СПОСОБ РАЗРУШЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ БИОПЛЕНКИ, ОБРАЗОВАННОЙ НА СВИНОЙ КОЖЕ В EX VIVO-МОДЕЛИ Российский патент 2025 года по МПК A61K33/34 A61K33/38 A61L2/08 B82B1/00 A61P17/02 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для разрушения патогенных биопленок, образуемых бактериями различных видов на коже и других поверхностях организма человека.

Большинство известных в настоящее время антибиотиков и антисептиков эффективны в отношении планктонных (свободно живущих) форм бактерий. Формируя биопленку (многоклеточное сообщество бактерий, окруженное, защищенное матриксом и прикрепленное к внешним или внутренним поверхностям организма-хозяина или неживых предметов), бактерии приобретают резистентность к антибиотикам и антисептикам, а также оказываются недоступными для уничтожения клетками иммунной системы. Поэтому лечение и профилактика вызываемых биопленками заболеваний представляет большие трудности.

В настоящее время известны различные способы разрушения биопленок, образованных на биотических и абиотических поверхностях. Так, например, широко известны способы разрушения бактериальных биопленок, основанные на нарушении их структурной целостности и дезорганизации с последующим высвобождением бактерий, доступных для антибактериального воздействия. С этой целью применяют ферменты, способные разрушать полисахариды матрикса (см., в частности, Т.С. Ильина, Ю.М. Романова. «Бактериальные биопленки: роль в хронических инфекционных процессах и поиск средств борьбы с ними», «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология», 2, 2021, стр. 14-24 [1]).

Основной недостаток подобных способов состоит в том, что ферменты обладают высокой специфичностью по отношению к субстрату: каждый фермент катализирует единственную реакцию либо группу реакций одного типа. При этом известно, что в состав матрикса биопленок входят полисахариды различных видов, такие, как декстран, гиалуроновая кислота, целлюлоза и др. Также в состав матрикса входят и другие химические компоненты, концентрация которых может сильно варьироваться.

Также широко известны способы разрушения бактериальных биопленок методом фотодинамической терапии (далее - ФДТ) с использованием фотосенсибилизаторов, которые при воздействии видимого или инфракрасного света с длинами волн, соответствующими спектру их поглощения, генерируют образование цитотоксических активных форм кислорода (преимущественно синглетного кислорода) и свободных радикалов, вызывающих окислительную деструкцию жизнеобеспечивающих структур бактериальных клеток (см., в частности [1]).

Основной недостаток подобных способов состоит в том, что ФДТ более эффективна в отношении грамположительных бактерий и менее - в отношении грамотрицательных (Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa), что обусловлено различиями в строении клеточной стенки, тогда как бактериальные биопленки могут состоять как из грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Кроме этого, возможности ФДТ ограничены длиной волны возбуждения, дозой облучения, глубиной проникновения в ткани (до 1 мм), спецификой проведения терапии в темноте.

Известны способы разрушения бактериальных биопленок, заключающиеся в воздействии на них антимикробными пептидами (см., например, RU 2664708 С1, опубл. 21.08.2018 [2]).

Основной недостаток подобных способов заключается в том, что пептиды проявляют цитотоксичность в отношении клеток млекопитающих, теряют активность при низких концентрациях солей или в присутствии белков плазмы, разлагаются тканевыми протеазами.

Известен способ разрушения бактериальной биопленки, образованной на свиной коже в ex vivo модели, в результате покрытия ее поверхности слоем металлических (медных или серебряных) наночастиц (см. Yin-Ku Lin, Shih-Chun Yang, Ching-Yun Hsu et al. «The Antibiofilm Nanosystems for Improved Infection Inhibition of Microbes in Skin», Molecules, 2021, 26, 6392 [3]).

Основной недостаток известного из [3] способа заключается в том, что он основан на использовании металлических наночастиц, полученных химическим методом восстановления соответствующих солей, являющимся достаточно трудоемким и неспецифичным в отношении внесенных и естественно присутствующих восстановителей для адресного воздействия на биопленку. Кроме этого, в основе химических способов получения наночастиц лежат химические реакции между солями металлов и восстанавливающими и стабилизирующими агентами, многие из которых являются токсичными. К таким агентам можно отнести боргидрид натрия, гидразин и диметилформамид.

