Композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток и способы ее приготовления и применения Российский патент 2025 года по МПК A01N1/00 C12N5/775 A61K35/28 A61K35/51 A61P17/02 

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В настоящей заявке на изобретение заявлен приоритет предварительной заявки на патент США№62/912368, поданной 8 октября 2019 года, содержание которой включено в настоящем документе для всех задач путем ссылки.

ПЕРЕЧНИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка на изобретение содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, которая включена в настоящем документе путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, способу приготовления композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, а также к способам применения композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток. Такие способы включают способ транспортирования мезенхимальных стволовых клеток в этой композиции для хранения или транспортировки, а также способ лечения субъекта, страдающего от заболевания, где способ включает местное введение мезенхимальных стволовых клеток, которые хранят или транспортируют в этой композиции для хранения или транспортировки. Также рассмотрена однократная доза мезенхимальных стволовых клеток.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

О мезенхимальных стволовых клетках, выделенных из амниотической мембраны пуповины, и их ранозаживляющих свойствах впервые сообщалось в заявке на патент США 2006/0078993 (на основании которой выданы патенты США №9085755, 9737568 и 9844571) и в соответствующей международной патентной заявке WO 2006/019357. Поскольку затем на ткань пуповины обратили внимание в качестве источника мультипотентных клеток; вследствие ее широкой доступности пуповина и, в частности, стволовые клетки, выделенные из амниотической мембраны пуповины (также называемые как "выстилающие пуповину стволовые клетки"), рассматриваются как превосходный альтернативный источник клеток для регенеративной медицины. См., Jeschke et al. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences; The Open Tissue Engineering and Regenerative Medicine Journal, 2011, 4, 21-27. В то же самое время, популяция таких мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины описана в заявке на патент США 20181/27721 или в соответствующей международной патентной заявке WO 2018/067071.

Популяция мезенхимальных стволовых клеток, описанная в заявке на патент США 20181/27721 или в соответствующей международной патентной заявке WO 2018/067071, обладает преимуществом, заключающемся в том, что 99% или более стволовых клеток этой популяции экспрессируют три маркера MCK CD73, CD90 и CD 105, но не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR. Таким образом, эта чрезвычайно гомогенная и хорошо определенная клеточная популяция представляет собой идеальный кандидат для клинических исследований и способов клеточной терапии, поскольку она, например, полностью удовлетворяет критериям, в общем принятым для МСК человека, используемых для клеточной терапии, как определено, например, в Dominici et al, "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy (2006) Vol.8, No. 4, 315-317, Sensebe et al,."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a, review", Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:66), Vonk et al., Stem Cell Research & Therapy (2015) 6:94, или Kundrotas Acta Medica Lituanica. 2012. Vol. 19. No. 2. P. 75-79. Как описано в международной патентной заявке WO 2018/067071, эта популяция мезенхимальных стволовых клеток может, например, использоваться в своем недифференцированном состоянии для задач заживления ран, таких как лечение ожогов.

Тем не менее, стволовые клетки, такие как описанные выше мезенхимальные стволовые клетки, как правило не применяют/не вводят пациентам в том месте, где их получают.Часто достаточное количество пересевов клеток осуществляется между сбором клеток и их последующим использованием. Таким образом, существует необходимость в том, чтобы предложить композиции для хранения или транспортировки, которые сохраняли бы клетки жизнеспособными и здоровыми в течение периода времени, обычно используемого для транспортировки или хранения клеток.

Соответственно, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить композицию, подходящую для хранения и/или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, которая удовлетворяла бы указанной потребности.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Эта задача выполняется при помощи способов, композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток и однократной дозы, обладающей признаками, изложенными в независимых пунктах формулы изобретения.

В первом аспекте в изобретении предложен способ приготовления композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, которая содержит от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток, где способ включает

а) суспендирование мезенхимальных стволовых клеток в предварительно определенном объеме кристаллоид но го раствора, где кристаллоидный раствор содержит от приблизительно 0,5% или приблизительно 1% до приблизительно 5% (масс/об.) сывороточного альбумина с получением таким образом первой клеточной суспензии,

б) определение концентрации мезенхимальных стволовых клеток в первой клеточной суспензии и определение объема первой клеточной суспензии, необходимого для приготовления композиции, содержащей от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток,

в) смешивание определенного объема первой клеточной суспензии с объемом жидкого носителя, где указанный жидкий носитель содержит от приблизительно 0,5% или приблизительно 1% до приблизительно 5% (масс/об.) сывороточного альбумина, а также

1) тролокс;

2) Na⁺;

3) K+;

4) Са²⁺,

5) Mg²⁺;

6) Cl^-;

7) Н₂РО₄^-;

8) HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту);

9) лактобионат;

10) сахарозу;

11) маннит;

12) глюкозу;

13) декстран-40;

14) аденозин и

15) глутатион,

с получением таким образом композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, содержащей от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток.

Во втором аспекте в изобретении предложена композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, полученную определенным в настоящем документе способом.

В третьем аспекте в изобретении предложена композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, которую можно получить определенным в настоящем документе способом.

В четвертом аспекте в изобретении предложен способ транспортирования мезенхимальных стволовых клеток, включающий транспортирование указанных мезенхимальных стволовых клеток в определенной в настоящем документе композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток.

В пятом аспекте в изобретении предложен способ лечения субъекта, страдающего от заболевания, включающий местное введение мезенхимальных стволовых клеток, которые хранят или транспортируют в определенной в настоящем документе композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток.

В шестом аспекте в изобретении предложена однократная доза мезенхимальных стволовых клеток, которую готовят при помощи определенного в настоящем документе способа.

Краткое описание графических материалов

Изобретение будет лучше понятно со ссылкой на подробное описание, рассматриваемое в связи с не ограничивающими объем изобретения примерами и графическими материалами, в которых:

На фиг. 1 показан технический информационный лист от Lonza для модифицированной Дульбекко среды Игла, включающий номер по каталогу DM ЕМ, используемой для приготовления иллюстративного примера среды в соответствии с изобретением (РТТ-6) в экспериментальном разделе;

На фиг. 2 показан технический информационный лист от Lonza для среды Хэма F12;

На фиг. 3 показан технический информационный лист от Lonza для среды DMEM:F12 (1:1), включающий номер по каталогу среды DMEM:F12 (1:1), используемой для приготовления иллюстративного примера среды в соответствии с изобретением (РТТ-6) в экспериментальном разделе;

На фиг. 4 показан технический информационный лист от Life Technologies Corporation для среды М171, включающий номер по каталогу среды М171, используемой для приготовления иллюстративного примера среды в соответствии с изобретением (РТТ-6) в экспериментальном разделе;

На фиг. 5 показан список ингредиентов, включающий их коммерческого поставщика и номер по каталогу, используемых в экспериментальном разделе для приготовления среды РТТ-6. В случае использования среды РТТ-6 в процессе производства в соответствии с GMP (надлежащая производственная практика), она не содержит антибиотики для того, чтобы удовлетворять указаниям по производству от US FDA (Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) для биологических веществ.

На фиг. 6 показаны результаты экспериментов с проточной цитометрией, в которых мезенхимальных стволовые клетки, выделенные из пуповины, анализировали в отношении экспрессии маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105. Для этих экспериментов мезенхимальные стволовые клетки выделяли из ткани пуповины путем культивирования ткани пуповины в трех различных средах для культивирования с последующим пассированием мезенхимальных стволовых клеток в соответствующих средах. Три следующие культуральные среды использовали в этих экспериментах: а) 90% (об./об./ DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) дополненная 10% FBS (фетальной бычьей сывороткой) (об./об.), б) культуральная среда РТТ-4, описанная в заявке на патент США 2006/0078993 и соответствующей международной патентной заявке WO 2006/019357, которая состоит из 90% (об./об.) CMRL1066 и 10% (об./об.) FBS (см. абзац [0183] в WO 2006/019357), и в) культуральная среда по настоящему изобретению РТТ-6, состав которой описан в настоящем документе. В этом анализе путем проточной цитометрии два отличающихся образца популяции мезенхимальных стволовых клеток, выстилающих пуповину (CLMC), анализировали для каждой из трех используемых культуральных сред. Результаты представлены на фиг. 6а - фиг. 6с. Подробнее, на фиг. 6а показана процентная доля выделенных выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток которые экспрессируют маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105 после выделения из ткани пуповины и культивирования в DMEM/10% FBS, на фиг. 6b показана процентная доля выделенных выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток которые экспрессируют маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105 после выделения из ткани пуповины и культивирования в РТТ-4, и на фиг. 6 с показана процентная доля выделенных выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток которые экспрессируют маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105, после выделения из ткани пуповины и культивирования в РТТ-6.

На фиг. 7 показаны результаты экспериментов с проточной цитометрией, в которых мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из пуповины, анализировали в отношении экспрессии в них маркеров стволовых клеток (CD73, CD90 и CD 105, CD34, CD45 и HLA-DR (человеческий лейкоцитарный антиген - родственный антигену D), которые используют для определения пригодности мультипотентных человеческих мезенхимальных стволовых клеток для клеточной терапии, и сравнивали с экспрессией этих маркеров мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга. Для этого эксперимента мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины выделяли из ткани пуповины путем культивирования ткани пуповины в культуральной среде по настоящему изобретению РТТ-6, тогда как мезенхимальные стволовые клетки костного мозга выделяли из человеческого костного мозга с использованием стандартного протокола.

На фиг. 7а показана процентная доля выделенных выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток которые экспрессируют маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105 и не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR после выделения из ткани пуповины и культивирования в среде РТТ-6, тогда как на фиг. 7b показана процентная доля выделенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, которые экспрессируют CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR.

На фиг. 8 показана схема эксперимента для сравнения различных носителей. Первую популяцию описанных в настоящем документе мезенхимальных стволовых клеток выращивали во флаконах для клеточной культуры. Количество живых мезенхимальных стволовых клеток подсчитывали, и затем 2 миллионов клеток/флакон хранили в течение различных периодов времени в Плазмалит-А (Plasmalyte-A) или HypoThermosol™-FRS. После хранения клетки подсчитывали в образце, меньшем или равным 50 мкл, ежесуточно в течение суток 1-5 (общий объем извлекаемой жидкости составлял 250 мкл) и проверяли в отношении жизнеспособности путем окрашивания клеток трипановым синим. Кроме того, на 1, 3 и 5 сутки образец, меньший или равный 80 мкл, отбирали и анализировали. После хранения в течение 1, 3 и 5 суток 100000 МСК в каждый момент времени затем выращивали в среде РТТ-6 в течение 48 ч, и супернатанты отбирали для анализа цитокинов: PDGF-AA, PDGF-BB, VEGF, IL-10, Ang-1, HGF и TGFpl путем измерения при помощи системы FLEXMAP 3D.

На фиг. 9 обобщены данные о жизнеспособности. Как можно видеть на левом графике, 73% от общего количества клеток (приблизительно 95%) с момента начала хранения все еще сохраняли жизнеспособность в течение 7 суток после хранения в HypoThermosol™. Напротив, после 7 суток хранения в Плазмалит-А только 42% от общего количества клеток (приблизительно 94%) с момента начала хранения все еще сохраняли жизнеспособность. Все подсчеты основаны на регистрировании в двух параллелях, которые находятся друг от друга в пределах 10% (в соответствии с SOP (стандартные операционные процедуры) CR D2.600.1). Во время подсчета клетки, которые хранили в HypoThermosol™, были отчетливо меньше с ровными и очерченными краями. Напротив, клетки в Плазмалит-А находились в диапазоне размеров. HypoThermosol™ заметно поддерживает целостность мембраны и, предположительно, выживание в течение 6 суток. Аналогичные результаты также представлены на графике с правой стороны.

На фиг. 10 показаны результаты, полученные при измерении диаметра клеток. Описанная в настоящем документе популяция мезенхимальных стволовых клеток при хранении в HypoThermosol™ обладала меньшим диапазоном диаметров по сравнению с клетками, которые хранили в Плазмалит-А. Сравнение сделано после 3 суток хранения.

На фиг. 11 показана концентрация TGF61 в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А после 48 часов хранения. Как можно видеть на графике с правой стороны, клетки секретируют приблизительно столько же TGFB1 при хранении в HypoThermosol™, как при хранении в Плазмалит-А. В целом, с течением времени, количество секретируемого TGF61 уменьшалось (график с правой стороны).

На фиг. 12 и 13 показаны контрольные эксперименты. В настоящем документе концентрации PDGF-BB и IL-10 измеряли в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А в течение 48 ч. Поскольку PDGF-BB или IL-10 в норме не секретируются описанной в настоящем документе популяцией мезенхимальных стволовых клеток, то ни PDGF-BB, ни IL-10 не обнаруживались ни в одном из образцов.

На фиг. 14 показана концентрация VEGF в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А в течение 48 ч. Как можно видеть на графике с правой стороны, клетки секретируют приблизительно столько же VEGF при хранении в HypoThermosol™, как и при хранении в Плазмалит-А на 0 сутки. На 1 и 5 сутки клетки секретировали больше VEGF при хранении в Плазмалит-А. Примечательно, что, когда клетки хранили в течение 3 суток, тогда они секретировали больше VEGF при хранении в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А. Таким образом, HypoThermosol™ превзошел Плазмалит-А на 3 сутки хранения. Чем больше VEGF обнаруживается, тем здоровее культура. Таким образом, вследствие большей секреции VEGF после 3 суток хранения в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А, клетки были более здоровыми в HypoThermosol™, чем в Плазмалит-А. С 5 суток хранение в Плазмалит, по-видимому, становится более благоприятным, поскольку в этот момент хранения клеток в Плазмалит-А, они секретировали больше VEGF. В целом, с течением времени количество секретируемого VEGF уменьшалось (график с правой стороны).

На фиг. 15 показана концентрация PDGF-AA в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А в течение 48 ч. Как можно видеть на графике с правой стороны, клетки секретируют приблизительно столько же PDGF-AA при хранении в HypoThermosol™, как при хранении в Плазмалит-А на 0 сутки. На 1 и 5 сутки клетки секретировали больше PDGF-AA при хранении в Плазмалит-А. Примечательно, что, когда клетки хранили в течение 3 суток, тогда они секретировали больше PDGF-AA при хранении в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А. Таким образом, клетки, которые хранили в HypoThermosol™, здоровее, чем клетки, которые хранили в Плазмалит-А после 3 суток хранения. Начиная с 5 суток хранения Плазмалит, по-видимому, представляет собой более благоприятный носитель, поскольку с этого момента времени клетки, которые хранили в Плазмалит-А, секретировали больше PDGF-AA. В целом, с течением времени количество секретируемого PDGF-AA уменьшалось (график с правой стороны).

