Способ оздоровления картофеля от вирусных инфекций in vitro Российский патент 2023 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, биотехнологии и может быть использовано для оздоровления растений от вирусов, в частности, в безвирусном семеноводстве картофеля.

Картофель относится к интенсивным сельскохозяйственным культурам. По разносторонности хозяйственного использования урожая и сбору сухого вещества с единицы площади он занимает одно из первых мест среди других сельскохозяйственных культур. Для значительной части населения он входит в число основных продуктов питания. Картофель сильно поражается патогенами грибной, бактериальной и вирусной природы.

Известно около 40 вирусов, поражающих картофель (О.Ю. Антонова и др., 2017). В большинстве регионов мира, производящих картофель, встречаются 16 вирусов, из них в Российской Федерации наиболее вредоносны пять: вирус скручивания листьев картофеля, ВСЛК (potato leaf roll virus, PLRV); Y вирус картофеля, YBК (Potato virus Y, PVY); X вирус картофеля, ХВК (Potato virus X, PVX); S вирус картофеля, SBK (Potato virus S, PVS); M вирус картофеля, МВК (Potato virus M, PVM) (E.B. Рогозина и др., 2016). Вирусные болезни обусловливают снижение урожайности картофеля на 50 и более процентов, ухудшается качество клубней (Б.В. Анисимов, 2010). Поэтому в современном семеноводстве картофеля обязательным этапом является получение оздоровленного посадочного материала биотехнологическими методами.

Для оздоровления сортов картофеля от вирусной инфекции применяются различные приемы: культура апикальных меристем (Э.В. Трускинов, 1976), термо-, химио- (Л.Н. Трофимец, и др., 1988), крио-, электропарация или разные сочетания этих методов (Ю.В. Ухатова и др., 2016); В.И. Куликова и др., 2020). Разработан также способ на основе воздействия на экспланты картофеля импульсного магнитного поля (патент РФ №2761498, МПК A01G 7/04 А01С 1/00, опубл. 08.12.2021). Недостатком этого способа является необходимость приобретения установки, обеспечивающей обработку импульсным магнитным полем, а также его ограниченная эффективность - достигается оздоровление только от одного вируса PVS.

Широко используется химиотерапия, основанная на обработке инфицированных растений веществами с противовирусной активностью. Наиболее часто для химиотерапии растений картофеля in vitro применяется рибавирин - синтетический аналог гуанозина (1-бета-D-рибофуранозил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид). Наиболее высокая эффективность рибавирина показана в отношении вирусов картофеля М, L, S, X и Y (I.V. Kim и др., 2021; Badarau C.L., Chiru N.). Недостатком его применения на картофеле является то, что низкие дозы препарата малоэффективны, а высокие приводят к угнетению роста растений.

При оздоровлении картофеля все большее применение находят ингибиторы вирусов природного происхождения, например, хитозан (Т.А. Евстигнеева, 2012; В.И. Куликова и др., 2020; I.V. Kim и др., 2021). Известен способ защиты картофеля от вирусов X и Y, который предполагает использование концентрированного состава, содержащего в мас. %: хитозан с М.м. 30-40 кДа, степенью деацетилирования 75-90% - 4-5, янтарная кислота-4-5, натрий салицилово-кислый-1-2,бензиламинопурин(6-БАП)-0,02-0,04 (Пат. РФ №2567643, МПК A01N 63/02, опубл. 10.11.2015 Бюл. №31). Недостатком данного способа является сложность приготовления многокомпонентного состава, который освобождает растения картофеля только от двух вирусов X и Y.

Наиболее близким к заявленному изобретению является метод комплексной антивирусной химио-термотерапии для оздоровления растений картофеля in vitro, включающий три последовательных цикла выращивания in vitro растений на среде Мурасиге-Скуга с рибавирином (30 мг/л) при температуре 37°С в течение 4 недель (О.Ю. Антонова и др., 2017).

