca gagacaccag actcaagcct ctcgaccaaa caagtagtcc atgttgattg 1020

cattatgttg gctcacaacc ctggaggcaa agaacggacc gagaaggagt tcgaggcatt 1080

agctaaagga tcaggcttca aaggcatcaa tgttgcctgc aatgcttttg gtgtttacgt 1140

tattgagctg ctcaaaaaga tgtaagacac acacacacac acacaatcca tgtaataatg 1200

atattatatg taaacattgc tttcatgtac gtctacttca ccgtctttgt tttaaaacta 1260

tgatgtgtaa taatggttta ttaannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1320

nnnnnnnnnn nn 1332

<210> 33

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 33

tgtagatgtt tataatatta tatgtgaacg ttatatgatc gggtactttt ttctttgaaa 60

yttatatgat cggatactct taacgtaagt acgcatatga ttagcggatc actcacggca 120

g 121

<210> 34

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 34

atatcgaact ctagaatttt caattcataa aatgaatttt taaatattcg gttatamygt 60

aaattcataa agcataaaat aaatattcat aatatattaa catttttctt acttatacac 120

gatttagttt tggtcattga ctatcaaata yattatgcaa gctattgttt tccattttat 180

tttccatttt atgcgagcta ttgttttcca ttttttcatc atctattaat actttttctt 240

tctttaacaa gatttagttt cattccatgt gtcaaacgaa tcatcaagtg cctgytatga 300

a 301

<210> 35

<211> 298

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 35

aagtcttcca tggtagacct tttccctctg aaactacagt acccacagct cawgcttcca 60

tcatcactgt catcacacat aacccttatt aagtactact aaaaaaaaca aatataaaac 120

attggtccaa agccacattg cctacacaac agtaacgtat atcggaaaat cagtttcttc 180

agtacatgta attaattcaa taaccctaca agctattttc tacaacagag acaaatgaac 240

tcactttttc cagccaccac caatgtaccc gccgtcatca actttctcct tcgggata 298

<210> 36

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 36

actagccaaa attgattgtt gggcttttgt aagaaacaca ctttattaat tagatataca 60

ygactattaa ctaccatctt tgacctcaaa acctattarc tacaatcttt gacctagaaa 120

c 121

<210> 37

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 37

gcagtattct tttattgaag agaawattat agttawagtc tcatccatgt caatgtgact 60

yatcaggtat aatatctatg agaaggatga tcaagcatat aacaaaacta gataaccagt 120

m 121

<210> 38

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 38

ccatatatat kcatgtatgt aagcatttac aacactaact aatgcattgt gtatataaat 60

kggtccctaa attttaacta aaacctaggg agtctaagag catcattatc crgmrtttct 120

t 121

<210> 39

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 39

gatatgttga gacgccagtc cacatatgca gtaccgaatg taccwagagt tgataaaaaa 60

rggtaatggt tttctgtgcc tcaaagcaac acagtttagc ttagcaatgc aaggctgact 120

a 121

<210> 40

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 40

tctttgtatg atatgcaacc tcgwtgcaac attttgctcc aaaagctcat gtttatttct 60

ycatttacct gttgtgacct caataaatac taaaagattc gatacaacat gaaaagttar 120

m 121

<210> 41

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 41

agcattctat tctctaaaag cggttatgtt caatcgtttt aaaacttttt ttttctgaac 60

atgtaataaa taattgaaga tctttatttg tattttatgt ctggtttagg tactaatctt 120

tacgcctata tgcattctac gttctttaat ytaaaagctt attgaatagg ttgtaaaaaa 180

caagaattgt atacgtgact ttgtctatgt aaacttggta ttcaaaactg gttgaccaaa 240

ccgtttgata aatatatgga tatttgctga caagaaaaaa gaccaaggac cataattaac 300

a 301

<210> 42

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 42

atccaaatgt tacaaccaaa atacagtgaa aaacacaaag catttacata tttaattgaa 60

tttgatcgat atatctcttt caaataaacc acataggtct cactgccaat aacatccgga 120

atcctttaaa caccgcaatt tttctctcta ragtctctcc cctcagcttc cacaaaccct 180

aaatcagccg tcgcatcttt ttcctctggt gaccggtagc tctcttgctc cggtcgccac 240

cccagtccgt catgcgttct agccttcttc cttagcctct ttgtcctacc cttctccttc 300

t 301

<210> 43

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 43

ttgttgaacc ccaccaatta atatttatca tactcttcgc catttttgat gtttcgggtc 60

