РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВИРУСЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/86 A61K39/12 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к рекомбинантным вирусам и их применению. Более конкретно, данное изобретение относится к новым рекомбинантным вирусам болезни Марека, кодирующим представляющую(-ие) интерес молекулу(-ы), и их применению для экспрессии или доставки таких молекул животным, особенно сельскохозяйственным птицам. Данное изобретение особенно подходит для вакцинации сельскохозяйственных птиц против птичьих патогенов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Мясо и яйца сельскохозяйственных птиц являются важными источниками пищи, потребление которых постоянно увеличивается из-за роста населения и их отличного соотношения цены и качества. Недавняя эпидемия птичьего гриппа сосредоточила общественное мнение на здоровье сельскохозяйственных птиц, а также на безопасности пищевых продуктов. Технология вакцин для сельскохозяйственных птиц стала предметом обеспокоенности во всем мире.

Рекомбинантные вирусы, экспрессирующие белки патогенов, обычно используются в качестве вакцин против патогенов-мишеней для сельскохозяйственных птиц. Вакцины, включающие в себя такие вирусы, индуцируют экспрессию чужеродных белков патогенов или их фрагментов в инфицированных клетках, что впоследствии может вызывать специфический и защитный гуморальный иммунитет, а также клеточно-опосредованный иммунитет.

Известно, что различные вирусы могут выжить в организме инфицированного животного в состоянии латентной или персистирующей инфекции. Следовательно, такие вирусы, в которые интегрирован чужеродный ген, происходящий от патогена, были разработаны для использования в качестве вакцин с вирусным вектором, увеличивающих длительность иммунитета у иммунизированного животного.

Эти вирусные векторы (или рекомбинантные вирусы) обычно основаны на авипоксвирусах, таких как оспа птиц (EP-A-0517292), вирус герпеса, такой как вирус болезни Марека серотипов 1, 2 и 3 (вирус герпеса индеек (HVT)) (например, WO-A-87/04463, US 5980906, US 5853733) или, в альтернативных случаях, вирус болезни Ньюкасла (NDV) и аденовирусы птиц.

Эти рекомбинантные вирусы птиц обладают различными уровнями защиты. Рекомбинантный HVT, экспрессирующий белок VP2 вируса инфекционного бурсита птиц (ИБП, англ. «IBD»), показал преимущества по сравнению с классическими вакцинами против ИБП (Vectormune® IBD). Другие представляющие интерес векторы HVT экспрессируют антигены вируса болезни Ньюкасла (БН, англ. «ND») (Vectormune® ND) или вируса инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ, англ. «ILT») (Vectormune® LT).

Одной из практических проблем рекомбинантных вирусов на основе HVT может быть их интерференция, когда они используются в комбинации для придания иммуногенности против различных патогенов. Действительно, при смешивании двух разных рекомбинантных HVT (rHVT), экспрессирующих разные антигены, может быть индуцирована более слабая защита по меньшей мере от одного из заболеваний (см., например, Slacum G et al., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, March 23-25, p. 84).

Соответственно, существует потребность в новых подходах к усовершенствованию вакцинации животных, в особенности - сельскохозяйственных птиц, позволяющей обеспечить одновременную защиту от нескольких заболеваний.

Были разработаны мультивалентные векторы HVT, которые могут экспрессировать два различных антигенных пептида (см. WO 2013/144355).

Также сообщалось о рекомбинантных векторах на основе MDV1, например, в WO 2016/120421, в которых применяются области клонирования, расположенные в основном в области UL. Также упоминались сайты клонирования в области US, например, US2 или US10.

В данном изобретении представлены новые рекомбинантные вирусы, подходящие для индукции сильной иммунной защиты у животных, и которые в дополнение к этому могут применяться в комбинации с другими вирусными вакцинами, такими как рекомбинантные вакцины HVT, для обеспечения более широкого иммунитета.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении представлены новые рекомбинантные вирусы, подходящие для индукции сильной иммунной защиты у животных, и которые в дополнение к этому могут применяться в комбинации с другими вирусными вакцинами, такими как рекомбинантные вакцины HVT, для вызывания более широкого иммунитета. Более конкретно, данное изобретение относится к новым рекомбинантным вирусам болезни Марека серотипа 1 («rMDV1»), содержащим один или несколько чужеродных генов, расположенных в локусе MDV086.6. Данное изобретение действительно показывает, что указанный локус в геноме MDV1 делает возможным эффективное клонирование и стабильную экспрессию чужеродных генов.

Таким образом, предмет данного изобретения заключается в рекомбинантном вирусе болезни Марека серотипа 1 (rMDV1), содержащем рекомбинантную нуклеиновую кислоту в своем геноме, при этом указанная рекомбинантная нуклеиновая кислота расположена в локусе MDV086.6 (SORF1) указанного генома.

Как будет далее описано в данном изобретении, указанная рекомбинантная нуклеиновая кислота может быть клонирована вместо всего или части локуса MDV086.6 (SORF1) путем вставки в кодирующую последовательность MDV086.6 (SORF1) или путем вставки в межгенную область, фланкирующую MDV086.6 (SORF1).

Дополнительный предмет данного изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей геном rMDV1, как определено выше.

Данное изобретение также относится к вектору (например, плазмиде, космиде, вирусу, хромосоме и т.д.), содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, как определено выше.

Данное изобретение также относится к клетке-хозяину или культуре таких клеток, содержащей rMDV1, вектор или нуклеиновую кислоту, как определено выше.

Еще один дополнительный предмет данного изобретения представляет собой способ получения или репликации rMDV1, как определено выше, включающий в себя инфицирование компетентной клетки молекулой нуклеиновой кислоты, как определено выше, или rMDV1, как определено выше, и сбор rMDV1.

Еще один дополнительный предмет данного изобретения представляет собой способ получения rMDV1, включающий в себя: (i) введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты под контролем промотора в локус MDV086.6 вируса болезни Марека серотипа 1, (ii) репликацию указанного вируса и (iii) сбор указанного вируса.

Другой предмет данного изобретения представляет собой композицию, такую как вакцина, содержащую rMDV1, как определено выше, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый эксципиент и (или) адъювант.

Такую композицию можно применять, например, для вакцинации или иммунизации птиц, таких как сельскохозяйственные птицы.

Другой предмет данного изобретения, таким образом, заключается в rMDV1, как определено выше, или в композиции, как определено выше, для применения для вакцинации птицы, предпочтительно курицы, против патогена.

Другой предмет данного изобретения заключается в rMDV1 или композиции, как определено выше, для применения в целях индукции или стимуляции иммунного ответа у птицы, предпочтительно курицы.

Еще один дополнительный предмет данного изобретения представляет собой rMDV1, как определено выше, для применения в комбинации с дополнительным рекомбинантным вирусом герпеса другого серотипа и экспрессирующим другой антиген, для вакцинации птицы, предпочтительно курицы, против по меньшей мере двух различных патогенов, путем одновременного, раздельного, последовательного или попеременного введения.

В другом аспекте данного изобретения представлен способ вакцинации или иммунизации животного, включающий в себя по меньшей мере одно введение rMDV1 или композиции, как определено выше.

В дополнительном аспекте данного изобретения представлен способ индукции иммуногенного или защитного ответа у животного против одного или нескольких патогенов птиц, включающий в себя по меньшей мере одно введение rMDV1 или композиции, как определено выше.

Данное изобретение также относится к способу иммунизации птиц, включающему в себя введение указанной птице эффективного иммунизирующего количества rMDV1 или композиции согласно данному изобретению.

Данное изобретение также относится к вакцинационному набору для иммунизации птиц, который включает в себя эффективное количество композиции согласно данному изобретению и средства для введения указанной композиции указанной птице.

Данное изобретение можно применять для экспрессии любого полипептида, предпочтительно - для экспрессии антигенов птичьих патогенов. Данное изобретение подходит для вакцинации птиц, например, сельскохозяйственных птиц.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показаны три типа базовых гомологичных плазмид, которые можно применять для конструирования (а) RR071, или (b) RR072, или (c) RR075, соответственно.

На Фиг. 2 показаны схематические изображения (а) геномов рекомбинантных MDV1/IBD (RR071, RR072, RR075) и (b) геномов рекомбинантных MDV1/ILT (RR080, RR083, RR092, RR093, RR094).

