КОНСТРУКЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО НЕПАТОГЕННОГО ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА, КОДИРУЮЩИЕ АНТИГЕНЫ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА И ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА Российский патент 2017 года по МПК C12N15/86 C12N7/01 C12N15/869 A61K39/245 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке по пункту 35 U.S.C. § 119(e) испрашивается приоритет временной заявки США, имеющей серийный No. 61/549844, поданной 21 октября 2011 г., полное содержание которой таким образом включено в настоящее описание в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым конструкциям рекомбинантного мультивалентного непатогенного вируса болезни Марека, кодирующим и экспрессирующим белковые антигены вируса инфекционного ларинготрахеита и вируса болезни Ньюкасла, и к способам их использования в вакцинах для домашней птицы.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Патогенные вирусы домашней птицы не только являются истощающими для кур, но также являются дорогостоящими для птицеводов, поскольку большинство из возникающих заболеваний являются инфекционными, и промышленное птицеводство существенно опирается на ограниченные, крупномасштабные предприятия для разведения. Вакцинация молодых цыплят часто является единственным целесообразным средством для борьбы с этими вирусами. Хотя аттенуированные или убитые вирусные вакцины для домашней птицы остаются важными на рынке, в последние годы значительные ресурсы потрачены на разработку вакцин, содержащих рекомбинантные вирусные конструкции, экспрессирующие белковые антигены патогенных вирусов. Более того, значительные усилия прикладывают для конструирования стабильных и эффективных мультивалентных рекомбинантных векторов на основе непатогенного вируса болезни Марека (rMDV_np), экспрессирующих чужеродные гены из множества вирусных патогенов. Такие мультивалентные вакцины могут служить для минимизации количества инъекций, вводимых цыплятам, и, таким образом, снижать дискомфорт и стресс вакцинируемых цыплят, также как значительно снижать стоимость работ и материалов. Вакцинация отдельными мультивалентными конструкциями также может являться предпочтительной по сравнению с альтернативными мультивалентными вакцинами rMDV_np, содержащими множество рекомбинантных моновалентных конструкций rMDV_np, поскольку эти альтернативные вакцины, по меньшей мере до настоящего времени, приводили к защите только против одного вирусного патогена. Неудача таких альтернативных вакцин предположительно обусловлена тем, что одна из моновалентных конструкций rMDV_np перерастает другие моновалентые кострукции rMDV_np, таким образом, предотвращая индукцию значительного иммунного ответа этими другими конструкциями rMDV_np. В любом случае, несмотря на значительные усилия в прошлом для конструирования стабильных и эффективных мультивалентных рекомбинантных векторов rMDV_np, экспрессирующих чужеродные гены из множества вирусных патогенов, до настоящего времени доказана безуспешность таких попыток.

Одним из вирусных заболеваний домашней птицы, с которым можно бороться посредством вакцинации, является болезнь Марека. Болезнь Марека представляет собой патогенное заболевание, тяжело поражающее кур во всем мире.

Болезнь Марека возникает преимущественно у молодых кур в возрасте между 2 и 5 месяцами. Клинические признаки включают в себя: прогрессирующий паралич одной или нескольких конечностей, нарушение координации из-за паралича ног, свисание конечностей из-за поражения крыльев и опущенное положение головы из-за поражения мышц шеи. В случаях острого заболевания может возникать тяжелая депрессия. Может развиваться также атрофия бурсы и тимуса.

Этиологическим фактором для болезни Марека является вирус болезни Марека серотипа 1 (MDV1), ассоциированный с клетками вирус, имеющий геном - двухцепочечную ДНК. MDV1 представляет собой лимфотрофный альфавирус герпеса птиц, который как: (i) инфицирует B-клетки, что может приводит к цитолизу, так и (ii) латентно инфицирует T-клетки, что может индуцировать T-клеточную лимфому. Близко родственный вирулентному штамму MDV1, вирус болезни Марека серотипа 2 (MDV2), ранее известный как вирус герпеса 3 Gallid, представляет собой естественным образом ослабленный штамм MDV, как показано, от слабо патогенного до непатогеного у кур [Petherbridge et al., J. Virological Methods 158:11-17 (2009)]. SB-1 представляет собой специфический штамм MDV2, как показано, пригодный для вакцин против MDV1 [см., например, Murthy and Calnek, Infection and Immunity 26(2) 547-553 (1979)].

Другой близкородственный альфавирус герпеса, вирус болезни Марека серотипа 3 (MDV3), более широко известный как вирус герпеса индеек (HVT), представляет собой непатогенный вирус домашних индеек [см., например, Kingham et al., J. of General Virology 82:1 123-1 135 (2001)]. Два общепринятых штамма HVT представляют собой штамм PB1 и штамм FC126. Поскольку HVT также является непатогенным для кур, он действительно индуцирует длительный защитный иммунный ответ у кур против MDV1. Соответственно, HVT используют в вакцинах для домашней птицы против вирулентного MDV1 в течение многих лет, как правило, в комбинации с SB-1, который более присутствует в кровотоке, чем HVT, но считается менее безопасным. Альтернативно, когда стада заражены особенно вирулентными штаммами MDV1, HVT можно комбинировать с вакциной Риспен. Вакцина Риспен представляет собой изолят, происходящий из умеренно вирулентного штамма MDV1, который затем дополнительно ослабляли пересевом клеток. Однако штамм Rispen's охраняет некоторую вирулентность по отношению к высоко чувствительным линиям кур.

Последовательность полного генома HVT описана [Afonso et al., J. Virology 75(2):971-978 (2001)], и, как большинство альфавирусов герпеса, HVT обладает значительным количеством потенциальных, не являющихся необходимыми участков для вставки [см., например, U.S. 5187087; U.S. 5830745; U.S. 5834305; U.S. 5853733; U.S. 5928648; U.S. 5961982; U.S. 6121043; U.S. 6299882 B1]. Показано также, что HVT поддается генетической модификации и, таким образом, его использовали в качестве рекомбинантного вектора в течение многих лет [WO 87/04463]. Соответственно, опубликовано, что рекомбинантные векторы HVT экспрессируют чужеродные гены, кодирующие антигены, например, из вируса болезни Ньюкасла (NDV), [Sondermeijer et al., Vaccine, 11:349-358 (1993); Reddy et al., Vaccine, 14:469-477 (1996)], вируса инфекционного бурсита (IBDV), [Darteil et al., Virology, 211:481-490 (1995); Tsukamoto et al., J. of Virology 76(11):5637-5645 (2002)] и вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) [Johnson et al., Avian Disease, 54(4):1251-1259 (2010); WO 92/03554; U.S. 6875856]. Полная геномная последовательность MDV2 также известна [см. номер доступа в GenBank: AB049735.1 и Petherbridge et al., выше]. Геномная организация MDV2 очень похожа на организацию HVT, где область US, в частности, является идентичной области US HVT [см., Kingham et al., выше].

Кроме того, сконструирован рекомбинантный химерный вирус, известный как новый вирус птичьего герпеса (NAHV), в котором конкретные области генома HVT заменены на соответствующие области генома MDV1. NAHV используют также для экспрессии чужеродных генов, кодирующих антигены из других вирусов домашней птицы [U.S. 5965138; U.S. 6913751].

Подобно MDV, вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV) представляет собой альфавирус герпеса, тяжело поражающий кур во всем мире [Fuchs et al., Veterinary Research 38:261-279 (2007)]. ILTV вызывает у кур острое респираторное заболевание, характеризующееся угнетением дыхания, одышкой и выделением кровавой мокроты. Репликация вируса ограничена клетками дыхательных путей, где в трахее инфекция вызывает эрозию и геморрагию тканей.

Болезнь Ньюкасла является другим высоко инфекционным и истощающим заболеванием кур. Этиологическим фактором для болезни Ньюкасла является вирус болезни Ньюкасла (NDV). NDV принадлежит к отряду Mononegavirales и состоит в семействе Paramyxoviridae. Вирусы болезни Ньюкасла имеют геном из несегментированной, антисмысловой одноцепочечной РНК. NDV сгруппированы в три отдельных патотипа в соответствии с их вирулентностью. Инфекция домашней птицы этими непатогенными лентогенными штаммами NDV является по существу бессимптомной. Прямопротивоположно этому мезогенные (средне патогенные) и велогенные (высоко патогенные) штаммы NDV вызывают обширное заболевание, которое может быть летальным. Большинство типов NDV инфицируют дыхательную систему и/или нервную систему и могут приводить к одышке и искривлению шеи.

Вирус инфекционного бурсита (IBDV), называемый также вирусом болезни Гумборо, представляет собой возбудитель заболевания инфекционного бурсита. IBDV вызывает острую, высоко инфекционную вирусную инфекцию лимфоидной ткани кур, где первичной мишенью является жизненно важный иммунологический орган птиц: сумка Фабриция. Уровень заболеваемости в чувствительных стадах является высоким, с быстрой потерей массы и уровнями смертности от среднего до высокого. Цыплята, выздоровевшие после заболевания, могут иметь иммунодефициты из-за разрушения (или разрушения частей) сумки Фабриция. Это делает их особенно восприимчивыми к вторичным инфекциям.

IBDV является членом семейства Birnaviridae. Вирусы этого семейства имеют геном, состоящий из двух сегментов (A и B) двухцепочечной РНК. Существует два серотипа IBDV - серотипы 1 и 2, которые можно дифференцировать посредством тестов нейтрализации вируса (VN). Показано, что вирусы серотипа 1 являются патогенными для кур, в то время как вирусы серотипа 2 вызывают только подострое заболевание у индеек. Исторически, серотип 1 вирусов IBDV состоит только из одного типа, известного в настоящее время как «классический» вирус IBD. Более недавно появились так называемые «варианты» штаммов IBDV. Классический штамм и варианты штаммов IBDV можно идентифицировать и различать посредством теста нейтрализации вируса с использованием панели моноклональных антител или посредством RT-ПЦР [Wu et al., Avian Diseases, 51:515-526(2007)]. Хорошо известные классические штаммы IBDV включают в себя D78, Faragher 52/70 и STC, в то время как 89/03 представляет собой хорошо известный вариант штамма. Множество живых или инактивированных вакцин IBDV являются коммерчески доступными, например, живая вакцина, такая как NOBILIS^R Gumboro D78 (MSD Animal Health).

Как указано выше, поскольку HVT может действовать как антиген, обеспечивающий значительную защиту против болезни Марека, и как рекомбинантный вектор, его используют в настоящее время в качестве вектора-платформы для таких мультивалентных вакцин, как Innovax^®-ILT (выпускаемой Merck Animal Health), защищающей против ILTV; и Innovax^®-ND-SB (выпускаемой Merck Animal Health) и Vectormune^® HVT-NDV (выпускаемой Ceva) - обе из которых защищают против NDV. Следует отметить, однако, до настоящего времени ни для одной из мультивалентных вакцин, содержащих рекомбинантный HVT, кодирующий антигены из более чем одного патогена, не показано стабильности и эффективности, даже несмотря на то, что такие вакцины предложены более пятнадцати лет назад [см., например, U.S. 5965138]. Действительно, Innovax^®-ILT содержит только рекомбинантный HVT, содержащий два чужеродных гена, т.е. ILTV gD и ILTV gI, которые, как доказано, являются безопасными, эффективными и стабильными. Однако эти два чужеродных гена происходят из одного и того же патогена, и более того, они естественным образом прерываются и нуждаются в совместной экспрессии, чтобы позволять надлежащую иммунизацию против ILTV.

Соответственно, несмотря на явные преимущества стабильных, мультивалентных рекомбинантных конструкций MDV_np, которые могут эффективно экспрессировать чужеродные антигены из двух или более различных патогенов, и значительные усилия для их конструирования, до настоящего времени, ни одной из них не ожидается. Таким образом, существует явная необходимость преодоления общих неудач в этой области посредством конструирования новых, стабильных рекомбинантных векторов MDV_np, которые можно использовать в мультивалентных вакцинах в качестве единственного активного средства для защиты против двух или нескольких различных не относящихся к MDV1 вирусных патогенов домашней птицы.