Цель настоящего изобретения - получение микрорастений картофеля свободных от вирусов М, L, S в культуре in vitro с помощью использования в качестве противовирусного средства каррагинанов.

Указанная цель достигается тем, что способ оздоровления картофеля от вирусных инфекций in vitro включает посадку асептических апексов размером 2-4 мм на питательную среду Мурасиге и Скуга без фитогормонов, содержащую антивирусные вещества (ABB). Согласно изобретению в качестве ABB используют смесь каппа и лямбда каррагинанов в соотношении 70:30, добавленную в количестве 1,0 г/л среды, при длительности культивирования эксплантов не менее 100 суток.

По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа оздоровления картофеля от вирусных инфекций in vitro является:

1. «…в качестве ABB используют смесь каппа и лямбда каррагинанов в соотношении 70:30…»:

- впервые для оздоровления растений картофеля от вирусов использовано вещество природного происхождения - полисахарид (смесь каппа и лямбда каррагинанов в соотношении 70:30), выделенный из водорослей Chondrus armatus (Yermak I.M. и др., 1999; Максема И.Г. и др. 2012);

- применение природного полисахарида (каррагинана), по сравнению с синтетическим препаратом рибавирином, не оказывает фитотоксического действия на растения картофеля in vitro;

- каррагинаны являются безопасными для человека и окружающей среды;

2. «…добавленную в количестве 1,0 г/л среды…», что позволяет:

- уменьшить содержание агара с 6,0-8,0 г/л (стандартное содержание) до 5,0 г/л среды и снизить затраты на приобретение агара микробиологического, за счет того, что каррагинаны обладают способностью образовывать вязкие растворы и прочные гели (I.M. Yermak, Yu. S. Khotimchenko, 2003);

3. «…при длительности культивирования эксплантов не менее 100 суток», что позволяет:

- существенно сократить срок получения оздоровленных от вирусов растений со 180 (О.Ю. Антонова и др., 2017) до 100 суток;

- снизить затраты на производство безвирусных растений картофеля in vitro;

- увеличить выход оздоровленных безвирусных растений in vitro.

Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели доказывают, что заявляемый способ оздоровления картофеля от вирусных инфекций in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.

Техническим результатом изобретения является использование в качестве антивирусного вещества (ABB) смеси каппа и лямбда каррагинанов в соотношении 70:30, добавленной в количестве 1,0 г/л среды, при длительности культивирования эксплантов не менее 100 суток.

Предлагаемый способ оздоровления картофеля от вирусных инфекций in vitro осуществляют в изобретении следующим образом. До начала оздоровления клубни картофеля тестируются на зараженность вирусами методом ПЦР. В культуру in vitro изолируются асептические апексы проростков размером 2,0-4,0 мм, выделенные из клубней с минимальным количеством вирусов. Культивирование эксплантов проходит на питательной среде с минеральной основой по Мурасиге и Скуга без добавления фитогормонов следующего состава, (мг/л):

Аммоний азотнокислый (NH₄NO₃) - 1650

Калий азотнокислый (KNO₃) - 1900

Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH₂PO₄) - 170

Магний сернокислый семиводный (MgSO₄×7Н₂О) - 370

Кальций хлористый двухводный (CaCl₂×2Н₂О) - 440

Железо сернокислое семиводное (FeSO₄×7Н₂О) - 27,8

Трилон Б (Na₂ЭДТА×2H₂O) - 37,3

Борная кислота (Н₃ВО₃) - 6,2

Марганец сернокислый четырехводный (MnSO₄×4H₂O) - 22,3

Кобальт хлористый шестиводный (CoCl₂×6Н₂О) - 0,025

Медь сернокислая пятиводная (CuSO₄×5Н₂О) - 0,025

Цинк сернокислый семиводный (ZnSO₄×7H₂O) - 8,6

Натрий молибденовокислый двухводный (NaMoO₄×2H₂O) - 0,25

Калий йодистый (KI) - 0,83

Тиамин-HCl - 0,5

Пиридоксин-HCl - 0,5

Сахароза - 20000

Агар микробиологический - 5000,0

Каррагинаны - 1000,0

При рН от 5,6-6,0.