На Фиг. 3 (а) показано схематическое изображение генома рекомбинантного MDV1/IBD (RR072) с указанием местоположения всех участков контакта, амплифицированных в реакциях ПЦР для подтверждения структур геномов данного вируса. На Фиг. 3 (b) показаны результаты ПЦР-анализов. RR072 собирали на момент пассажа +1 и подготавливали для ПЦР-анализов. На Фиг. 3 (c) представлены результаты анализа по методу вестерн-блоттинга, выявляющего экспрессию белка VP2 IBDV рекомбинантным MDV1/IBD, RR072 (пассаж +1). Молекулярная масса белка VP2 составляет около 40 кДа.

На Фиг. 4 (а) показаны схематические изображения геномов рекомбинантных MDV1/ILT (RR080 и RR083) с указанием местоположения всех участков контакта, амплифицированных в реакциях ПЦР для подтверждения структур геномов данных вирусов. На Фиг. 4 (b) показаны результаты ПЦР-анализов. Все рекомбинантные MDV1/ILT собирали на момент пассажа +5. На Фиг. 4 (c) представлены результаты анализа по методу вестерн-блоттинга, выявляющего экспрессию белка gB ILTV рекомбинантными вирусами MDV1/ILT, RR080 или RR083 (пассаж +1). Молекулярная масса белка gB ILTV, который экспрессируется из рекомбинантного MDV1/ILT, оценивается в около 53 кДа.

На Фиг. 5 показаны средние титры IBDV в твердофазном ИФА для кур, свободных от специфических патогенов (куры SPF), вакцинированных рекомбинантным MDV1/IBD (RR071 или RR072, или RR075) с использованием коммерческого набора для твердофазного ИФА IBD.

На Фиг. 6 показаны средние оценки клинических признаков у кур SPF, вакцинированных рекомбинантными MDV1/ILT RR080 или RR092.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение в целом относится к rMDV1, который содержит рекомбинантную нуклеотидную последовательность, расположенную в локусе MDV086.6 (SORF1). Данное изобретение также относится к композициям, таким как вакцины, включающим такой rMDV1, а также к их применению для вакцинации животных, в особенности - сельскохозяйственных птиц.

Описание данного изобретения будет наилучшим образом понятно со ссылкой на следующие определения.

Определения

Термин «вирус» обозначает, в частности, вирусную частицу, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты (например, геном), инкапсулированную в капсид или капсулу. Термин «вирус» также обозначает вирусный вектор или выделенный вирусный геном.

Термин «рекомбинантный» по отношению к вирусу герпеса обозначает вирус герпеса, геном которого был модифицирован путем вставки по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, т.е. нуклеиновая кислота (например, ДНК, такая как ген), которая в природе не встречается в геноме указанного вируса герпеса или которая в природе встречается в указанном геноме, но в другой форме или в другом положении. Рекомбинантный вирус может быть получен множеством способов, таких как технология рекомбинантных ДНК, как описано в данном документе, и, полученный однажды, может быть воспроизведен без дальнейшего использования технологий рекомбинантных ДНК, как также описано в данном документе.

В данном описании термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» и «нуклеотидная последовательность» используются взаимозаменяемо и относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей определенную последовательность, которая может представлять собой дезоксирибонуклеотиды и (или) рибонуклеотиды. Нуклеотидная последовательность может быть сначала получена, например, с помощью рекомбинантных, ферментативных и (или) химических методик, а затем реплицирована в клетке-хозяине или в системе in vitro. Нуклеотидная последовательность предпочтительно содержит открытую рамку считывания, кодирующую молекулу (например, пептид или белок). Нуклеотидная последовательность может содержать дополнительные последовательности, такие как промотор, терминатор транскрипции, сигнальный пептид, IRES и т.д. Предпочтительно, открытая рамка считывания в рекомбинантной нуклеиновой кислоте не содержит интрона.

«Рекомбинантная нуклеотидная последовательность» обозначает последовательность, которая в природе не встречается в геноме вируса герпеса или которая в природе встречается в указанном геноме, но в другой форме или в другом положении. Типичные «рекомбинантные нуклеотидные последовательности» представляют собой гены, предпочтительно кодирующие молекулы, которые не продуцируются в природе вирусом герпеса птиц, например, молекулы из другого вируса или из клетки. «Ген» в контексте такой «рекомбинантной нуклеотидной последовательности» обозначает любую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую открытую рамку считывания, такую как нуклеиновая кислота, состоящая или по существу состоящая из открытой рамки считывания. Ген может дополнительно содержать регуляторные элементы, такие как, например, промотор или терминатор.

В данном описании термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и относятся к любой молекуле, содержащей полимер из по меньшей мере 2 последовательных аминокислот.

В контексте данного изобретения термин «локус» для данного гена обозначает всю область генома, содержащую открытую рамку считывания, регуляторные последовательности и фланкирующие межгенные последовательности. Таким образом, в этом отношении локус MDV086.6 (SORF1) включает в себя открытую рамку считывания SORF1, последовательности промотора/терминатора SORF1, а также межгенные последовательности, простирающиеся в направлениях 5' и 3' от их, то есть между SORF1 и MDV086.4 с одной стороны, и между SORF1 и MDV087 с другой стороны.

Термин «виды птиц» предназначен для обозначения всех видов птиц, таких как птицы класса Aves, т.е. пернатых, крылатых, бипедальных, теплокровных и откладывающих яйца позвоночных животных. В контексте данного изобретения птицы или виды птиц относятся, более конкретно, к птицам, представляющим экономический и (или) сельскохозяйственный интерес, таким как сельскохозяйственные птицы (такие как куры и индейки), водоплавающие сельскохозяйственные птицы (такие как утки и гуси) и декоративные птицы (такие как лебеди и попугаеобразные).

Используемый в контексте данного изобретения термин «вакцина» обозначает агент, который можно применять для того, чтобы вызывать, стимулировать или усиливать иммунный ответ в организме.

«Представляющая интерес молекула или представляющий интерес продукт» включают в себя, но не ограничиваются ими, полипептид (например, пептид, белок и т.д.), а также РНК (например, антисмысловую РНК, интерферирующую РНК, аптамер и т.д.).

Термин «иммунный ответ» обозначает развитие у хозяина клеточного и (или) опосредованного антителами иммунного ответа на представляющие интерес композицию или вакцину. Обычно «иммунный ответ» включает в себя продукцию антител, В-клеток, хелперных Т-клеток и (или) цитотоксических Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенные в представляющие интерес композицию или вакцину. Предпочтительно, иммунный ответ является защитным, вследствие чего будет усиливаться устойчивость к новой инфекции и (или) уменьшаться клиническая тяжесть заболевания.

rMDV1

Данное изобретение в целом относится к rMDV1, который содержит рекомбинантную нуклеотидную последовательность (такую как чужеродный ген), расположенную в локусе MDV086.6 (SORF1), и способам его применения.

Вирусы болезни Марека (MDV) представляют собой вирусы герпеса птиц. MDV описаны в публикациях (см., например, Kingham et al. “The genome of herpesvirus of turkeys: comparative analysis with Marek's disease viruses” - Journal of General Virology (2001) 82, 1123-1135) и общедоступны из коллекций. Последовательность генома MDV также доступна в библиотеках генов (GenBank, № доступа: DQ530348 и AF291866).

В изобретении используются MDV серотипа 1, предпочтительно - непатогенные штаммы MDV1 для целевого животного. Конкретным примером такого штамма является штамм CVI988 Rispens (GenBank, № доступа: № DQ530348).

Геном MDV1 содержит около 160 т.п.о., организованных в две отдельные области, L и S, которые состоят из уникальных длинных (UL) и уникальных коротких (US) последовательностей, ограниченных инвертированными повторами. Указанный геном содержит около 400 открытых рамок считывания.

Данное изобретение основано на открытии того, что конкретный локус в геноме MDV1, расположенный в области US, можно применять для эффективного и стабильного клонирования любого представляющего интерес чужеродного гена. Более конкретно, авторы данного изобретения продемонстрировали, что локус MDV086.6 (также известный как SORF1) представляет собой подходящий новый сайт для клонирования в геноме MDV1. MDV086.6 расположен в области US, на конце области US, фланкированной областью IR. Данный ген является уникальным для MDV и кодирует белок, который состоит из 76 аминокислот в случае штамма CVI988 Rispens (Brunovskis et al., 1993, PMID: 7831788, гипотетическая аминокислотная последовательность данного белка: GenBank, № доступа: ABF72352.1). Функция указанного белка в настоящее время неизвестна. Проведя эксперименты, авторы данного изобретения подтвердили, что недостаток MDV086.6 (SORF1) практически не влияет на рост вирусов. Авторы данного изобретения также продемонстрировали, что вирусы могут быть получены, когда чужеродный ген вставлен в указанный локус, и что такие рекомбинантные конструкции могут размножаться, оставаться инфекционными in vivo и могут стабильно экспрессировать указанный чужеродный ген.