Цитирование любой ссылки в настоящем описании не следует рассматривать как допущение, что такая ссылка является доступной в качестве «предшествующей области техники» в настоящем описании.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, настоящее изобретение относится к новым, стабильным и эффективным мультивалентным рекомбинантным непатогенным вирусам болезни Марека (rMDV_np) для применения в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов для множества вирусных патогенов. В частных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой рекомбинантный вирус герпеса индеек (rHVT). В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой рекомбинантный вирус болезни Марека серотипа 2 (rMDV2). rMDV_np, например, rHVT или rMDV2, можно использовать в вакцинах против патогенных вирусов домашней птицы.

В частных вариантах осуществления rMDV_np содержит первую нуклеиновую кислоту, вставленную в первый, не являющийся необходимым участок в геноме rMDV_np, и вторую нуклеиновую кислоту, вставленную во второй, не являющийся необходимым участок в геноме rMDV_np. Первая нуклеиновая кислота содержит как нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), так и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gI вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV). Вторая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F вируса болезни Ньюкасла (NDV). В конкретных вариантах осуществления этого типа первая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 16, и вторая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 15. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

В частных вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US2, в то время как второй, не являющийся необходимым участок, представляет собой не являющийся необходимым участок rMDV_np, отличный от участка US2. В родственных вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US2, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок UL7/8. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US2, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US10. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок US2, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляет собой участок UL 54.5. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, являются одинаковыми. В конкретных вариантах осуществления этого типа первую нуклеиновую кислоту и вторую нуклеиновую кислоту фактически конструируют в форме части одной и той же молекулы ДНК, которую вставляют в не являющийся необходимым участок rMDV_np. Такая молекула ДНК может представлять собой экспрессирующую кассету, кодирующую белок gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), белок gI вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) и белок F вируса болезни Ньюкасла (NDV). В конкретных вариантах осуществления этого типа молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 17. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Соответственно, в частных вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляют собой участок US2. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляют собой участок UL54.5. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляют собой участок UL7/8. В других вариантах осуществления первый, не являющийся необходимым участок, и второй, не являющийся необходимым участок rMDV_np, представляют собой участок US10. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие белок gD ILTV, белок gI ILTV и белок F NDV, могут функционально находиться под контролем экзогенных промоторов, т.е. промоторов, не обнаруженных в природе в MDV_np. В некоторых вариантах осуществления эти три нуклеотидные последовательности функционально находятся под контролем различных промоторов, т.е. нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gD ILTV, функционально находится под контролем первого промотора, нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gI ILTV, функционально находится под контролем второго промотора, и нуклеотидная последовательность, кодирующая белок F NDV, функционально находится под контролем третьего промотора, где первый промотор, второй промотор и третий промотор - все являются различными. В частных вариантах осуществления промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gD ILTV, представляет собой эндогенный промотор gD ILTV. В конкретных вариантах осуществления промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gI ILTV, представляет собой эндогенный промотор gI ILTV. В частных вариантах осуществления этого типа промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gD ILTV, представляет собой эндогенный промотор gD ILTV, и промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gI ILTV, представляет собой эндогенный промотор gI ILTV. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из промоторов, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок gD ILTV, белок gI ILTV или белок F NDV, представляет собой немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE). В частных вариантах осуществления этого типа промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок F NDV, представляет собой промотор IE hCMV. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один из промоторов, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок gD ILTV, белок gI ILTV или белок F NDV, представляет собой промотор gpX вируса псевдобешенства (PRV). В родственных вариантах осуществления по меньшей мере один из промоторов, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок gD ILTV, белок gI ILTV или белок F NDV, представляет собой промотор гена бета-актина кур. В конкретных вариантах осуществления промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок F NDV, представляет собой промотор IE hCMV, промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gD ILTV, представляет собой эндогенный промотор gD ILTV, и промотор для нуклеотидной последовательности, кодирующей белок gI ILTV, представляет собой эндогенный промотор gI ILTV.

В некоторых вариантах осуществления rMDV_np по настоящему изобретению, включающий вставки нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок gD ILTV, белок gI ILTV и белок F NDV, также включает одну или несколько экзогенных последовательностей терминатора транскрипции. В частных вариантах осуществления этого типа последовательность терминатора транскрипции находится ниже нуклеотидной последовательности, кодирующей белок F NDV. В частных вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, кодирующие белок gD ILTV и белок gI ILTV, разделяют одну последовательность терминатора транскрипции, и нуклеотидная последовательность, кодирующая белок F NDV, имеет другую. В частных вариантах осуществления по меньшей мере одна из последовательностей терминатора транскрипции содержит синтетическую последовательность для полиаденилирования. В родственных вариантах осуществления по меньшей мере одна из последовательностей терминатора транскрипции содержит последовательность для полиаденилирования тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV TK). В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, содержащей в направлении от 5' до 3' в следующем порядке: (i) промотор gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), (ii) кодирующую последовательность белка gD ILTV, (iii) промотор gI ILTV, (iv) кодирующую последовательность белка gI ILTV, (v) немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE), (vi) кодирующую последовательность белка F NDV, и (viii) последовательность терминатора транскрипции. В частном варианте осуществления этого типа рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 17.

Кроме того, настоящее изобретение относится к rMDV_np, в котором рекомбинантная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению вставлена в не являющийся необходимым участок вставки rMDV_np. В некоторых вариантах осуществления этого типа rMDV_np включает в себя не являющийся необходимым участок, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую в направлении от 5' до 3' в следующем порядке (i) промотор gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), (ii) кодирующую последовательность белка gD ILTV, (iii) промотор gI ILTV, (iv) кодирующую последовательность белка gI ILTV, (v) немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE), (vi) кодирующую последовательность белка F NDV, и (vii) последовательность терминатора транскрипции. В конкретных вариантах осуществления можно включать также промежуточные нуклеотидные последовательности, такие как линкеры, спейсерные последовательности и/или дополнительные кодирующие последовательности, см. пример 1 ниже. В конкретном варианте осуществления rHVT содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 17, вставленную в не являющийся необходимым участок. В конкретных вариантах осуществления этих типов не являющийся необходимым участок представляет собой участок US2. В других таких вариантах осуществления не являющийся необходимым участок представляет собой участок UL54.5. В других таких вариантах осуществления не являющийся необходимым участок представляет собой участок UL7/8. В других таких вариантах осуществления не являющийся необходимым участок представляет собой участок US10. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Настоящее изобретение также относится к способам получения rMDV_np по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления конструируют гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gD ILTV, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gI ILTV, и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F NDV. Затем гетерологичную нуклеиновую кислоту вставляют в не являющийся необходимым участок rMDV_np по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления гетерологичная нуклеиновая кислота представляет собой экспрессирующую кассету. В конкретных вариантах осуществления этого типа экспрессирующая кассета содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 17. В других вариантах осуществления конструируют первую гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gD ILTV и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gI ILTV; и конструируют вторую гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F NDV. Первую гетерологичную нуклеиновую кислоту вставляют в участок US2 rMDV_np, и вторую гетерологичную нуклеиновую кислоту вставляют в альтернативный, не являющийся необходимым участок rMDV_np. В конкретных вариантах осуществления такие гетерологичные нуклеиновые кислоты представляют собой экспрессирующие кассеты. В конкретных вариантах осуществления этого типа первая гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 16, и вторая гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 15. В конкретных вариантах осуществления способ получения rMDV_np представляет собой способ получения rHVT. В альтернативных вариантах осуществления способ получения rMDV_np представляет собой способ получения rMDV2.

Кроме того, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим любой rMDV_np по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам способствования защите домашней птицы против заболевания, вызванного ILTV и/или NDV и/или MDV1, посредством введения такой вакцины и/или иммуногенной композиции по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления такие способы способствуют защите кур. В конкретных вариантах осуществления этого типа вакцину по настоящему изобретению вводят подкожно. В других вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят in ovo.

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к стабильным, безопасным и эффективным иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим rMDV_np по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим любой rMDV_np по настоящему изобретению, который дополнительно комбинируют с дополнительным антигеном NDV, ILTV и/или MDV для улучшения и усиления вызванной иммуногенности. Кроме того, настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим любой rMDV_np по настоящему изобретению, который дополнительно комбинируют с антигеном для патогена, отличного от MDV, ILTV или NDV. В конкретном варианте осуществления этого типа антиген представляет собой антиген вируса инфекционного бурсита (IBDV). В более конкретном варианте осуществления - антиген IBDV слабого живого IBDV. В конкретных вариантах осуществления слабый живой IBDV представляет собой вариант IBDV. Настоящее изобретение также относится к способам способствования защите домашней птицы против заболевания, вызванного ILTV и/или NDV, и/или MDV1, и/или IBDV, посредством введения такой вакцины и/или иммуногенной композиции домашней птице (например, курам). В конкретных вариантах осуществления этого типа вакцину по настоящему изобретению вводят подкожно. В других вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят in ovo.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции и/или вакцины по настоящему изобретению содержат rHVT, содержащий вставку в участок US2 рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащий от 5' до 3': (i) промотор gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV); (ii) кодирующую последовательность белка gD ILTV; (iii) промотор gI ILTV; (iv) кодирующую последовательность белка gI ILTV; (v) немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE); (vi) кодирующую последовательность белка слияния вируса болезни Ньюкасла (NDV F); и (vii) последовательность терминатора транскрипции. В конкретных вариантах осуществления этого типа иммуногенные композиции и/или вакцины дополнительно содержат слабый живой вирус инфекционного бурсита (IBDV). В конкретных вариантах осуществления слабый живой IBDV представляет собой вариант IBDV. В более конкретных вариантах осуществления IBDV представляет собой 89/03. В более конкретных вариантах осуществления этого типа рекомбинантная нуклеиновая кислота обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17.

Кроме того, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам, содержащим любой rMDV_np по настоящему изобретению, комбинированный с дополнительным антигеном NDV, ILTV и/или MDV, и патогеном, отличным от MDV, ILTV или NDV.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения можно лучше понять со ссылкой на следующие фигуры и подробное описание.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение генома HVT (FC126), состоящего из уникальной длинной (UL) области и уникальной короткой (US) области, каждая из которых обозначена прямой линией и фланкирована областями повтором, обозначенными как прямоугольники. Под схемой генома расположена линейка, указывающая локализацию фрагментов расщепления рестрикционным ферментом BamHI, относительно их положения в геноме, и буквенное обозначение, ассоциированное с каждым фрагментом (наибольшему фрагменту присвоена буква «A», следующему по величине фрагменту присвоена буква «B» и т.д. и т.п.). Положения (и их обозначение) каждого клонированного субгеномного фрагмента, используемого для реконструирования либо HVT (FC126), либо rHVT/NDV/ILT вирусов, указаны под картой рестрикции BamHI. Звездочкой (*) указано положение участков вставки: UL7/UL8 в 1196-05.1; UL54.5 в 1332-29.4; US2 в 1332-47.A2 или 1317-15.1-1.

Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение шести различных рекомбинантных HVT, изображающее гены, вставленные в остов HVT, и участок их вставки. Innovax-LT представляет собой rHVT, включающий экспрессирующую кассету, кодирующую гены ILTV gD и gI ILTV, вставленные в участок UL54.5 rHVT. Innovax-ND представляет собой rHVT, включающий экспрессирующую кассету, кодирующую ген слияния NDV, вставленную в участок US10 rHVT. 1348-34C представляет собой rHVT, включающий как экспрессирующую кассету, кодирующую гены gD ILTV и gI ILTV, вставленную в участок UL54.5 rHVT, так и экспрессирующую кассету, кодирующую ген слияния NDV, вставленную в участок US10 rHVT. 1332-62E представляет собой rHVT, включающий в себя экспрессирующую кассету, кодирующую гены gD ILTV, gI ILTV и ген слияния NDV, вставленную в участок US2 rHVT. 1317-46 представляет собой rHVT, включающий как экспрессирующую кассету, кодирующую гены gD ILTV и gI ILTV, вставленные в участок US2, так и экспрессирующую кассету, кодирующую ген слияния NDV, вставленную между UL7 и UL8 (т.е. в участок UL7/8) rHVT. 1332-70B представляет собой rHVT, включающий экспрессирующую кассету, кодирующую гены gD ILTV, gI ILTV и ген слияния NDV, вставленные в участок UL54.5 rHVT.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение преодолевает неудачу предшествующей области техники с возможностью конструировать векторы rMDV_np, которые как содержат чужеродные антигены, так и могут защищать против двух или более различных патогенов вирусов домашней птицы посредством предоставления уникальных рекомбинантных векторов MDV_np, которые кодируют и экспрессируют антигены из ILTV и NDV и которые защищают против вируса болезни Марека, болезни Ньюкасла, и инфекционного ларинготрахеита. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np по настоящему изобретению кодирует и экспрессирует чужеродные антигены только из ILTV и NDV и может способствовать защите против вируса болезни Марека, болезни Ньюкасла и инфекционного ларинготрахеита. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

До настоящего изобретения уже был сконструирован вектор HVT, содержащий ген NDV, вставленный в область US10. Показано, что этот вектор HVT-NDV является стабильным и экспрессирует достаточные уровни соответствующего продукта гена NDV, белка F NDV для защиты вакцинированных кур против заражения вирулентным NDV. Кроме того, уже сконструирован вектор HVT, содержащий пару генов ILTV, вставленных в область UL54.5 HVT. Показано, что этот вектор HVT-ILTV является стабильным и экспрессирует достаточные уровни соответствующих продуктов генов ILTV, белков gI и gD для защиты вакцинированных кур против заражения вирулентным вирусом ILTV.

Соответственно, сконструирована мультивалентная конструкция HVT для защиты против как NDV, так и ILTV, на основе успешных вышеописанных конструкций, т.е. вставки гена NDV-F в участок US10 и вставки генов gD и gI в участок UL54.5 [см. 1348-34C на фигуре 2]. Неожиданно, однако, после пассирования этой конструкции в культуре клеток рекомбинантный вирус утратил свою способность экспрессировать белки ILTVgD, ILTVgI и NDV F. Доказано, что это является правдой для ряда повторов рекомбинантных конструкций rHVT. Действительно, эти рекомбинантные вирусы являлись нестабильными и непригодными для дальнейшей разработки вакцин. Эти обнаружения показывают, что дизайн отдельного мультивалентного вектора rHVT, который может экспрессировать как белок NDV F, так и белки ILTVgD и ILTVgI, не является простым процессом, который можно экстраполировать из существующей информации. Действительно, если такие стабильные и эффективные мультивалентные векторы rHVT вообще были возможны, их дизайн необходимо было основывать на непредсказуемом наборе комплексных взаимодействий, минимально вовлекающих связь между используемыми участками вставки и чужеродными генами, подлежащими вставке. До настоящего времени такой дизайн конструкций rHVT невозможно было легко предсказать из известной предшествующей области техники.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к рекомбинантным векторам rMDV_np, в которые вставлены два гена из ILTV и один ген из NDV. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения все три гена вставляли в область US2 генома HVT. После вакцинации кур или яиц кур этим rHVT клетки иммунизированного хозяина экспрессировали белки, кодируемые вставленными генами. Более того, белки NDV и ILTV, экспрессированные rHVT, стимулировали иммунный ответ, защищающий вакцинированных кур против заболевания, вызванного NDV и ILTV. Соответственно, такие векторы rMDV_np можно использовать для обеспечения защиты против инфекции как NDV, так и ILTV. Ранее два отдельных вектора rHVT являлись необходимыми для защиты против этих двух вирусов, а именно, один для защиты против ILTV, и другой для защиты против NDV.

Настоящее изобретение, таким образом, является преимущественным по сравнению с другими современными способами, поскольку оно обеспечивает одновременную защиту против ILTV и NDV посредством инокуляции домашней птицы и/или яиц домашней птицы только одним рекомбинантным MDV_np. В частности, это позволяет вводить дополнительные вакцины способом in ovo, поскольку существует предел того, насколько большой объем можно инъецировать в яйцо и дополнительно экономит стоимость производства, поскольку необходим только один, а не два вектора. Более того, это может позволять включать в вакцину дополнительный антиген, такой как живой IBDV, например, штамм 89/03.

Более того, настоящее изобретение дополнительно включает в себя варианты осуществления, включающие в себя различные конструкции rMDV_np в одной и той же вакцине и/или в иммуногенной композиции. В конкретных вариантах осуществления этого типа вакцина и/или иммуногенная композиция содержит как rMDV2, так и rHVT, каждый из которых кодирует один или несколько чужеродных антигенов. Действительно, в отличие от комбинации двух rHVT, которая неизбежно приводит к тому, что одна конструкция существенно перерастает другую, комбинация rHVT с rMDV2 приводит к не такому значительному перерастанию. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления вакцина по настоящему изобретению содержит rHVT, кодирующий белок ILTVgD, белок ILTVgI и белок NDV F вместе с rMDV2, кодирующим другой антиген вируса домашней птицы.

Для более полного понимания настоящего изобретения представлены следующие определения.

Использование терминов в единственном числе для удобства в описании никаким образом не предназначено для ограничения этим. Таким образом, например, ссылка на композицию, содержащую «полипептид», включает в себя ссылку на один или несколько таких полипептидов.

Как применяют в настоящем документе, «непатогенный вирус болезни Марека» или «MDV_np» или «npMDV» представляет собой вирус семейства MDV, для которого показано от низкой патогенности до отсутствия патогенности для домашней птицы. Термин «MDV_np» включает в себя природные MDV, которые подвергали пассированию или иным сходным манипуляциям, но которые не включают вирусные конструкции, в которых конкретная область генома одного серотипа MDV заменена на соответствующую область другого серотипа MDV для получения химерного вируса, такого как новый вирус герпеса птиц (NAHV). В конкретных вариантах осуществления MDV_np представляет собой HVT. В других вариантах осуществления MDV_np представляет собой MDV2. В конкретных вариантах осуществления этого типа MDV2 представляет собой SB1.

Как применяют в настоящем документе, MDV_np, генетически модифицированный для кодирования гетерологичной нуклеотидной последовательности (например, чужеродного гена), определяют как «рекомбинантный MDV_np» или «rMDV_np».

Как применяют в настоящем документе, «не являющийся необходимым участок» представляет собой участок в геноме MDV_np, для которого вставка гетерологичной нуклеотидной последовательности в этот участок не предотвращает репликацию MDV_np в клетке-хозяине. Не являющиеся необходимыми участки, как правило, идентифицируют по гену, в котором они находятся, например, участок US2, или область между двумя генами, например, участок UL7/8.

Как применяют в настоящем документе, термин «домашняя птица» может включать в себя кур, индеек, уток, гусей, перепелок и фазанов.

Как применяют в настоящем документе, «вакцина» представляет собой композицию, пригодную для использования для животных (включая, в конкретных вариантах осуществления, человека, в то же время, в других вариантах осуществления, предназначенной конкретно не для человека), содержащую один или несколько антигенов, как правило, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как жидкость, содержащая воду, которая при введении животному индуцирует иммунный ответ, достаточно сильный, чтобы как минимум способствовать защите от клинического заболевания, возникающего от инфекции микроорганизмом дикого типа, т.е. достаточно сильный, чтобы способствовать предотвращению клинического заболевания и/или предотвращению, облегчению или излечению клинического заболевания.

Как применяют в настоящем документе, «мультивалентная вакцина» представляет собой вакцину, содержащую два или более различных антигена. В конкретном варианте осуществления этого типа мультивалентная вакцина стимулирует иммунную систему реципиента против двух или более различных патогенов.

Как применяют в настоящем документе, термин «способствует защите» не требует полной защиты от любого признака инфекции. Например, «способствует защите» может означать, что защита является достаточной, такой, что после заражения симптомы лежащей в основе инфекции по меньшей мере уменьшены, и/или что одна или более из лежащих в основе клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, вызывающих симптомы, уменьшены и/или исключены. Понятно, что «уменьшенный», как используют в этом контексте, имеет значение по отношению к состоянию инфекции, включая молекулярное состояние инфекции, не только физиологическое состояние инфекции.

Как применяют в настоящем документе, «адъювант» представляет собой вещество, способное оказывать благоприятное влияние или усиление для каскада иммунологических событий, в конечном счете, приводя к лучшему иммунологическому ответу, т.е. к интегрированному системному ответу на антиген. Адъювант, как правило, не является необходимым для возникновения иммунологического ответа, однако благоприятствует этому ответу или усиливает его.

Как применяют в настоящем документе, термин «фармацевтически приемлемый» используют в качестве прилагательного для обозначения того, что модифицированное существительное является пригодным для использования в фармацевтическом продукте. Когда его используют, например, для описания наполнителя в фармацевтической вакцине, оно характеризует наполнитель как совместимый с другими ингредиентами композиции и не оказывающий неблагоприятного вредного воздействия на реципиента, для которого он предназначен.

Как применяют в настоящем документе, «системное введение» представляет собой введение в циркуляционную систему организма (включающую в себя сердечно-сосудистую и лимфатическую систему), таким образом, воздействующее на организм в целом, а не на конкретный участок, такой как желудочно-кишечный тракт (посредством, например, перорального или ректального введения) и дыхательная система (посредством, например, интраназального введения). Системное введение можно осуществлять, например, посредством введения в мышечную ткань (внутримышечно), в дерму (внутрикожно или чрескожно), под кожу (подкожно), под слизистую оболочку (субмукозально), в вену (внутривенно) и т.д.

Как применяют в настоящем документе, термин «парентеральное введение» включает в себя подкожные инъекции, субмукозальные инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, внутрикожные инъекции и инфузию.

Термин «приблизительно» используют взаимозаменяемо с термином «около», и он означает, что значение находится в пределах двадцати пяти процентов от указанного значения, т.е. пептид, содержащий «приблизительно» 100 аминокислотных остатков может содержать между 75 и 125 аминокислотными остатками.

Как применяют в настоящем документе, термин «полипептид» используют взаимозаменяемо с терминами «белок» и «пептид», и он означает полимер, содержащий две или более аминокислот, соединенных пептидными связями. Термин «полипептид», как применяют в настоящем документе, включает в себя значительный фрагмент или сегмент и содержит отрезок аминокислотных остатков по меньшей мере приблизительно из 8 аминокислот, как правило, по меньшей мере приблизительно из 12 аминокислот, как правило, по меньшей мере приблизительно из 16 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно из 20 аминокислот, и в особенно предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно из 30 или более аминокислот, например, из 35, 40, 45, 50 и т.д. Такие фрагменты могут иметь концы, которые начинаются и/или заканчиваются фактически на всех положениях, например, начинаясь на остатках 1, 2, 3 и т.д. и заканчиваясь, например, на 155, 154, 153 и т.д. во всех фактических комбинациях.

Необязательно, в полипептиде могут отсутствовать конкретные аминокислотные остатки, кодированные геном или мРНК. Например, ген или молекула мРНК могут кодировать последовательность аминокислотных остатков на N-конце полипептида {т.е. сигнальную последовательность), которая отщепляется от финального белка, и таким образом, может не являться его частью.