atttcacatt tgcttatttc gtatattata aaagaaagca aaactgtaaa caaacttggg 120

aacaaaattc aaactgatat tgttttgttt waaaaaacat ttctattaat ttgcttgatt 180

cttataatag tggtgacatt tagaaccata ataatttgtt cgaacactgt ataactatat 240

atacttacaa aggaccacaa aaatatcttt ctcttcaatt taaaccattc catagtggag 300

a 301

<210> 44

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 44

cgggtcattt cacatttgct tatttcgtat attataaaag aaagcaaaac tgtaaacaaa 60

cttgggaaca aaattcaaac tgatattgtt ttgtttaaaa aaacatttct attaatttgc 120

ttgattctta taatagtggt gacatttaga wccataataa tttgttcgaa cactgtataa 180

ctatatatac ttacaaagga ccacaaaaat atctttctct tcaatttaaa ccattccata 240

gtggagacaa attcaaaatc aatatatccg taacatcatg cacctaggaa ctgttatccc 300

g 301

<210> 45

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 45

cactagcagt ttgatattgt cattctggga catccatttt aatcggagca tttacagctg 60

gtacttgtga cttaatcact ttcttatggt cagtaaatga gtctggtaac tcatatgcta 120

atctttgtaa tagaattatc tccatacatt yattttggac ttccatttac gctctttagt 180

ccgaggatca atgataattc attttaactc attcattctc caacgtaact gtttattttc 240

tccctctatt gttggataga ctaactttga gtctttacat aaatcttata aaagcttcta 300

g 301

<210> 46

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 46

atacccgaaa ccgcacagaa atcactcact cacccatctt cttcatggtg attcttacat 60

agatgagaaa tgattagcac aagacgtttg ttggttgttt aatattcatg cgggatattg 120

tctccttctt cactatttgg taaagctaga rgaaactgtg aaacaaatat actatggtta 180

aattatatat atgatggggc tgattatttg aattggttga gcaggagatt tttttctttg 240

tcaactagca ggggatttac ttatataatt tgtattgtga tgcttgattt acgtgatttc 300

t 301

<210> 47

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 47

ttagtagcag caagatgcgt ttgtgtatct ttcttgtttc taatgcgact gaattgtatt 60

rtatgctggt aaatggtaac tgtgtgtctg tgttaaagaa atatgcaagg acgctagtct 120

t 121

<210> 48

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 48

ttatgtcatt gtgaaagtgt agtttatgaa tgtggtaaac atatttacat aaatatctgc 60

ctgcctggtc ttttttgctt gtagttaatg tatgtagcaa acttactctg tcttcttagt 120

ctagattgat attctgaaaa ttaaatttct ractccaaaa tgttaaactg caatttaatt 180

gaagattgca tatatcaaag gtttaaatgg taggatcacc cgcttgcttt cagtgaactg 240

ggttccaagt tatgtattga acaatactag gatcttcacc ccgcgcaagc gcggggatag 300

a 301

<210> 49

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 49

agtttatgaa tgtggtaaac atatttacat aaatatctgc ctgcctggtc ttttttgctt 60

gtagttaatg tatgtagcaa acttactctg tcttcttagt ctagattgat attctgaaaa 120

ttaaatttct gactccaaaa tgttaaactg saatttaatt gaagattgca tatatcaaag 180

gtttaaatgg taggatcacc cgcttgcttt cagtgaactg ggttccaagt tatgtattga 240

acaatactag gatcttcacc ccgcgcaagc gcggggatag aaggagttcg atttctatgt 300

a 301

<210> 50

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 50

tagattgata ttctgaaaat taaatttctg actccaaaat gttaaactgc aatttaattg 60

aagattgcat atatcaaagg tttaaatggt aggatcaccc gcttgctttc agtgaactgg 120

gttccaagtt atgtattgaa caatactagg rtcttcaccc cgcgcaagcg cggggataga 180

aggagttcga tttctatgta gtaaacaatt gtgcgggcta tatatatttt gtgtcttatt 240

gttttatggt cccatttcat atttatttgc atatttggtt tcataccaca attatctctt 300

g 301

<210> 51

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 51

ttctgaaaat taaatttctg actccaaaat gttaaactgc aatttaattg aagattgcat 60

atatcaaagg tttaaatggt aggatcaccc gcttgctttc agtgaactgg gttccaagtt 120

atgtattgaa caatactagg atcttcaccc ygcgcaagcg cggggataga aggagttcga 180

tttctatgta gtaaacaatt gtgcgggcta tatatatttt gtgtcttatt gttttatggt 240

cccatttcat atttatttgc atatttggtt tcataccaca attatctctt gaattgtcat 300

t 301

<210> 52

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 52