Таким образом, в данном изобретении представлен новый rMDV1, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту (такую как чужеродный ген), расположенную в локусе MDV086.6 (SORF1).

Клонирование в локусе MDV086.6 может быть выполнено путем вставки в кодирующую генную последовательность данного локуса, вставки в межгенную область данного локуса или путем замены всей или части последовательности данного генного локуса. Термин «межгенная область» хорошо известен в данной области техники и относится к любой области вирусного генома, которая расположена между двумя определенными открытыми рамками считывания (ОРС) вируса. Таким образом, межгенная область может включать в себя регуляторные последовательности.

Со ссылкой на геном штамма MDV1 CVI988 Rispens, кодирующая последовательность MDV086.4 расположена между нуклеотидами 154371 и 154529, кодирующая последовательность MDV086.6 (SORF1) расположена между нуклеотидами 154605 и 154835, а кодирующая последовательность MDV087 (SORF2) расположен между нуклеотидами 155025 и 155564. Межгенная область между MDV086.4 и MDV086.6, таким образом, расположена между нуклеотидами 154529 и 154605, а межгенная область между MDV086.6 и MDV087, таким образом, расположена между нуклеотидами 154835 и 155025. Таким образом, согласно данному изобретению клонирование в локусе MDV086.6 (SORF1) включает в себя клонирование в любом месте между нуклеотидами 154529 и 155025 генома MDV1 со ссылкой на штамм CVI988 Rispens.

В данной заявке ссылка на полный геном штамма CVI998 Rispens представляет собой ссылку на указанный геном, как описано в Genbank под номером доступа DQ530348 на дату подачи данной заявки.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота замещает всю или часть последовательности генного локуса. В конкретном варианте осуществления данного изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота замещает всю или часть кодирующей последовательности SORF1 и (или) всю или часть регуляторной последовательности SORF1. Обычно рекомбинантная нуклеиновая кислота может замещать от 30% до 100% последовательности локуса, например, от 30% до 100% ОРС и (или) регуляторной части локуса. В конкретном аспекте данного варианта осуществления замещенная часть локуса имеет длину, подобную длине рекомбинантной нуклеиновой кислоты. В другом конкретном аспекте данного варианта осуществления замещенная часть локуса содержит по меньшей мере 90% ОРС. В другом конкретном и предпочтительном аспекте данного варианта осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота замещает всю кодирующую последовательность локуса. Это соответствует нуклеотидам от 154605 до 154835 генома MDV1 со ссылкой на штамм CVI988 Rispens.

В другом конкретном варианте осуществления данного изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота вставлена в последовательность, кодирующую ген локуса, по существу без делеции указанной последовательности, кодирующей ген, или даже указанного локуса. В таком варианте осуществления данного изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота, таким образом, прерывает в геноме последовательность, кодирующую ген. В таком варианте осуществления данного изобретения продукт гена SORF1 не экспрессируется рекомбинантным вирусом. Такая стратегия клонирования по существу не приводит к делеции вирусной последовательности в целевом генном локусе, за исключением случаев, когда, например, удаляют 1-5 нуклеотидов для целей клонирования. В предпочтительном аспекте такого варианта осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота расположена внутри кодирующей последовательности SORF1, то есть между старт-кодоном и стоп-кодоном. Что касается генома штамма CVI988 Rispens, то данный вариант осуществления, таким образом, включает в себя клонирование путем вставки в любую область между нуклеотидами с 154605 по 154835. Конкретными иллюстративными положениями для такого клонирования являются, в направлении от старт-кодона, нуклеотиды с 80 по 81, нуклеотиды с 100 по 101 или нуклеотиды со 170 по 171.

В другом конкретном варианте осуществления данного изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота вставлена в межгенную область, фланкирующую кодирующую последовательность SORF1, в положении 5' или 3' от нее. В этом отношении предпочтительной межгенной областью является межгенная область между кодирующей последовательностью MDV086.6 (SORF1) и кодирующей последовательностью MDV087 (SORF2). Такая область расположена между старт-кодоном SORF1 и старт-кодоном SORF2 (поскольку обе кодирующие последовательности имеют противоположную ориентацию). Таким образом, этот вариант осуществления данного изобретения включает в себя клонирование в любой области между положениями нуклеотидов 154835 и 155025 генома MDV1 со ссылкой на штамм CVI988 Rispens. Иллюстративное положение для такого клонирования находится между нуклеотидами 154835 и 154836. Такая стратегия клонирования по существу не приводит к делеции вирусной последовательности в целевом генном локусе, за исключением случаев, когда, например, удаляют 1-5 нуклеотидов для целей клонирования.

Предпочтительные rMDV1 согласно данному изобретению содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту в локусе MDV086.6 (SORF1) и сохраняют кодирующую последовательность по меньшей мере одного фланкирующего гена, такого как, например, SORF2. В частности, векторы согласно данному изобретению не содержат геномных делеций, охватывающих несколько вирусных генов в области клонирования, что обеспечивает стабильность/воспроизводимость репликации. Таким образом, конкретные rMDV1 согласно данному изобретению содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту в локусе MDV086.6 (SORF1) и сохраняют кодирующую последовательность SORF2 и (или) US1.

Рекомбинантная(-ые) нуклеиновая(-ые) кислота(-ы)

Нуклеиновая (-ые) кислота (-ы), содержащаяся (-иеся) в rMDV1 согласно данному изобретению, может (могут) кодировать любой представляющий интерес продукт, такой как любой белок, пептид или полипептид, например, биологически активные полипептиды, иммуногенные (т.е. антигенные) полипептиды и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения представляющий интерес продукт представляет собой антиген, такой как антигенный белок, полипептид или пептид, еще более предпочтительно - белок, пептид или полипептид, полученные из антигена патогенного организма, способного вызывать инфекцию у животного, в частности - у птицы. Примеры патогенов, которые вызывают инфекцию у птиц, включают в себя вирусы, бактерии, грибы, простейшие и т.д. Иммуногенный полипептид может предпочтительно представлять собой (происходить из) поверхностный белок, секретируемый белок или структурный белок указанного патогена, или их фрагменты. Полипептид может происходить из любого источника, например, вирусного, прокариотического, эукариотического или синтетического.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения нуклеиновая кислота кодирует антиген патогенного агента птицы.

Конкретные примеры патогенных агентов птиц включают в себя, но не ограничиваются ими, вирус птичьего гриппа, парамиксовирус птиц типа 1, также называемый вирусом болезни Ньюкасла (NDV), метапневмовирус птиц, вирус болезни Марека, вирус болезни Гамборо, также называемый вирусом инфекционного бурсита птиц (IBDV), вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV), вирус инфекционного бронхита (IBV), Escherichia coli, виды Salmonella, Pasteurella multocida, Riemerella anatipestifer, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma galli septicum, Mycoplasma synoviae, микоплазменные микроорганизмы, инфицирующие виды птиц, или кокцидии.

Предпочтительно, антиген выбран из следующего: белок F NDV, белок VP2 IBDV, белок gB ILTV, белок 40K Mycoplasma galisepticum и поверхностный белок гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа, или их иммуногенные фрагменты.

В контексте данного изобретения термин «фрагмент» белка обозначает, предпочтительно, фрагмент, содержащий по меньшей мере 5 последовательных аминокислотных остатков указанного белка, еще более предпочтительно - от 5 до 100. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения такой фрагмент содержит по меньшей мере один эпитоп и (или) является иммуногенным in vivo, т.е. может вызывать выработку антител, связывающих полноразмерный белок.

Конкретные примеры иммуногенных пептидов включают в себя, например, пептид, содержащий аминокислотные остатки 1-453 из VP2.

Рекомбинантная нуклеиновая кислота может содержать промотор для управления экспрессией представляющего интерес продукта. Промотор может представлять собой любой промотор, подходящий для экспрессии в, например, птичьих клетках, такой как клеточный промотор, вирусный промотор, синтетический/искусственный промотор и т.д., который может быть регулируемым или не быть таковым. В конкретном варианте осуществления данного изобретения промотор выбран из промотора бета-актина курицы (Bac) или его производного, такого как Coa5; промотора Pec; немедленно-раннего (ie) промотора 1 цитомегаловируса мыши (Mcmv); промотора цитомегаловируса человека (Hcmv); промотора вируса обезьян (SV)40; и промотора вируса саркомы Рауса (RSV), или любых их фрагментов, которые сохраняют промоторную активность.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения промотор представляет собой промотор бета-актина курицы или полученный из него промотор, такой как промотор Coa5.