На фиг. 16 показана концентрация Ang-1 в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А в течение 48 ч. Как можно видеть на графике с правой стороны, клетки секретируют приблизительно столько же Ang-1 при хранении в HypoThermosol™, как при хранении в Плазмалит-А на 0 и 3 сутки. На 5 сутки клетки секретировали больше Ang-1 при хранении в Плазмалит-А. Примечательно, что, когда клетки хранили в течение 1 суток, тогда они секретировали гораздо больше Ang-1 при хранении в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А. Таким образом, клетки, которые хранили в HypoThermosol™, выглядели более здоровыми, чем при хранении в Плазмалит-А в течение по меньшей мере от 48 часов до 3 суток хранения. С 5 суток Плазмалит, по-видимому, представляет собой более благоприятный носитель, поскольку с этого момента времени клетки, которые хранили в Плазмалит-А, секретировали больше Ang-1. В целом, с течением времени, количество секретируемого Ang-1 уменьшалось (график с правой стороны).

На фиг. 17 показана концентрация HGF в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которые хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А после 48 часов хранения. Как можно видеть на графике с правой стороны, клетки секретируют приблизительно столько же HGF при хранении в HypoThermosol™, как при хранении в Плазмалит-А на 0 сутки. На 3 и 5 сутки клетки секретировали больше HGF при хранении в Плазмалит-А. Примечательно, что, когда клетки хранили в течение 1 суток, тогда они секретировали гораздо больше HGF при хранении в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А. Таким образом, клетки, которые хранили в HypoThermosol™, по-видимому, были более здоровыми, чем клетки, которые хранили в Плазмалит-А, с по меньшей мере 1 суток (48 часов) до 3 суток хранения. Начиная с 3 суток Плазмалит-А, по-видимому, представляет собой более благоприятный носитель, поскольку в моменты времени 3 и 5 суток, клетки, которые хранили в Плазмалит-А, секретировали больше HGF. В целом, с течением времени количество секретируемого HGF уменьшалось (график с правой стороны).

Фиг. 18 представляет собой фотографии, полученные в преклиническом исследовании популяции мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению у свиней. У свиней вызывали диабет с помощью стрептозотоцина в дозе 120 мг/кг, и им давали возможность восстановиться в течение 45 дней, после чего на их спины наносили шесть ран полной толщины 5 см × 5 см. Свиней (n=2) обрабатывали дважды в неделю 10⁵ клеток описанной в настоящем документе человеческой популяции мезенхимальных стволовых клеток на см² в течение 4 недель. Двух контрольных свиней обрабатывали PBS. Раны фотографировали на 0 сутки после операции (PODay 0) и каждые семь суток вплоть до 35 суток после операции. Раны анализировали в отношении размера площади поверхности при помощи Image J. К 35 суткам добавление описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых приводило в результате к затягиванию 10 из 12 диабетических ран (83%) по сравнению с только 3 из 12 (25%) контрольных ран, обработанных PBS. Скорость заживления ран составляла 0,8 см²/сутки для описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток по сравнению с 0,6 см²/сутки у контрольных животных, где улучшение составило 33%.

Фиг. 19 техническое описание Тролокс, доступного от Tocris.

На фиг. 20 показано техническое описание NaCl, доступного от Sigma Aldrich.

На фиг. 21 показано техническое описание КН2РО4, доступного от Sigma Aldrich.

На фиг. 22 показано техническое описание HEPES от Sigma Aldrich.

На фиг. 23 показано описание продукта лактобионата натрия от COMBI-BLOCKS.

На фиг. 24 показано описание продукта сахарозы от Sigma Aldrich.

На фиг. 25 показано описание продукта маннита от avantor.

На фиг. 26 показано описание продукта глюкозы от Sigma Aldrich.

На фиг. 27 показано описание продукта декстрана-40 от Sigma Aldrich.

На фиг. 28 показано описание продукта аденозина от Sigma Aldrich.

На фиг. 29 показано описание продукта глутатиона от Sigma Aldrich.

На фиг. 30 показано описание продукта HypoThermosol™-FRS (HTS-FRS) от STEMCELL Technologies.

На фиг. 31 показано описание продукта СаС1 от Sigma Aldrich.

На фиг. 32 показано описание продукта MgCl от Sigma Aldrich.

На фиг. 33 показаны результаты тестирования стабильности, проведенного на выстилающей пуповину популяции мезенхимальных стволовых клеток, как описано в настоящем документе, высеянной в композиции по настоящему изобретению (Плазмалит/HSA/HypoThermosol) в течение вплоть до 3 суток. На фиг. 33а показаны результаты тестирования жизнеспособности МСК после хранения в композиции по настоящему изобретению. МСК хранили при 2-8°С в течение 1-3 суток для имитации транспортировки и хранения продукта перед нанесением на раны. Результаты демонстрируют то, что клетки не проявляли значительную потерю жизнеспособности вплоть до 3 суток в этих условиях. На фиг. 33b показана морфология МСК после хранения в композиции по настоящему изобретению при 2-8°С. МСК фотографировали после извлечения из Aseptic Technologies (АТ)-закрытых флаконов и культивирования в течение 24 часов при 37°С. Как можно видеть, клетки, полученные до 2 суток хранения при охлаждении, были способны адгезировать на планшетах для культуры ткани и образовывать типичные веретенообразные структуры. После хранения в течение 2,5 суток при 2-8°С клетки демонстрировали увеличение сфероидных форм, свидетельствующее о гибели клеток. На фиг. 33 с показаны пролиферация и метаболизм МСК после хранения в композиции по настоящему изобретению. МСК из одних и тех же культур, проанализированные на фиг. 33а, исследовали в отношении продукции лактата в качестве показателя метаболизма и роста в течение 48-часового периода в культуре при 37°С. Лактат представляет собой продукт метаболизма глюкозы, который валидировали как непосредственно пропорциональный скорости роста клеток МСК. Клетки, которые хранили в течение 24 часов при 2-8°С, были эквивалентны по метаболизму и росту клеткам, которые хранили в течение 0 часов, а клетки, которые хранили в течение 36 часов, проявляли 86% от контроля продукции лактата. После 72 часов при 2-8°С клетки проявляли только 46% от метаболизма при последующем культивировании. На фиг. 33d показана продукцию лактата у МСК, которые хранили в течение 0, 1, 1,5, 2, 2,5 или 3 суток в композиции по настоящему изобретению, и затем измеряли через 24 часа и 48 часов в культуре. Можно видеть, что продукция лактата через 24 часа и 48 часов у МСК, которые хранили в композиции по настоящему изобретению в течение 24 часов (1 сутки) была идентичной с МСК, которые не хранили (0 сутки). К 3 суткам продукция лактата падала на 40-45%. На фиг. 33е показана продукция цитокинов, измеренная в одних и тех же культурах, проанализированных на фиг. 33 с, через 24 часа при 37°С. В соответствии с данными по метаболизму способность МСК продуцировать ангиопоэтин 1 (Ang-1), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста гепатоцитов (HGF) была в пределах 10-20% относительно контролей (0 сутки) при хранении клеток в композиции по настоящему изобретению при 2-8°С в течение 24 часов. На фиг. 33f показана продукция цитокинов, измеренная в еще одной культуре после 24 ч. Результаты демонстрируют то, что способность МСК продуцировать VEGF, ангиопоэтин-1, TGF-β и HGF сохранялась тогда, когда клетки хранили в композиции по настоящему изобретению при 2-8°С в течение 24 часов, но уменьшалась приблизительно на 50% при хранении в течение более 2 суток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как объяснялось выше, в первом аспекте изобретение относится к способу приготовления композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, содержащей от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток, где способ включает

а) суспендирование мезенхимальных стволовых клеток в предварительно определенном объеме кристаллоид но го раствора, где кристаллоидный раствор содержит от приблизительно 0,5 до приблизительно 5% (масс./об.) сывороточного альбуминас получением таким образом первой клеточной суспензии,

б) определение концентрация мезенхимальных стволовых клеток в первой клеточной суспензии и определение объема первой клеточной суспензии, необходимого для приготовления композиции, содержащей от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток,

в) смешивание определенного объема первой клеточной суспензии с объемом жидкого носителя, где указанный жидкий носитель содержит от приблизительно 0,5 до приблизительно 5% (масс./об.) сывороточного альбумина, а также

1) тролокс;

2) Na⁺;

3) K+;

4) Са²⁺,

5) Mg²⁺;

6) Cl^-;

7) Н₂РО₄^-;

8) HEPES;

9) лактобионат;

10) сахарозу;

11) маннит;

12) глюкозу;

13) декстран-40;

14) аденозин и

15) глутатион,

с получением таким образом композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, содержащей от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток.

Неожиданно в настоящей заявке на изобретение обнаружили, что использование композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, описанного в настоящем документе, стабилизирует пролиферацию и метаболизм МСК во время хранения/транспортировки, что приводит к повышенной жизнеспособности МСК в течение до 72 ч. Например, после 3 суток хранения мезенхимальных стволовых клеток в композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению приблизительно 90% клеток все еще сохраняли жизнеспособность (см. фиг. 33а). Напротив, после 3 суток хранения в Плазмалит^® только приблизительно 66% клеток все еще сохраняли жизнеспособность (см. примеры измерений при помощи гемоцитометра и фиг. 9). Таким образом, использование композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, описанной в настоящем документе, обеспечивает транспортировку/хранение стволовых клеток в течение определенного периода времени без значительной потери жизнеспособности клеток. В частности, хранение в композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению в течение более короткого периода времени, составляющего 3 суток или меньше, по-видимому оказывается особенно благоприятным, поскольку стволовые клетки в общем секретируют больше факторов, чем после хранения в Плазмалит-А, как описано подробно в экспериментальном разделе. Кроме того, неожиданно обнаружили, что использовани композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, описанной в настоящем документе, обеспечивает восстановление более чем 95% МСК из сосуда для хранения/транспортировки, тем самым гарантируя, что требуемая доза клеток может быть введена пациенту.

При использовании в настоящем документе термина "транспортировка" или "транспортирование" понимают любую транспортировку. Такая транспортировка может быть осуществлена в любом транспорте, таком как автомобиль, поезд и самолет, или при помощи лица, несущего/транспортирующего контейнер, содержащий стволовые клетки, контактирующие с жидким носителем, с одного места в другое место. В одном из воплощений транспортирование осуществляют от интересуемого места продуцирования мезенхимальных стволовых клеток (или популяции мезенхимальных стволовых клеток, поскольку оба термина используются в настоящем документе взаимозаменяемо) в место введения стволовых клеток (например, от производства в соответствии с GMP, на котором получают стволовые клетки, соответственно интересующую популяцию стволовых клеток, к месту введения стволовых клеток или популяции стволовых клеток, например, в клинику или кабинет врача). Тем не менее, также предполагается, что термин "транспортирование" относится к хранению клеток в одном и том же месте в течение определенного периода времени. Например, стволовые клетки можно хранить после отбора до их применения в отношении субъекта в одном месте. Контейнер, в котором стволовые клеток можно хранить или транспортировать, может представлять собой любой контейнер, подходящий для способа по настоящему изобретению.

Приготовление композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток включает ресуспендирование МСК в предварительно определенном объеме кристаллоид но го раствора. В настоящем изобретении любой объем кристаллоидного раствора, подходящий для достаточного ресуспендирования МСК, может быть использован в качестве предварительно определенного объема. Например, предварительно определенный объем может находиться в диапазоне от приблизительно 0,5 мл до приблизительно 15 мл. В одном из примеров предварительно определенный объем может находиться в диапазоне от приблизительно 1 мл до приблизительно 10 мл. В иллюстративном примере предварительно определенный объем кристаллоидного раствора может составлять приблизительно 1 мл, приблизительно 2 мл, приблизительно 3 мл, приблизительно 4 мл или приблизительно 5 мл. Путем ресуспендирования МСК в предварительно определенном объеме кристаллоидного раствора получают первую клеточную суспензию. Ресуспендирование обычно осуществляют после отбора мезенхимальных стволовых клеток/популяции мезенхимальных стволовых клеток после культивирования для фармацевтического введения.

После определения концентрации МСК в первой клеточной суспензии и определения объема первой клеточной суспензии, необходимой для приготовления композиции, содержащей от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток, первую клеточную суспензию смешивают с объемом жидкого носителя. Объем первой клеточной суспензии, смешиваемой с жидким носителем, может составлять от приблизительно 0,5 мл до приблизительно 10 мл. В иллюстративном примере определенного объема первой клеточной суспензии с объемом жидкого носителя общий объем композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток составляет приблизительно 1 мл. Количество от 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток выбрано для приготовления стандартной дозы, которая содержит от 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток, предпочтительно в предварительно определенном объеме, таком как 1 мл, 2 мл и т.п. В настоящем изобретении предварительно определенный объем кристаллоидного раствора содержит от приблизительно 0,1 до приблизительно 15 миллионов жизнеспособных МСК. В одном из примеров предварительно определенный объем кристаллоидного раствора содержит от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов МСК. В иллюстративном примере композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток содержит приблизительно 1 миллион МСК, приблизительно 2 миллиона МСК, приблизительно 3 миллиона МСК, приблизительно 4 миллиона МСК, приблизительно 5 миллионов МСК или приблизительно 6 миллионов МСК. Используемый в настоящем документе термин "приблизительно" в отношении количества мезенхимальных стволовых клеток может означать, что числовое значение может варьировать на определенную процентную долю. Например, "приблизительно" может означать числовую вариацию/отклонение от ±1% до приблизительно ±15%. Таким образом, "приблизительно" может также означать ±1%, ±2%, ±3%, ±4%, ±5%, ±6%, ±7%, ±8%, ±9% или ±10%. Для специалиста в данной области техники очевидно, что такие вариации происходят в том случае, если, в частности, композицию для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток готовят вручную (который представляет собой обычный подход для приготовления таких композиций, основанных на живых клетках) для последующего хранения и/или транспортировки композиции в место введения, такое как клиника для лечения ран или кабинет врача.

В настоящем изобретении МСК можно собирать непосредственно из культуры ткани, содержащей МСК, или из культуры выделенных МСК или популяции МСК перед ресуспендированием в кристаллоид ном растворе. В любом случае, культивирование МСК может быть осуществлено в сосуде для культивирования клеток. Следовательно, МСК, использованные в настоящем изобретении, можно собирать из сосуда для культивирования клеток перед ресуспендированием МСК в предварительно определенном объеме кристаллоидного раствора.