Стерилизацию питательной среды осуществляют при 0,9 атм в течение 20 минут в стерилизаторе паровом ГК-100-3. Инструменты (пинцеты и скальпели) стерилизуют сухим жаром в сухожаровом шкафу FD 240 (Binder) в течение 2 ч при температуре 280°С. Экспланты растений картофеля пассируют на питательную среду в стерильных условиях ламинар-бокса (БАВнп-01-«Ламинар-С»). Культивирование материала проводят на фитостеллажах при освещенности 4,5-5,0 клк, температуре +22±3°С, 16 часовом световом дне, влажности воздуха 60-70%.

Продолжительность противовирусной терапии на среде с каррагинанами составляет не менее 100 дней (два субкультивирования). Микрорастения из каждой пробирки тестируются методом ПЦР-анализа на наличие вирусной инфекции. Тестирование микрорастений через 55 суток культивирования на среде с каррагинанами показало, что освобождение от вирусов не произошло. В таблице представлены результаты оздоровления трех сортов картофеля (Орион, Посейдон, Беллароза) с использованием смеси каппа и лямбда каррагинанов через 55 суток и через 100 суток применения противовирусной терапии.

ПЦР анализ подтвердил отсутствие вирусных инфекций только через 100 суток культивирования на среде с противовирусным веществом в виде смеси каррагинанов. Применение каррагинанов позволяет освободить от вируса PLRV 74% эксплантов, PVM - 70%, PVS - 72% и получать здоровые от вирусной инфекции микрорастения.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с прототипом, ускорении процесса оздоровления, снижении себестоимости среды за счет замены части дорогостоящего агара микробиологического на каррагинан.

Литература

Анисимов, Б.В. Вирусные болезни и их контроль в семеноводстве картофеля / Б.В. Анисимов // Защита и карантин растений. - 2010. - №5. - С. 12-18.

Антонова О.Ю. Оздоровление микрорастений трех культурных видов картофеля (Solanum tuberosum L., S. Phureja Juz. & Buk. и S. stenotomum Juz. & Buk.) от вирусов методом комбинированной термо-химиотерапии / О.Ю. Антонова, О.В. Апаликова, Ю.В. Ухатова, Е.А. Крылова, О.Ю. Шувалов, А.Р.Шувалова, Т.А. Гавриленко // Сельскохозяйственная биология. - 2017. - Т. 52.-№1 - C. 95-104. doi: 10.15389/agrobiology.2017.1.95rus.

Биотехнологические методы получения и оценки оздоровленного картофеля (рекомендации) [сост. Л.Н. Трофимец, В.В. Бойко, Т.В. Зейрук и [др.]. - М.: ВО «АГРОПРОМИЗДАТ», 1988. - 36 с.

Евстигнеева Т.А. Действие фитоактивного хитозана и салициловой кислоты на устойчивость растений картофеля к вирусу Y / Т.А. Евстигнеева, Н.А. Павлова, С.Л. Тютерев // Вестник защиты растений. - 2012. - №2. - С. 27-33.

Куликова, В.И. Оценка различных способов оздоровления перспективных сортов и гибридов картофеля / В.И. Куликова, В.П. Ходаева, Н.А. Лапшинов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2020. - Т. 50. - №4. - С. 23-31. - DOI 10.26898/0370-8799-2020-4-3).

Максема И.Г., Компанец Г.Г., Барабанова А.О., Ермак И.М., Слонова Р.А. Противовирусное действие каррагинанов из красной водоросли при экспериментальной хантавирусной инфекции // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2012. - №1. - С. 32-33.