Последовательность промотора бета-актина курицы известна в данной области техники и доступна в библиотеках генов с публичным доступом. Иллюстративная последовательность представлена в SEQ ID NO: 22.

Промотор, «полученный» из промотора бета-актина курицы, представляет собой промотор, который содержит последовательность функционального фрагмента промотора бета-актина курицы, предпочтительно - последовательность транскрипционно активного фрагмента промотора бета-актина курицы. Промотор может дополнительно содержать дополнительные остатки или функциональные домены, которые могут быть искусственными и (или) полученными из разных промоторов. Промотор, полученный из промотора бета-актина курицы, обычно содержит по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов последовательности указанного промотора бета-актина курицы или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична ей, предпочтительно - последовательность, которая по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентична ей, и проявляет транскрипционную активность либо самостоятельно, либо в комбинации с дополнительным доменом.

Последовательность промотора - производного от бета-актина курицы для применения в данном изобретении более предпочтительно представляет собой последовательность, которая содержит по меньшей мере коровую последовательность промотора бета-актина курицы. Указанная коровая последовательность обычно находится в области между нуклеотидами от -1200 до -900 нативного промотора, еще более предпочтительно - между нуклеотидами -1192 и -922. Конкретный пример коровой последовательности промотора бета-актина курицы представлен в SEQ ID NO: 20.

В конкретном варианте осуществления промотор, применяемый в данном изобретении, содержит коровую последовательность промотора бета-актина курицы, которая содержит: (i) SEQ ID NO: 20 или (ii) последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности с SEQ ID NO: 20, предпочтительно - последовательность, которая по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности с SEQ ID NO: 20, и которая проявляет активность промотора транскрипции.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения промотор представляет собой промотор Coa5.

В другом конкретном варианте осуществления данного изобретения промотор представляет собой промотор RSV.

Конструкция вируса rMDV1

Клонирование генов и конструирование плазмид хорошо известны рядовому специалисту в данной области техники и могут по существу выполняться с помощью стандартных методик молекулярной биологии (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2012).

Обычно рекомбинантные вирусы могут быть получены с помощью гомологичной рекомбинации между вирусным геномом и конструкцией (например, плазмидой), содержащей нуклеиновую кислоту, которая должна быть вставлена, фланкированную нуклеотидами из сайта вставки для обеспечения рекомбинации. Вставка может производиться с удалением или без удаления эндогенных последовательностей.

Для этой цели последовательность, содержащую целевой локус MDV086.6 (SORF1), обычно сначала клонируют в подходящий вектор. Примеры векторов включают в себя плазмиды, такие как pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8 или pUC9; фаги, такие как фаг лямбда и фаг Ml3; или космиды, такие как pHC79.

Последовательность целевой области интегрируют в вектор в соответствии с обычным методом клонирования. Применяемая последовательность целевой области предпочтительно имеет достаточную длину, чтобы обеспечить последующую гомологичную рекомбинацию in vivo с вирусным геномом. Предпочтительно, клонированная последовательность целевой области будет иметь длину, составляющую по меньшей мере около 100 нуклеотидов, обычно - более 300 нуклеотидов, например, от 1000 до 2000 нуклеотидов.

Кодирующие и промоторные последовательности, подлежащие вставке в вирус, вставляют в целевую область вирусного генома, клонированного в векторе. Вставку предпочтительно производить таким образом, чтобы на каждой стороне клонированной вставки оставалась часть последовательности целевой области, длина которой достаточна для гомологичной рекомбинации (например, по меньшей мере 50 нуклеотидов, предпочтительно - по меньшей мере 100 нуклеотидов). Кодирующие и промоторные последовательности могут быть введены в клонированную целевую область с помощью классических рестрикционных ферментов и процедур лигирования. При необходимости может (могут) быть выполнена (-ы) мутация (-и) в конкретном сайте целевой области для создания нового сайта расщепления для рестрикционного фермента. Для этой цели можно применять обычные методики мутагенеза, хорошо известные специалисту в данной области техники, такие как, например, мутагенез in vitro или ПЦР.

Векторы, в которых кодирующая и промоторная последовательности были вставлены в целевую область, полученные так, как описано выше, могут быть введены в клетку, инфицированную MDV1, или в клетки, трансфицированные геномом MDV1, с использованием известных методик, таких как электропорация, фосфат кальция, способ на основе липофектина и т.п. Таким образом, рекомбинантные вирусы получают путем рекомбинации в указанных клетках между гомологичными областями ДНК MDV1 и вектором. Когда количество вектора находится в диапазоне от 0,1 мкг до 1000 мкг, эффективность генерации рекомбинантных вирусов особенно оптимизирована.

Полученный в результате рекомбинантный вирус может быть отобран генотипически или фенотипически с использованием известных методик отбора, например, путем гибридизации, обнаружения активности фермента, кодируемого геном, интегрированным вместе с последовательностями рекомбинантных нуклеиновых кислот, или путем иммунологического обнаружения антигенного пептида, экспрессируемого рекомбинантным вирусом. Отобранный рекомбинантный вирус можно культивировать в больших масштабах в культуре клеток, после чего можно собирать рекомбинантный вирус, содержащий пептиды.

Предпочтительные rMDV1

Предпочтительные rMDV согласно данному изобретению кодируют антигенный пептид, выбранный из белка F NDV, белка VP2 IBDV, белка gB ILTV, белка 40K Mycoplasma galisepticum и поверхностного белка HA вируса птичьего гриппа, или их иммуногенные фрагменты.

Предпочтительный rMDV1 согласно данному изобретению включает в себя рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген VP2 IBDV или антиген gB ILTV, которые замещают все или часть кодирующих MDV086.6 (SORF1) и (или) регуляторных областей генома.

Другой предпочтительный rMDV1 согласно данному изобретению включает в себя рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген VP2 IBDV или антиген gB ILTV, расположенные в кодирующей области MDV086.6 (SORF1) генома, по существу без делеции указанной кодирующей области.

Другой предпочтительный rMDV1 согласно данному изобретению включает в себя рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген VP2 IBDV или антиген gB ILTV, расположенные в межгенной области между MDV086.6 (SORF1) и MDV087 (SORF2).

Другой предпочтительный rMDV1 согласно данному изобретению включает в себя вставленную в кодирующую последовательность гена MDV086.6 (SORF1) рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 IBDV или его иммуногенный фрагмент, под контролем промотора Coa5.

Другой предпочтительный rMDV1 согласно данному изобретению содержит по меньшей мере одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая замещает весь или часть генного локуса MDV086.6 (SORF1). Предпочтительно, птичий антиген представляет собой белок VP2 или gB, или их иммуногенные фрагменты, под контролем промотора Coa5 или под контролем промотора вируса саркомы Рауса (RSV).

Другие предпочтительные rMDV1 согласно данному изобретению содержат по меньшей мере одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту, вставленную в межгенную область между MDV086.6 (SORF1) и MDV087 (SORF2). Предпочтительно, птичий антиген представляет собой белок VP2 или gB, или их иммуногенные фрагменты, под контролем промотора Coa5.

Конкретные и предпочтительные примеры таких rMDV1 согласно данному изобретению включают в себя RR071, RR072, RR075, RR080, RR083, RR092, RR093 и RR094.

В RR071 нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP2 IBDV в соответствии с SEQ ID NO: 19, находится под контролем промотора Coa5 в соответствии с SEQ ID NO: 20, связанного с сигналом полиаденилирования SV40 в соответствии с SEQ ID NO: 21 на 3'-конце, и вставлена в кодирующую последовательность MDV086.6 (SORF1) MDV1 с положительным (плюс) направлением (цепью).

В RR072 нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP2 IBDV в соответствии с SEQ ID NO: 19, находится под контролем промотора Coa5 в соответствии с SEQ ID NO: 20, связанного с сигналом полиаденилирования SV40 в соответствии с SEQ ID NO: 21 на 3'-конце, и замещает кодирующую последовательность MDV086.6 (SORF1) MDV1 с отрицательным (минус) направлением.