Как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель по настоящему изобретению дополнены сывороточным альбумином. Не желая быть связанными теорией, полагают, что сывороточный альбумин улучшает жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток/популяции мезенхимальных стволовых клеток и может также улучшать восстановление стволовых клеток из сосуда, в котором их хранят для транспортировки стволовых клеток до места введения. Концентрация сывороточного альбумина может быть одинаковой или отличаться в кристаллоидном растворе и в жидком носителе. Предпочтительно, концентрации сывороточного альбумина являются одинаковыми, как в кристаллоидном растворе, так и в жидком носителе. В этом контексте может быть использована любая концентрация сывороточного альбумина, которая подходит, например, для улучшения жизнеспособности МСК. Например, как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель могут содержать от приблизительно 0,5% (масс./об.), от приблизительно 0,6% (масс./об.), от приблизительно 0,7% (масс./об.), от приблизительно 0,8 (масс./об.), от приблизительно 0,9% (масс/об.) или от приблизительно 1,0% (масс./об.) до приблизительно 5% (масс./об.) сывороточного альбумина. В одном из таких примеров кристаллоидный раствор и жидкий носитель могут содержать от приблизительно 1% (масс/об.) до приблизительно 3% (масс./об.) сывороточного альбумина. В иллюстративном примере как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель содержат приблизительно 1% (масс/об.) сывороточного альбумина. В настоящем документе может быть использован любой фармацевтически приемлемый сывороточный альбумин, например, бычий или человеческий сывороточный альбумин. В иллюстративном примере как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель могут содержать человеческий сывороточный альбумин (HSA). Используемый в настоящем документе сывороточный альбумин в идеале получают в фармацевтически приемлемом качестве. Пример такого сывороточного альбумина фармцевтической чистоты представляет собой 25% раствор (масс./об.) человеческого сывороточного альбумина, имеющегося в продаже под товарным знаком Plasbumin^® от Grifols Therapeutics LLC, Clayton, North Carolina, USA.

Кристаллоидный раствор может также содержать один или более чем один компонент, подходящий для поддержания роста и/или пролиферации МСК. Такой компонент может представлять собой неорганическое вещество, такое как натрий, калий, железо, магний, цинк, селен, хлорид или их комбинацию. В одном из примеров кристаллоидный раствор содержит натрий, калий, магний и хлорид. Кристаллоидный раствор может представлять собой имеющийся в продаже раствор, включающий дополнительный компонент, подходящий для поддержания роста и/или пролиферации МСК. В одном из примеров кристаллоидный раствор может представлять собой Плазмалит или лактат рингера. В композиции по настоящему изобретению общее количество кристаллоидного раствора может быть ограничено конкретной процентной долей. Например, композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток может содержать не более чем приблизительно 50%, не более чем приблизительно 40%, не более чем приблизительно 30%, не более чем приблизительно 20%, не более чем приблизительно 10% или не более чем приблизительно 5% кристаллоидного раствора. В иллюстративном примере композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток может содержать не более чем приблизительно 30% или приблизительно 20%, или приблизительно 10% Плазмалит.

Транспортирование/хранение могут быть осуществлены в течение любого периода времени. Например, транспортирование/хранение могут быть осуществлены в течение приблизительно 7 суток или меньше. Также предусматривается, что транспортирование/хранение могут быть осуществлены в течение приблизительно 6, 5, 4, 3, 2, 1 суток или меньше. Таким образом, транспортирование/хранение осуществляют в течение приблизительно 48 часов или приблизительно 24 часов или меньше.

Также предполагается, что транспортирование/хранение осуществляют при любой температуре, подходящей для способа по настоящему изобретению. Например, транспортирование/хранение могут быть осуществлены при температуре от приблизительно -5°С до приблизительно 15°С. Таким образом, также предусматривается, что транспортирование/хранение могут быть осуществлены при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 8°С. Транспортирование также может быть осуществлено при температуре более чем приблизительно -5°С, более чем приблизительно -10°С, более чем приблизительно -15°С или более чем приблизительно -20°С.Дополнительно, предполагают, что транспортирование/хранение могут быть осуществлены при температуре меньше 20°С, меньше 18°С, меньше 15°С, меньше 12°С или меньше 10°С.

Способ по настоящему изобретению также предполагает, что популяцию стволовых клеток (или мезенхимальных стволовых клеток) хранят или транспортируют в любой подходящей концентрации. Как указано выше, термины "мезенхимальные стволовые клетки" и "популяция мезенхимальных стволовых клеток" могут быть использованы в настоящем документе взаимозаменяемо. Также возможно, что если в настоящем документе ссылаются на "мезенхимальные стволовые клетки", то эти стволовые клетки относятся к той же самой популяции мезенхимальных стволовых клеток. Например, все мезенхимальные стволовые клетки могут принадлежать к популяции мезенхимальных стволовых клеток, в которой приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более или приблизительно 99% или более ее клеток экспрессируют CD73, CD90 и CD105, но не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR. В настоящем документе отмечено, что если термин "носитель" или "жидкий носитель" может быть использован в контексте раствора, содержащего МСК, Плазмалит, HSA и Hyothermosol, то также может подразумеваться композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению. Таким образом, термины "носитель" или "жидкий носитель" и "композиция для хранения или транспортировки стволовых клеток" также могут быть использованы взаимозаменяемо, если раствор содержит МСК, Плазмалит, HSA и Hyothermosol. Используемые в настоящем документе популяции стволовых клеток могут, например, транспортироваться/храниться в концентрации приблизительно 70 миллионов клеток на 1 мл носителя, приблизительно 60 миллионов клеток миллионов клеток на 1 мл носителя, приблизительно 50 миллионов клеток на 1 мл носителя, приблизительно 40 миллионов клеток на 1 мл носителя, приблизительно 30 миллионов клеток на 1 мл носителя, приблизительно 20 миллионов клеток на 1 мл носителя, приблизительно 10 миллионов клеток на 1 мл носителя, приблизительно 5 миллионов клеток на 1 мл носителя, приблизительно 4 миллиона клеток на 1 мл носителя, приблизительно 3 миллиона клеток на 1 мл носителя, приблизительно 2 миллиона клеток на 1 мл носителя, приблизительно 1 миллион клеток на 1 мл носителя, приблизительно 0,5 миллионов клеток на 1 мл носителя, приблизительно 0,1 миллиона клеток на 1 мл носителя или менее чем 0,1 миллиона клеток на 1 мл носителя. Таким образом, популяция стволовых клеток может быть транспортирована/храниться в концентрации от приблизительно 10 миллионов клеток на мл носителя до приблизительно 1 миллион клеток на 1 мл носителя.

Способ по настоящему изобретению касается транспортирования/хранения стволовых клеток. В принципе, любая стволовая клетка может быть использована в способе по настоящему изобретению. Одна из характерных особенностей стволовых клеток заключается в их способности к самообновлению. "Самообновление" представляет собой способность проходить многочисленные клеточные циклы деления при поддержании недифференцированного состояния. Способы тестирования способности клеток к самообновлению известны специалистам в данной области техники. Например, самообновление может быть тестировано путем пассирования клеток в течение более чем 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более пассажей. Пассирование включает разделение клеток перед их повторным нанесением в виде суспензии единичных клеток. Дополнительная особенность стволовых клеток заключается в их мультипотентности или плюрипотентности, как также описано в настоящем документе. В принципе, мультипотентность или плюрипотентность могут быть тестированы путем дифференцирования указанных стволовых клеток в различные линии.

В частности, популяция стволовых клеток, используемая в способе по настоящему изобретению, может представлять собой популяцию эмбриональных стволовых клеток, популяцию взрослых стволовых клеток, популяцию мезенхимальных стволовых клеток или популяцию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Используемая в настоящем документе "популяция эмбриональных стволовых клеток" представляет собой "популяцию плюрипотентных стволовых клеток". Упомянутая в настоящем документе плюрипотентная клетка относится к типу клеток, обладающему способностью к самообновлению и возможности дифференцироваться в различные типы клеток. Плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться почти во все клетки, т.е. в клетки, происходящие из любого из трех первичных зародышевых слоев: эктодерму, эндодерму и мезодерму. Термин «плюрипотентная стволовая клетка» также охватывает стволовые клетки, происходящие из внутренней клеточной массы ранней эмбриональной стадии, известной как бластоцист.Отмечается, что недавние успехи в исследовании эмбриональных стволовых клеток привели к возможности создания новых линий эмбриональных стволовых клеток без разрушения эмбрионов, например, с использованием способа, основанного на биопсии бластомера, который не нарушает возможность эмбриона развиваться (Klimanskaya (2006) "Embryonic stem cells from blastomeres maintaining embryo viability." Semin Reprod Med. 2013 Jan;31(l):49-55). Кроме того, в области техники имеется большое количество установленных линий эмбриональных стволовых клеток. Таким образом, имеется возможность работы с эмбриональными стволовыми клетками без необходимости разрушения эмбриона. Плюрипотентные стволовые клетки могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки, которые не получены путем разрушения человеческого эмбриона. Таким образом, плюрипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки, полученные у эмбриона без разрушения последнего.

Используемый в настоящем документе термин "популяция взрослых стволовых клеток" представляет собой популяцию мультипотентных стволовых клеток. Популяция мультипотентных стволовых клеток может быть источником ограниченного количества типов клеток, таким образом их соматическая судьба ограничена. Например, нервная стволовая клетка может привести к нервным и глиальным клеткам. Взрослые стволовые клетки обладают способностью к самообновлению и могут быть получены из любого подходящего источника. Например, взрослая стволовая клетка может быть получена из костного мозга, периферической крови, головного мозга, спинного мозга, пульпы зуба, кровеносных сосудов, скелетной мышцы, эпителия кожи и пищеварительной системы, роговицы, сетчатки глаза, печени или поджелудочной железы.

Популяция стволовых клеток, использованная в способе по настоящему изобретению, также может представлять собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток. В этом контексте отмечается, что описанная в настоящем документе культуральная среда (например, РТТ-6) обеспечивает выделение популяции мезенхимальных стволовых клеток (также названной в настоящем документе как "мезенхимальные стволовые клетки") из амниотической мембраны в условиях, которые обеспечивают возможность для клеточной пролиферации мезенхимальных стволовых клеток/клеток-предшественников без дифференцирования мезенхимальных стволовых клеток/клеток-предшественников. Таким образом, после выделения мезенхимальных стволовых клеток из описанной в настоящем документе амниотической мембраны выделенная популяция мезенхимальных стволовых клеток/клеток-предшественников обладает способностью дифференцироваться во множество типов клеток, как описано, например, в заявке на патент США 2006/0078993, патенте США 9085755, международной патентной заявке WO 2006/019357, патенте США 8287854 или WO 2007/046775. Как описано, например, в заявке на патент США 2006/0078993, мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины обладают веретенообразной формой, экспрессируют следующие гены: POU5fl, Bmi-1, фактор ингибирования лейкоза (LIF), и секретируют активин А и фоллистатин. Мезенхимальные стволовые клетки, выделенные в настоящем изобретении, могут, например, дифференцироваться в любой тип мезенхимальных клеток, таких как без ограничения адипоциты, фибробласты кожи, хондроциты, остеобласты, теноциты, фибробласты лигамента, кардиомиоциты, гладкомышечные клетки, клетки скелетной мускулатуры, продуцирующие муцин клетки, полученные из желез внутренней секреции клетки, такие как инсулинпродуцирующие клетки (например, р-клетки островка Лангерганса), или нейроэктодермальные клетки. Стволовые клетки, выделенные в соответствии с описанным в настоящем документе способом, могут быть дифференцированы in vitro для последующего применения для дифференцирования клеток для медицинских задач. Иллюстративный пример такого подхода представляет собой дифференцирование мезенхимальных стволовых клеток в инсулинпродуцирующие р-клетки островка Лангерганса, которые затем могут быть введены, например, путем имплантации, пациенту, который страдает от недостатка инсулина, такого как сахарный диабет (в этой связи см. также WO 2007/046775). Альтернативно, описанные в настоящем документе мезенхимальные стволовые клетки могут быть использованы в своем недифференцированном состоянии для клеточной терапии, например, с целью заживления ран, такой как лечение ран или хронических диабетических ран. В этих терапевтических применениях мезенхимальные стволовые клетки в соответствии с изобретением могут либо способствовать заживлению ран путем взаимодействия с окружающей пораженной заболеванием тканью, либо также могут дифференцироваться в соответствующую клетку кожи (см. также, например, WO 2007/046775).

В этом контексте отмечается, что МСК могут быть получены из любой ткани млекопитающего или компартмента/части организма, который, как известно, содержит МСК. В иллюстративных примерах МСК могут представлять собой МСК пуповины, плацентарные МСК, МСК пуповинно-плацентарного сочленения, МСК пуповинной крови, МСК костного мозга или происходящие из жировой ткани МСК. МСК пуповины могут быть (получены) из любого компартмента ткани пуповины, который содержит МСК, такого как амнион, периваскулярными МСК, МСК вартонова студня, МСК амниотической мембраны пуповины, а также смешанными МСК пуповины, что означает МСК, которые включают стволовые клетки из двух или более чем двух из этих компартментов. Описанная в настоящем документе популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть выделена и культивирована (т.е. получена) из любой ткани пуповины, а также ткани пуповины, которая содержит амниотическую мембрану (которая также названа в настоящем документе, как "выстилающая пуповину"). Соответственно, популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть выделена из (кусочков) целой пуповины, как описано в экспериментальном разделе настоящей заявки на изобретение. Таким образом, эта ткань пуповины может содержать дополнительно к амниотической мембране любую другую ткань/компартмент пуповины. Как представлено, например, на фиг. 16 Заявки на патент США 2006/0078993 или международной патентной заявке WO 2006/019357, амниотическая мембрана пуповины представляет собой находящуюся ближе всего к наружной поверхности часть, покрывающую пуповину. Дополнительно, пуповина содержит одну вену (которая несет оксигенированную богатую питательными веществами кровь плоду) и две артерии (которые несут деоксигенированную обедненную питательными веществами кровь от плода). Для защиты и механической поддержки эти три кровеносных сосуда погружены в вартонов студень, представляющий собой желатинообразное вещество в основном из мукополисахаридов. Соответственно, использованная в настоящем документе ткань пуповины также может содержать эту одну вену, две артерии и вартонов студень. Применение такого целого (интактного) среза пуповины обладает преимуществом, заключающемся в том, что амниотическая мембрана не нуждается в отделении от других компонентов пуповины. Это позволяет снизить число стадий выделения, и, таким образом, описанный в настоящем документе способ становится проще, быстрее, менее склонным к ошибкам и более экономичным - все из этого представляет собой важные аспекты производства в соответствии с GMP, необходимые для терапевтического применения мезенхимальных стволовых клеток. Таким образом, выделение мезенхимальных стволовых клеток может начаться с тканевого экспланта, за которым может последовать субкультивирование (культивирование) выделенных мезенхимальных стволовых клеток, если желательно большее количество мезенхимальных стволовых клеток, например, для применения в клинических исследованиях. Альтернативно, также возможно сначала отделить амниотическую мембрану от других компонентов пуповины и выделить выстилающие пуповину мезенхимальные стволовые клетки из амниотической мембраны путем культивирования амниотической мембраны в культуральной среде, например, в РТТ-6. Это культивирование также может быть осуществлено путем получения тканевого экспланта возможно с последующим пассированием выделенных мезенхимальных стволовых клеток. В этом контексте термин "тканевый эксплант" или "способ получения тканевого экспланта" используется в своем обычном для уровня техники значении, обозначающем способ, при котором ткань после отбора или кусочек ткани помещают в чашку для культуры клеток, содержащую среду для культивирования (роста), и из которой с течением времени стволовые клеток мигрируют из ткани на поверхность чашки. Эти первичные стволовые клетки затем могут быть дополнительно выращены и перенесены на свежие чашки путем микроразмножения (субкультивирования), как также в настоящем документе описано. В этом контексте отмечается, что с точки зрения получения клеток для терапевтических задач на первой стадии выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины формируют главный банк выделенных мезенхимальных стволовых клеток, тогда как при последующем субкультивировании может быть получен рабочий банк клеток. Таким образом, в конкретных воплощениях популяция стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток. Популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть выделена из амниотической мембраны пуповины при помощи способа, включающего культивирование ткани пуповины в культуральной среде, содержащей DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла), F12 (среда Хэма F12), М171 (среда 171) и FBS (фетальная бычья сыворотка). Использование такой среды позволяет выделить популяцию мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, в которой более чем 90%, или даже 99% или более клеток являются положительными в отношении трех маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD73, CD90 и CD105, в то же самое время, эти стволовые клеток не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR (см. экспериментальный раздел), что означает то, что 99% или даже более чем 99% клеток этой популяции экспрессируют маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105, в то же самое время, не экспрессируя маркеры CD34, CD45 и HLA-DR. О такой чрезвычайно гомогенной и хорошо определенной популяции клеток впервые сообщалось в находящейся в одновременном рассмотрении заявке на патент США №15/725913, поданной 5 октября 2018 года (опубликованной как US 2018/127721), в которой заявлен приоритет перед предварительной заявкой на патент США №62/404582, поданной 5 октября 2017 года, содержание которой включено в настоящем документе путем ссылки), и также в находящейся в одновременном рассмотрении заявки РСТ PCT/SG2017/050500 (опубликованной как WO 2018/067071), также поданной 5 октября 2018 года, заявляющей приоритет перед предварительной заявкой на патент США №62/404582, поданной 5 октября 2017 года, и она представляет собой идеальный кандидат для клинических исследований и клеточной терапии, поскольку эта популяция стволовых клеток, например, полностью удовлетворяет критериям, общепринятым для человеческих мезенхимальных стволовых клеток, используемых для клеточной терапии, как определено, например, в Dominici et al, "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy (2006) Vol.8, No. 4, 315-317, Sensebe et al,."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a, review", Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:66), Vonket al., Stem Cell Research & Therapy (2015) 6:94, или Kundrotas Acta Medica Lituanica. 2012. Vol.19. No. 2. P. 75-79. Также с использованием биореактора, такого как Quantum Cell Expansion System, возможно получать большие количества мезенхимальных стволовых клеток, такие как 300-700 миллионов мезенхимальных стволовых клеток за один цикл (см. также экспериментальный раздел). Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает транспортирование/хранение стволовых клеток в количестве, которое необходимо для терапевтического применения, такого как их применение в заживлении ран, экономически эффективным образом. Дополнительно, все компоненты, используемые для приготовления культуральной среды по настоящему изобретению имеются в продаже качества GMP. Соответственно, настоящее изобретение открывает путь к транспортированию/хранению полученной в соответствии с GMP и высокогомогенной популяции мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины.