aaatcagaac ggaggccgaa gtataagcaa gaaatatgga cgatagtttg aacaaaaaga 60

rcaataaatt atactgaart gttaagtgtt catgacattt gatcatagtt atatgttcat 120

g 121

<210> 53

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 53

atcactacgg ttcaactttg gcatgctagt gaaccgtagt gatgctagtg atattcccac 60

ygggtcaatt aaccacaaag tgktcatgaa tttctgttct aaggagtttt ggatgcaata 120

c 121

<210> 54

<211> 934

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 54

aactataaca acgaaaacat aatacatgtt ttggctataa ttgtttgagg gcacccacga 60

actcatatcc taaggtagca aaaagatcgc atcctctagc tcgtggacgg ggtaatcgcg 120

gtggaggtaa agaggtggac gtggataatt tcgtctttga cgttatgaac tctccaagta 180

cttgagtttg agaactctcg gtccttactc tatcccttct tctctattag gaacttgtat 240

tacttctaaa catcagctaa ttagctctcg cttatctcta cttttaaaaa ctgcatgact 300

ttgtcatagc tgtaatggtt acttgcaagt aaatagaaag tttttttttt taaaaaagaa 360

gaagataaac gaagaacatg gttacatgga agttaattaa taagaatgac aaatacatat 420

ttacttagaa aatkaagaag agttcggctc cctgacgttc ttaccttttt gttaaaagat 480

aagttcgtgt tctttccatg acaaaagtat atttggtcca ttacatagtt caattttcct 540

tttgtctcta ctatgaaaga ataagttgtt tattgtgtat gtgtttatac atttagacca 600

aaggttttaa cctcaaaagc tttgacttca aaagctgttt cttttgtgaa tttcaaaaat 660

ttcgaccttc tttcacttta aagtctaaag aacggtgtgc acaaaaaaaa aggggtctaa 720

agaacggttt gctttgtaac tttttttgtt caacacattt tcttttaact ttaatacaaa 780

tgagaatcaa aatattattt ttaataagtt attgattagc ctaacaatgt tttatacttt 840

tcagctttgt ttttaaatgt ttttgggttc aattttaaga tcccattctt gttctagtat 900

tcttgttttc actgcagcaa cgtatgatta tgaa 934

<210> 55

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 55

tcataaaaac ggcgagcact gcgacgtcac agctcaaacc cgacacgatg ttcttcgatg 60

actctgtttc ctctgtttct tcatcaaaga gattctttga cctcataaag cctctataca 120

acaaaacaac caagaaacag agcgtcaaca stgtatccac atctcctgcg tctttaccgg 180

cgacggcgag ggagaaacag aggaataata aaccgtcagg gattcgaaga cagcttggga 240

agagccggtc ggcgtctgcg actttgtctc cggcgaagag agtcgacgag tctttacagg 300

t 301

<210> 56

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 56

tctrcaagaa aagccctttc tsaaaaaaga aaaaattcya ccaagaaata tttttrgctc 60

mttactgtga agattaatta tggcatattg tgagatgtgt gacagacgaa gacgacagag 120

t 121

<210> 57

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 57

aggagyaaaa atatgaatga attaagagct ggtgttttat tcgaaattta atatttaggt 60

kacgaaataa attcgaactt cgactttacy gtacagatta atggattgtg tgaatggtga 120

c 121

<210> 58

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 58

tacttaaaca ataacttaaa aatatgtagt atatgtcaca tagtcactcg tttaggtcgt 60

ytgttagcgc atgtaatcaa cccaaatata ctattctagt caacaaagga atgaattcca 120

c 121

<210> 59

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 59

tggacgtctg tggtatcagg gtttgtacga aacttgagag ccaaggaagc agttgctaaa 60

tttcatgaga tgctaggttt gggtttgcaa cccaataact ttacatactt tgcaatcttg 120

atcttgtgtt cctctgtcca gttggtggat wagggcaaga agattcgttc acaggcaata 180

aaggtcgctt ggaggacagc attgatatcg aaaattcact tgtagatatt tagatgaagt 240

gctaggcatc ataaattgtc tgtctcttag acaacgttaa tcttaggtca agcggattac 300

g 301

<210> 60

<211> 201

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 60

cttatcacat tcttgtgttg tactatgcta ccgagtctgc ccttttcaac ctttttgttc 60

tgagtttgct cattttacaa acactttcat caccgtggag ytgtaatgtc ttttgatttg 120

cgattgcaga atgggaccct tggggtgttc cagatgacta cgagtgtgaa gtaattgaga 180

acgatgcacc cattcccaag c 201

<210> 61

<211> 494

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<220>

<221> другой_признак

<222> (432)..(432)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (468)..(468)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> другой_признак