В RR075 нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP2 IBDV в соответствии с SEQ ID NO: 19, находится под контролем промотора Coa5 в соответствии с SEQ ID NO: 20, связанного с сигналом полиаденилирования SV40 в соответствии с SEQ ID NO: 21 на 3'-конце, и вставлена в межгенную область между MDV086.6 (SORF1) и MDV087 (SORF2) MDV1 с положительным направлением.

В RR080 нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gB ILTV в соответствии с SEQ ID NO: 23, находится под контролем промотора Coa5 в соответствии с SEQ ID NO: 20 и замещает кодирующую последовательность MDV086.6 (SORF1) MDV1 с положительным направлением.

В RR083 нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gB ILTV в соответствии с SEQ ID NO: 23, находится под контролем промотора RSV в соответствии с SEQ ID NO: 24 и замещает кодирующую последовательность MDV086.6 (SORF1) MDV1 с отрицательным направлением.

В RR092 нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gB ILTV в соответствии с SEQ ID NO: 23, находится под контролем промотора Coa5 в соответствии с SEQ ID NO: 20 и вставлена в кодирующую последовательность MDV086.6 (SORF1) MDV1 с отрицательным направлением.

В RR093 нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gB ILTV в соответствии с SEQ ID NO: 23, находится под контролем промотора Coa5 в соответствии с SEQ ID NO: 20 и вставлена в кодирующую последовательность MDV086.6 (SORF1) MDV1 с положительным направлением.

В RR094 нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gB ILTV в соответствии с SEQ ID NO: 23, находится под контролем промотора Coa5 в соответствии с SEQ ID NO: 20 и вставлена в межгенную область между MDV086.6 (SORF1) и MDV087 (SORF2) MDV1 с положительным направлением.

Культуры клеток

Рекомбинантные вирусы согласно данному изобретению можно размножать в любых культурах компетентных клеток. После достижения необходимого роста вирусов клетки можно отделить от лунок с помощью скребка или трипсина, а инфицированные клетки можно отделить от надосадочной жидкости путем центрифугирования.

Примеры компетентных клеток включают в себя фибробласты куриного эмбриона (CEF), яйцо с развивающимся эмбрионом, клетку куриной почки и т.п. Клетки или вирусы можно культивировать в культуральной среде, такой как минимальная питательная среда Игла (Eagle's MEM), культуральная среда Лейбовица L-15/Маккоя 5А (Leibowitz-L-15/McCoy 5A) (смесь 1:1) при температуре около 37°C в течение 3-6 суток. Инфицированные клетки обычно суспендируют в культуральной среде, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО) или CELLBANKER® 1 (ZENOAQ), и хранят замороженными в жидком азоте или в морозильной камере глубокой заморозки, например, при температуре -85°C.

Композиции и вакцины

Данное изобретение также относится к композициям, таким как вакцины, которые содержат один или большее число рекомбинантных MDV1 согласно данному изобретению и фармацевтически или ветеринарно приемлемый эксципиент и (или) адъювант.

Подходящие эксципиенты и адъюванты известны специалисту в данной области техники.

rMDV согласно данному изобретению можно применять в живой форме (например, для приготовления живых вакцин) или, в качестве альтернативы, в инактивированной, аттенуированной или убитой форме. Производство таких форм известно в данной области техники.

Предпочтительно композиция согласно данному изобретению представляет собой вакцину.

Композиция или вакцина согласно данному изобретению могут дополнительно содержать подходящий растворитель, такой как, например, водный буфер или фосфатный буфер. Предпочтительно композиция или вакцина также содержат добавки. Добавки согласно данному изобретению могут быть получены из любого ряда источников, включая различные белки и пептиды, полученные от животных (например, гормоны, цитокины, костимуляторные факторы), и новые нуклеиновые кислоты, полученные из вирусов и других источников (например, двухцепочеченая РНК, CpG) и т.п., которые вводят с композицией или вакциной. Кроме того, любое число комбинаций указанных выше веществ может обеспечивать эффект иммунопотенцирования.

Композиции или вакцины согласно данному изобретению могут быть дополнительно составлены с одной или несколькими дополнительными добавками для поддержания изотоничности, физиологического pH и стабильности, например, с буфером, таким как физиологический раствор (0,85%), фосфатно-солевой буфер (ФСБ), цитратные буферы, трис(гидроксиметиламинометан) (ТРИС), Трис-забуференный физиологический раствор и т.п., либо с антибиотиком, например, с неомицином или стрептомицином и т.п.

Введение может осуществляться любым путем, включая пероральное введение, глазное введение (например, с помощью глазных капель), глазоносовое введение с использованием аэрозоля, интраназальное введение, клоакальное введение с кормом, с водой или спреем, in ovo, местное введение или введение посредством вакцинирующей инъекции (например, посредством внутривенной, подкожной, внутримышечной, внутриглазничной, внутриглазной, внутрикожной и (или) внутрибрюшинной инъекции). Специалист в данной области техники сможет легко адаптировать состав вакцинирующей композиции для каждого пути введения.

Каждая доза вакцины может содержать подходящую дозу, достаточную для того, чтобы вызвать защитный иммунный ответ у видов птиц. Оптимизация такой дозы хорошо известна в данной области техники. Количество антигена на дозу может быть определено с помощью известных методов с использованием реакций антиген/антитело, например, методом твердофазного ИФА.

Композиции или вакцины согласно данному изобретению можно вводить в виде однократных или многократных доз, в зависимости от протокола вакцинации.

Композиции или вакцины согласно данному изобретению имеют дополнительное преимущество в том, что они обеспечивают защиту видов птиц от целевых птичьих патогенов, как показано в примере 6.

Применение

Данное изобретение также относится к rMDV1 или композиции (вакцине) согласно данному изобретению для применения для вакцинации птиц, таких как сельскохозяйственные птицы против патогена.

Такую вакцинацию предпочтительно проводят путем введения иммунологически эффективного количества rMDV1 или композиции (вакцины) согласно данному изобретению.

rMDV1 или композицию (вакцину) согласно данному изобретению можно с преимуществом вводить внутрикожно, подкожно, внутримышечно, перорально, in ovo, через слизистую оболочку или путем глазоносового введения, предпочтительно - подкожно.

rMDV1 или композицию (вакцину) согласно данному изобретению можно удобно применять в комбинации с дополнительным рекомбинантным вирусом герпеса другого серотипа и экспрессирующим другой антиген для вакцинации птицы, предпочтительно курицы, путем одновременного, раздельного последовательного или попеременного введения.

Данное изобретение также относится к наборам для вакцинации для иммунизации видов птиц, содержащим эффективное количество композиции или вакцины, как описано выше, и средствам введения указанной композиции или вакцины указанным видам. Например, такой набор включает в себя инъекционное устройство, заполненное вакциной согласно данному изобретению, и инструкции по внутрикожной, подкожной, внутримышечной инъекции или инъекции in ovo. В качестве альтернативы, указанный набор содержит устройство для спрея/аэрозоля или глазных капель, заполненное вакциной согласно данному изобретению, и инструкции по глазоносовому введению, пероральному введению или введению через слизистую оболочку.

Дополнительные аспекты и преимущества данного изобретения описываются в следующем разделе, касающемся экспериментов, который иллюстрирует данное изобретение.

ПРИМЕРЫ

Авторы данного изобретения сконструировали серию рекомбинантных MDV1 с различными кассетами экспрессии, вставленных в локус MDV086.6. Их схематические изображения представлены на фиг. 2(а) и фиг. 2(b).

Эти вирусы обозначаются следующим образом (вирус/сайт вставки/вставленные гены (направление)):

RR071: rMDV1/MDV086.6(Ins)/Coa5_VP2(+)

RR072: rMDV1/MDV086.6(Sub)/Coa5_VP2(-)

RR075: rMDV1/MDV086.6-087/Coa5_VP2(+)

RR080: rMDV1/MDV086.6(Sub)/Coa5_gBdel(+)

RR083: rMDV1/MDV086.6(Sub)/RSV_gBdel(-)

RR092: rMDV1/MDV086.6(Ins)/Coa5_gBdel(-)

RR093: rMDV1/MDV086.6(Ins)/Coa5_gBdel(+)

RR094: rMDV1/MDV086.6(Ins)/Coa5_gBdel(-)

Пример 1: Конструирование гомологичных векторов

Конструирование плазмид по существу выполнялось с помощью стандартных методик молекулярной биологии (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2012).