Таким образом, в некоторых воплощениях популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию выделенных мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины. Дополнительно предполагается, что по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD 105. Например, по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105. Дополнительно или альтернативно, по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток не экспрессируют следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA-DR (человеческий лейкоцитарный антиген родственный антигену D). В дополнительных примерах по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток МСК экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105, тогда как по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более МСК могут не экспрессировать CD34, CD45 и HLA-DR. В конкретных примерах приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более или приблизительно 99% или более МСК экспрессируют CD73, CD90 и CD 105, но не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR.

Маркер CD73 известен специалисту в данной области техники. В этой связи, CD73 относится к кластеру дифференцирования 73, также известному как 5'-нуклеотидаза (5'-NT) или экто-5'-нуклеотидаза. Последовательность человеческого белка CD73 может представлять собой SEQ ID NO. 1. Маркер CD90 известен специалисту в данной области техники. В этой связи, CD90 относится к кластеру дифференцирования 90, также известному как антиген дифференцирования тимоцитов 1 (Thy-1). Последовательность человеческого белка CD90 может представлять собой SEQ ID NO: 2. Маркер CD 105 известен специалисту в данной области техники. CD 105 также известен как эндоглин (ENG). Последовательность человеческого белка CD105 может представлять собой SEQ ID NO: 3.

Если популяцию мезенхимальных стволовых клеток в соответствии с изобретением (в частности популяцию мезенхимальных стволовых клеток, в которой по меньшей мере приблизительно 98% или 99% экспрессируют каждый из маркеров CD73, CD90 и CD10 и не экспрессируют каждый из маркеров: CD34, CD45 и HLA-DR) используют для клинических исследований или в качестве улучшенного терапевтического применения, тогда для этой задачи как правило используют клеточную популяцию рабочего банка клеток. Как объясняется, популяция мезенхимальных стволовых клеток может не экспрессировать следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA-DR. В этом контексте отмечается, что маркер CD34, CD45 и HLA-DR известны специалистам в данной области техники. Человеческий белок CD34 может иметь последовательность SEQ ID NO. 4. Человеческий белок CD45 может иметь последовательность SEQ ID NO: 5. Человеческий белок HLA-DR может иметь последовательность SEQ ID NO: 6.

Как популяция стволовых клеток со стадии выделения (которая может формировать главный банк клеток), так и популяции стволовых клеток со стадии субкультивирования (которая может формировать рабочий банк клеток) могут, например, храниться в криоконсервированной форме.

Как упомянуто выше, способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины по настоящему изобретению обладает преимуществом, заключающемся в том, что все компоненты, используемые в культуральной среде в соответствии с изобретением, доступны в качестве GMP, и, таким образом, обеспечивают возможность для выделения мезенхимальных стволовых клеток в условиях GMP для последующего терапевтического введения.

Таким образом, популяция стволовых клеток также может представлять собой популяцию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Используемый в настоящем документе термин "индуцированные плюрипотентные стволовые клетки" относится к взрослым соматическим клеткам, которые генетически перепрограммированы в состояние, подобное эмбриональным стволовым клеткам, путем усиления генов экспрессии и факторов, важных для поддержания определяющих свойств эмбриональных стволовых клеток. Таким образом, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть получены/генерированы из неплюрипотентной клетки.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки представляют собой важное продвижение в исследовании стволовых клеток, поскольку они обеспечивают возможность получения плюрипотентных стволовых клеток без использования эмбрионов. О мышиных iPSC (индуцированных плюрипотентных стволовых клетках) впервые сообщалось в 2006 году (Takahashi, К; Yamanaka, S (2006). "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors". Cell 126 (4): 663-76), а о человеческих iPSC (hiPSCs) впервые сообщалось в 2007 году (Takahashi et al. (2007) "Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors." Cell; 131(5):861-72). Мышиные iPSC демонстрируют важные характеристики плюрипотентных стволовых клеток, включающие экспрессию маркеров стволовых клеток, образующих опухоли, которые содержат клетки всех трех зародышевых слоев, и способны вносить вклад в множество различных тканей при инъекции в мышиные эмбрионы на очень ранней стадии развития. Человеческие iPSC также экспрессируют маркеры стволовых клеток и способны образовывать клетки, характерные для всех трех зародышевых слоев. Такие маркеры стволовых клеток могут включать Oct3/4, Sox2, Nanog, щелочную фосфатазу (ALP), а также специфический для стволовых клеток ангиген 3 и 4 (SSEA3/4). Также, паттерны метилирования хроматина iPSC напоминают аналогичные паттерны эмбриональных стволовых клеток (Tanabe, Takahashi, Yamanaka (2014) "Induction of pluripotency by defined factors." Proc. Jpn. Acad., 2014, Ser. В 90).

Дополнительно, iPSC способны к самообновлению in vitro и дифференцируются во все три зародышевых слоя. Плюрипотентность или способность дифференцироваться в различные типы клеток iPSC может быть тестирована, например, путем дифференцирования in vitro в нервные клетки или клетки глии, или продуцирования химерных животных зародышевой линий через инъекцию бластоцисты.

Способы генерирования человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалисту в данной области техники и, например, описаны в WO 2009115295, WO 2009144008 или ЕР2218778. Таким образом, специалист в данной области техники может получить iPSC при помощи любого способа. В принципе, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки может быть получены из любой взрослой соматической клетки (у субъекта). Примеры соматических клеток включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) или фибробласты, полученные из тканевых биоптатов кожи.

Настоящее изобретение среди прочего относится к композиции для хранения или транспортирования МСК, которую получают при помощи описанного в настоящем документе способа, а также к композиции для хранения или транспортирования МСК, которая может быть получена при помощи описанного в настоящем документе способа. Кроме того, настоящее изобретение относится к транспортированию МСК, включающему транспортирование указанных МСК в определенной в настоящем документе композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток. В этом контексте настоящее изобретение включает приведение в контакт описанной в настоящем документе популяции стволовых клеток с жидким носителем. Предполагается, что в способе по настоящему изобретению описанные в настоящем документе популяцию стволовых клеток приводят в контакт с носителем перед транспортированием/хранением. Дополнительно или альтернативно, популяцию стволовых клеток приводят в контакт с носителем после ее выделения. Каким образом может быть осуществлено выделение, подробно описано в настоящем документе, а также в экспериментальном разделе. Например, популяция стволовых клеток может быть приведена в контакт с носителем приблизительно через 0 минут, приблизительно через 1 минуту, приблизительно через 5 минут, приблизительно через 10 минут, приблизительно через 30 минут, приблизительно через 45 минут, приблизительно через 60 минут или более длительное время после ее выделения.

Выделение может включать отделение популяции стволовых клеток от культуральной среды, например, от РТТ-6. Подходящее способы такого отделения известны специалистам в данной области техники. Например, отделение может быть осуществлено путем центрифугирования стволовых клеток в культуральной среде и сцеживания культуральной среды.

Популяцию стволовых клеток приводят в контакт с жидким носителем, где жидкий носитель содержит

1) тролокс;

2) Na⁺;

3) K+;

4) Са²⁺,

5) Mg²⁺;

6) Cl^-;

7) H₂PO₄^-;

8) HEPES;

9) лактобионат;

10) сахарозу;

11) маннит;

12) глюкозу;

13) декстран-40;

14) аденозин и

15) глутатион,

Под "тролоксом" понимают 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту, имеющую номер CAS (Химической реферативной службы) 53188-07-1. Он представляет собой водорастворимый аналог витамина Е и, как предполагается, уменьшает окислительный стресс или повреждение. На фиг. 19 показано техническое описание Тролокс, доступного от Tocris. Он также имеется в продаже от Sigma Aldrich (номер продукта: 238813).

Как Na⁺ так и Cl^- представляют собой хорошо известные ионы. Специалисту в данной области техники известно то, каким образом получать их. Например, эти ионы могут быть добавлены в носитель в виде соли NaCl. NaCl качества GMP может быть получен от Sigma Aldrich. На фиг. 20 показано техническое описание NaCl, доступного от Sigma Aldrich.

Са²⁺и Mg²⁺ также представляют собой хорошо известные ионы. Специалисту в данной области техники известно то, каким образом получать их. Например, эти ионы могут быть добавлены в носитель в виде соли CaCl₂ или MgCl₂. На фиг. 31 показано техническое описание CaCl₂, доступного от Sigma Aldrich и на фиг. 32 показано техническое описание MgCl₂, доступного от Sigma Aldrich.

K⁺и Н₂РО₄^- (дигидрофосфат) также хорошо известны специалисту в данной области техники. Они могут быть использованы, например, в виде KH₂PO₄ полученного от SigmaAldrich. На фиг. 21 показано техническое описание KH₂PO₄, доступного от Sigma Aldrich.

HEPES, также называемый 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота (номер CAS 7365-45-9), обычно используется в качестве цвиттер-ионного органического химического буферного агента. Специалисту в данной области техники также известно то, каким образом получать HEPES, который имеется в продаже.

Например, специалист в данной области техники может получить его от Sigma Aldrich; соответствующей техническое описание представлен на фиг. 22.

Лактобионат представляет собой карбоксилат-анион лактобионовой кислоты. Лактобионовая кислота (4-(3-β-галактопиранозил-В-глюконовая кислота) представляет собой сахарную кислоту. Лактобионат может быть использован различными способами. Когда его используют в виде лактобионата калия, тогда он может, например, обеспечивать осмотическую поддержку и предупреждать клеточный отек, а при комбинировании с натрием может выполнять консервирующую функцию. Альтернативно, неорганические соли лактобионовой кислоты могут быть использованы в качестве неорганической добавки. Для фармацевтического применения часто антибиотик эритромицин среди прочего может быть использован в виде соли лактобионата эритромицина. Специалисту в данной области техники также известно, каким образом получать лактобионат, например, лактобионат натрия (номер Cas: 27297-39-8), а именно, например, из COMBI-BLOCKS, см. описание продукта на фиг. 23.

Сахароза, также известная как D-Glc-(1→2)-β-D-Fru, α-D-глюкопиранозил β-D-фруктофуранозид, β-D-фруктофуранозил-α-D-глюкопиранозид, D(+)-сахароза или сахар (номер CAS 57-50-1), может выступать в качестве других имеющихся в продаже веществ, и специалисту в данной области техники также известно то, где его покупать. Соответствующее описание продукта сахарозы от Sigma Aldrich представлено на фиг. 24.

Маннит представляет собой тип сахарных спиртов (регистрационный номер CAS: 69-65-8). Специалист в данной области техники знает то, каким образом получать маннит.Например, он может быть получен от Avantor. Соответствующее описание продукта представлено на фиг. 25.

Глюкоза (номер CAS: 50-99-7) также хорошо известна специалисту в данной области техники и имеется в продаже. Соответствующее описание продукта от Sigma Aldrich представлено на фиг. 26.

Декстран представляет собой разветвленный глюкан, состоящий из линейных связанных путем α (1→6) мономеров глюкозы и связанных α (1→3) инициированных ветвей. Декстран находится в диапазоне от 10000 до 150000 кДа. Декстраны используют во множестве применений в качестве веществ, придающих объем, стабилизаторов, компонентов матрицы, связывающих веществ, смазывающих веществ и компонентов физической структуры. Декстран 40 (номер CAS: 9004-54-0), используемый здесь в качестве носителе, как правило используют в разработке новых улучшенных консервирующих растворов для трансплантации органов. Декстран 40 может быть использован для определения плотности клеток и параметров проницаемости между клеточными слоями. Декстран 40 также может быть использован в качестве коллоидного вещества, увеличивающего объем плазмы крови. Декстран-40 имеется в продаже и среди прочего может быть получен от Sigma Aldrich (описание продукта представлено на фиг. 27).

Аденозин (номер CAS 58-61-7) представляет собой пуриновый нуклеозид, состоящий из молекулы аденина, присоединенной к группировке молекулы сахара рибозы (рибофураноза) при помощи β-N₉-гликозидной связи. Аденозин имеется в продаже в том числе от Sigma-Aldrich (соответствующее описание продукта представлено на фиг. 28).