<222> (479)..(479)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 61

aatgtgtgca aggaagagga agactgggag gcgatcgaga agcgtcttgg ctgcggtcaa 60

gtcgaggagc tcatcgagga ggcgcaagat gagctcacac tcattgcgaa gatgatcgaa 120

tgggaccctt ggggtgttcc agatgactac gagtgtgaag taattgagaa cgatgcaccc 180

attcccaagc acgttcctca gcatcgacct ggtcctcttc ctgaggattt ctacagaacc 240

cttgaaggtc taattacaga gtccaaaaca aaaatcccag ctgccgctac ctccactgat 300

ycgcagttga aggagtgagt aacttccagt tctacattgt ttgtttgtgt tctttgttgc 360

tttgtttggc cactgttcag agacagcgag cctatgaata aactggttaa taatctttga 420

aaactagaac anatatcact cgtttcataa atgtttttat ctttcttnct caaagaacng 480

tatgataata caaa 494

<210> 62

<211> 448

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 62

aattcgttca aacttttctg gtagtttgga ttgttttaag gtcttacttt tcctatttgg 60

ccgactctgc atgtccagtt tttgtcatta tactatcaag tgaacattac cctggctaag 120

taactaatta acaattctgg tttctgcaac tagagtgttc tttagttttt gcagctttac 180

tacactcttc attttactac tttcttactt atcaaagtat atgataccaa cagcaagtgt 240

gaagaaaaat gatgacactg aaggttgtca gactaagtat aaaccaaaac ccaattctac 300

ttgactagac aaaaatataa tttgcccaaa aacaaactat ttgaacaaga gagataagat 360

ggaagggaaw cattaattta agaacggatg tttgctccaa caacgaaact taactcagat 420

aaaaaaaaca tgaagatagt ccagaatt 448

<210> 63

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 63

cccgagttga gaactagagt aaggcagtac aaatggtcaa aatcttggcg attcaagttc 60

aaggacaagt caatggaaca cacattatca actggtctct ggtttgtacg gtgataatca 120

gatgcttcta gatgatatag ttsaggaagg ytcagtccta gtggagaagt ttgcctcagt 180

agagatatat aacaaagctc gtttactgct gaagttgatt catatggagt tcattggagg 240

caaagcccgt gacaatgggc tgttagttgc aggtcaaatc aagatttatg tgtgaattct 300

c 301

<210> 64

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 64

aatcaaatgg tggaagacag tgttgatgat caaaaggtgg ttaaaacaat ggttcaagat 60

attaccgacc aagataaacc tactgaagtt aatgctgtta ctgctagcta ctttgttgac 120

gctgaattgc agttgacaag gaaaagcata kagtagcttc tctaatggtg ttgagatgcc 180

tcaggacttg tttgttatca tgaagctgga ttgtgcagat ccatttcgtt gacactacgt 240

ctccccatga agaattgttg agaactagag taaggcagta caaatggtca aaatcttggc 300

g 301

<210> 65

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 65

ctctgtagcc gtaaacttcc ctttatctgc cttaagcaac attccgagaa gatcacggtg 60

gtcgtctcca tcgaccaaag atctctttcg ttcgtttatg atcgacaaaa ggagaccatc 120

gatctctttg cctaactctc tagctttgag rgtttgcttg taggccaaaa tgttgctaaa 180

aggtacccct acgtagcgat ttgagttgaa gagagcgaat tgcacggctc ttaggttttt 240

gaggacttga gctccgtttt ctcccttgac tccgaagctt gtcttagcaa tgatctcacc 300

g 301

<210> 66

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 66

tgtcattata gaatgcaatg atgatggtgt tataatgact taaacaggtt acaatcctcg 60

gaatggctat caagtacggt gggaagtatg tggactcatt tctaaaaggt ataatctctt 120

ccataatttc acacaagagt tgaattacct racgttttgt tggcttattt gagatttgaa 180

acaacaaatg tgcagttttt ttattttcct ggaagcacat tttcaagatc ataatgaatt 240

agtcttccag ctggtaaatt tggtgttctt tgccttttcc tttactgatc tctctgtcca 300

c 301

<210> 67

<211> 201

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 67

cattcagtaa cgataaagcc attgagattt tgaagagaga ttagtgtgca gtcatgtcgt 60

acccrkccag aagttggagc ckcgtgagtt gtacggagaa kagccttcac gttaaacaga 120

aagcgctctg gagatctctt tgttgctggt attttgctgg tgatggctga ttgwttcmtm 180

ccttaaaaaa aaactcatat a 201

<210> 68

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 68

tctctcttca aaatctcaat ggctttatcg ttactgaatg ctgcgaacca tttacgtaga 60

ttctcctcta aaattttcac ttccgaaaac ttgaaatcta aatagatccg aaccaaactc 120

gaaaagatat tcaaacgccc acccctgctt mactccaaca acaacaaaac acaccaatgt 180

caaatagcag ataaactagc actgagtgaa tgctcgtata caacctaatg ccgtagaccg 240

tttatataga ttcgagttta cagttataca acaaaatagt atttattttg gttgcaagaa 300

a 301

<210> 69

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 69

gggacgatct tgaggacgat ttctatgaag agcctaaaag cagcaagaag atgaagaggt 60

ctgatgctac tgcacctaat gatttagatc agaagagcat ccctgaaaag aaacaaggtc 120

caaaggttgt caatttcttt ggatgataca rgaggatcta aaaggtctat caattttgta 180