Как применяют в настоящем документе, термин «антигенный фрагмент» по отношению к конкретному белку (например, белковому антигену) представляет собой фрагмент этого белка (включая большие фрагменты, в которых отсутствует настолько мало, как отдельная аминокислота из полноразмерного белка), который является антигенным, т.е. способным специфически взаимодействовать с узнающей антиген молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или T-клеточный рецептор антигена. Например, антигенный фрагмент слитого белка NDV представляет собой фрагмент этого слитого белка, который является антигенным. Предпочтительно, антигенный фрагмент по настоящему изобретению является иммунодоминантным для узнавания антитела и/или T-клеточного рецептора.

Как применяют в настоящем документе, аминокислотная последовательность является на 100% «гомологичной» второй аминокислотной последовательности, если две аминокислотные последовательности являются идентичными и/или отличаются только нейтральными или консервативными заменами, как определено ниже. Соответственно, аминокислотная последовательность является приблизительно на 80% «гомологичной» второй аминокислотной последовательности, если приблизительно 80% двух аминокислотных последовательностей являются идентичными и/или отличаются только нейтральными или консервативными заменами.

Функционально эквивалентными аминокислотными остатками часто можно заменять остатки в последовательности, что в результате приводит к консервативной аминокислотной замене. Такие изменения определяют термин «консервативная замена», как применяют в настоящем документе. Например, один или несколько аминокислотных остатков внутри последовательности можно заменять на другую аминокислоту сходной полярности, которая действует как функциональный эквивалент, что приводит в результате к молчащей замене. Замены для аминокислоты внутри последовательности можно выбирать из других членов класса, к которому принадлежит аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин.

Аминокислоты, содержащие структуры ароматического кольца, представляют собой фенилаланин, триптофан и тирозин. Полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Не ожидают, что такие замены могут влиять на кажущуюся молекулярную массу, как определено посредством электрофореза в полиакриламидном геле или по изоэлектрической точке.

Особенно предпочтительными консервативными заменами являются: Lys для Arg и наоборот, так чтобы можно было сохранять положительный заряд; Glu для Asp и наоборот, так чтобы можно было сохранять отрицательный заряд; Ser для Thr, так чтобы можно было сохранять свободный -OH; и Gln для Asn, так чтобы можно было сохранять свободный NH₂. Аминокислоты можно помещать также в следующие группы по сходству: (1) пролин, аланин, глицин, серин и треонин; (2) глутамин, аспарагин, глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота; (3) гистидин, лизин и аргинин; (4) цистеин; (5) валин, лейцин, изолейцин, метионин и (6) фенилаланин, тирозин и триптофан.

В родственном варианте осуществления две гомологичные последовательности ДНК можно идентифицировать по их собственной гомологии или гомологии аминокислот, которые они кодируют. Такое сравнение последовательностей можно осуществлять с использованием общепринятого программного обеспечения в базах данных последовательностей. В конкретном варианте осуществления две высоко гомологичные последовательности ДНК кодируют аминокислотные последовательности, имеющие приблизительно 80% идентичности, более предпочтительно, приблизительно 90% идентичности и даже более предпочтительно, приблизительно 95% идентичности. Более конкретно, две высоко гомологичные аминокислотные последовательности имеют приблизительно 80% идентичности, даже более предпочтительно, приблизительно 90% идентичности и даже более предпочтительно, приблизительно 95% идентичности.

Как применяют в настоящем документе, процент идентичности последовательности белка и ДНК можно определять с использованием такого программного обеспечения, как MacVector v9, коммерчески доступный из Accelrys (Burlington, Massachusetts) и алгоритма Clustal W с параметрами выравнивания по умолчанию, и параметров идентичности по умолчанию. См., например, Thompson, et al,. 1994. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. ClustalW доступен для свободной загрузки для платформ Dos, Macintosh и Unix, например, из EMBLI, European Bioinformatics Institute. Настоящая ссылка для загрузки обнаружена на http://www.ebi.ac.uk/clustalw/. Эти и другие доступные программы можно использовать также для определения сходства последовательности с использованием таких же или аналогичных параметров по умолчанию.

Как применяют в настоящем документе, термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» используют взаимозаменяемо, и они означают молекулу, содержащую нуклеотиды, включая, но без ограничения, РНК, кДНК, геномную ДНК и даже синтетические последовательности ДНК. Предусматривают также, что термины включают в себя молекулы нуклеиновой кислоты, включающие любые известные в данной области аналоги оснований ДНК и РНК.

«Кодирующая последовательность» нуклеиновой кислоты или «последовательность, кодирующая» конкретный белок или пептид, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая транскрибируется и транслируется в полипептид in vitro или in vivo при помещении под контроль подходящих регуляторных элементов.

Границы кодирующей последовательности определены инициирующим кодоном на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Кодирующая последовательность может включать в себя, но без ограничения, прокариотические последовательности, кДНК из эукариотической мРНК, последовательности геномной ДНК из ДНК эукариот (например, птиц) и даже синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции может быть локализована на 3'- от кодирующей последовательности.

«Функционально связанный» относится к расположению элементов, где компоненты, описанные таким образом, имеют такую конфигурацию, чтобы выполнять их обычную функцию. Таким образом, контрольные элементы, функционально связанные с кодирующей последовательностью, являются способными оказывать влияние на экспрессию кодирующей последовательности. Контрольные элементы необязательно являются непосредственно прилегающими к кодирующей последовательности, при условии, что они функционируют для управления их экспрессией. Таким образом, например, вставки нетранслируемых, но транскрибируемых последовательностей могут присутствовать между промотором и кодирующей последовательностью, и промотор можно рассматривать как «функционально связанный» с кодирующей последовательностью.

Как применяют в настоящем документе, термин «последовательность терминатора транскрипции» используют взаимозаменяемо с термином «регуляторный элемент полиаденилирования», и он представляет собой последовательность, которая, как правило, находится ниже кодирующей области ДНК и которая может являться необходимой для полной терминации транскрипции этой кодирующей последовательности ДНК.

Как применяют в настоящем документе, «экспрессирующая кассета» представляет собой рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая как минимум содержит промотор и гетерологичную кодирующую последовательность, функционально связанную с промотором. Во многих таких вариантах осуществления экспрессирующая кассета дополнительно содержит последовательность терминатора транскрипции. Соответственно, вставка экспрессирующей кассеты в не являющийся необходимым участок генома rMDV_np может приводить к экспрессии гетерологичной кодирующей последовательности посредством rMDV_np. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

«Гетерологичная нуклеотидная последовательность», как применяют в настоящем документе, представляет собой нуклеотидную последовательность, которую добавляют к нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению посредством рекомбинантных способов для образования нуклеиновой кислоты, естественным образом не образующейся в природе. В конкретных вариантах осуществления «гетерологичная нуклеотидная последовательность» по настоящему изобретению может кодировать белковый антиген, такой как белок F NDV, белок gI ILTV или белок gD ILTV. Гетерологичные нуклеотидные последовательности могут также кодировать слитые (например, химерные) белки. Кроме того, гетерологичная нуклеотидная последовательность может кодировать пептиды и/или белки, обладающие регуляторными и/или структурными свойствами. В других таких вариантах осуществления гетерологичная нуклеотидная последовательность может кодировать белок или пептид, функционирующий в качестве средства детекции белка или пептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, после экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления гетерологичная нуклеотидная последовательность может функционировать в качестве средства детекции нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Гетерологичная нуклеотидная последовательность может содержать некодирующие последовательности, включая участки рестрикции, регуляторные участки, промоторы и т.п.

Вставку нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген по настоящему изобретению, в вектор rMDV_np легко осуществляют, когда концы как нуклеиновой кислоты, так и вектора, содержат совместимые участки рестрикции. Если это невозможно осуществить, может являться необходимым модифицировать концы нуклеотидной последовательности и/или вектора посредством отщепления одноцепочечных выступающих концов нуклеиновой кислоты (например, выступающих концов ДНК), полученных посредством расщепления рестрикционной эндонуклеазой, для получения тупых концов или для достижения такого же результата посредством заполнения одноцепочечных концов соответствующей полимеразой. Альтернативно, желательные участки можно получать, например, посредством лигирования нуклеотидных последовательностей (линкеров) на концах. Такие линкеры могут содержать специфические олигонуклеотидные последовательности, определяющие желательные участки рестрикции. Участки рестрикции можно получать также посредством использования полимеразной цепной реакции (ПЦР). [См., например, Saiki et al., Science 239:487-491 (1988)]. Расщепленный вектор и фрагменты ДНК можно также модифицировать, при необходимости, посредством добавления гомополимерного хвоста.

Белковые антигены и нуклеиновые кислоты, кодирующие белковые антигены

Ген gD ILTV, по-видимому, кодирует гликопротеин длиной 434 аминокислот, обладающий молекулярной массой 48477 дальтон, хотя существуют другие предположения, что нижестоящий инициирующий кодон, приводящий к белку gD ILTV, содержащему только 377 аминокислотных остатков, является фактичекским инициирующим кодоном [Wild et al., Virus Genes 12:104-116 (1996)]. Ген gI ILTV кодирует гликопротеин длиной 362 аминокислот, обладающий молекулярной массой 39753 дальтон [U.S. 6875856, содержание которой, таким образом, приведено в качестве ссылки]. Нуклеиновыми кислотами, кодирующими природные и/или лабораторные варианты gD ILTV и gI ILTV, можно заменять варианты, проиллюстрированные в настоящее время.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения rMDV_np содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту (например, экспрессирующую кассету), кодирующую белок gD ILTV, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 2 или ее антигенный фрагмент. В родственных вариантах осуществления rMDV_np содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок gD ILTV, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую более 90%, и/или более 95%, и/или более 98%, и/или более 99% идентичности с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 2. В конкретных вариантах осуществления белок gD ILTV кодирован нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO: 1. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения rMDV_np содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту (например, экспрессирующую кассету), кодирующую белок gI ILTV, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 4 или ее антигенный фрагмент. В родственных вариантах осуществления rMDV_np содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок gI ILTV, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую более 90% и/или более 95%, и/или более 98%, и/или более 99% идентичности с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 4. В конкретных вариантах осуществления белок gI ILTV кодирован нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO: 3. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Ген белка F NDV кодирует так называемый белок «слияния». Один из генов белка F NDV, проиллюстрированный настоящим изобретением, получен из клона 30 NDV, общепринятого лентогенного вакцинного штамма NDV. Нуклеиновые кислоты, кодирующие природные и/или лабораторные варианты гена белка F, могут являться эквивалентно применимыми, из лентогенного, мезогенного или велогенного NDV, поскольку собственно последовательность гена белка F является высоко консервативной в этих различных патотипах NDV. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения rMDV_np содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту (например, экспрессирующую кассету), кодирующую слитый белок NDV, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6 или ее антигенный фрагмент. В родственных вариантах осуществления rMDV_np содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F NDF, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую более 90% и/или более 95%, и/или более 98%, и/или более 99% идентичности с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 6. В конкретных вариантах осуществления слитый белок NDV кодирован нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO: 5. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения rMDV_np содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту (например, экспрессирующую кассету), кодирующую слитый белок NDV, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 8 или ее антигенный фрагмент. В родственных вариантах осуществления rMDV_np содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую F белок NDF, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую более 90% и/или более 95%, и/или более 98%, и/или более 99% идентичности с аминокислотной последовательностью из SEQ ID 8. В конкретных вариантах осуществления слитый белок NDV кодирован нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO: 7. В конкретных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rHVT. В альтернативных вариантах осуществления rMDV_np представляет собой rMDV2.