Глутатион также известен как (2S)-2-амино-4-{[(1R)-1-[(карбокс иметил)карбамоил]-2-сульфанилэтил]карбамоил}бутановая кислота. Этот компонент имеется в продаже и среди прочего может быть получен от Sigma Aldrich (соответствующее описание продукта представлено на фиг. 29).

В принципе, любой жидкий носитель, содержащий вещества, перечисленные в 1)-15) выше, может быть использован в способе по настоящему изобретению. Носитель представляет собой жидкий носитель. Таким образом, возможно, чтобы вещества, перечисленные в 1)-15) были растворены в жидкости с образованием раствора/суспензии. Жидкость может представлять собой любую подходящую жидкость. Например, жидкость может представлять собой культуральную среду, воду, буфер и т.п.

Носитель может дополнительно содержать регулирующие рН буферы, энергетические субстраты, поглотители свободных радикалов и осмотические/онкотические стабилизаторы - все из которых известны специалисту в данной области техники. Кроме того, жидкий носитель может быть бессывороточным и/или не содержащим белок. Жидкий носитель может не содержать диполярный апротонный растворитель, такой как, например, DMSO (диметилсульфоксид). В частности, жидкий носитель может представлять собой носитель, описанный в WO 2010/064054. Этот носитель может представлять собой HypoThermosol™ или HypoThermosol™-FRS (HTS-FRS). HypoThermosol™-FRS (HTS-FRS) может быть приобретен в STEMCELL Technologies (в соответствии с описанием продукта, представленным на фиг. 30).

Дополнительно предполагается, что носитель представляет собой среду для транспортировки/хранения или эксципиент. Среда для транспортировки/хранения может представлять собой природную среду, которая состоит исключительно из встречающихся в природе биологических жидкостей, которые дополнительно содержат вещества, перечисленные в описанных в настоящем документе 1)-15). Среда также может представлять собой среду, содержащую вещества, перечисленные в описанных в настоящем документе 1)-15), и с добавлением (дополнительно) питательных веществ (органических и неорганических), витаминов, солей, газовых фаз О₂ и СО₂, белков сыворотки крови, углеводов и/или кофакторов. В конкретных воплощениях среда не содержит сыворотку крови и/или белок.

Носитель также может представлять собой эксципиент."Эксципиент" представляет собой вещество, приготовленное с активным ингредиентом лекарственного средства. В способе по настоящему изобретению активный ингредиент представляет собой популяцию стволовых клеток.

Носитель может дополнительно содержать биосовместимые матрицы или микроносители. Матрицы или микроносители могут, например, представлять собой биоразрушаемые полимерные вещества, наиболее предпочтительно, поли(D,L сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты) (PLGA)). Альтернативно, матрицы или микроносители могут представлять собой гладкие макропористые или микропористые структуры, содержащие вещества, включающие поли-L-лактид (PLLA), коллаген, фибронектин, гликозаминогликаны (GAG), фибрин, крахмал, арабиногалактан целлюлозы (камедь лиственницы), альгиновую кислоту, агар, карраген, хитин, гиалуроновую кислоту, декстран, геллановую камедь, пуллулан, гидроксиапатит, полигидроксиалканоаты (РНА), гидрогели или другие самособираемые материалы, такие как основанные на пептидах наноструктурированные волокнистые матрицы.

В принципе любое количество стволовых клеток может быть приведено в контакт с любым количеством жидкого носителя. В этой связи приведение в контакт может быть осуществлено путем суспендирования популяции стволовых клеток с плотностью приблизительно 70 миллионов/мл, приблизительно 60 миллионов/мл, приблизительно 50 миллионов/мл, приблизительно 40 миллионов/мл, приблизительно 30 миллионов/мл, приблизительно 20 миллионов/мл, приблизительно 10 миллионов/мл, приблизительно 5 миллионов/мл, приблизительно 4 миллиона/мл, приблизительно 3 миллиона/мл, приблизительно 2 миллиона/мл, приблизительно 1 миллион/мл, приблизительно 0,5 миллиона/мл, приблизительно 0,1 миллиона/мл или менее чем 0,1 миллиона клеток в 1 мл носителя. В некоторых воплощениях, приведение в контакт осуществляют путем суспендирования популяции стволовых клеток с плотностью приблизительно 10 миллионов/1 мл носителя.

После приведение в контакт популяции стволовых клеток с композицией для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток стволовые клетки, контактирующие с композицией для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток могут быть аликвотированы во флаконы в объеме приблизительно 50 мл, приблизительно 20 мл, приблизительно 10 мл, приблизительно 5 мл, приблизительно 4 мл, приблизительно 3 мл, приблизительно 2 мл, приблизительно 1 мл, приблизительно 0,5 мл, приблизительно 0,25 мл или менее чем 0,25 мл композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток. Например, стволовые клетки, контактирующие с композицией для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, могут быть аликвотированы во флаконы в объеме приблизительно 1 мл.

Дополнительно предполагается, что способ по настоящему изобретению не включает стадию оттаивания или замораживания. Последнее может быть следствием того, что после отбора популяции стволовых клеток их транспортируют/хранят без необходимости в замораживании и оттаивании популяции стволовых клеток.

Описанный в настоящем документе носитель, используемый в способе транспортировки/хранения популяции стволовых клеток, особенно подходит для этой цели. Одно из преимуществ этого носителя заключается в том, что по существу все стволовые клетки, транспортируемые/сохраняемые в нем, остаются жизнеспособными. "Жизнеспособная клетка" представляет собой клетку, способную жить. Специалисту в данной области техники известно то, каким образом обнаруживать жизнеспособные клетки. Один из таких способов представляет собой окрашивание клеток красителем трипановым синим. Жизнеспособные клетки не окрашиваются трипановым синим.

В этой связи, в способе по настоящему изобретению не более приблизительно 50%, приблизительно 40%, приблизительно 30%, приблизительно 20%, приблизительно 10% или менее чем приблизительно 10% популяции стволовых клеток может погибнуть во время транспортировки/хранения по сравнению с количеством/количеством жизнеспособных стволовых клеток перед транспортированием/ хранением.

Способ по настоящему изобретению также предполагает то, что популяции стволовых клеток имеют любой клеточный диаметр после транспортировки/хранения. Специалисту в данной области техники известно то, каким образом измерять диаметр клетки. Например, размер/диаметр клетки может быть определен путем регистрации изображения из микроскопа и с использованием вторичного программного обеспечения для измерения диаметра клетки. Таким образом, большая часть стволовых клеток в популяции стволовых клеток может иметь клеточный диаметр от приблизительно 9 мкм до приблизительно 20 мкм после транспортировки/хранения. Также предполагается, что большая часть стволовых клеток в популяции стволовых клеток имеет клеточный диаметр от приблизительно 12 мкм до приблизительно 16 мкм после транспортировки.

Стволовые клетки, которые транспортировали/хранили в описанном в настоящем документе носителе, секретируют такие же белки/факторы, как и жизнеспособные стволовые клетки. Например, способ по настоящему изобретению предполагает, что после транспортировки/хранения популяция (мезенхимальных) стволовых клеток может секретировать приблизительно столько же TGF бета 1, как до транспортировки/хранения. TGF бета 1 (трансформирующий фактор роста бета, TGF-β1) известен специалисту в данной области техники и может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO. 7. Дополнительно или альтернативно, после транспортировки/хранения популяция (мезенхимальных) стволовых клеток может секретировать приблизительно столько же VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), PDGF-AA (тромбоцитарный фактор роста субъединица АА), Ang-1 (ангиогенин-1) и/или HGF (фактор роста гепатоцитов) как до транспортировки/хранения. Все из VEGF, PDGF-AA, Ang-1 и/или HGF известны специалистам в данной области техники благодаря их вовлеченности в заживление ран. В частности, VEGF может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO. 8, PDGF-AA может иметь последовательность, представленную в SEQ ID NO. 9, Ang-1 может иметь последовательность, представленную в SEQ ID NO. 10, тогда как HGF может иметь последовательность, представленную в SEQ ID NO. 11. Дополнительно или альтернативно, по существу ни один из PDGF-BB и/или IL-10 не обнаруживается до и/или после транспортировки. PDGF-BB (тромбоцитарный фактор роста субъединица ВВ) и/или IL-10 (интерлейкин-10) также известны специалисту в данной области техники. PDGF-BB может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO.

12, тогда как IL-10 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO:

13. Секреция этих факторов может быть определена при помощи любого подходящего способа, например, путем измерения количества белка (т.е., например, PDGF-AA, PDGF-BB, VEGF, IL-10, Ang-1, HGF или TGFβ1), который стволовые клетки секретируют в носитель. Количество белка может быть измерено при помощи имеющихся в продаже антител/иммуноанализов автоматически с использованием, например, системы, такой как система FLEXMAP 3D (Luminex Corporation, Austin, Texas, USA). В этом контексте отмечается, что вовлечение белков ангиопоэтина 1 (Ang-1), TGF-β1, VEGF и HGF в процесс заживления раны известно специалисту в данной области техники. В отношении вовлечения ангиопоэтина 1 в заживление ран см., например, Li et al. Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:113 "Mesenchymal stem cells modified with angiopoietin-1 gene promote wound healing". В отношении вовлечения фактора роста гепатоцитов (HGF) в заживление ран, в частности, заживление хронических/не заживающих ран, см. например, Yoshida et al., "Neutralization of Hepatocyte Growth Factor Leads to Retarded Cutaneous Wound Healing Associated with Decreased Neovascularization and Granulation Tissue Formation. J. Invest. Dermatol. 120:335-343, 2003, Li, Jin-Feng et al. "HGF Accelerates Wound Healing by Promoting the Dedifferentiation of Epidermal Cells through p 1-Integrin/ILK Pathway." BioMed Research International 2013 (2013): 470418 или Conway et al, "Hepatocyte growth factor regulation: An integral part of why wounds become chronic". Wound Rep Reg (2007) 15 683-692. В отношении вовлечения фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в заживление ран, в частности, заживление хронических/незаживающих ран, см., например, Froget et al., Eur. Cytokine Netw., Vol. 14, March 2003, 60 64 or Bao et al., "The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Wound Healing" J Surg Res. 2009 May 15; 153(2): 347-358.

В отношении вовлечения трансформирующего фактора роста бета (включающего TGF-βl, TGF-β2 и TGF-рЗ) в заживление ран, в частности, заживление хронических/не заживающих ран, см., например, Ramirez et al. "The Role of TGFb Signaling in Wound Epithelialization" Advances hi Wound Care, Volume 3, Number 7, 2013, 482-491 или Pakyari et al., Critical Role of Transforming Growth Factor Beta in Different Phases of Wound Healing, Advances In Wound Care, Volume 2, Number 5, 2012, 215-224.

Возвращаясь к культуральной среде, используемой в настоящем изобретении, культуральная среда может содержать для выделения или культивирования выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток DMEM в конечной концентрации приблизительно 55-65% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 5-15% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно 15-30% (об./об.) и FBS в конечной концентрации приблизительно 1-8% (об./об.). Используемая в настоящем документе величина "% (об./об.)" относится к объему индивидуального компонента относительно конечного объема культуральной среды. Последнее означает, что, если, например, DMEM представлен в культуральной среде в конечной концентрации приблизительно 55-65% (об./об.), то 1 литр культуральной среды содержит приблизительно 550-650 мл DMEM.

В других воплощениях культуральная среда может содержать DMEM в конечной концентрации приблизительно 57,5-62,5% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 7,5-12,5% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно 17,5-25,0% (об./об.) и FBS в конечной концентрации приблизительно 1,75-3,5% (об./об.). В дополнительных воплощениях культуральная среда может содержать DMEM в конечной концентрации приблизительно 61,8% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 11,8% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно 23,6% (об./об.) и FBS в конечной концентрации приблизительно 2,5% (об./об.).

Дополнительно к вышеупомянутым компонентам культуральная среда может содержать добавки, которые благоприятны для культивирования выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток. Культуральная среда по настоящему изобретению может, например, содержать фактор роста эпидермиса (EGF). Если EGF присутствует, то он может быть представлен в культуральной среде в конечной концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл. В некоторых из этих воплощений культуральная среда может содержать EGF в конечной концентрации приблизительно 10 нг/мл.

Культуральная среда может также содержать инсулин. Если инсулин присутствует, то он может быть представлен в конечной концентрации от приблизительно 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. В некоторых из этих воплощений культуральная среда может содержать инсулин в конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл.

Культуральная среда может дополнительно содержать по меньшей мере одну из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). В таких воплощениях культуральная среда может содержать все три из аденина, гидрокортизона и натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). В этих воплощения культуральная среда может содержать аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мкг/мл, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл.

В одном из воплощений мезенхимальные стволовые клетки выращивают в среде РТТ6 с получением описанной и используемой в настоящем документе высокоочищенной популяции мезенхимальных стволовых клеток. В этом контексте отмечается, что описанная в настоящем документе среда РТТ6, представляет собой среду, которую готовят при помощи смешивания с получением конечного объема 500 мл культуральной среды:

1. 250 мл DMEM

2. 118 млМ171

3. 118 мл DMEM/F12

4. 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) для достижения конечной концентрации 2,5% (об./об.)

5. EGF в конечной концентрации 10 нг/мл

6. Инсулин в конечной концентрации 5 мкг/мл.

7. Инсулин 0,175 мл (конечная концентрация 5 мкг/мл).

Под "DMEM" понимают модифицированную Дульбекко среду Игла, которая была разработана в 1969 году, и представляет собой модификацию базовой среды Игла (ВМЕ) (см. фиг, 1 демонстрирующий техническое описание DMEM, доступный от Lonza). Исходная формула DMEM содержит 1000 мг/л глюкозы и впервые была использована для культивирования эмбриональных клеток мыши. DMEM затем стала стандартной средой для клеточной культуры, которая имеется в продаже из различных источников, таких как ThermoFisher Scientific (номер по каталогу 11965-084), Sigma Aldrich (номер по каталогу D5546) или Lonza, и это только несколько поставщиков. Таким образом, любая имеющаяся в продаже DMEM может быть использована в настоящем изобретении. В предпочтительных воплощениях использованная в настоящем документе DMEM представляет собой среду DMEM, доступную от Lonza под номером по каталогу 12-604F. Эта среда представляет собой DMEM, дополненную 4,5 г/л глюкозы и L-глутамином. В еще одном предпочтительном воплощении использованная в настоящем документе DMEM представляет собой среду DMEM от Sigma Aldrich с номером по каталогу D5546, которая содержит 1000 мг/л глюкозы и бикарбонат натрия, но без L-глутамина.

Под средой "F12" понимают среду Хэма F12. Эта среда также представляет собой стандартную клеточную культуральную среду и представляет собой питательную смесь, исходно разработанную для культивирования широкого разнообразия клеток млекопитающих и клеток гибридомы при использовании с сывороткой крови в комбинации с гормонами и трансферрином (см. фиг. 2, демонстрирующий техническое описание среды Хэма F12 от Lonza). Любая имеющаяся в продаже среда Хэма F12 (например, от ThermoFisher Scientific (номер по каталогу 11765-054), Sigma Aldrich (номер по каталогу N4888) или Lonza, и это только несколько поставщиков) может быть использована в настоящем изобретении. В предпочтительных воплощениях используют среду Хэма F12 от Lonza.