gggaaatatc agttttttgt tgttctttat ctgcctctag agtttgtgta aggactattt 240

gctatttgga gtttcacaac agtgtcatgt aatggaaccg gtgaaccaca gtcacttctg 300

t 301

<210> 70

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 70

aggacgattt ctatgaagag cctaaaagca gcaagaagat gaagaggtct gatgctactg 60

cacctaatga tttagatcag aagagcatcc ctgaaaagaa acaaggtcca aaggttgtca 120

atttctttgg atgatacagg aggatctaaa rggtctatca attttgtagg gaaatatcag 180

ttttttgttg ttctttatct gcctctagag tttgtgtaag gactatttgc tatttggagt 240

ttcacaacag tgtcatgtaa tggaaccggt gaaccacagt cacttctgtt tcagataatc 300

t 301

<210> 71

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 71

cacccaccat ctcaatgtcc attctggttc gaaaaggaaa cagtacatta ctgggaaaga 60

tgagacttat atggaagact cggtccattg tgttccctcg acagagtttg ctggttcgaa 120

gcgcaagcct tcaggggatt tccaacttga kgatccttgg tcatctagag atcatgagat 180

gtttcatttt gaccctgtca ctgagttccc cgatgcacct ctcaaacctt ctgggatcat 240

tcatcctaat gactcttggc catctaaaga tcctgagagg tttgacaaca agtcaggacc 300

t 301

<210> 72

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 72

atatggaaga ctcggtccat tgtgttccct cgacagagtt tgctggttcg aagcgcaagc 60

cttcagggga tttccaactt gaggatcctt ggtcatctag agatcatgag atgtttcatt 120

ttgaccctgt cactgagttc cccgatgcac stctcaaacc ttctgggatc attcatccta 180

atgactcttg gccatctaaa gatcctgaga ggtttgacaa caagtcagga cctggttctt 240

catcaaagga cacgttctgg gagactgatt ttggagtcga ggataacctt cctggatttg 300

a 301

<210> 73

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 73

ctctgtttcc gtacctgctg cttttgattc gtctctcatc ttggtgagct tcggaaacct 60

caccttcaag catctgttct ggactttcat cgacaaatct ttgtgcttct cttccacgtt 120

ttttttgtct ctctctctgt tacgtaatct mactctctgc tatctcttgc atttcctcta 180

gatttttgtt ctgcagacga aggttgtttg cttcagccaa tttctttgtt gtcaggttct 240

catgctcgtg atcgatcctc gatctctttc tttaaactcc ttaacctgac tctccagttc 300

a 301

<210> 74

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 74

tacggtgata atatgttaag tattatttaa ccaagttggt tattgtctgc taatagtttg 60

accattttgg aaccaatcat ttctcagtat gttttcacct aacgttttca ttgaagttta 120

gtaacgtaac tatcacagtt tttgacaaaa wgagactaat gccatcttta agaccttagt 180

taatctgaac tacttaaaac taagcaccta ttgtgaaaag tgaaaacaaa aagagtacga 240

tgatttcact tgtcatggtc tctttataca aaagcaaact caaaaacact atcaatgcca 300

a 301

<210> 75

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 75

gattacttga cctcttgcct ggaaacatca ggaaacagag ctttgtttgt gtataaatat 60

acatgatcca aagtcctaac tagcccatct ttttaatctt tctggcattt ttcagcttgt 120

tcatgccttt acctgaacat cagttgaact rtcttctctg ttgtatatct gaccaagatt 180

tgatatgttg tttgcaattt gggtagcttc tggagaagga agatcctgca tttcataggt 240

atctttagag ccacttcttg tgatttaata tcaaaagctt cgtgtgagtc actttcatag 300

a 301

<210> 76

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 76

acaaaataat gatttatatc ggctagtctc aaatcaaata taatttcaga ataaaaaaca 60

aactctactt agttgataac cgaactctaa taccatacat aaatttacat catattttgg 120

aaaaagtaaa agtatatgta taagttttaa kttagctaat tacccttagt tttaagtcaa 180

aactataaaa cagtttttat aaaagctttt ttattttttt gggttttgtt ttatataagg 240

aaaaacaaag aaaaacaaaa caccttcaat cgatattctc tattaaatca aaatttacca 300

c 301

<210> 77

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 77

ttgggaaata aaaaagatag agtctacaag atgtatgtta tggttgttag ttccgatttg 60

yagagaaagc tcttatgaga aattggagac attctaacaa aagaaccaca aaaatatgca 120

t 121

<210> 78

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 78

gttatgtata ataataaaac tattctcgtt catagtatca aatttcaaag attatttttg 60

rcttttcatt ttaatttggg aaataaaaaa gatagagtct acaagatgta tgttatggtt 120

g 121

<210> 79

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 79

acagccacta agctcaagct tcacaagccc cttacaccct tgtgctaata tcgtcaaacc 60

aatatcggaa acagaagaag tatacagtcc ctccacgctt cccaccagtc tcaacactct 120

tagactctcg caagcagcga tgccacgtaa ratattatcg ttacacttgc ggagctcgag 180

ctcttgaaga tcggaacagt gctcggctaa accgagtaaa cctagctcag tagcgttagt 240

caccacgagc ttaagcaaat cgcagcttcc tcttcctaac accataagtc ctctgtcgat 300