Конструирование pUC18_MDV086.6 (Ins) Sfil

Фрагмент геномной ДНК MDV1 штамма Rispens размером в 1,1 т.п.о., фланкирующий целевой локус - ген MDV086.6 (SORF1) - клонировали с помощью ПЦР таким образом, что сайт узнавания Sfil был добавлен в середину MDV086.6 (SORF1) (фиг. 1(a)). Кратко, используя ДНК, экстрагированную из MDV1 штамма Rispens (пассаж +21) в качестве матрицы, проводили две стадии ПЦР. Пары праймеров, используемые в первой ПЦР, представляют собой SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4. Вторую ПЦР проводили с использованием смеси продуктов ПЦР, полученных в результате первой ПЦР, в качестве матрицы, и SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 4 - в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 (GenBank, № доступа: L09136) после расщепления с помощью KpnI и Sac I, в результате чего получали pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI. Данная базовая гомологичная плазмида представлена на фиг. 1(а).

Конструирование pUC18_MDV086.6(Sub)_Sfil

Фрагмент геномной ДНК MDV1 штамма Rispens размером в 1,1 т.п.о., фланкирующий целевой локус - ген MDV086.6 (SORF1) - клонировали с помощью ПЦР таким образом, что MDV086.6 (SORF1) был замещен сайтом узнавания Sfil (фиг. 1(b)). Кратко, используя ДНК, экстрагированную из MDV1 штамма Rispens (пассаж +21) в качестве матрицы, проводили две стадии ПЦР. Пары праймеров, используемые в первой ПЦР, представляют собой SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8. Вторую ПЦР проводили с использованием смеси продуктов ПЦР, полученных в результате первой ПЦР, в качестве матрицы, и SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 8 - в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 (GenBank, № доступа: L09136) после расщепления с помощью Kpnl и Sac I, в результате чего получали pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI. Данная базовая гомологичная плазмида представлена на фиг. 1(b).

Конструирование pUC18_MDV086.6/087_Sfil

Фрагмент геномной ДНК MDV1 штамма Rispens размером в 1,3 т.п.о., фланкирующий целевой локус - межгенную область между MDV086.6 (SORF1) и MDV087 (SORF2) - клонировали с помощью ПЦР таким образом, что сайт узнавания Sfil был добавлен между MDV086.6 (SORF1) и MDV087 (SORF2) (фиг. 1(c)). Кратко, используя ДНК, экстрагированную из MDV1 штамма Rispens (пассаж +21) в качестве матрицы, проводили две стадии ПЦР. Пары праймеров, используемые в первой ПЦР, представляют собой SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 8. Вторую ПЦР проводили с использованием смеси продуктов ПЦР, полученных в результате первой ПЦР, в качестве матрицы, и SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 8 - в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 (GenBank, № доступа: L09136) после расщепления с помощью Kpnl и Sac I, в результате чего получали pUC18_MDV086.6/087_SfiI. Данная базовая гомологичная плазмида представлена на фиг. 1(c).

Конструирование pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5VP2(-)

Данный гомологичный вектор, содержащий промотор Coa5 и ген VP2 IBDV из стандартного контрольного штамма (VP2-STC), конструировали с использованием плазмиды pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI. Данный гомологичный вектор использовали для конструирования рекомбинантного MDV1/IBD - RR072. Сначала pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI расщепляли с помощью Sfil и дефосфорилировали с помощью щелочной фосфатазы Shewanella sp. рекомбинантного S1B1 (PAP) (Funakoshi, № DE110). Генную кассету «промотор Coa5 IBDV VP2 сигнал полиА SV40» получали путем расщепления pUC18-MDV071-Coa5VP2stc (WO 2016120421 Al) с помощью Sfil-Bg1I и вставляли в pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI, расщепленную с помощью Sfil, в результате чего получали pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5VP2(-). Данная плазмида содержит генную кассету «промотор Coa5_IBDV VP2_сигнал полиА SV40» в отрицательном направлении.

Конструирование pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5VP2(+)

Что касается конструирования данного гомологичного вектора, генную кассету «промотор Coa5_IBDV VP2_сигнал полиА SV40» амплифицировали с помощью ПЦР с использованием pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5VP2(-) в качестве матрицы для ПЦР и SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 - в качестве праймеров. Полученный фрагмент ПЦР расщепляли с помощью Sfil и вставляли в pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI. Полученную в результате плазмиду pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5VP2(+) использовали для получения RR071. Данная плазмида содержит генную кассету «промотор Coa5_IBDV VP2_игнал полиА SV40» в положительном направлении.

Конструирование pUC18_MDV086.6/087_Coa5VP2(+)

Что касается конструирования данного гомологичного вектора, генную кассету «промотор Coa5_IBDV VP2_сигнал полиА SV40» амплифицировали с помощью ПЦР с использованием pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5VP2(-) в качестве матрицы для ПЦР и SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 - в качестве праймеров. Полученный фрагмент ПЦР расщепляли с помощью Sfil и вставляли в pUC18_MDV086.6/087_SfiI. Полученную в результате плазмиду pUC18_MDV086.6/087_Coa5VP2(+) использовали для получения RR075. Данная плазмида содержит генную кассету «промотор Coa5-VP2-STC» в положительном направлении.

Конструирование pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5gBdel(+)

Данный гомологичный вектор конструировали с использованием плазмиды pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI и применяли для получения RR080. Сначала pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI расщепляли с помощью Sfil и дефосфорилировали с помощью PAP. Генную кассету «промотор Coa5_ILTV gBdel» конструировали с помощью ПЦР-амплификации и вставляли в pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI, расщепленную с помощью Sfil, в результате чего получали pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5gBdel(+). Нуклеотидная последовательность гена gBdel ILTV была первоначально получена путем субклонирования из штамма 632 ILTV (EP1731612A1). В данном эксперименте этот ген был слегка модифицирован без аминокислотных изменений. Последовательность gBdel ILTV, применяемая в данном документе, представлена как SEQ ID NO: 23. Данная плазмида содержит генную кассету «промотор Coa5_ILTV gBdel» в положительном направлении.

Конструирование pUC18 _MDV086.6(Sub)_RSVgBdel(-)

Данный гомологичный вектор конструировали с использованием плазмиды pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI и применяли для получения RR083. Генную кассету «промотор RSV_ILTV gBdel» конструировали с помощью субклонирования и вставляли в pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI, расщепленную с помощью Sfil, в результате чего получали pUC18_MDV086.6(Sub)_RSVgBdel(-). Нуклеотидную последовательность промотора RSV субклонировали с использованием вектора pBK-RSV (Stratagene) в качестве матрицы для ПЦР. Данная последовательность представлена как SEQ ID NO: 24. Данная плазмида содержит генную кассету «промотор RSV ILTV gBdel» в отрицательном направлении.

Конструирование pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5gBdel(-)

Данный гомологичный вектор конструировали с использованием плазмиды pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI и применяли для получения RR092. Генную кассету «промотор Coa5_ILTV gBdeF» конструировали с помощью ПЦР-амплификации и вставляли в pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI, расщепленную с помощью Sfil, в результате чего получали pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5gBdel(-). Данная плазмида содержит генную кассету «промотор Coa5_ILTV gBdel» в отрицательном направлении.

Конструирование pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5gBdel(+)

Данный гомологичный вектор конструировали с использованием плазмиды pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI и применяли для получения RR093. Генную кассету «промотор Coa5_ILTV gBdel» конструировали с помощью ПЦР-амплификации и вставляли в pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI, расщепленную с помощью Sfil, в результате чего получали pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5gBdel(+). Данная плазмида содержит генную кассету «промотор Coa5_ILTV gBdeF» в положительном направлении.

Конструирование pUC18_MDV086.6/087 Coa5gBdel(-)

Данный гомологичный вектор конструировали с использованием плазмиды pUC18_MDV086.6/087_SfiI и применяли для получения RR094. Генную кассету «промотор Coa5_ILTV gBdel» конструировали с помощью ПЦР-амплификации и вставляли в pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI, расщепленную с помощью Sfil, в результате чего получали pUC18_MDV086.6/087_Coa5gBdel(-). Данная плазмида содержит генную кассету «промотор Coa5_ILTV gBdel» в отрицательном направлении.