Под "DMEM/F12" или "DMEM:F12" понимают смесь 1:1 DMEM с культуральной средой Хэма F12 (см. фиг. 3, демонстрирующую техническое описание для среды DMEM: F12 (1:1) от Lonza). Среда DMEM/F12 (1:1) представляяет собой широко используемую базовую среду для поддержания роста множества отличающихся клеток млекопитающих и имеются в продаже от различных поставщиков, таких как ThermoFisher Scientific (номер по каталогу 11330057), Sigma Aldrich (номер по каталогу D6421) или Lonza. Любая имеющаяся в продаже среда DMEM:F12 может быть использована в настоящем изобретении. В предпочтительных воплощениях, использованная в настоящем документе среда DMEM:F12 представляет собой среду DMEM/F12 (1:1), доступную от Lonza под номером по каталогу 12-719F (которая представляет собой DMEM: F12 с L-глутамином, 15 мМ HEPES и 3,151 г/л глюкозы).

Под "М171" понимают культуральную среду 171, которая была разработана в качестве базовой среды для культивирования и роста обычных человеческих эпителиальных клеток (см. фиг. 4 демонстрирующую техническое описание для среды М171 от Life Technologies Corporation). Эта базовая среда широко используется и имеется в продаже от поставщиков, например, таких, как ThermoFisher Scientific или Life Technologies Corporation (номер по каталогу М171500). Любая имеющаяся в продаже среда М171 может быть использована в настоящем изобретении. В предпочтительных воплощениях используемая в настоящем документе среда М171 представляет собой среду М171, доступную от Life Technologies Corporation под номером по каталогу М171500.

Под "FBS" понимают фетальную бычью сыворотку (которая также названа в настоящем документе "фетальной телячьей сывороткой"), т.е. фракцию крови, которая остается после естественного свертывания крови с последующим центрифугированием для удаления любых оставшихся эритроцитов. Фетальная бычья сыворотка представляет собой наиболее широко используемую сывороточную добавку для культивирования культуры эукариотических клеток in vitro, поскольку она имеет очень низкий уровень антител и содержит большее количество факторов роста, обеспечивая универсальность применения в отношении множества различных клеточных культур. FBS предпочтительно получают от члена Международной ассоциации производителей сывороток (ISIA), основной фокус которой заключается в безопасности использования сыворотки крови и продуктов животного происхождения путем надлежащего отслеживания происхождения, правильности маркировки и подходящей стандартизации и надзора. Поставщики FBS, который являются членами ISIA, включают Abattoir Basics Company, Animal Technologies Inc., Biomin Biotechnologia LTD A, GE Healthcare, Gibco от Thermo Fisher Scientific и Life Science Production, и это лишь некоторые из них. В предпочтительных воплощениях FBS получают из GE Healthcare под номером по каталогу А15-151.

Как упомянуто выше, способ приготовления культуральной среды для выделения популяции мезенхимальных стволовых клеток, используемый в изобретении, включает смешивание с получением конечного объема 500 мл культуральной среды:

1. 250 мл DMEM

2. 118 млМ171

3. 118 мл DMEM/F12

4. 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) для достижения конечной концентрации 2,5% (об./об.).

Как объяснялось выше, среда DMEM/F12 представляет собой смесь 1:1 DMEM и среды Хэма F12. Таким образом, 118 мл среды DMEM/F12 содержат 59 мл DMEM и 59 мл F12. Соответственно, при использовании этого способа приготовления культуральной среды конечные концентрации (об./об.) на 500 мл общего объема являются следующими:

- DMEM: 250 мл+59 мл=309 мл, соответствует 309/500=61,8% (об./об.)

- М171: 118 мл, соответствует 118/500=23,6% (об./об.)

- F12: 59 мл, соответствует 59/500=11,8% (об./об.).

Воплощения этого способа приготовления культуральной среды дополнительно включают добавление

5. 1 мл концентрированного раствора EGF (5 мкг/мл) для достижения конечной концентрации EGF 10 нг/мл, и

6. 0,175 мл концентрированного раствора инсулина (14,28 мг/мл) для достижения конечной концентрации инсулина 5 мкг/мл.

В настоящем документе отмечено, что в этих воплощениях вышеупомянутые объемы этих компонентов 1-6 приводят в результате к конечному объему 499,675 мл культуральной среды. Если никакие дополнительные компоненты не добавляют в культуральную среду, то оставшиеся 0,325 мл (для доведения до объема 500 мл) могут представлять собой, например, любой из компонентов 1- 4, что означает DMEM, М171, DMEM/F12 или FBS. Альтернативно, концентрация концентрированного раствора EGF или инсулина безусловно может быть скорректирована таким образом, что общий объем культуральной среды составлял 500 мл. Дополнительно, также отмечается, что компоненты 1 - 4 не обязательно должны добавляться в последовательности, в которой они перечислены, но безусловно также возможно использовать любой порядок смешивания этих компонентов для приготовления культуральной среды по настоящему изобретению. Последнее означает, что, например, М171 и DMEM/F12 могут быть смешаны вместе и затем комбинированы с DMEM и FBS для достижения описанной в настоящем документе конечной концентрации, т.е. конечной концентрация DMEM приблизительно 55 - 65% (об./об.), конечной концентрации F12 приблизительно 5 - 15% (об./об.), конечной концентрации М171 приблизительно 15 - 30% (об./об.) и конечной концентрации FBS приблизительно 1 - 8% (об./об.).

В других воплощениях способ дополнительно включает добавление к DMEM объема 0,325 мл одной или более чем одной из следующих добавок: аденина, гидрокортизона, натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3), с достижением таким образом общего объема 500 мл культуральной среды. В этом воплощении конечные концентрация этих добавок в DMEM могут быть следующими:

приблизительно 0,05 - 0,1 мкг/мл аденина, например, приблизительно 0,025 мкг/мл аденина,

приблизительно 1-10 мкг/мл гидрокортизона,

приблизительно 0,5 - 5 нг/мл натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3), например, 1,36 нг/мл натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).

В свете вышеприведенного описания используемая в настоящем документе клеточная культуральная среда может быть получена или ее получают при помощи описанного в настоящем документе способа приготовления среды.

Дополнительно, способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины включает культивирование ткани амниотической мембраны в культуральной среде, приготовленной при помощи описанного в настоящем документе способа.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к (применению) клеточной культуральной среде(ы), содержащей:

- DMEM в конечной концентрации приблизительно 55 - 65% (об./об.),

- F12 в конечной концентрации приблизительно 5 - 15% (об./об.),

- М171 в конечной концентрации приблизительно 15 - 30% (об./об.) и

- FBS в конечной концентрации приблизительно 1 - 8% (об./об.).

В некоторых воплощениях описанной в настоящем документе культуральной среды последняя содержит DMEM в конечной концентрации приблизительно 57,5 -62,5% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 7,5 - 12,5% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно 17,5 - 25,0% (об./об.) и FBS в конечной концентрации приблизительно 1,75 - 3,5% (об./об.). В других воплощениях культуральная среда может содержать DMEM в конечной концентрации приблизительно 61,8% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 11,8% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно 23,6% (об./об.) и FBS в конечной концентрации приблизительно 2,5% (об./об.).

Дополнительно, культуральная среда может дополнительно содержать фактор роста эпидермиса (EGF) в конечной концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл. В некоторых воплощения, культуральная среда содержит EGF в конечной концентрации приблизительно 10 нг/мл. Описанная в настоящем документе культуральная среда может дополнительно содержать инсулин в конечной концентрации от приблизительно 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. В таких воплощениях культуральная среда может содержать инсулин в конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл.

Клеточная культуральная среда может дополнительно содержать по меньшей мере одну из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). В некоторых воплощениях культуральная среда содержит все три из аденина, гидрокортизона и натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). Если эти компоненты присутствуют, то культуральная среда может содержать аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина или от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона или от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл.

В воплощениях клеточной культуральной среды 500 мл клеточной культуральной среды по настоящему изобретению содержат:

1. 250 мл DMEM

2. 118 млМ171

3. 118 мл DMEM/F12

4. 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) (конечная концентрация 2,5%)

В дополнительных воплощениях клеточная культуральная среда может дополнительно содержать

5. EGF в конечной концентрации 10 нг/мл, и

6. Инсулин в конечной концентрации 5 мкг/мл.

Как инсулин, так и EGF могут быть добавлены в культуральную среду с использованием выбранного концентрированного раствора, таким образом, что общий объем культуральной среды не превышает 500 мл.

В конкретном примере компоненты 1-6 культуральной среды, используемые в настоящем изобретении, представляют собой компоненты, указанные на фиг. 5, что одначает то, что они получены от соответствующих производителей с использованием номера по каталогу, указанного на фиг. 5. Среда, которую получают путем смешивания компонентов 16, как указано на фиг. 5, также названа в настоящем документе как "РТТ-6". В этом контексте также отмечается, что составляющие 1 - 6, а также любой другой ингредиент, такой как антибиотик от любого другого коммерческого поставщика, может быть использован при приготовлении среды по настоящему изобретению.

Дополнительно, клеточная культуральная среда в соответствии с изобретением может содержать аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина или от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина, гидрокортизон в конечной концентрации приблизительно 0,1 - 10 мкг/мл, от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мкг/мл, или от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 нг/мл или от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл.

Для получения описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток ткань пуповины может быть культивирована до тех пор, пока подходящее количество (первичных) выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток разрастается из ткани. В типичных воплощениях ткань пуповины выращивают до тех пор, пока разрастание мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны не достигает от приблизительно 70 до приблизительно 80% конфлюэнтности. В настоящем документе отмечено, что термин "конфлюэнтности" или "конфлюэнтность" используется в своем обычном в области техники значении в отношении культуры клеток, и его понимают, как оценку/показатель количества адгезивных клеток в культуральной чашке или флаконе, указывая на долю поверхности, покрытой клетками. Например, 50 процентная конфлюэнтность означает то, что приблизительно половина поверхности покрыта и все еще остается пространство для роста клеток. 100 процентная конфлюэнтность означает то, что поверхность полностью покрыта клетками, и для клеток больше не остается пространство для роста в виде монослоя.

После получения подходящего количества первичных клеток (выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток) из выстилающей пуповину ткани при помощи тканевого экспланта, эти мезенхимальные стволовые клетки удаляют из контейнера, используемого для культивирования. Таким образом, может быть сформирован главный банк клеток, содержащий (первичные) выделенные мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны. Как правило, поскольку мезенхимальные стволовые клетки представляют собой адгезированные клетки, удаление осуществляют с использованием стандартной ферментативной обработки. Например, ферментативная обработка может включать трипсинизацию, как описано международной патентной заявке США 2006/0078993, международной патентной заявке WO 2006/019357 или международной патентной заявке WO 2007/046775, что означает то, что разросшиеся клетки могут быть собраны путем трипсинизации (0,125% трипсин/0,05% EDTA) для дальнейшего наращивания. После сбора мезенхимальных стволовых клеток, например, для использования в формировании главного банка клеток, эти клетки также могут быть подвергнуты криоконсервации и храниться для дальнейшего использования, как объясняется в настоящем документе ниже.

После сбора мезенхимальные стволовые клетки могут быть перенесены в контейнер для субкультивирования. Субкультивирование также может быть начато из замороженных первичных клеток, т.е. из главного банка клеток. Для субкультивирования любое подходящее количество клеток может быть высеяно в контейнер для культивирования, такой как планшет для культуры клеток. Для этой задачи мезенхимальные стволовые клетки могут быть суспендированы в подходящей среде (как правило, культуральной среде РТТ-6) для субкультивирования в концентрации, например, от приблизительно 0,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл. В одном из воплощений клетки суспендируют для субкультивирования в концентрации приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл. Субкультивирование может быть осуществлено путем культивирования в простых культуральных флаконах, а также, например, в многослойной системе, такой как CellStacks (Corning, Corning, NY, USA) или Cellfactory (Nunc, часть Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), которая может быть установлена в инкубаторы. Альтернативно, субкультивирование также может быть осуществлено в закрытой системе, такой как биореактор. Различные конструкции биореакторов известны специалисту в данной области техники, например, плоскопараллельные, половолоконные или микрофлуидные биореакторы, см., например, Sensebe et al. "Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review" выше. Иллюстративный пример имеющегося в продаже биореактора с полыми волокнами представляет собой Quantum^® Cell Expansion System (Terumo BCT, Inc), который, например, используется для наращивания мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для клинических исследований (см. Hanley et al, Efficient Manufacturing of Therapeutic Mesenchymal Stromal Cells Using the Quantum Cell Expansion System, Cytotherapy. 2014 August; 16(8): 1048-1058). Еще один пример имеющихся в продаже биореакторов, которые могут быть использованы для субкультивирования популяции мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению, представляет собой Xuri Cell Expansion System, доступную от GE Heathcare. Культивирование популяции мезенхимальных стволовых клеток в автоматизированной системе, такой как Quantum^® Cell Expansion System, является особенно благоприятным в том случае, если рабочий банк клеток для терапевтического применения должен быть сформирован в условиях GMP (надлежащей производственной практики) и требуется большое количество клеток.

Субкультивирование описанных в настоящем документе мезенхимальных стволовых клеток пуповины осуществляется в описанной в настоящем документе культуральной среде, такой как среда РТТ-6. Соответственно, культуральная среда, такая как РТТ-6, может быть использована для выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны и последующего культивирования выделенных первичных клеток путем субкультивирования. Также для субкультивирования мезенхимальные стволовые клетки могут быть культивированы до подходящего количества клеток. В иллюстративных воплощениях мезенхимальные стволовые клетки субкультивировали до тех пор, пока мезенхимальные стволовые клетки не достигали от приблизительно 70 до приблизительно 80% конфлюэнтности.

Выделение/культивирование популяции выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток может быть осуществлено в стандартных для культивирования клеток млекопитающих условиях. Как правило, способ в соответствии с изобретением выделения популяции выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток типично осуществляют в условиях (температура, атмосфера), которые обычно используются для культивирования клеток видов, от которых получают клетки.

Например, ткань человеческой пуповины и выстилающие пуповину мезенхимальные стволовые клетки, соответственно, обычно выращивают при 37°С в воздушной атмосфере с 5% СО₂. В этом контексте отмечается, что мезенхимальные клетки могут быть получены у любых видов млекопитающих, таких как мышь, крыса, морская свинка, кролик, коза, лошадь, собака, кошка, овца, обезьяна или человек, причем мезенхимальные стволовые клетки человеческого происхождения являются предпочтительными в одном из воплощений.