t 301

<210> 80

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 80

ctacaacaca ttccttttgt aagttatatt cgtcgctttc cacatccttt tccggtgact 60

taaactacaa gcctcgacga ggactgaccc ggtggtaaat ggaccttcta tacccacaga 120

ctctggaatt ttcagactcg cgcttgccct kaagttgcta ccgattcttc ttgtgcatcc 180

tccacctgcg tgtgttagac atcctccacc tgatgtctac gatctactat atttaaaata 240

tataagacaa aaaatacagc tcttcaaaat ttacattttg tatcatagac gaaaggcatc 300

c 301

<210> 81

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 81

wgtacttgga gcttgggtac ggtgaatttt aaacgtttaa gttgtgtaga tgagtgaaac 60

mgaactggtt aagcttagct traaaacttt atatccaatg aatatttcca atattttcaa 120

t 121

<210> 82

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 82

gataattgtt ggtttgattg tatgatgttt taatacttct ctattcattt atgccaactg 60

mtcatgawtt ttrtaattga aatcaaaagc atamtatacc tktgtttcat acatgactat 120

g 121

<210> 83

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 83

caaatktrtc aaagtgattg rttttgtatc aaatgtgttg gtataattgt ttggtttgat 60

ytaaattggt ttagataatt gttggtttga ttgtatgatg ttttaatact tctctattca 120

t 121

<210> 84

<211> 301

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 84

ggttttacgg tgatgtcgtt tcagagagtg aaaagtatcg gtggatgggt cctaaacgct 60

atgattatgt tggaactaaa gtattcttga agcacaggta tttcccttta acatatttac 120

caatttactc ttgccgagat gtgctgaaca stgttgggaa ctatgttaat gcaagatcat 180

atgaggcaga ggtgatgttt gaagaagcag agaacgctaa agcttcaccg ctcacgcgga 240

gcaagacatg gccatttcga agtacaacaa gatcagagaa gatactgtgt cgtgcaaaat 300

g 301

<210> 85

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 85

aatatccgag tgggacttaa gagataggtt tggrtacaaa accaaatyga atcaaaattc 60

raattaagat ccgaaaattt ccgaaattag cttaatatgt tgatcttttg aagattttaa 120

t 121

<210> 86

<211> 121

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 86

tatctatctt cagatgcctg ttattattat attacagata atgttatgag taatgaagac 60

rcaatgtgga ctacccctaa aaatggataa actcatatgc ttgtatgtcg ttacaaatgc 120

a 121

<210> 87

<211> 1001

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 87

aaatcaaaga ctgatgacct ctgccgagga atcttcccgg ccacgacaca ctcttcactc 60

ctgagattag aggagttata cagaggatca gttatctctc tcggttgatg agtctcaaaa 120

gcatccattt tggttatgat gcaaaggaga agagagagag agatgatatt ggtttgaata 180

ttactatgat ggtcatcacg acaacacttg acatttatta tattacagaa aatccctttg 240

acatttgact tcgtagctaa ttaaaagttc cttaaatgaa agaaatggtt acaagtgtca 300

tttgactttt gtagcatttg acttctagtt atctaagtcc agactttctg cctgagatca 360

tgaacgttca attaagaaga gagtttctgt tattatggga aggaagagaa acaaagacac 420

ttaaaacaag actcctaaac ctataattca atctctgtgg aatgaaccct ttcttctagg 480

ggaatgtaac attaaccttt yatcaaaatc atgatgctgt tggaactatc aggcatcttt 540

aaagaccagg aatagcctcc aggttatact tttcttcagc tttttgagct tcgccttccc 600

cactctctgg aggcggtttc ggcttctcca acgcatctag actctggcga tacacatagg 660

aagagctttg ccggttttta ctgctagaat tgcttatttg actagcaaga aaccttcgga 720

tgagccccct cagaaacgga gccaacgtat ctggttcatg ttctaggtaa tacattattc 780

ctcccataca tgcacagaac atagccacct gttttcattg attgtataaa taaaaagatc 840

agttctattg ttaaagagga agaacggttg gtcccttgaa ttgtagtacc tcggcgtttt 900

taatatcagg aagaacgtgg cggttgacaa gtatctccca cagtgaatct cctgctcggg 960

gaagaacgta tagagcaagc tcagagcgtc tcggtttttt c 1001

<210> 88

<211> 201

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 88

aggaagagaa acaaagacac ttaaaacaag actcctaaac ctataattca atctctgtgg 60

aatgaaccct ttcttctagg ggaatgtaac attaaccttt yatcwaaatc atgatgctgt 120

tggamctatc aggcatcttt aaagaccagg aatagcctcc aggttatact tttcttcagc 180

tttttgagct tcgccttccc c 201

<210> 89

<211> 201

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 89

ggttgacaag tatctcccac agtgaatctc ctgctcgggg aagaacgtat agagcaagct 60

cagagcgtct cggttttttc tccagcataa ccgagagagc wgctacacca cccgcgaacc 120

agtaaacgat cttgtggtcc ttggwtgcaa cttttctatg kgcacatatg aaagcctatt 180

tgcaaatggg acataaagta t 201

<210> 90

<211> 401

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<220>

<221> другой_признак

<222> (86)..(86)