Пример 2: Конструирование рекомбинантного MDV1

Конструирование рекомбинантного MDV1 проводили с помощью гомологичной рекомбинации в культивируемых клетках. Для гомологичной рекомбинации в культивируемых клетках вирусную ДНК MDV1 штамма Rispens дикого типа (пассаж +22) получали так, как описано в Morgan et al. (Avian Diseases, 34: 345-351, 1990). Около 2 мкг ДНК MDV1 штамма Rispens и 1 мкг одного из гомологичных векторов трансфицировали в около 10⁷ клеток CEF путем электропорации с использованием прибора Nucleofector II (Lonza, Базель, Швейцария). Трансфицированные клетки добавляли в среду Лейбовица L-15 (Life Technologies Corp., номер по каталогу: 41300-39) и Маккоя 5A (Life Technologies Corp., номер по каталогу: 21500-061) (смесь 1:1) с 4% телячьей сыворотки [среда LM (+)], высевали в 96-луночные планшеты для тканевых культур и затем инкубировали при температуре 37°C в 4-5% CO₂ в течение 5-7 суток до тех пор, когда стали видны бляшки рекомбинантного MDV1. Затем клетки отделяли от планшетов путем трипсинизации, переносили поровну в два 96-луночных планшета с CEF и инкубировали в течение 4-6 суток до появления бляшек. Скрининг проводили с помощью анализа черных бляшек, окрашивая только бляшки, экспрессирующие белок VP2 IBDV или белок gB ILTV. Кратко, один из двух планшетов фиксировали в смеси метанол:ацетон (1:2) и инкубировали с моноклональным антителом R63 мыши против IBDV VP2 (АТСС №: HB-9490) или с моноклональным антителом № 1_B4_7 мыши против ILTV (не опубликовано). Далее бляшки, инкубированные с биотинилированным антителом против IgG мыши (Vector Laboratories, № по каталогу: BA-9200), а затем - с набором реактивов VECTASTAIN ABC-AP (Vector Laboratories, № по каталогу: AK-5000), экспрессирующие белок VP2 или белок gB, окрашивали путем добавления раствора NBT/BCIP (Roche Applied Science, № по каталогу: 1681451). Идентифицировали лунки, содержащие окрашенные рекомбинантные бляшки, и клетки из соответствующих лунок другого 96-луночного планшета обрабатывали трипсином. Затем данные клетки разбавляли свежими вторичными клетками CEF и переносили в 96-луночные планшеты для завершения первого цикла очистки. Процедуру очистки повторяли до тех пор, пока все бляшки не были окрашены положительно в анализе черных бляшек.

Пример 3: Верификация структуры генома

Ниже описан метод характеризации рекомбинантных MDV1/IBD с использованием RR072 в качестве модельного случая. Кратко, геномные структуры рекомбинантных MDV1/IBD верифицировали с помощью трех реакций ПЦР, амплифицирующих участки контактов на каждом конце вставленных генов. На фиг. 3(а) показано, где находятся все участки контактов в RR072. Пары праймеров, использованные в указанных реакциях ПЦР, представляют собой SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15 для участка контакта 1, и SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16 для участка контакта 2, и SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 для участка контакта 3. На фиг. 3(b) показано, что RR072 имеет правильную структуру генома. Ожидаемые размеры продуктов ПЦР наблюдались и для всех других рекомбинантных MDV1/IBD, а именно RR071 и RR075, что подтверждает, что эти рекомбинантные MDV1/IBD также имеют ожидаемые структуры геномов.

Подобным образом характеризация рекомбинантных MDV1/ILT описана в случае RR080 и RR083. Структуры геномов рекомбинантных MDV1/ILT также верифицировали с помощью трех реакций ПЦР, амплифицирующих участки контактов на каждом конце вставленных генов. На фиг. 4(a) показано, где расположены все участки контактов в RR080 и RR083. Пары праймеров, использованные в указанных реакциях ПЦР, представляют собой SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 17 для участка контакта 4, и SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 18 для участка контакта 5, и SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 для участка контакта 6, и SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 18 для участка контакта 7, и SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 17 для участка контакта 8. На фиг. 4(b) показано, что и RR080, и RR083 имеет целевую структуру генома. Ожидаемые размеры продуктов ПЦР наблюдались и для всех других рекомбинантными MDV1/ILT, а именно RR092, RR093 и RR094, что подтверждает, что эти рекомбинантные MDV1/ILT также имеют ожидаемые структуры геномов.

Пример 4: Экспрессия антигена VP2 рекомбинантным MDV1

Экспрессию антигена VP2 рекомбинантным MDV1/IBD согласно данному изобретению подтверждали с помощью вестерн-блоттинга. Вестерн-блоттинг проводили с использованием клеток CEF, инфицированных рекомбинантными вирусами, и сыворотки кролика против IBDV. Кратко, клетки CEF в 12-луночных планшетах инфицировали одним из рекомбинантных вирусов или другим штаммом рекомбинантного вируса при множественности инфицирования, составляющей около 0,01. Через трое суток после инокуляции клетки собирали путем обработки трипсином и центрифугировали при 913 × g в течение 5 минут. Осадок промывали с помощью ФСБ и ресуспендировали в 100 мкл ФСБ. После добавления того же объема 2-кратного ДСН-буфера для образцов (2 × ДСН: 130 мМ Трис-Cl (pH 6,8), 6% ДСН, 20% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола и 0,01% бромфенолового синего) суспензию клеток кипятили в течение 5 минут. Образцы разделяли с помощью ДСН-ПААГ с использованием 10% полиакриламидного геля и переносили на PVDF-мембрану (Immobilon-P, Millipore). Мембрану полностью высушивали и затем инкубировали с сывороткой кролика против IBDV. После вымывания сыворотки кролика против IBDV добавляли биотинилированное антитело против IgG кролика (Vector Laboratories, № по каталогу: BA-9200), а затем - набор реактивов VECTASTAIN ABC-AP (Vector Laboratories, № по каталогу: AK-5000). Белок, связанный с сывороткой кролика против IBDV, визуализировали путем добавления раствора NBT/BCIP (Roche Applied Science, № по каталогу: 1681451).

Как показано на фиг. 3(c), полосы белка в 40 килодальтон (кДа), что было ожидаемым размером белка VP2, наблюдались на дорожках с образцами клеток, инфицированных RR072.

С помощью вестерн-блоттинга также подтвердили экспрессию белка VP2 и для других рекомбинантных MDV1/IBD - RR071 и RR075.

Пример 5: Экспрессия антигена gB рекомбинантным MDV1

Оценку экспрессии белка gB из рекомбинантных MDV1/ILT согласно данному изобретению выполняли по существу так, как описано в примере 4, с использованием RR080 и RR083. Для обнаружения белка gB ILTV применяли моноклональное антитело мыши против gB ILTV (№ 1_B4_7, неопубликованный клон) в качестве 1-го антитела. Молекулярная масса белка gB, который экспрессируется из рекомбинантного MDV1/ILT, по оценкам составляет около 53 кДа.

Как показано на фиг. 4(c), были обнаружены полосы белка около 53 кДа на дорожках RR080 или RR083.

Пример 6: Эффективность рекомбинантных MDV1/IBD согласно данному изобретению у цыплят SPF

Эффективность RR071, RR072 и RR075 исследовали на цыплятах SPF. Цыплята в возрасте одних суток были разделены на пять групп, и цыплят в группах 3, 4 и 5 вакцинировали подкожно с помощью около 3000 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/0,2 мл одного из рекомбинантных MDV1 (группа 3 - RR071, группа 4 - RR072, группа 5 - RR075). Цыплята в группе 2 (неиммунизированный зараженный положительный контроль) оставались невакцинированными. Цыплята в группе 1 (неиммунизированный незараженный контроль) оставались невакцинированными и не подвергались контрольному заражению. У цыплят брали кровь каждую неделю в возрасте от 1 до 5 недель и тестировали на наличие антител против IBDV с помощью коммерческого набора твердофазного ИФА для IBDV (ID Screen® IBD VP2: IDvet). Контрольное заражение проводилось, когда цыплята достигали возраста в 5 недель. Для контрольного заражения вводили 3×10³ EID₅₀ вирулентного штамма STC IBDV пероральным путем. Цыплят ежедневно наблюдали на предмет клинических признаков, связанных с ИБП, таких как депрессия и смерть. Через семь суток после контрольного заражения цыплят вскрывали и наблюдали на предмет видимых повреждений бурсы, таких как отек, изменение цвета, атрофия, кровоизлияние и желтый или студенистый экссудаты. Массы тела и бурсы также измеряли при вскрытии для расчета индекса B/B, который представляет собой отношение между массой бурсы и массой тела зараженных птиц, деленное на то же соотношение у незараженных птиц.

Результаты твердофазного ИФА для IBDV показаны на фиг. 5.

Результаты анализа эффективности представлены в табл. 1.