После получения из субкультуры желаемого/подходящего количества выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки могут быть собраны путем их отбора из контейнера, используемого для субкультивирования. Сбор мезенхимальных стволовых клеток как правило вновь осуществляют путем ферментативной обработки, включающей трипсинизацию клеток. Выделенные мезенхимальные стволовые клетки затем собирают и непосредственно используют или сохраняют для дальнейшего использования. Как правило, консервацию осуществляют путем криоконсервации. Термин "криоконсервация" используется в настоящем документе в своем обычном значении для описания процесса, при котором мезенхимальные стволовые клетки консервируют путем охлаждения до температур ниже нуля, таких как (типично) -80°С или -196°С (температура кипения жидкого азота). Криоконсервация может быть осуществлена, как известно специалисту в данной области техники, и может включать применение криоконсервантов, таких как диметилсульфоксид (DMSO) или глицерин, которые замедляют образование кристаллов льда в клетках пуповины.

Выделенная популяция выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток представляющая собой популяцию, которую готовят при помощи описанного в настоящем документе способа выделения, является четко определенной и гомогенной. В типичных воплощениях способа по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют следующие маркеры: CD73, CD90 и CD105. Дополнительно, в этих воплощениях по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток может не экспрессировать следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA-DR. В конкретных воплощениях приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более или приблизительно 99% или более выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют CD73, CD90 и CD105, но не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR.

Таким образом, в свете вышеприведенного описания популяция мезенхимальных стволовых клеток, выделенная из амниотической мембраны пуповины, где по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток популяции стволовых клеток экспрессирует каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD 105. В предпочтительных воплощениях по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток представляют собой CD73+, CD90+ и CD105+, что означает то, что в настоящем документе может быть использована эта процентная доля выделенной популяции клеток, экспрессирующая каждый из CD73, CD90 и CD105 (см. экспериментальный раздел настоящей заявки на изобретение). Дополнительно, по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток может не экспрессировать следующие маркеры. В конкретных воплощениях приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, или приблизительно 99% или более клеток выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют CD73, CD90 и CD 105, но не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR. О такой высокогомогенной популяции мезенхимальных стволовых клеток, полученной из амниотической мембраны пуповины, сообщалось впервые предварительной заявке на патент США №62/404582, поданной 5 октября 2016 года, а также в находящейся в одновременном рассмотрении заявке на патент США №15/725913, поданной 5 октября 2017 года, а также в находящейся в одновременном рассмотрении заявке РСТ PCT/SG2017/050500, также поданной 5 октября 2017 года, и она удовлетворяет критериям к мезенхимальным стволовым клеткам, предназначенным для использования для клеточной терапии (также см. экспериментальный раздел и, например, Sensebe et al."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review", выше). В этом контексте отмечается, что эта популяция мезенхимальных стволовых клеток может представлять собой популяцию, которую получают при помощи способа выделения по настоящему изобретению, а также при необходимости при помощи отличающегося способа, такого как клеточная сортировка.

Способ приготовления культуральной среды для выделения описанных в настоящем документе мезенхимальных стволовых клеток может включать смешивание с получением конечного объема 500 мл культуральной среды:

1. 250 мл DMEM

2. 118 млМ171

3. 118 мл DMEM/F12

4. 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) для достижения конечной концентрации 2,5% (об./об.).

Как объяснялось выше, среда DMEM/F12 представляет собой смесь 1:1 DMEM и среды Хэма F12.

Таким образом, 118 мл среды DMEM/F12 содержат 59 мл DMEM и 59 мл F12. Соответственно, при использовании этого способа приготовления культуральной среды конечные концентрации (об./об.) на 500 мл общего объема являются следующими:

DMEM: 250 мл+59 мл=309 мл, соответствует 309/500=61,8% (об./об.)

Ml71: 118 мл, соответствует 118/500=23,6% (об./об.)

F12: 59 мл, соответствует 59/500=11,8% (об./об.).

Настоящее изобретение также относится к способу лечения субъекта, страдающего от заболевания, где способ включает местное введение субъекту мезенхимальных стволовых клеток, которые хранят или транспортируют в растворе для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, или описанной в настоящем документе популяции, где мезенхимальные стволовые клетки или популяцию стволовых клеток вводят в течение приблизительно 96 часов с момента сбора популяции мезенхимальных стволовых клеток. Этот способ лечения субъекта может быть осуществлен, как описано в международной патентной заявке WO 2019/199229 "А Method Of Transporting Mesenchymal Stem Cells By Means Of A Transporting Solution And A Method Of Administering Stem Cells To Wounds", опубликованной после даты приоритета настоящей заявки на изобретение РСТ и включенной в настоящий документ полностью для всех целей.

Аналогично, настоящее изобретение также относится к описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток для применения в способе лечения заболевания у субъекта, где популяцию мезенхимальных стволовых клеток вводят местно в течение приблизительно 96 часов с момента сбора популяции мезенхимальных стволовых клеток.

Субъект, которого лечат, может представлять собой любого подходящего субъекта. Субъект может представлять собой позвоночное животное, более предпочтительно млекопитающее. Млекопитающие включают без ограничения сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, собак, лошадей, мышей и крыс.Млекопитающее также может представлять собой человека, собаку, кошку, корову, свинью, мышь, крысу и т.п.Таким образом, в одном из воплощений субъект представляет собой позвоночное животное. Субъект также может представлять собой субъекта-человека. Таким образом, субъект может представлять собой субъекта, нуждающегося в лечении. Такой субъект может страдать от описанного в настоящем документе заболевания. В некоторых воплощениях субъект страдает от диабета I или II типа с хроническими язвами стопы. Предпочтительно, субъект является отрицательным в отношении антител HLA против популяции мезенхимальных стволовых клеток.

Популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть применена в любой дозе. Доза может быть терапевтически эффективной. "Терапевтически эффективное количество/доза" может варьировать в зависимости от факторов, включающих без ограничения активность используемых клеток, стабильность клеток в организме пациента, тяжесть состояний, которые необходимо облегчить, возраст и чувствительность пациента, которого лечат, неблагоприятные явления и т.п., как будет понятно специалисту в данной области техники. Количество введения может быть скорректировано в соответствии с изменением различных факторов с течением времени.

Доза, в которой применяют мезенхимальные стволовые клетки, также может представлять собой однократную дозу. Например, популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть применена в однократной дозе приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 15 миллионов клеток, приблизительно 10 миллионов клеток, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 4 миллиона клеток, приблизительно 3 миллиона клеток, приблизительно 2 миллиона клеток, приблизительно 1 миллион клеток, приблизительно 0,5 миллиона клеток, приблизительно 0,25 миллиона клеток или менее чем 0,25 миллиона клеток. В одном из примеров мезенхимальные стволовые клетки могут быть применены в дозе приблизительно 3, приблизительно 5 или приблизительно 10 миллионов клеток. В конкретном воплощении популяцию мезенхимальных стволовых клеток применяют в е дозе приблизительно 10 миллионов клеток.

Мезенхимальные стволовые клетки могут быть применены несколько раз в отношении одного и того же субъекта. Например, стволовые клетки применяют один раз, дважды, три раза или более чем три раза в неделю. В принципе, любая однократная доза мезенхимальных стволовых клеток может быть применена то количество раз, которое подходит для лечения или облегчения заболевания. Например, популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть применена один раз, дважды три раза или более чем три раза в неделю. Популяция мезенхимальных стволовых клеток также может быть применена в течение одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати недель или более.

Таким образом, однократную дозу приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 15 миллионов клеток, приблизительно 10 миллионов клеток, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 4 миллиона клеток, приблизительно 3 миллиона клеток, приблизительно 2 миллиона клеток, приблизительно 1 миллион клеток, приблизительно 0,5 миллиона клеток, приблизительно 0,25 миллиона клеток или менее чем 0,25 миллиона клеток вводят один раз или дважды в неделю. Однократную дозу приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 15 миллионов клеток, приблизительно 10 миллионов клеток, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 4 миллиона клеток, приблизительно 3 миллиона клеток, приблизительно 2 миллиона клеток, приблизительно 1 миллион клеток, приблизительно 0,5 миллиона клеток, приблизительно 0,25 миллиона клеток или менее чем 0,25 миллиона клеток также могут вводить один раз или дважды в неделю в течение периода времени три недели, четыре недели или пять недель, или шесть недель, или семь недель, или восемь недель или десять недель или более недель.

В способе лечения по настоящему изобретению также предполагается, что мезенхимальные стволовые клетки или популяцию мезенхимальных стволовых клеток применяют в дозе от приблизительно 1000 клеток/см² до приблизительно 5 миллионов клеток/см². В настоящем документе выражение см² обозначает площадь раны/кожи, на которую наносят стволовые клетки. Также предполагается, что популяцию мезенхимальных стволовых клеток применяют в дозе приблизительно 100000 клеток/см², 300000 клеток/см² или 500000 клеток/см². Популяцию мезенхимальных стволовых клеток также могут применять два раза в неделю в течение приблизительно 8 недель в дозе приблизительно 100000 клеток/см², приблизительно 300000 клеток/см² или приблизительно 500000 клеток/см².

Популяцию мезенхимальных стволовых клеток вводят в течение приблизительно 96 часов с момента сбора популяции мезенхимальных стволовых клеток. В настоящем документе описано то, каким образом осуществляется сбор. Также возможно, что мезенхимальные стволовые клетки или популяцию мезенхимальных стволовых клеток применяют в течение приблизительно 72 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 6 часов или меньше с момента сбора популяции мезенхимальных стволовых клеток. В период между сбором и применением популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть транспортирована или храниться в композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, как описано в настоящем изобретении. Таким образом, аспекты, описанные для транспортировки/хранения в композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток в соответствии с настоящим изобретением, с соответствующими поправками в равной степени относятся к способу лечения субъекта, включающему введение MCS, которые хранили в композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению.

Способ лечения субъекта по настоящему изобретению служит для облегчения заболевания, от которого страдает субъект.В принципе, в настоящем документе подразумевается любое заболевание, которое можно лечить при помощи описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток. В частности, заболевание может представлять собой заболевание кожи или рану. Рана может быть вызвана любой причиной, например, ожогом, укусом, травмой, хирургическим вмешательством или заболеванием. Рана также может быть вызвана диабетическим заболеванием. Таким образом, рана также может представлять собой диабетическую рану. Рана также может представлять собой язву, обусловленную синдромом диабетической стопы. Отмечается, что популяция мезенхимальных стволовых клеток может, например, помещаться непосредственно на рану, такую как ожог или диабетическая рана (см. международную заявку на патент WO 2007/046775).

В соответствии с описанным в настоящем документе, от сбора описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток до их применения субъекту клетки могут транспортироваться/храниться в определенном в настоящем документе носителе. Таким образом, способ лечения субъекта по настоящему изобретению также может включать стадию отделения популяции мезенхимальных стволовых клеток от носителя перед введением субъекту популяции мезенхимальных стволовых клеток. Специалисту в данной области техники известно, как осуществлять отделение клеток от носителя. Например, отделение популяции мезенхимальных стволовых клеток от носителя может включать центрифугирование. Дополнительно или альтернативно, отделение популяции мезенхимальных стволовых клеток от носителя может включать извлечение популяции клеток из флакона посредством шприца.

После отделения стволовых клеток от композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток или после сбора мезенхимальных стволовых клеток, или после получения описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток при помощи любого другого способа эти клетки применяют в отношении субъекта местно. В принципе, в настоящем документе предполагается любой путь местного введения. Введение популяции мезенхимальных стволовых клеток может быть осуществлено посредством шприца. Тем не менее, также возможно приведение в контакт мезенхимальных стволовых клеток с кремом, мазью, гелем, суспензией или любым другим подходящим веществом перед применением субъекту мезенхимальных стволовых клеток. Популяция мезенхимальных стволовых клеток после применения в отношении субъекта может удерживаться на месте при помощи пленки или бинта. Пример такой пленки или бинта может представлять собой повязку, такую как повязка Tegaderm^®, и эластический бинт для покрывания повязки Tegaderm^®. Для дополнительного распределения клеток область применения может быть осторожно массирована.

Настоящее изобретение также относится к однократной дозе мезенхимальных стволовых клеток, которые получены или могут быть получены при помощи описанного в настоящем документе способа. Например, однократная доза может содержать приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 15 миллионов клеток, приблизительно 10 миллионов клеток, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 4 миллионов клеток, приблизительно 3 миллионов клеток, приблизительно 2 миллионов клеток, приблизительно 1 миллионов клеток, приблизительно 0,5 миллионов клеток, приблизительно 0,25 миллиона клеток или менее чем 0,25 миллиона клеток описанной здесь популяции мезенхимальных стволовых клеток в объеме 1 мл.

Также предполагается, что однократная доза содержит приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6, приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3, приблизительно 2, приблизительно 1, приблизительно 0,5, приблизительно 0,25 или приблизительно 0,1 миллионов клеток. В одном из примеров однократная доза может содержать приблизительно 1 миллион, приблизительно 3 миллиона или приблизительно 5 миллионов клеток. Предпочтительно, однократная доза содержит приблизительно 10 миллионов клеток. Дополнительно предполагается, что однократная доза содержит от приблизительно 1000 клеток до приблизительно 5 миллионов клеток. Однократная доза может быть применена в дозе приблизительно 100000 клеток, 300000 клеток или 500000 клеток. Описанная в настоящем документе однократная доза может быть применена местно. Например, однократная доза может быть применена местно на 1 см².

Однократная доза может быть применена один раз, дважды, три раза или более чем три раза в неделю. Например, однократная доза может быть применена в течение одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати недель или более. Однократная доза, содержащая приблизительно 100000 клеток, приблизительно 300000 клеток или приблизительно 500000 клеток, может быть применена два раза в неделю в течение 8 недель, предпочтительно на 1 см².

Однократная доза может содержаться в любом подходящем контейнере. Например, однократная доза может содержаться во флаконе объемом 1 мл. В таких случаях, например, 0,1 мл из флакона могут быть применены в отношении субъекта, предпочтительно на 1 см². Однократная доза может альтернативно содержаться в шприце.

Однократная доза клеток по настоящему изобретению может находиться в контакте с определенным в настоящем документе жидким носителем. В этом случае тогда мезенхимальные стволовые клетки отделяют от носителя перед введением. Например, клетки могут быть центрифугированы и выделены перед введением субъекту. Носитель может содержать или представлять собой любой описанный в настоящем документе носитель, такой как HypoThermosol™ или Hypothermosol™-FRS.