Известный из [3] способ принят в качестве ближайшего аналога заявленного способа.

Техническая проблема, решаемая заявленным изобретением, состоит в создании способа разрушения бактериальной биопленки, образованной на свиной коже в ex vivo модели, лишенного указанных недостатков.

При этом достигается технический результат, заключающийся в упрощении и повышении экологичности процесса получения металлических наночастиц для последующего адресного нанесения их на бактериальные биопленки при сохранении эффективности воздействия наночастиц на биопленки, приводящего к их разрушению, а также в потенциальном повышении безопасности воздействия наночастиц на живую ткань при дальнейшем адресном использовании способа in vivo в результате сниженной токсичности получаемых наночастиц.

Техническая проблема решается, а указанный технический результат достигается в результате создания способа разрушения бактериальной биопленки, образованной на свиной коже в ex vivo модели, включающего покрытие ее поверхности слоем наночастиц меди или серебра. Упомянутые наночастицы меди или серебра переносят с донорной подложки, прозрачной для инфракрасного излучения, на поверхность которой нанесена серебряная или медная пленка толщиной не менее 20 нм, расположенной на расстоянии 0,8-1,2 мм от фрагмента свиной кожи, в результате сканирования упомянутой донорной подложки-пучком лазерного излучения с длиной волны 1064 нм, длительностью импульса 120 нс, частотой следования импульсов 20 кГц при энергии в импульсе 0,2 мДж, скорости сканирования 1000 мм/с и размере пятна лазерного излучения 30 мкм.

На фиг. 1 представлено схематичное изображение процесса реализации заявленного способа.

На фиг. 2а и фиг. 2b представлено изображение со сканирующего электронного микроскопа фрагментов свиной кожи до и после нанесения наночастиц меди.

Заявленный способ реализуют посредством выполнения следующей последовательности действий:

1. Донорную подложку 1, прозрачную для инфракрасного излучения, с нанесенным на ее внутреннюю (обращенную в зону переноса) поверхность слоем материала, подлежащего переносу (серебряной или медной пленкой 2 толщиной более 20 нм), размещают на держателе (условно не показан) пленкой 2 вниз. Пучок излучения 3 от лазера с длиной волны 1064 нм, длительностью импульса 120 нс и частотой следования импульсов 20 кГц фокусируют на пленке 2 (через внешнюю поверхность донорной подложки 1) объективом с фокусным расстоянием 160 мм, что обеспечивает размер пятна лазерного излучения 30 мкм.

Выбор толщины пленки менее или равной 20 нм не обеспечивает гарантированное покрытие слоем наночастиц поверхности бактериальной биопленки, что снижает эффективность антибактериального воздействия.

2. На расстоянии 0,8-1,2 мм от донорной подложки 1 на прозрачном предметном стекле 4, расположенном на моторизованной подвижке 5, размещают фрагмент свиной кожи 6.

Расстояние между донорной подложкой 1 с нанесенной на ней серебряной или медной пленкой 2 и фрагментом свиной кожи 6 с образованной на нем биопленкой, равное 0,8-1,2 мм, является оптимальным. При выборе расстояния, меньшего 0,8 мм, происходит значительное воздействие лазерного излучения на свиную кожу, нежелательное при дальнейшем использовании способа in vivo. При выборе расстояния, большего 1,2 мм, наночастицы не переносятся (не долетают) на фрагмент свиной кожи 6.

3. Производят сканирование пленки 2 пучком лазерного излучения при энергии в импульсе 0,2 мДж, скорости сканирования 1000 мм/с и размере пятна лазерного излучения 30 мкм, в результате чего происходит перенос наночастиц 7 серебра или меди на поверхность биопленки на фрагменте свиной кожи 6.

Пример.

Свиную кожу очищали теплой водой и дезинфицировали 70%-ным этиловым спиртом. Далее высушивали стерильной марлей и делили на фрагменты размером примерно 5×10 см, используя хирургический скальпель. Фрагменты кожи упаковывали в стерильные пластиковые пакеты и хранили в морозильнике при -20°С. Замороженные фрагменты свиной кожи размораживали при комнатной температуре в течение 10 минут. С помощью скальпеля из-под кожи удаляли излишки жировой ткани, а нижнюю поверхность разглаживали для получения равномерной толщины кожи. Далее при помощи медицинского инструмента вырезали фрагменты диаметром 8 мм и переносили в стерильную посуду.