Таблица 1. Защита, вызываемая рекомбинантными MDV1/IBD согласно данному изобретению, против заражения вирулентным IBDV у цыплят SPF в возрасте 5 недель

Номер группы Группа Число цыплят Индекс B/B Число умерших после заражения Число особей с поражениями бурсы/общее число особей % защиты 1 НИНЗ 15 1,00 0 0 100 2 НИЗ 15 0,53 10 5 0 3 RR071 15 0,89 0 3 80 4 RR072 14 0,96 0 2 86 5 RR075 15 0,75 0 5 67

Данные результаты показывают, что RR071, RR072 и RR075 вызывают защитный иммунитет против контрольного заражения IBDV in vivo.

Пример 7: Эффективность рекомбинантных MDV1/ILT согласно данному изобретению у цыплят SPF

Эффективность рекомбинантных MDV1/ILT (RR080, RR092) исследовали на цыплятах SPF. Цыплята в возрасте одних суток были разделены на три группы, и цыплят в группах 2 и 3 вакцинировали подкожно с помощью около 3000 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/0,2 мл одного из рекомбинантных MDV1/ILT (группа 2 - RR080, группа 3 - RR092). Цыплята в группе 1 (неиммунизированный зараженный положительный контроль) оставались невакцинированными. У цыплят брали кровь каждую неделю в возрасте от 1 до 5 недель. Контрольное заражение проводилось, когда цыплята достигали возраста в 5 недель. Для контрольного заражения вводили 1×10³ EID₅₀ вирулентного штамма ILTV US пероральным путем. Цыплят ежедневно наблюдали на предмет клинических признаков, связанных с ИЛТ, таких как чихание и удушье. Ежедневные оценки клинических признаков рассчитывались путем деления «общих оценок клинических признаков в данный день» на «количество живых цыплят в данный день». При подсчете оценок клинических признаков смерть засчитывалась как 6 баллов, а другие клинические признаки засчитывались как 1 балл за 1 симптом. Средние оценки клинических признаков у цыплят, вакцинированных каждым рекомбинантным MDV1/ILT, обобщены на фиг. 6. Через одиннадцать суток после контрольного заражения цыплят вскрывали и наблюдали на предмет видимых повреждений респираторного тракта, таких как кровянистая мокрота.

Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2. Защита, вызываемая рекомбинантными MDV1/ILT согласно данному изобретению, против заражения вирулентным ILTV у цыплят SPF в возрасте 5 недель

Номер группы Группа Число цыплят Число зараженных Число умерших Число симптомов % защиты 1 НИЗ 15 15 7 8 0 2 RR080 15 15 3 2 66,7 3 RR092 15 15 3 1 73,3

Данные результаты показывают, что рекомбинантные MDV1/ILT RR080 и RR092 согласно данному изобретению вызывают защитный иммунитет против контрольного заражения ILTV in vivo.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан рекомбинантный вирус болезни Марека серотипа 1 (rMDV1), подходящий для экспрессии рекомбинантной нуклеотидной последовательности, который содержит рекомбинантную нуклеотидную последовательность в своем геноме, при этом указанная рекомбинантная нуклеотидная последовательность расположена в локусе MDV086.6 (SORF1) указанного генома, и при этом указанный rMDV1 сохраняет кодирующую последовательность SORF2 и/или US1. Представлена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая rMDV1. Представлены вектор экспрессии и клетка для продуцирования rMDV1. Описаны способ продуцирования rMDV1 и способ репликации rMDV1. Описана композиция для вакцинации птицы против патогена, содержащая rMDV1. Также описан набор для вакцинации птицы, который содержит указанную композицию. Изобретение расширяет арсенал средств для экспрессии или доставки нуклеиновых молекул животным, особенно сельскохозяйственным птицам. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 7 пр.

1. Рекомбинантный вирус болезни Марека серотипа 1 (rMDV1), подходящий для экспрессии рекомбинантной нуклеотидной последовательности, который содержит рекомбинантную нуклеотидную последовательность в своем геноме, при этом указанная рекомбинантная нуклеотидная последовательность расположена в локусе MDV086.6 (SORF1) указанного генома, и при этом указанный rMDV1 сохраняет кодирующую последовательность SORF2 и/или US1.

2. rMDV1 по п. 1, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная нуклеотидная последовательность замещает весь локус MDV086.6 или часть локуса MDV086.

3. rMDV1 по п. 1, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная нуклеотидная последовательность расположена в кодирующей области MDV086.6, по существу без делеции последовательности локуса SORF1.

4. rMDV1 по п. 1, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная нуклеотидная последовательность расположена в межгенной области между MDV086.4 и MDV086.6 или в межгенной области между MDV086.6 и MDV087 (SORF2).

5. rMDV1 по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный MDV1 представляет собой MDV1 штамма CVI988 Rispens.

6. rMDV1 по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная нуклеотидная последовательность кодирует антиген, предпочтительно антиген птичьего патогена.

7. rMDV1 по п. 6, отличающийся тем, что указанный птичий патоген выбран из вируса болезни Ньюкасла (NDV), вируса болезни Гамборо, вируса инфекционного бурсита птиц (IBDV), вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), вируса инфекционного бронхита (IBV), микоплазмы (MG) или кокцидии.

8. rMDV1 по п. 7, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная нуклеотидная последовательность кодирует белок VP2 IBDV, белок gB ILTV или их иммуногенные фрагменты.

9. rMDV1 по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная нуклеотидная последовательность содержит промотор транскрипции.

10. rMDV1 по п. 9, отличающийся тем, что указанный промотор выбран из промотора бета-актина курицы (Bac) или его производного, такого как Coa5; промотора Pec; немедленно-раннего (ie) промотора 1 цитомегаловируса мыши (Mcmv); промотора цитомегаловируса человека (Hcmv); промотора вируса обезьян (SV)40; и промотора вируса саркомы Рауса (RSV), или любых их фрагментов, которые сохраняют промоторную активность.

11. rMDV1 по п. 1, отличающийся тем, что указанный rMDV1 содержит рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 IBDV, или белок gB ILTV, или их иммуногенные фрагменты вместо всего локуса MDV086.6 указанного генома или вместо части локуса MDV086.6 указанного генома.

12. rMDV1 по п. 1, отличающийся тем, что указанный rMDV1 содержит рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 IBDV, или белок gB ILTV, или их иммуногенные фрагменты, расположенные в кодирующей области MDV086.6 указанного генома, по существу без делеции указанного локуса.

13. rMDV1 по п. 1, отличающийся тем, что указанный rMDV1 содержит рекомбинантную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP2 IBDV или белок gB ILTV, расположенные в межгенной области между MDV086.6 и MDV087.

14. rMDV1 по любому из пп. 1-13 для вакцинации птицы против патогена rMDV1.

15. rMDV1 по любому из пп. 1-13 в комбинации с дополнительным рекомбинантным вирусом герпеса другого серотипа и экспрессирующим другой антиген для вакцинации птицы, предпочтительно курицы, против по меньшей мере двух различных патогенов, путем одновременного, раздельного, последовательного или попеременного введения.

16. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая rMDV1 по любому из пп. 1-13.

17. Вектор экспрессии для продуцирования rMDV1 по любому из пп. 1-13, причем указанный вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п. 16.

18. Клетка-хозяин для продуцирования MDV1, причем клетка-хозяин содержит rMDV1 по любому из пп. 1-13, молекулу нуклеиновой кислоты по п. 16 или вектор экспрессии по п. 17.

19. Способ продуцирования rMDV1 по любому из пп. 1-13, включающий в себя этап, в котором происходит инфицирование компетентной клетки молекулой нуклеиновой кислоты по п. 16 или rMDV1 по любому из пп. 1-13 и этап сбора rMDV1.

20. Способ репликации rMDV1 по любому из пп. 1-13, включающий в себя этап инфицирования компетентной клетки молекулой нуклеиновой кислоты по п. 16 или rMDV1 по любому из пп. 1-13 и этап сбора rMDV1.

21. Композиция для вакцинации птицы против патогена, содержащая rMDV1 по любому из пп. 1-13 и фармацевтически или ветеринарно приемлемый эксципиент и/или адъювант.

22. Композиция по п. 21 для вакцинации птицы против патогена в комбинации с дополнительным рекомбинантным вирусом герпеса другого серотипа и экспрессирующим другой антиген для вакцинации птицы, предпочтительно курицы, против по меньшей мере двух различных патогенов путем одновременного, раздельного, последовательного или попеременного введения.

23. Набор для вакцинации птицы, который состоит из следующих компонентов:

a. эффективного количества композиции по п. 21 и

b. средств для введения указанной композиции указанной птице.