Промоторы и регуляторные элементы полиаденилирования

Множество альтернативных промоторов можно использовать для управления экспрессией гетерологичного гена, кодирующего белковый антиген или его антигенный фрагмент в rMDV_np по настоящему изобретению. Примеры включают в себя промотор вируса псевдобешенства (PRV) gpX [см., WO 87/04463], промотор LTR вируса саркомы Рауса, промотор раннего гена SV40, промотор gD ILTV, промотор gI ILTV [см., например, U.S. 6183753 B1], промотор немедленного раннего гена цитомегаловируса человека 1 (hCMV IE1) [U.S. 5830745; U.S. 5980906] и промотор гена бета-актина кур [EP 1 298 139 B1]. Более конкретные примеры, как проиллюстрировано в настоящем документе, включают в себя промотор hCMV IE штамма Towne, содержащий нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 12, усеченный промотор hCMV IE, содержащий нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 11, промотор gD ILTV, содержащий нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 9, и промотор gI ILTV, содержащий нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 10.

Включение регуляторного элемента полиаденилирования ниже кодирующей области ДНК часто является необходимым для терминации транскрипции кодирующей последовательности ДНК. Соответственно, многие гены содержат регуляторный элемент полиаденилирования на нижнем конце своей кодирующей последовательности. Многие такие регуляторные элементы идентифицированы, и их можно использовать в rMDV_np по настоящему изобретению. Конкретные примеры регуляторных элементов полиаденилирования, как проиллюстрировано в настоящем документе, включают в себя синтетический сигнал полиаденилирования, содержащий нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 13, и сигнал полиаденилирования тимидинкиназы HSV, содержащий нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 14.

Вакцины и иммуногенные композиции

Настоящее изобретение относится к использованию рекомбинантного MDV_np, к молекулам нуклеиновой кислоты, используемым для конструирования MDV_np, или к клеткам-хозяевам для их выращивания, или к любой их комбинации - все в соответствии с настоящим изобретением для изготовления вакцины для домашней птицы. Соответственно, настоящее изобретение относится к вакцинам и/или иммуногенным композициям, включающим мультивалентный рекомбинантный MDV_np по настоящему изобретению. Такие вакцины можно использовать, чтобы способствовать предотвращению и/или предотвращать болезнь Ньюкасла, и/или болезнь Марека, и/или заболевания, ассоциированные с инфекциями ILTV. Вакцину в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для профилактического и/или для терапевтического лечения, и таким образом, она может мешать развитию и/или прогрессированию инфекции и/или клинических симптомов вызванных ею заболеваний.

Рекомбинантный MDV_np по настоящему изобретению можно выращивать любым количеством способов, используемых на практике в настоящее время в данной области. Например, рекомбинантный MDV_np по настоящему изобретению можно выращивать с использованием культур in vitro первичных клеток курицы, см., например, примеры ниже, где использованы клетки эмбриональных фибробластов курицы (CEF). CEF можно получать трипсинизацией эмбрионов курицы. CEF можно также рассевать в монослои и затем инфицировать MDV_np. Этот конкретный способ можно легко масштабировать для производства в промышленном масштабе.

Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к способу получения вакцины по изобретению, включающему в себя стадии инфекции клеток-хозяев рекомбинантным MDV_np по настоящему изобретению, сбора инфицированных клеток-хозяев, и затем смешивания собранных инфицированных клеток-хозяев с фармацевтически приемлемым носителем. Пригодные способы инфекции, культивирования и сбора хорошо известны в данной области и описаны и проиллюстрированы в настоящем документе.

Как правило, инфицированные клетки-хозяева собирают, пока они еще являются интактными, для получения рекомбинантного MDV_np в его ассоциированной с клетками форме. Эти клетки можно заключать в подходящую композицию носителя для обеспечения стабилизации для хранения и замораживания. Инфицированными клетками можно наполнять стеклянные ампулы, которые герметично закрывают, замораживают и сохраняют в жидком азоте. Соответственно, в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения вакцины и/или иммуногенные композиции по настоящему изобретению сохраняют замороженными и, соответственно, они содержат криоконсервант, такой как диметилсульфоксид (DMSO), для консервации замороженных инфицированных клеток.

Альтернативно, когда рекомбинантный MDV_np представляет собой рекомбинантный HVT, его можно выделять из его клетки-хозяина, например, посредством обработки ультразвуком в конце культивирования, и затем заключать в стабилизатор, и сублимировать (лиофилизировать) для стабильного хранения или иным способом уменьшать объем жидкости для хранения, и затем разводить в жидком разбавителе до или во время введения. Такое разведение можно осуществлять с использованием, например, воды, пригодной для вакцин квалификации. В конкретных вариантах осуществления лиофилизированная часть мультивалентной вакцины может содержать один или несколько антигенов, и разбавитель может содержать один или несколько других антигенов.

В конкретных вариантах осуществления вакцина по настоящему изобретению (или ее часть) может находиться в лиофилизированной форме, например, в форме таблеток и/или сфер, которые получают способом, описанным в WO 2010/125084, полное содержание которого, таким образом, приведено в качестве ссылки. В частности, приведена ссылка на примеры от страницы 15, строка 28 до страницы 27, строка 9 из WO 2010/125084, описывающие способ получения таких таблеток/сфер для рассасывания. Такие лиофилизированные формы можно легко разводить в разбавителе для получения вакцин для системного введения.

Вакцины и иммуногенные композиции могут включать, но не обязательно включают, физиологически совместимые буферы и солевой раствор и т.п., также как фармацевтически приемлемые адъюванты. Адъюванты могут являться пригодными для улучшения иммунного ответа и/или увеличения стабильности препаратов вакцины. Адъюванты, как правило, описывают как неспецифические стимуляторы иммунной системы, но они также могут являться пригодными для нацеливания специфических ветвей иммунной системы. Одно или несколько соединений, обладающих такой активностью, можно добавлять к вакцине. Таким образом, конкретные вакцины по настоящему изобретению могут дополнительно содержать адъювант. Примеры химических соединений, которые можно использовать в качестве адъювантов, включают в себя, но без ограничения, соединения алюминия (например, гидроксид алюминия), метаболизируемые и неметаболизируемые масла, минеральные масла, включая производные олеата маннида в растворе минеральных масел (например, MONTANIDE ISA 70 из Seppic SA, France), и легкие минеральные масла, такие как DRAKEOL 6VR, блок-сополимеры, ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), витамины и минералы (включая, но без ограничения,: витамин E, витамин A, селен и витамин B12) и CARBOPOL®.

Другие пригодные адъюванты, на которые иногда ссылаются как на иммуностимуляторы, включают в себя, но без ограничения: цитокины, факторы роста, хемокины, супернатанты от клеточных культур лимфоцитов, моноциты, клетки из лимфоидных органов, препараты клеток и/или экстракты из растений, бактерий или паразитов (препараты Staphylococcus aureus или липополисахаридов) или митогены. Как правило, адъювант вводят в то же самое время, что и антиген по настоящему изобретению. Однако адъюванты можно также или альтернативно вводить в пределах периода двух недель до вакцинации и/или в течение некоторого периода времени после вакцинации, т.е. пока антиген, например, рекомбинантный MDV_np по настоящему изобретению, персистирует в тканях.

Вакцины и/или иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно вводить любым способом, таким как in ovo, посредством парентерального введения, включая внутримышечную инъекцию, подкожную инъекцию, внутривенную инъекцию, внутрикожную инъекцию, посредством скарификации, посредством перорального введения или посредством любой их комбинации.

Более того, мультивалентный рекомбинантный MDV_np по настоящему изобретению можно использовать и/или комбинировать с дополнительными антигенами NDV, ILTV и/или MDV для улучшения и усиления вызванной иммуногенности, и/или с антигенами для других патогенов для обеспечения иммунной защиты против таких других патогенов. Эти дополнительные антигены могут представлять собой живые или убитые цельные микроорганизмы, другие рекомбинантные векторы, гомогенаты, экстракты клеток, белки или любое другое такое производное при условии, что они не оказывают отрицательного влияния на безопасность, стабильность и эффективность вакцин в соответствии с настоящим изобретением.

Комбинация мультивалентного рекомбинантного MDV_np по настоящему изобретению с дополнительным антигеном MDV, NDV и/или ILTV может являться преимущественным в тех случаях, в которых очень вирулентные полевые штаммы MDV, NDV или ILTV являются преобладающими, например, в конкретном географическом регионе. В этой связи комбинация мультивалентного рекомбинантного MDV_np по настоящему изобретению с MDV1, MDV2 или HVT включает в себя штамм Rispens (MDV1), штамм SB1 (MDV2), штамм FC-126 (HVT) и/или штамм PB1 (HVT). Для улучшения ответа против NDV мультивалентный рекомбинантный MDV_np можно комбинировать с вакцинным штаммом NDV, таким как умеренный живой вакцинный штамм C2 NDV.

Примеры других микроорганизмов, которые можно использовать в качестве антигенов вместе с мультивалентным рекомбинантным MDV_np по настоящему изобретению, включают в себя: (i) вирусы, такие как вирус инфекционного бронхита, аденовирус, вирус синдрома снижения яйценоскости, вирус инфекционного бурсита, вирус анемии цыплят, вирус энцефаломиелита птиц, поксвирус птиц, вирус ринотрахеита индеек, вирус чумы уток (вирусного энтерита уток), поксвирус голубей, вирус лейкоза птиц, пневмовирус и реовирус птиц, (ii) бактерии, такие как Escherichia coli, виды Salmonella, Ornitobacterium rhinotracheale, Haemophilis paragallinarum, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, виды Erysipelas, виды Mycoplasma и виды Clostridium, (iii) паразитов, таких как виды Eimeria, и (iv) грибы, такие как виды Aspergillus. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантный MDV_np по настоящему изобретению можно комбинировать с умеренным живым вакцинным штаммом IBDV, таким как D78 (клонированный промежуточный штамм), PBG98, Cu-1, ST-12 (промежуточный штамм), или 89-03 (живой вариант штамма Delaware) в мультивалентной вакцине. Множество таких штаммов используют в коммерческих вакцинах.

Комбинированную вакцину можно получать множеством способов, включая комбинацию рекомбинантной MDV_np по настоящему изобретению с препаратами вируса или бактерий, или грибов, или паразитов, или клеток-хозяев, или смесью любых и/или всех из них. В конкретных вариантах осуществления компоненты для такой комбинированной вакцины удобно получать по отдельности и затем комбинировать и заполнять ими один и тот же контейнер для вакцины.

Как описано выше, вакцину по изобретению можно преимущественно использовать для обеспечения безопасной и эффективной иммунной защиты домашней птицы от множества заболеваний посредством однократной инокуляции в очень молодом возрасте или in ovo. Альтернативно, как очевидно специалистам в области вакцин для домашней птицы, комбинации, описанные выше, могут включать в себя также расписания вакцинации, при которых мультивалентный рекомбинантный MDV_np по настоящему изобретению и дополнительный антиген не вводят одновременно; например, рекомбинантный MDV_np можно вводить in ovo, и штамм C2 NDV и/или штамм IBDV (например, 89/03) можно вводить в последовательные периоды времени/даты.

Соответственно, вакцины по настоящему изобретению можно вводить субъекту-птице в однократной дозе или во множественных дозах. Например, вакцину по настоящему изобретению можно вводить на сутки вылупления и/или in ovo на сутки 16-18 (сутки эмбрионального развития) ED. При введении множественных доз их можно вводить либо одновременно, либо последовательно, способом и в периоды времени, совместимыми с составлением вакцины, и в таком количестве, какое может являться иммунологически эффективным. Таким образом, вакцина по настоящему изобретению может эффективно служить в качестве примирующей вакцинации, за которой затем может следовать и усиливать ее бустер-вакцинация идентичной вакциной, или другим препаратом вакцины, например, классической инактивированной, содержащей адъювант вакцины из цельного вируса.

Объем на дозу вакцины по настоящему изобретению можно оптимизировать в соответствии с намеченным способом введения: инокуляцию in ovo обычно вводят в объеме между 0,05 и 0,5 мл/яйцо, и парентеральную инъекцию обычно вводят в объеме между 0,1 и 1 мл/птицу. В любом случае, оптимизация объема дозы вакцины полностью находится в компетенции специалиста в данной области.