На полученные фрагменты диаметром 8 мм наносили неглубокие царапины длиной 5 мм (имитировали рану) и помещали в стерильный культуральный планшет на 24 лунки (по одному в каждую лунку), который содержал физиологический раствор, покрывающий одну треть толщины кожи, для поддержания влажности тканей. В центр каждого фрагмента помещали 20 мкл 10⁷ КОЕ/мл культуральной среды Р. aeruginosa или S. aureus. Чтобы предотвратить испарение, культуральный планшет закрывали крышкой и выдерживали в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.

Фрагменты свиной кожи со сформированной инфекцией переносили на стерильные предметные стекла, на их поверхности лазером переносили слои наночастиц меди (Cu) или серебра (Ag), согласно описанной выше последовательности действий, и выдерживали в течение часа.

Для количественного определения жизнеспособных бактерий фрагменты свиной кожи с наночастицами переносили в стерильные пробирки с 2 мл 0,9% NaCl. Затем их гомогенизировали в стерильных условиях, полученную суспензию последовательно 10-кратно разбавляли и высевали на плотную питательную среду. Чашки Петри инкубировали при температуре 37°С в течение ночи, а затем подсчитывали полученные колонии и определяли КОЕ/мл (см. таблица 1).

Данные таблицы 1 демонстрируют сохранение эффективности воздействия наночастиц на бактериальные биопленки, приводящего к их разрушению, при реализации заявленного способа.

Таким образом, при реализации заявленного способа достигается возможность дешевого, отличающегося незначительными временными затратами, а также несущественной материалоемкостью и энергоемкостью, и экологичного получения металлических наночастиц для их последующего (в данном случае практически одновременного) адресного нанесения на бактериальные биопленки. При этом сохраняется эффективность воздействия наночастиц на биопленки, приводящая к их разрушению, а также потенциально повышается безопасность воздействия наночастиц на живую ткань при использовании способа in vivo в результате сниженной токсичности получаемых наночастиц (вследствие отсутствия применяемых для их получения токсичных химически активных агентов).

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для разрушения патогенных биопленок, образуемых бактериями различных видов на коже и других поверхностях организма человека. Проводят разрушение бактериальной биопленки, образованной на свиной коже в ex vivo модели, осуществляют покрытие ее поверхности слоем наночастиц меди или серебра. Упомянутые наночастицы меди или серебра переносят с донорной подложки, прозрачной для инфракрасного лазерного излучения, на поверхность которой нанесена серебряная или медная пленка толщиной не менее 20 нм, расположенной на расстоянии 0,8-1,2 мм над фрагментом свиной кожи. В результате сканирования упомянутой донорной подложки пучком лазерного излучения с длиной волны 1064 нм, длительностью импульса 120 нс, частотой следования импульсов 20 кГц при энергии в импульсе 0,2 мДж, скорости сканирования 1000 мм/с и размере пятна лазерного излучения 30 мкм. Изобретение обеспечивает разрушение, а также потенциальное повышение безопасности воздействия наночастиц на живую ткань при дальнейшем адресном использовании способа in vivo в результате сниженной токсичности получаемых наночастиц. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ разрушения бактериальной биопленки, образованной на свиной коже в ex vivo модели, включающий покрытие ее поверхности слоем наночастиц меди или серебра, отличающийся тем, что упомянутые наночастицы меди или серебра переносят с донорной подложки, прозрачной для инфракрасного лазерного излучения, на поверхность которой нанесена серебряная или медная пленка толщиной не менее 20 нм, расположенной на расстоянии 0,8-1,2 мм над фрагментом свиной кожи, в результате сканирования упомянутой донорной подложки пучком лазерного излучения с длиной волны 1064 нм, длительностью импульса 120 нс, частотой следования импульсов 20 кГц при энергии в импульсе 0,2 мДж, скорости сканирования 1000 мм/с и размере пятна лазерного излучения 30 мкм.