Пат. RU 2567643, МПК A01N 63/02. Концентрированный состав и способ защиты семенного картофеля от вирусов X и Y / Т.А. Евстигнеева, С.Л. Тютерев, Н. А. Павлова; патентообладатель ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений ФАНО. - 2014144245/10; заявл. 31.10.2014; опубл. 10.11.2015. - Бюл. №31.

Пат. RU 2761498 МПК A01G 7/04 А01С 1/00. Способ оздоровления растений картофеля от вирусных инфекций / С.Н. Шевченко, В.А. Глущенков, А.В. Милехин и др.; патентообладатель ФГБУН Самарский ФИЦ РАН, федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королева". - 2021106114; заявл. 09.03.2021; опубл. 08.12.2021. - Бюл. №34.

Рогозина Е.В. Широко распространенные и потенциально опасные для российского агропроизводства возбудители вирусных болезней картофеля / Е.В. Рогозина, Н.В. Мироненко, О.С. Афанасенко, Ю. Мацухито // Вестник защиты растений. - 2016. - №4(90). - С. 24-33.

Трускинов Э.В. Оздоровление картофеля от вирусных болезней методом культуры меристемных тканей // Сельскохозяйственная биология. - 1976, №11(2). - С. 250-255.

Ухатова, Ю.В. Оздоровление от вируса скручивания листьев картофеля чилийских образцов Solanum tuberosum с использованием методов криотерапии и комплексной химио-, термотерапии / Ю.В. Ухатова, О.Ю. Антонова, Т.А. Гавриленко // Достижения науки и техники АПК. - 2016. - Т. 30. - №10. - С. 56-60.

C.L., Chiru N. Effect of some therapies on potato plantlets infected with potato virus X (PVX) // Journal of EcoAgriTourism. - 2014. - Vol. 10 (1/28). - P. 11-17.

Kim I.V., Chibizova A.S., Shischenko E.V., Fisenko P.V., Chekushkina T.N., Barsukova E.N., Volkov D.I., Klykov A.G. Methods of biotechnology in the improvement of promising potato hybrids (Solanum tuberosum L.) // Research on Crops. - 2021. - Vol.22. - P. 96-99.

Yermak I.M. Chemical structure and gel properties of carrageenans from algae belonging to the Gigartinaceae and Tichocarpaceae, collected from the Russian Pacific Coast. / I.M. Yermak, Y.H. Kim, E.A. Titlynov, V.V. Isakov, T.F. Solov'eva, // J. Appl. Phycol. - 1999. - Vol. 11 - P. 41-48.

Yermak I.M., Khotimchenko Yu. S. Chemical properties, biological activities and applications of carrageenan from red algae // in Recent Advances in Marine Biotechnology (Fingerman M, Nagabhushanam R. eds). Sci. Publ. Inc. USA-UK. 2003. Vol. 9. P. 207-255.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемый способ оздоровления картофеля от вирусных инфекций in vitro включает посадку асептических апексов размером 2,0-4,0 мм на питательную среду Мурасиге и Скуга без фитогормонов, содержащую антивирусные вещества (ABB). Отличительной особенностью способа является то, что в качестве ABB используют смесь каппа- и лямбда-каррагинанов в соотношении 70:30, добавленную в количестве 1,0 г/л среды, при длительности культивирования эксплантов не менее 100 суток. Предлагаемое изобретение позволит получить микрорастения картофеля, свободные от вирусов М, L, S в культуре in vitro, с помощью использования в качестве противовирусного средства каррагинанов. 1 табл.

Способ оздоровления картофеля от вирусов PLRV, PVM, PVS in vitro, включающий посадку асептических апексов размером 2,0-4,0 мм на питательную среду Мурасиге и Скуга без фитогормонов, содержащую антивирусные вещества (ABB), отличающийся тем, что в качестве ABB используют смесь каппа- и лямбда-каррагинанов в соотношении 70:30, добавленную в количестве 1,0 г/л среды, при длительности культивирования эксплантов не менее 100 суток.