Таблица последовательностей SEQ ID NO: Описание Тип 1 Гликопротеин gD ILTV нуклеиновая кислота 2 Гликопротеин gD ILTV аминокислотная 3 Гликопротеин gI ILTV нуклеиновая кислота 4 Гликопротеин gI ILTV аминокислотная 5 Белок F NDV (Clone 30) нуклеиновая кислота 6 Белок F NDV (Clone 30) аминокислотная 7 Белок F NDV (B1 Hitchner) нуклеиновая кислота 8 Белок F NDV (B1 Hitchner) аминокислотная 9 Промотор gD ILTV нуклеиновая кислота 10 Промотор gI ILTV нуклеиновая кислота 11 Промотор hCMV IE (усеченный) нуклеиновая кислота 12 Промотор hCMV IE (штамм Towne) нуклеиновая кислота 13 Синтетический сигнал полиаденилирования нуклеиновая кислота 14 Сигнал полиаденилирования HSVTK нуклеиновая кислота 15 Вставка IE-NDV F нуклеиновая кислота 16 Вставка ILTV нуклеиновая кислота 17 Вставка ILTV /IE-NDV F нуклеиновая кислота

Настоящее изобретение можно лучше понять со ссылкой на следующие неограничивающие примеры, которые представлены в качестве иллюстративных по изобретению. Следующие примеры представлены для более полной иллюстрации вариантов осуществления изобретения, и их никоим образом не следует рассматривать как ограничивающие широкий смысл изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ HVT/NDV/ILTV

Возможность получения вирусов герпеса посредством совместной трансфекции клонированных перекрывающихся субгеномных фрагментов впервые продемонстрирована для вируса псевдобешенства [van Zijl et al., J. Virology 62:2191-2195 (1988)]. Этот способ впоследствии использовали для конструирования рекомбинантных векторов HVT [см., U.S. 5853733, содержание которого приведено в качестве ссылки по отношению к способу, описанному в отношении конструирования рекомбинантных HVT векторов] и использованы для конструирования рекомбинантных векторов HVT/NDV/ILTV по настоящему изобретению. По этому способу полный геном HVT клонируют в бактериальные векторы в форме больших перекрывающихся субгеномных фрагментов, сконструированных с использованием общепринятых способов рекомбинантной ДНК [Maniatis 15 et al., (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1982); и Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]. Космидная библиотека HVT штамма FC126 получена из фрагментированной сдвигом вирусной ДНК, клонированной в космидный вектор, WE15 (Stratagene, в настоящее время Agilent Technologies of Santa Clara, CA). Кроме того, несколько больших фрагментов геномной ДНК 20 выделяли рестрикционным расщеплением с помощью фермента BamHI и клонировали либо в pWE15, либо в плазмидный вектор pSP64 (Promega, Madison WI). Как описано в U.S. 5853733, совместная трансфекция этих фрагментов в клетки эмбриональных фибробластов курицы (CEF) приводит к регенерации генома HVT, опосредованной гомологичной рекомбинацией среди перекрывающихся областей фрагментов. Если вставку конструируют непосредственно в одном или нескольких из субгеномных фрагментов перед совместной трансфекцией, этот способ приводит в результате к высокой частоте вирусов, содержащих вставку. Пять перекрывающихся субгеномных клонов необходимы для получения FC126 HVT, и они служат основой для получения всех рекомбинантных вирусов HVT/NDV/ILTV.

Конструирование HVT/NDV/ILTV 1332-62.E1: Космидную регенерацию HVT/NDV/ILTV 1332-62.E1 проводили в основном, как описано в U.S. 5853733 [например, фиг.8 из U.S. 5853733; скопированная, по меньшей мере, частично на фиг.1 в настоящем документе]. Чтобы позволить интеграцию в область US генома FC126 HVT, область, перекрываемая нуклеотидами 378-50 космиды в U.S. 5853733, в настоящее время представлена из трех меньших плазмид: pSY640 и 556-60.6 и одной плазмиды для переноса (1332-47.A2), перекрывающей эти две и содержащей экспрессирующие кассеты ILTV/NDV в локусе гена US2.

Набором из семи линеаризованных конструкций: 3 космид и 4 плазмид всеми вместе трансфицировали CEF с использованием общепринятого способа трансфекции с CaCl₂, и полученный исходный препарат вируса один раз очищали из отдельной бляшки.

Конструирование HVT/NDV/ILTV 1332-70.B1: Космидную регенерацию HVT/NDV/ILTV 1332-70.B1 проводили в основном, как описано в U.S. 5853733 [например, фиг.8 из U.S. 5853733; скопированная, по меньшей мере, частично на фиг.1 в настоящем документе]. Чтобы позволить интеграцию в область UL54.5 генома FC126 HVT, область, перекрываемая нуклеотидами 407-32.1C1 космиды в U.S. 5853733, в настоящее время предоставлена из трех меньших плазмид: 672-01.A40 и 672-10 07.C40 и одной плазмиды для переноса (1332-29.4), перекрывающей эти две и содержащей экспрессирующие кассеты ILTV/NDV в локусе гена UL54.5.

Набором из семи линеаризованных конструкций: 4 космид и 3 плазмид всеми вместе трансфицировали CEF с использованием общепринятого способа трансфекции с CaCl₂, и полученный исходный препарат вируса один раз очищали из отдельной бляшки.

Конструирование HVT/NDV/ILTV 1317-46. A1-1: Космидную регенерацию HVT/NDV/ILTV 1317-46.A1-1 проводили в основном, как описано в U.S. 5853733 [например, фиг.8 из U.S. 5853733; скопированная, по меньшей мере, частично на фиг.1 в настоящем документе]. Чтобы позволить интеграцию в область US генома FC126 HVT, область, перекрываемая нуклеотидами 378-50 космиды в U.S. 5853733, в настоящее время предоставлена из трех меньших плазмид: pSY640 и 556-60.6 и одной плазмиды для переноса (1317-15.1-1), перекрывающей эти две и содержащей экспрессирующие кассеты ILTV, вставленные в локус гена US2. Вставку во второй участок в геноме FC126 HVT осуществляли заменой области UL космиды нуклеотиды 407-32.2C3 в U.S. 5853733 космидой для переноса (1196-05.1), содержащей экспрессирующую кассету NDV, вставленную между генами HVT UL7 и UL8.

Набором из семи конструкций: 1 нерасщепленной космиды (1196-05.1), оставшихся 2 линеаризованных космид и 4 линеаризованных плазмид, всеми вместе трансфицировали CEF с использованием общепринятого способа трансфекции с CaCl₂, и полученный исходный препарат вируса один раз очищали из отдельной бляшки.

Описание субгеномных фрагментов для получения FC126 HVT:

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 407-32.2C3. Космида 407-32.2C3 содержит область приблизительно 40170 пар оснований геномной ДНК HVT [Левый конец - положение 39754; Afonso et al., 2001, выше Acc. #AF291866]. Эта область включает BamHI фрагменты HVT F’, L, P, N1, E, D и 2092 пар оснований фрагмента B.

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 172-07.BA2. Плазмида 172-07.BA2 содержит область 25931 пар оснований геномной ДНК HVT. Она сконструирована посредством клонирования BamHI фрагмента В HVT [положения 37663-63593; Afonso et al., 2001, выше; Acc. #AF291866] в плазмиду pSP64 (Promega, Madison WI).

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 407-32,5G6. Космида 407-32.5G6 содержит область 39404 пар оснований геномной ДНК HVT [положения 61852-101255; Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866]. Эта область включает BamHI фрагменты H, C, Q, K1, M, K2 HVT, плюс 1742 пар оснований фрагмента B и 3880 пар оснований фрагмента J.

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 407-32.1 C1. Космида 407-32.1 C1 содержит область 37444 пар оснований геномной ДНК HVT [положения 96095-133538; Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866]. Эта область включает BamHI фрагменты J, G, I, F, O HVT, плюс 1281 пар оснований фрагмента K2 и 6691 пар оснований фрагмента A.

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 378-50. Космида 378-50 содержит область 28897 пар оснований геномной ДНК HVT [см. фиг.8 из U.S. 5853733; скопированная, по меньшей мере частично, на фиг.1 в настоящем документе]. Она сконструирована посредством клонирования BamHI фрагмента A HVT [положения 126848-155744; Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866] в космиду pWE15.

Дополнительные фрагменты вставок для получения HVT/NDV/ILTV 1332-62.E1:

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 1332-47.A2. Плазмида для вставки 1332-47.A2 содержит область 7311 пар оснований EcoRI фрагмента уникальной короткой области HVT [положения 136880-144190; Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866], клонированную в плазмиду pSP64 (Promega, Madison WI). Вставлены в уникальный участок StuI внутри гена HVT US2 [положения 140540/140541, Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866, между аминокислотными остатками 124 и 125] 2 элемента: SalI - HindIII фрагмент 3563 пар оснований из ILTV, штамм для заражения NVSL, партия # 83-2 [положения 10532-14094; Wild et al., Virus Genes 12:104-116 (1996); Acc.# U28832], кодирующий полноразмерные гены гликопротеина D (gD) и гликопротеина I (gI), плюс частичные кодирующие области из гликопротеина E (аминокислоты 1-101), и ORF5 (аминокислоты 734 -985); и экспрессирующая кассета, состоящая из IE промотора HCMV, NDV, штамм клона 30, гена слияния (F) с последующим синтетическим сигналом полиаденилирования. Транскрипция генов gD ILTV, gI ILTV и F NDV происходит в противоположном направлении относительно гена US2 HVT.

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН pSY640. Плазмида pSY640 содержит область приблизительно 13600 пар оснований геномной ДНК HVT [положения 126848-140540; Afonso et al., 2001, выше; Acc. #AF291866], полученной из BamHI фрагмента A. Для получения этой плазмиды область ДНК, локализованную выше гена US2, начинающуюся в участке StuI, локализованном в гене US2, и продолжающуюся до конца BamHI фрагмента A, клонировали в плазмиду pSP64 (Promega, Madison Wl).

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 556-60.6. Плазмида 556-60.6 содержит область приблизительно 12500 пар оснований геномной ДНК HVT, полученной из BamHI фрагмента A [приблизительно от положения 143300 до положения 155744, Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866]. Для получения этой плазмиды область ДНК, локализованную ниже гена US2, начинающуюся в участке StuI, локализованном в гене US2, и продолжающуюся до конца BamHI фрагмента A, клонировали в плазмиду pSP64 (Promega, Madison WI), и затем обрабатывали экзонуклеазой для «выкусывания» из участка StuI ~150 п.о. и переклонировали в плазмидный вектор pBR322.

Дополнительные фрагменты вставок для получения HVT/NDV/ILTV 1332-70.B1:

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 1332-29.4. Плазмида 1332-29.4 содержит область 8636 пар оснований геномной ДНК HVT, полученной из уникальной длинной области [положения 109489-118124; Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866], клонированной в производное плазмиды pNEB193 (с делецией AatII-PvuII). Она фланкирована участками AscI и включает BamHI фрагменты HVT I, S, плюс 1337 пар оснований фрагмента G и 1177 пар оснований фрагмента F. В участок XhoI внутри открытой рамки считывания UL54.5 HVT [положения. 111240/111241, Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866, между аминокислотными остатками 21 и 22] вставлены 2 элемента: SalI-HindIII фрагмент 3563 пар оснований из ILTV, штамм для заражения NVSL, партия # 83-2 [положения 10532- 14094; Wild et al. 1996, выше, Acc.# U28832], кодирующий полноразмерные гены гликопротеина D (gD) и гликопротеина I (gI), плюс частичные кодирующие области из гликопротеина E (аминокислоты 1-101) и ORF5 (аминокислоты 734-985); и экспрессирующая кассета, состоящая из IE промотора HCMV, NDV, штамма клона 30, гена слияния (F) с последующим синтетическим сигналом полиаденилирования. Транскрипция генов gD ILTV, gI ILTV и NDV F происходит в противоположном направлении относительно гена UL54,5 HVT.