<223> n представляет собой A, T, C или G

<220>

<221> другой_признак

<222> (316)..(316)

<223> n представляет собой A, T, C или G

<400> 90

gttctttgtt ttggatggat gccattacat caaatgcatg acctgctcgt tctgttacaa 60

tcacctgatt tcaatggtaa atcaanaata tcaaactaag gacagttata gtatgcacag 120

cgagaaaaac acgtatgtct ttctgtatga gagttatatt atctaaagaa actatgcaat 180

gttgtagaga caaagaaaat ytcatttggc caacacaaca tctcagatag caaaaactgt 240

ggatatctac taaaacgcat aactactcac tttgcttcaa atgactacag aataaacaac 300

aaataactat tgatcnggac aaaccccaaa gaagcaaata caataaatgg taataacatt 360

ttcccctaat gctctaccat agcacacaat aataaatact c 401

<210> 91

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотидный зонд

<400> 91

ccaaatgaga ttttc 15

<210> 92

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотидный зонд

<400> 92

ccaaatgaaa ttttc 15

<210> 93

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотидный праймер

<400> 93

tctaaagaaa ctatgcaatg ttgtagagac aaa 33

<210> 94

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотидный праймер

<400> 94

cacagttttt gctatctgag atgttgt 27

<210> 95

<211> 401

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<220>

<221> другой_признак

<222> (108)..(109)

<223> n представляет собой A, T, C или G

<220>

<221> другой_признак

<222> (111)..(112)

<223> n представляет собой A, T, C или G

<220>

<221> другой_признак

<222> (169)..(169)

<223> n представляет собой A, T, C или G

<220>

<221> другой_признак

<222> (239)..(239)

<223> n представляет собой A, T, C или G

<400> 95

ggcgccagcc tttgcctgta ccggttaggg tcctgggcac gtctccccgc cctgcgaatc 60

gaacagctga cctccccaag gcgcagatac cactggacta tcgagtcnng nnagtagcaa 120

cataactaac aagttaaact ccaatattca tgataatatg ttactatana gtcgtcgtat 180

gaataagaaa atgagagcat kcatatttgt attattttaa ttagtacaag caaattaana 240

ggagatgatt aatcgttgct tttgttgcgt cgcatgtgtg attacttcaa acgtggcagc 300

attttggata tgtcgtcctc tgtcgttaaa ttagggttta aatggagttg ttttcgtttc 360

atgaatttat tacacatatt acgttggacc ttcatgttct a 401

<210> 96

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотидный зонд

<400> 96

atgagagcat tcatattt 18

<210> 97

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотидный зонд

<400> 97

tgagagcatg catattt 17

<210> 98

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотидный праймер

<400> 98

gcaacataac taacaagtta aactccaata ttca 34

<210> 99

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотидный праймер

<400> 99

acgcaacaaa agcaacgatt aatca 25

<210> 100

<211> 590

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 100

gaggctattg gtgtccatgg ggttatctta caatgagctc aacagtccgt ccccaagtgg 60

aaatcaactg aatcttaatg aagcaacagm aycttgttcc ctgccaacca cagactgtct 120

gcttgtcgct tacgagtgag tatcatttat tgctataata ttattctctc aatgatcata 180

gcctttgaaa aatgactttt atgggaagtg gacagggaaa atatttgttg atgaataacg 240

gtaggggtct tttattatga tgattgcaag agctagatag tgctaaatac tgttgcttcc 300

caacctctga catattataa tgacatttgc ttgtgtgaat tgcttttttt tatgctcttt 360

ggatcttttc atgctaagaa acataccttt atctattctt gttcaacatt ttcggctaaa 420

ctgttctttt ggagagtagg caagctagct aactagttct tgctatttta ttctaggcgc 480

atttctccat cttttcctgt ggagaatttc agcgtcattg tagaatatgg aggtccaaat 540

gcatcgccca gagtctcatc tcctttaaag ttggactcct ttccttgctt 590

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ идентификации образца растения Brassica napus, содержащего низкое содержание клетчатки, включающий получение образца нуклеиновой кислоты из растения Brassica napus; скрининг образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, расположенных в хромосомном интервале N13 в Brassica napus, который фланкирован донорным аллелем A в положении 220 SEQ ID NO:1 и донорным аллелем A в положении 101 SEQ ID NO:89, и способ получения шрота Brassica napus с низким содержанием клетчатки, включающий идентификацию образца растения этим способом; способ получения растения Brassica napus, содержащего низкое содержание клетчатки, включающий выделение или получение образца нуклеиновой кислоты из каждого из одного или нескольких растений Brassica napus или их идиоплазмы; скрининг каждого образца и отбор первого растения Brassica napus или его идиоплазмы; затем скрещивание первого растения со вторым растением с получением растений-потомков, где растения-потомки содержат один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, и способ получения шрота Brassica napus с низким содержанием клетчатки, включающий получение растения Brassica napus с признаком низкого содержания клетчатки, получение семян из растения Brassica napus и производство шрота из семян. Изобретения обеспечивают расширение арсенала способов снижения содержания клетчатки в каноле. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Способ идентификации образца растения Brassica napus, который предусматривает признак, представляющий собой низкое содержание клетчатки, при этом способ включает:

a. получение образца нуклеиновой кислоты из растения Brassica napus;

b. скрининг образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, расположенных в хромосомном интервале N13 в Brassica napus, который фланкирован донорным аллелем A в положении 220 SEQ ID NO:1 и донорным аллелем A в положении 101 SEQ ID NO:89 и включает их, где маркерный аллель служит признаком низкого содержания клетчатки в Brassica napus.

2. Способ по п. 1, где способ включает скрининг в отношении одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, под SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95 или 100.

3. Способ по п. 1 или 2, где способ включает скрининг в отношении одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, расположенных в хромосомном интервале N13 в Brassica napus, который фланкирован донорным аллелем T в положении 301 SEQ ID NO:61 и донорным аллелем C в положении 61 SEQ ID NO:77 и включает их.

4. Способ по п. 3, где способ включает скрининг в отношении одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, под SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где образец растения Brassica napus содержит один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, в SEQ ID NO:90 или SEQ ID NO:95.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где скрининг в отношении одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, включает амплификацию посредством аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенирование нуклеиновых кислот.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где скрининг в отношении одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, предусматривает применение зонда на основе нуклеиновой кислоты, содержащего SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO 96 или SEQ ID NO:97, или комбинацию указанных зондов.

8. Способ по любому из пп. 1-7, при этом способ включает:

a. получение образцов нуклеиновой кислоты из каждого растения среди множества растений в популяции растений;

b. скрининг каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, согласно способу по любому из пп. 1-7 и

c. отбор (i) одного или нескольких растений из популяции, в которой наличие маркерного аллеля, связанного с низким содержанием клетчатки, идентифицировано с помощью скрининга на стадии b, или (ii) идиоплазмы из одного или нескольких растений из популяции, в которой наличие маркерного аллеля, связанного с низким содержанием клетчатки, идентифицировано с помощью скрининга на стадии b.

9. Способ получения шрота Brassica napus с низким содержанием клетчатки, включающий

a. идентификацию образца растения Brassica napus с признаком низкого содержания клетчатки, в соответствии с любым из пп. 1-8, где идентифицированный образец получен из растения Brassica napus, имеющего признак низкого содержания клетчатки;

b. получение семян из растения Brassica napus; и

c. производство шрота из семян.

10. Способ получения растения Brassica napus, содержащего признак, представляющий собой низкое содержание клетчатки, при этом способ включает

a. выделение или получение образца нуклеиновой кислоты из каждого из одного или нескольких растений Brassica napus или их идиоплазмы;

b. скрининг каждого образца в отношении нуклеиновой кислоты, содержащей один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, расположенных в хромосомном интервале N13 в Brassica napus, который фланкирован донорным аллелем A в положении 220 SEQ ID NO:1 и донорным аллелем A в положении 101 SEQ ID NO:89 и включает их;

c. отбор первого растения Brassica napus или его идиоплазмы, в которых наличие одного или нескольких маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки, идентифицировано с помощью скрининга на стадии b; и

d. скрещивание первого растения, отобранного на стадии с, со вторым растением с получением растений-потомков, где растения-потомки содержат один или несколько маркерных аллелей, связанных с низким содержанием клетчатки.

11. Способ по п. 10, где маркерные аллели представляют собой один или несколько под SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95 или 100.

12. Способ по п. 10 или 11, где первое растение Brassica napus и растения-потомки содержат маркер, связанный с низким содержанием клетчатки, (i) расположенный в хромосомном интервале N13 в Brassica napus, который фланкирован положением пары оснований 8978949 (DBSNP02056, SEQ ID NO:92) и положением пары оснований 9375623 (SEQ ID NO: 77) и включает их, (ii) из линии CL044864 или ее производных, (iii) из линии CL065620 или ее производных, (iv) SEQ ID NO:61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 100, (v) SEQ ID NO:90 или (vi) SEQ ID NO:95.

13. Способ по любому из пп. 10-12, где по меньшей мере один маркерный аллель выявлен с помощью специфичной в отношении последовательности амплификации, основанной на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

14. Способ по любому из пп. 10-13, где по меньшей мере один маркерный аллель выявлен с помощью зонда на основе нуклеиновой кислоты, содержащего SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO:97 или комбинацию указанных зондов.

15. Способ получения шрота Brassica napus с низким содержанием клетчатки, включающий

a. получения растения Brassica napus с признаком низкого содержания клетчатки, в соответствии с любым из пп. 10-14;

b. получение семян из растения Brassica napus; и

c. производство шрота из семян.