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 672-01.A40. Плазмида 672-01.A40 содержит область 14731 пар оснований геномной ДНК HVT, полученной из уникальной длинной области [положения 96095-110825; Afonso et al., 2001, выше^-, Acc. #AF291866], клонированной в производное плазмиды pNEB193. Эта область включает BamHI фрагменты G, J HVT и 1281 пар оснований из K2.

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 672-07.C40. Плазмида 672-07.C40 содержит область 12520 пар оснований геномной ДНК HVT, полученной из уникальной длинной области [положения 116948-129467; Afonso et al., 2001, выше; Acc. #AF291866], клонированной в производное плазмиды pNEB193. Эта область включает BamHI фрагменты F, О HVT и 2620 пар оснований из A.

Дополнительные фрагменты вставок для получения HVT/NDV/ILTV 1317-46.A1-1:

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 1196-05.1. Космида 1196-05.1 содержит область приблизительно 40170 пар оснований геномной ДНК HVT [Левый конец - положения 39754; Afonso et al., 2001, выше; Acc. #AF291866], клонированную в космиду pWE15. Эта область включает BamHI фрагменты F', L, P, N1, E, D HVT и 2092 пар оснований фрагмента B. Кроме того, экспрессирующая кассета, кодирующая ген слияния (F) NDV, включая IE промотор HCMV и регуляторные элементы для полиаденилирования HSV TK, вставлена в некодирующую область между генами HVT UL7 и UL8 внутри BamHI фрагмента E [положения 20030-20035; Afonso et al., 2001, выше; Acc. #AF291866]. Транскрипция гена F NDV происходит в том же направлении, что и UL7 HVT.

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 1317-15.1-1. Плазмида 1317-15.1-1 содержит область 7311 пар оснований EcoRI фрагмента уникальной короткой области HVT [положения 136880-144190; Afonso et al., 2001, выше; Acc. #AF291866], клонированную в плазмиду pSP64 (Promega, Madison WI). Кроме того, SalI-HindIII фрагмент 3563 пар оснований из ILTV, штамм для заражения NVSL, партия # 83-2 [положения 10532-14094; Wild et al., 1996, выше, Acc.# U28832], кодирующий полноразмерные гены гликопротеина D (gD) и гликопротеина I (gI), плюс частичные кодирующие области для гликопротеина E (аминокислоты 1-101) и ORF5 (аминокислоты 734-985), клонированы в уникальный участок StuI внутри гена US2 HVT [положения 140540/140541, Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866, между аминокислотными остатками 124 и 125]. Транскрипция генов gD и gI ILTV происходит в противоположном направлении относительно гена US2 HVT.

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН pSY640. Плазмида pSY640 содержит область приблизительно 13600 пар оснований геномной ДНК HVT [положения 126848-140540; Afonso et al., 2001, выше; Acc. #AF291866], полученной из BamHI фрагмента A. Для получения этой плазмиды область ДНК, локализованную выше гена US2, начинающуюся в участке StuI, локализованном в гене US2, и продолжающуюся до конца BamHI фрагмента A, клонировали в плазмиду pSP64 (Promega, Madison WI).

СУБГЕНОМНЫЙ КЛОН 556-60.6. Плазмида 556-60.6 содержит область приблизительно 12500 пар оснований геномной ДНК HVT, полученной из BamHI фрагмента A [приблизительно от положения 143300 до положения 155744, Afonso et al., 2001, выше, Acc. #AF291866]. Для получения этой плазмиды область ДНК, локализованную ниже гена US2, начинающуюся в участке StuI, локализованном в гене US2, и продолжающуюся до конца BamHI фрагмента A, клонировали в плазмиду pSP64 (Promega, Madison Wl), и затем обрабатывали экзонуклеазой для «выкусывания» из участка StuI ~150 п.о. и переклонировали в плазмидный вектор pBR322.

Общепринятый протокол трансфекции с CaCl₂. Вторичные CEF рассевали в 6-луночные культуральные планшеты и инкубировали при 38°C с 5% CO₂ в течение 24 часов и до формирования конфлюэнтного монослоя. Для каждой лунки общее количество 0,25 пг ДНК космид и плазмид смешивали в буфере Hepes, и 125 мМ CaCl₂ добавляли по каплям до неизбежной преципитации. Эту смесь добавляли к монослою клеток CEF и инкубировали в течение 2-3 час. Супернатант удаляли и добавляли верхний слой из 15% глицерина и сохраняли на клетках в течение 1 минуты. Затем его удаляли, промывали PBS и добавляли свежую культуральную среду, и клетки инкубировали в течение 5 суток. Затем клетки собирали трипсинизацией, и каждые клетки из отдельных планшетов рассеивали на свежие монослои клеток CEF в 10 см чашках и инкубировали до достижения 50-90% CPE. Затем амплифицированные трансфицированные клетки собирали трипсинизацией, и разведения 10^-2-10^-4 рассевали на 10 см чашки с монослоями CEF и инкубировали. На следующие сутки чашки покрывали агаром, и несколько отдельных бляшек на HVT/NDV/ILTV выделяли и амплифицировали на CEF.

ПРИМЕР 2

РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА HVT/ND/ILTV ЗАЩИЩАЕТ ЦЫПЛЯТ В ВОЗРАСТЕ ОДНИ СУТКИ ПРОТИВ ЗАРАЖЕНИЯ ВИРУСОМ ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА

Две вакцины, одну, содержащую HVT/NDV/ILTV-1332-62E1, и другую, содержащую 1332-70B1, оценивали по эффективности защиты кур от заражения вирусом инфекционного ларинготрахеита. HVT/NDV/ILTV-1332-62E1 представляет собой rHVT, в котором остов FC126 HVT содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, вставленную в участок US2 (см. пример 1 выше). HVT/NDV/ILTV-1332-70B1 представляет собой rHVT, в котором остов FC126 HVT содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, вставленную в участок UL54.5 (см. пример 1 выше).

Препараты вакцины для обоих исходных препаратов вируса получали из исходных препаратов, пассированных в культуре клеток эмбриональных фибробластов кур, по меньшей мере 8 раз, и дополнительный препарат после 11 пассажей в культуре клеток получали и тестировали для 1332-62E1.

Вакцины вводили только что вылупившимся, свободным от специфических антигенов (SPF) цыплятам подкожным способом. Затем птиц заражали в возрасте четырех недель вирулентным вирусом для заражения ILTV интратрахеальным способом и наблюдали в течение 10 суток клинические признаки заболевания. Случаи заболеваемости у этих цыплят сравнивали с контрольными, которым либо вводили коммерческую рекомбинантную вакцину HVT/ILTV (Innovax®-ILT из Merck Animal Health), либо не вводили вакцины. Федеральный код регистрации (9CFR) требует, чтобы по меньшей мере 80% из невакцинированных контрольных птиц обязательно обладали клиническими признаками, чтобы тест являлся действительным, и по меньшей мере 90% вакцинированных птиц должны оставаться свободными от клинических признаков, чтобы рассматривать обеспечение удовлетворительной защиты. Результаты этого исследования представлены в таблице 1 ниже. Обе двойные рекомбинантные вакцины обеспечивали удовлетворительную защиту против заражения вирулентным ILTV.

Таблица 1 Эффективность мультивалентной вакцины HVT/NDV/ILTV против заражения вирулентным ILTV Группа Вакцина Доза* Клинические признаки** Смертность** Клинические результаты и результаты некропсии** % защиты

1 1332-62.E Пассаж 8 2170 1/36 1/36 1/36=2,8% 97,2% 2 1332-62.E Пассаж 11 1409 0/36 0/36 0/36=0% 100% 3 1332-70.В Пассаж 8 2483 3/36 2/36 3/36=8,3% 91,7% 4 Innovax^®-ILT 2200 0/24 0/24 0/24=0% 100% 5a Контроль после заражения NA 10/10 9/10 10/10=100% 0% 5b Контроль без заражения NA 0/10 0/10 0/10 NA *Доза описана как бляшкобразующие единицы (БОЕ)/объем дозы 0,2 мл.
**Результаты приведены как количество положительных птиц на общее количество птиц (No. положительных/общее).

ПРИМЕР 3

РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА HVT/ND/ILTV ЗАЩИЩАЕТ ЦЫПЛЯТ В ВОЗРАСТЕ ОДНИ СУТКИ ПРОТИВ ЗАРАЖЕНИЯ ВИРУСОМ БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА

Свободных от специфических антигенов (SPF) цыплят в возрасте одни сутки или 19-суточные эмбрионы вакцинировали рекомбинантной вакциной HVT/NDV/ILTV-1332-62E1 на уровне пассажа 11 в культуре клеток или коммерческой рекомбинантной вакциной HVT/NDV (Innovax^®-ND, выпускаемой Merck Animal Health), и затем заражали в возрасте четырех недель вирулентным вирусом болезни Ньюкасла (ND) для заражения, штамм Texas-GB, внутримышечным способом. После периода наблюдения 14 суток, когда птицам присваивали баллы по клиническим признакам болезни Ньюкасла, случаи заболеваемости в каждой группе цыплят сравнивали с невакцинированным контролем. Федеральный код регистрации (9CFR) требует, чтобы по меньшей мере 80% из невакцинированных контрольных птиц обязательно обладали клиническими признаками, чтобы тест являлся действительным, и по меньшей мере 90% вакцинированных птиц должны оставаться свободными от клинических признаков, чтобы рассматривать вакцину как обеспечивающую удовлетворительную защиту. Результаты этого исследования показывают, что рекомбинантная вакцина HVT/NDV/ILTV 1332-62E1 обеспечивает удовлетворительную защиту против ND при обоих способах введения.

Таблица 2 Эффективность мультивалентной вакцины HVT/NDV/ILTV против заражения вирулентным NDV Группа Вакцина Доза* Способ No. птиц Клинические признаки Смертность** % защиты 1a 1332-62.E Пассаж 11 2160 in ovo 31 0/31=0% 0/31=0% 100% 1b 1332-62.E Пассаж 11 2010 SC 31 0/31=0% 0/31=0% 100% 2a Innovax^®-ND 2046 in ovo 32 3/32=9,4% 2/31=6,3% 90,6% 2b Innovax^®-ND 1872 SC 32 1/32=3% 1/32=3 % 96,9% 3 Разбавитель Марека NA SC 12 12/12=100% 12/12=100% 0% *Доза описана как бляшкобразующие единицы (БОЕ)/ объем дозы (0,2 мл/SC дозу, 0,1 мл/ in ovo дозу).
**Результаты приведены как количество положительных птиц на общее количество птиц (No. положительных/общее).

ПРИМЕР 4

РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА HVT/ND/ILTV ЗАЩИЩАЕТ ЦЫПЛЯТ В ВОЗРАСТЕ ОДНИ СУТКИ ПРОТИВ ЗАРАЖЕНИЯ ВИРУСОМ ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА И ЗАРАЖЕНИЯ ВИРУСОМ БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА

Вакцину HVT/NDV/ILT-1317-46.1-1 оценивали по эффективности защиты кур от заражения вирусом инфекционного ларинготрахеита или от заражения вирусом болезни Ньюкасла. HVT/NDV/ILTV-1317-46.1-1 представляет собой rHVT, в котором остов FC126 HVT содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 16, вставленную в участок US2, и последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, вставленную в участок UL7/8, т.е. между генами UL7 и UL8 HVT, (см. пример 1 выше). Препарат вакцины получали из исходного препарата, пассированного в культуре клеток эмбриональных фибробластов кур 15 раз.

Вакцины вводили только что вылупившимся, свободным от специфических антигенов (SPF) цыплятам подкожным способом. Затем птиц заражали в возрасте четырех недель вирулентным вирусом инфекционного ларинготрахеита (ILT) для заражения интратрахеальным способом и наблюдали в течение 10 суток клинические признаки заболевания, или заражали вирулентным вирусом болезни Ньюкасла, штамм Texas-GB, внутримышечным способом и наблюдали в течение 14 суток. Случаи заболеваемости у этих цыплят сравнивали с контрольными, которым либо вводили коммерческую рекомбинантную вакцину HVT/ILT, вакцину HVT/ND, либо не вводили вакцины. Федеральный код регистрации (9CFR) требует, чтобы по меньшей мере 80% из невакцинированных контрольных птиц обязательно обладали клиническими признаками, чтобы тест являлся действительным, и по меньшей мере 90% вакцинированных птиц должны оставаться свободными от клинических признаков, чтобы рассматривать обеспечение удовлетворительной защиты. Результаты этого исследования представлены в таблице 3 ниже. Вакцина HVT/NDV/ILT обеспечивала удовлетворительную защиту против заражения NDV. Хотя в этом предварительном исследовании защита, обеспеченная этой конструкцией против заражения вирулентным ILTV, не удовлетворяла федеральным требованиям, она в действительности обеспечивала существенную защиту.

Таблица 3 Эффективность мультивалентной вакцины HVT/NDV/ILTV против заражения вирулентными NDV и ILTV Группа обработки Доза * No. птиц a) Результаты после заражения ILT NDV No.
положительных/общее** % защиты No.
положительных/общее** % защиты HVT/NDV/ILT 1317-46 (p15) 1356 20 4/20=20% 80% 0/19=0% 100% Innovax^®-ILT 1740 20 1/20=5% 95% - - Innovax^®-ND 1836 20 - - 0/20=0% 100% Плацебо N/A 10 10/10=100% 0% 8/8=100% 0% *Доза описана как бляшкобразующие единицы (БОЕ)/объем дозы 0,2 мл.
**Результаты приведены как количество положительных птиц (клинические признаки и смертность) на общее количество птиц (No. положительных/общее).

ПРИМЕР 5

РЕКОМБИНАНТНЫЙ HVT/ND/ILTV В КОМБИНАЦИИ С 89/03 БУРСИТА В ВАКЦИНЕ ПРОТИВ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БУРСИТА

Группам цыплят в возрасте одни сутки (SPF леггорн) вводили HVT/NDV/ILTV-1332-62E1, объединенную с вакциной IBDV 89/03 во время использования. Отдельную группу цыплят вакцинировали только вакциной IBDV при 3,5 log₁₀ TCID₅₀ на дозу. Кур заражали в возрасте 4 недель вариантом E IBDV для заражения. На 10 сутки после заражения птиц подвергали эвтаназии и обследовали по массе тела/бурсы и макроскопическим повреждениям, соответствующим бурситу. Результаты анализировали по приемлемости по требованиям применимости 9CFR 113.331.

IBDV 89/03 представляет собой лицензированный продукт, используемый в промышленном птицеводстве для защиты стад как против классического штамма, так и против вариантов штаммов вируса инфекционного бурсита. Намеченная доза для вакцины IBDV 89/03 составляла 3,5 log₁₀ TCID₅₀ на дозу 0,2 мл. Намеченная доза для HVT/NDV/ILT составляла 3000 БОЕ на дозу 0,2 мл. Для достижения намеченных доз в конечном объеме разбавителя вакцины, вакцину HVT/NDV/ILTV-1332-62E1 разводили до содержания 6000 БОЕ в 0,2 мл, что в два раза превышает намеченную дозу. Вакцину 89/03 разводили до содержания 3,8 log₁₀ TCID₅₀, что в два раза превышает намеченную дозу. Для группы 1 комбинированную вакцину получали объединением равных объемов вакцины HVT/NDV/ILTV-1332-62E1 и вакцины 89/03. Для группы 2, в которой вводили только вакцину 89/03, добавляли равный объем разбавителя. Курам в возрасте одни сутки в каждой группе обработки вводили 0,2 мл соответствующей вакцины или плацебо подкожным (SC) способом (см. таблицу 4).

Таблица 4 ДИЗАЙН ЭКСПЕРИМЕНТА Группа No. Вакцина Доза HVT-(89/03) Вариант E IBDV Заражение Некропсия Возраст # птиц 1 45 HVT/NDV/ILT+89/03 3000-(3,5 log₁₀TCID₅₀) 4 недели >40 10 суток после заражения 2 45 89/03 NA-(3,5 log₁₀TCID₅₀) 4 недели >40 10 суток после заражения 3 45 Контроль после заражения плацебо - 4 недели >40 10 суток после заражения 4 30 Контроль без заражения плацебо - - >25 10 суток после заражения

После вылупления цыплят в группах обработки каждой вакциной помечали с помощью набора случайно выбранных идентификационных номеров, назначенных с использованием программы рандомизации EXCEL. Кроме того, птиц, отбираемых из каждого загона на 7 сутки после заражения для гистологического обследования бурсы, определяли случайным образом с использованием программы рандомизации EXCEL.

Кур заражали в возрасте четырех недель вирусом для заражения IBDV-вариант E. Каждой курице вводили 0,06 мл, содержащих приблизительно 10²² EID₅₀ на дозу, посредством введения в глазных каплях. Через семь суток после заражения 6-9 птиц из каждой группы удаляли для гистологической оценки индивидуальных бурс (см. таблицу 5). Образцы бурсы отбирали у каждой курицы после заражения, с осторожностью отбирая ткань, не поврежденную или не раздавленную ножницами. Образец ткани помещали в индивидуальный контейнер с 10% формалином.

Бурсу от каждой курицы, зараженной вирусом IBD-Var E, регистрировали как отрицательную или положительную по атрофии бурсы, макроскопическим повреждениям и/или лимфопении, как определяли по гистологическому обследованию. Повреждения бурсы включали в себя макроскопическую геморрагию, отек/выпоты, кремовый/желтый цвет, исчерченность или макроскопическую атрофию. Атрофию бурсы измеряли посредством индивидуального взвешивания каждой курицы до ближайшего грамма. Бурсы взвешивали индивидуально до ближайшей сотой грамма. Массовые соотношения бурсы/тела вычисляли для каждой птицы с использованием формулы, соотношение BW: (масса бурсы/масса тела) X 1000. Массовое соотношение бурсы к телу более 2 стандартных отклонений от зараженного контроля рассматривали как отрицательное и защитное для инфекционного бурсита. Результаты этого исследования показали, что группы обработки вакциной 1 и 2 являлись отрицательными по IBD (т.е. значимо не отличались от незараженного контроля с плацебо), что указывает на то, что обе вакцины являлись эффективными, и кроме того, показывает, что не присутствовало помех для защиты, обеспечиваемой вакцинами штамма 89/03 против заражения IBDV, обусловленных тем, что рекомбинантная конструкция HVT/NDV/ILT также присутствует в мультивалентной вакцине (см. таблицу 5).

Таблица 5 ДАННЫЕ НЕКРОПСИИ НА СУТКИ 7 ДЛЯ ЗАРАЖЕНИЯ ВАРИАНТОМ E IBDV Группа No. Вакцина Среднее соотношение BW бурсы 1 9 HVT/NDV/ILT + 89/03 5,464 2 9 89/03 5,715 3 9 контроль после заражения плацебо 1,874 (SD+0,641 )** 4 6 контроль без заражения плацебо 5,838 **2 SD от контроля является статистически отличным

ПРИМЕР 6

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Следующие последовательности использованы в иллюстративных конструкциях rHVT. Кодирующие последовательности, представленные ниже, включают индивидуальные стоп-кодоны, которые можно легко заменять альтернативными стоп-кодонами без модификации свойств белковых антигенов, кодируемых кодирующими последовательностями.

Настоящее изобретение не предназначено для ограничения в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Действительно, различные модификации по изобретению в дополнение к модификациям, описанным в настоящем документе, очевидны специалистам в данной области из предшествующего описания. Такие модификации предназначены, чтобы входить в объем прилагаемой формулы изобретения.

Кроме того, следует понимать, что все размеры в основаниях или размеры в аминокислотах, и все молекулярные массы или значения молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и представлены для описания.

Изобретения касаются рекомбинантного непатогенного вируса болезни Марека (rMDV_np), представляющего собой рекомбинантный вирус герпеса индеек (rHVT), а также вакцины, содержащей такой вирус, и способа защиты кур против вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) и вируса болезни Ньюкасла (NDV). Представленный вирус содержит первую нуклеиновую кислоту, вставленную в первый не являющийся необходимым участок в геноме rMDV_np, и вторую нуклеиновую кислоту, вставленную во второй не являющийся необходимым участок в геноме rMDV_np. Первая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие белки gD и gI ILTV. Вторая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок слияния вируса болезни Ньюкасла (NDV F). Первый не являющийся необходимым участок и второй не являющийся необходимым участок либо представляют собой один и тот же не являющийся необходимым участок, либо первый не являющийся необходимым участок представляет собой участок US2, а второй не являющийся необходимым участок представляет собой участок UL7/8. Изобретения позволяют получать стабильное средство защиты против ILTV и NDV. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Рекомбинантный непатогенный вирус болезни Марека (rMDV_np) для способствования защите кур против вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) и вируса болезни Ньюкасла (NDV), содержащий первую нуклеиновую кислоту, вставленную в первый не являющийся необходимым участок в геноме rMDV_np, и вторую нуклеиновую кислоту, вставленную во второй не являющийся необходимым участок в геноме rMDV_np,

где первая нуклеиновая кислота содержит как нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), так и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок gI вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV);

где вторая нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок слияния вируса болезни Ньюкасла (NDV F); и

где первый не являющийся необходимым участок и второй не являющийся необходимым участок либо представляют собой один и тот же не являющийся необходимым участок, либо первый не являющийся необходимым участок представляет собой участок US2, а второй не являющийся необходимым участок представляет собой участок UL7/8; и причем rMDVnp представляет собой рекомбинантный вирус герпеса индеек (rHVT).

2. rHVT по п. 1, где первый не являющийся необходимым участок и второй не являющийся необходимым участок представляют собой участок US2.

3. rHVT по п. 1, где первый не являющийся необходимым участок и второй не являющийся необходимым участок представляют собой участок UL54.5.

4. rHVT по п. 1, где первый не являющийся необходимым участок представляет собой участок US2 и второй не являющийся необходимым участок представляет собой участок UL7/8.

5. rHVT по п. 1, где нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gD ILTV, функционально находится под контролем первого промотора, нуклеотидная последовательность, кодирующая белок gI ILTV, функционально находится под контролем второго промотора и нуклеотидная последовательность, кодирующая белок F NDV, функционально находится под контролем третьего промотора.

6. rHVT по п. 5, где первый промотор представляет собой эндогенный промотор gD ILTV, второй промотор представляет собой эндогенный промотор gI ILTV и третий промотор представляет собой немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE).

7. rHVT по п. 1, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую в направлении от 5' до 3' в следующем порядке:

(i) промотор gD вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV);

(ii) кодирующую последовательность белка gD ILTV;

(iii) промотор gI ILTV;

(iv) кодирующую последовательность белка gI ILTV;

(v) немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV IE);

(vi) кодирующую последовательность белка слияния вируса болезни Ньюкасла (NDV F) и

(vii) последовательность терминатора транскрипции;

причем первый не являющийся необходимым участок и второй не являющийся необходимым участок представляют собой один и тот же не являющийся необходимым участок, выбранный из группы, состоящей из US2 и UL54.5, и рекомбинантная нуклеиновая кислота вставлена в этот не являющийся необходимым участок.

8. Вакцина для способствования защите кур против вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) и вируса болезни Ньюкасла (NDV), содержащая rHVT по любому из пп. 1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Вакцина по п. 8, дополнительно содержащая слабый живой вирус инфекционного бурсита (IBDV), где слабый живой IBDV представляет собой штамм 89/03.

10. Способ способствования защите кур против ILTV и NDV, включающий введение курам вакцины по п. 8 или 9.