Однократная доза по настоящему изобретению может содержать МСК пуповины. Как описано выше, МСК пуповины может быть (получен) из любого компартмента ткани пуповины, который содержит МСК. Таким образом, однократная доза может содержать МСК амниона, периваскулярные МСК, МСК вартонова студня, МСК амниотической мембраны пуповины. МСК амниотической мембраны пуповины могут быть четко определенными и гомогенными. Таким образом, в одном из воплощений по настоящему изобретению используют однократную дозу, которая может содержать МСК, как описано в международной патентной заявке WO 2018/067071. Таким образом, в типичных примерах способа однократная доза может содержать МСК, демонстрирующие по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более МСК, экспрессирующих каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD105. Кроме того, однократная доза может содержать МСК, демонстрирующие по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более МСК, не экспрессирующих следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA-DR. В конкретных примерах однократная доза содержит приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более или приблизительно 99% или более МСК, экспрессирующих CD73, CD90 и CD105, но не экспрессирующих CD34, CD45 и HLA-DR. В дополнительных примерах по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток МСК экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105, тогда как по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более МСК могут не экспрессировать CD34, CD45 и HLA-DR. В конкретных примерах приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, или приблизительно 99% или более МСК экспрессируют CD73, CD90 и CD 105, но не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR.

Способ лечения и однократная доза по настоящему изобретению может включать использование жизнеспособных клеток. В настоящем документе описано то, каким образом может быть тестирована жизнеспособность.

Изобретение будет дополнительно проиллюстрировано при помощи следующих не ограничивающих объем изобретения экспериментальных примеров.

Использованные в настоящем документе последовательности представлены в нижеприведенной таблице 1.

Экспериментальные примеры

1. Криокосервация ткани пуповины перед выделением мезенхимальных стволовых клеток

Ткань пуповины (пуповины получали при наличии информированного согласия от матери) обрабатывали для последующего выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины следующим образом.

1.1 Промывание образца ткани пуповины:

а. Скальпелем удаляют защитную пленку.

б. Надежно удерживают пуповину с помощью пинцета и пуповину нарезают на кусочки длиной 10 см с использованием скальпеля. Неиспользованную пуповину помещают обратно в исходные стаканчики для ткани.

в. Переносят кусочки пуповины длиной 10 см в новую 150 мм чашку для культивирования. 150 мм чашка для культивирования может быть использована вместо стаканчиков.

г.Используют крышку 150 мм чашки для культивирования в качестве места для хранения пинцета и скальпеля.

д. При помощи 30 мл шприца удаляют 25 мл Плазмалит A (Baxter, номер по каталогу 2B2543Q). Удерживают шприц под углом 45° с использованием одной руки и вносят Плазмалит А непосредственно на ткань пуповины.

е. Удерживают чашку для культивирования под небольшим углом для удаления Плазмалит А при помощи 30 мл шприца и тупоконечной иглы.

ж. Использованный Плазмалит А собирают в 300 мл контейнер для переноски, который служит в качестве контейнера для отходов и их утилизации в резервуар для биологически опасных отходов.

з. При необходимости процедуру промывания повторяют с использованием новой чашки для культивирования для каждого промывания. Убеждаются в том, что все сгустки крови с поверхности удалены. При необходимости для очистки ткани может быть использовано дополнительное количество Плазмалит А.

и. Помещают ткань в новую маркированную чашку для культивирования ткани для того, чтобы продолжить нарезку ткани. Помещают 20 мл Плазмалит А в чашку для того, чтобы ткань не высохла во время ее разрезания.

к. Пуповину нарезают на равные срезы толщиной приблизительно 1 см, в общей сложности получая в результате 10 срезов.

л. Дополнительно разрезают каждый из срезов толщиной 1 см на меньше кусочки размерами приблизительно от 0,3 см×0,3 см до 0,5 см×0,5 см на срез.

м. Весь оставшийся Плазмалит А удаляют из чашки.

н. При помощи 30 мл шприца добавляют 25 мл Плазмалит А из исходного контейнера Плазмалит А и распределяют непосредственно по кусочкам ткани пуповины.

о. Удерживают культуральную чашку под углом для сбора с одной стороны всего Плазмалит А, использованного для промывания ткани, и удаления его посредством шприца и тупоконечной иглы.

п. Промывание повторяют еще раз. Не должно остаться никаких сгустков.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если пуповина не будет замораживаться сразу, то ткань пуповины следует держать в Плазмалит А до ее готовности к замораживанию.

1.2 Криоконсервация ткани пуповины:

а. Готовят раствор для криоконсервации:

1. Готовят 50 мл раствора для замораживания, состоящего из 60% Плазмалит А, 30% 5%-го человеческого сывороточного альбумина, и 10% диметилсульфоксида (DMSO).

2. Маркируют 150 мл контейнер для переноса надписью "Раствор для замораживания ткани" и с использованием асептической техники присоединяют аксессуары для переноса плазмы крови к порту.

3. Удаляют 30 мл Плазмалит А при помощи 30 мл шприца из исходного контейнера Плазмалит А и переносят его в контейнер для переноса, маркированный "раствор для замораживания ткани" с временем и датой приготовления раствора.

4. Удаляют 15 мл 5% человеческого сывороточного альбумина при помощи 20 мл шприца и его переносят в маркированный контейнер для переноса.

5. В контейнер для переноса добавляют 5 мл DMSO.

б. Хорошо перемешивают и протоколируют смешивание раствора для замораживания.

6. Плазмалит А удаляют из ткани до добавления раствора для замораживания.

в. Посредством 60 мл шприца забирают все 50 мл раствора для замораживания в шприц, и приблизительно 30 мл раствора для замораживания добавляют в 150 мм чашку для культур клеток, содержащую ткань пуповины. Тупоконечную иглу надевают на шприц для того, чтобы сохранить его стерильность.

г.Перемешивают содержимое чашки для культивирования, содержащей ткань и раствор для замораживания каждую минуту на протяжении 10 минут.

д. Посредством пинцета произвольным образом выбирают 8 срезов, и их помещают в каждый из четырех криофлаконов объемом 4 мл. Произвольным образом выбирают 4 среза и помещают их в один криофлакон объемом 1,8 мл. Эти срезы не должны содержать кровяные сгустки.

е. Заполняют каждый из криофлаконов, содержащих ткань пуповины, оставшимся раствором для замораживания до линии заполнения 3,6 мл для пробирок объемом 4 мл и линии 1,8 мл для 1,8 мл флакона Nunc.

ж. Маркируют флакон Bactec Lytic/10 - Anaerobic/F и один флакон Bactec Plus Aerobic/F идентификационным номером ткани (ID).

з. Посредством шприца и тупоконечной иглы удаляют 20 мл раствора для замораживания из чашки для культивирования, затем флакона Bactec протирают спиртовой салфеткой, заменяют тупоконечную иглу на иглу 18g и инокулируют аэробные и анаэробные флаконы Bactec 10 мл каждого раствора.

и. Запускают замораживатель с контролируемой скоростью замораживания.

к. После завершения замораживания с контролируемой скоростью кусочки помещают в замораживатель с жидким азотом с непрерывным контролем температуры для дальнейшего использования.

2. Выделение выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины

2.1. Приготовление сред для выделения МСК из ткани пуповины:

а. Для приготовления 500 мл РТТ6 (культуральная/ростовой среды) добавляют следующие компоненты в указанной последовательности:

1. DMEM, 250 мл

2. М171 118 мл

3. DMEMF12 118 мл

4. FBS 12,5 мл (конечная концентрация 2,5%)

5. EGF 1 мл (конечная концентрация 10 нг/мл)

б. Инсулин 0,175 мл (конечная концентрация 5 мкг/мл)

Вышеупомянутые объемы компонентов 1-6 приводят в результате к конечному объему 499,675 мл культуральной среды. Если никакие другие компоненты не добавляют в культуральную среду, тогда оставшиеся 0,325 мл (добавляемые до объема 500 мл) могут, например, представлять собой любые из компонентов 1 - 4, то есть DMEM, М171, DMEM/F12 или FBS. Альтернативно, концентрация концентрированного раствора EGF или инсулина безусловно может быть скорректирована таким образом, чтобы общий объем культуральной среды составлял 500 мл. Альтернативно, может быть добавлен концентрированный раствор антибиотика, такого как пенициллин-стрептомицин-амфотерицин, что приведет в результате к конечному объему 500 мл. Также возможно добавлять в культуральную среду объем 0,325 мл одной или более чем одной из следующих добавок: аденин, гидрокортизон, натриевая соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3), таким образом, достигая общего объема 500 мл культуральной среды.

7. Флакон маркируют "РТТ6" с датой приготовления сред, инициалами оператора и фразой "годен до" с последующим указанием срока годности. Срок годности представляет собой самый короткий срок годности любого из компонентов или 1 месяц с даты приготовления, в зависимости от того, что наступит первым.

б. Для приготовления сред для промывания (буферный солевой раствор Хэнкса (HBSS) без кальция или магния и с 5% FBS) добавляют 2,5 мл FBS к 47,5 мл HBSS в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Пробирку маркируют "Среды для промывания" с инициалами оператора и датой приготовления сред.

в. Все среды тестируют в отношении стерильности с использованием Bactec Lytic/10 - Anaerobic/F (Becton Dickinson & Company) и Bactec Pluc+Aerobic/F (Becton Dickinson & Company). В каждый флакон инжектируют по 20 мл приготовленных сред.

2.2 Размораживание ткани пуповины для отбора МСК:

а. Как только оператор готов к обработке образца в чистой комнате, инициируют размораживание. Не следует размораживать более чем 1 флакон одновременно в том случае, если только флакон не содержат материал, полученный у одного и того же донора.

б. Протирают водяную баню дезинфектором, а затем 70% изопропанолом и заполняют 1 л стерильной воды. Водяную баню нагревают до 36-38°С.

в. В чистой комнате готовят 10 мл промывающей среды, состоящей из 70% - 90% Плазмалит А внутри бокса биологической безопасности. Раствор подвергают стерильному фильтрованию через шприцевой фильтр 0,2 мкм, присоединенный к 10 мл шприцу, и раствор хранят замороженным до применения.

г.На коническую пробирку объемом 50 мл наносят маркировку, соответствующую процессу обработки.

д. Убеждаются в том, что температура водяной бани составляет 36-38°С.

е. Извлекают флакон(ы) с тканью из хранилища в жидком азоте и быстро размораживают в водяной бане при 37°С, заполненной 1 л стерильной воды. Держатель для флаконов для контейнера для замораживания Mr. Frosty Nalgene Cryo 1°C плавает с флаконами в одном месте и может быть использован в качестве плавающего штатива при размораживании образцов.

ж. Извлекают флакон из водяной бани и опрыскивают ее 70% раствором изопропанола. Правильный момент времени для ивлечения флакона из водяной бани наступает тогда, когда небольшие кристаллики льда можно видеть плавающими во флаконе, что свидетельствует о внутренней температуре флакона меньше 37°С.

з. Флакон передают через передаточное окно и вызывают специалиста для обработки в чистом помещении.

2.3 Приготовление ткани для обработки:

а. Обработка ткани пуповины должна осуществляться в чистой комнате с контролем окружающей среды (ЕМ):. В конце каждого шага осуществляют полную очистку помещения и вытяжки.

б. Готовят/очищают бокс биологической безопасности.

в. Подсчет жизнеспособных частиц осуществляют при работе в боксе биологической безопасности.

г. Все необходимые расходные материалы собирают в бокс биологической безопасности, проверяя каждый из них в отношении целостности упаковки и сроков годности. При работе с дозаторами, серологическими пипетками, стерильными пинцетами, скальпелями, тканевыми планшетами и иглами необходимо избегать прикосновения к любой поверхности, которую приводят в контакт со стерильным продуктом. Безопасно можно только касаться внешней части цилиндра шприца, пробирок, наконечника плунжера и/или колпачка или кожуха иглы. Расходный материал необходимо утилизировать в том случае, если до поверхности дотронулись или дотронулись до не стерильной поверхности.

д. Регистрируют номера партий и сроки годности (если они учитываются) всех используемых реагентов и расходных материалов.

е. Размороженный флакон очищают безворсовой салфеткой, увлажненной 70% спиртом перед переносом в бокс биологической безопасности.

ж. Посредством аспирационной иглы со шприцом извлекают всю жидкость из флакона. Избегают засасывания ткани.

з. Посредством стерильного пинцета переносят ткань в 100 мм стерильную чашку

Петри.

и. К фрагментам ткани добавляют 5 мл промывающей среды.

к. Перемешивают содержимое в течение 15-30 секунд, затем промывающую среду отбирают пипеткой или шприцом с аспирационной иглой. Этот процесс промывания повторяют дважды.

л. К ткани добавляют 2 мл промывающей среды для того, чтобы избежать высушивания ткани.

2.4. Инициирование разрастания МСК из ткани:

а. Маркируют дно 6-луночного планшета "Разрастание 1" с номером партии МСК или идентификационным номером пуповинной ткани и датой инициирования разрастания. Если используют 60 мм чашку для культивирования ткани, тогда разделяют чашку на 4 квадранта путем нанесения сетки на дно чашки.

б. Посредством стерильного одноразового пинцета помещают один кусочек ткани размером от 3×3 мм до 5×5 мм в каждую лунку. Если используют 60 мм чашку для культивирования ткани, тогда помещают ткань в центр каждого квадранта для пространственного разделения тканей (более чем 1 см друг от друга).

в. Каждую лунку заполняют 3 мл РТТ6.

г. Посредством аспирационной иглы, надетой на 30 мл шприц, извлекают среду в количестве, достаточном для того, чтобы едва покрыть ткань. Не наклоняйте планшет.Не касайтесь дна лунки аспирационной иглой.

д. С помощью инвертированного светового микроскопа ежесуточно наблюдают за разрастанием клеток (24±6 часов). Система визуализации клеточной культуры в реальном времени может быть использована вместо светового микроскопа.

е. Среды меняют ежесуточно. До применения обеспечьте уравновешивание сред до комнатной температуры.

1. Среду отбирают.

2. Добавляют 3 мл РТТ6.

3. Отбирают до тех пор, пока ткань не будет едва погружена в среду.

ж. Когда обнаруживают разрастание клеток из ткани, тогда ткань переносят в новый 6-луночный планшет с использованием той же самой процедуры, как описано в 4.а - 4.д выше, за исключением того, что чашку маркируют "Разрастание 2". Разрастание клеток в планшете "Разрастание 1" поддерживают путем добавления в каждую лунку по 2 мл РТТ6. За конфлюэнтностью наблюдают ежесуточно. Среды заменяют каждые 2-3 суток (необходимо убедиться в уравновешивании сред до комнатной температуры перед использованием).

з. Когда разрастание клеток обнаруживают в планшете "Разрастание 2", тогда повторяют стадии 4.а - 4.д за исключением того, что планшет маркируют "Разрастание 3." Разрастание клеток в планшете "Разрастание 2" поддерживают путем добавления в каждую лунку по 2 мл РТТ6. За конфлюэнтностью наблюдают ежесуточно. Среды заменяют каждые 2-3 суток (необходимо убедиться в уравновешивании сред до комнатной температуры перед использованием).

и. Когда обнаруживают разрастание в планшете "Разрастание 3", тогда ткань удаляют.Если ткани очень малы, и, по видимому, не влияют на клеточный рост, тогда ткань удаляют при субкультивировании.

к. Когда клетки достигают 40-50% конфлюэнтности, тогда за клетками наблюдают каждые сутки для предупреждения чрезмерного разрастания.

л. Когда клетки достигают 70-80% конфлюэнтности, тогда клетки субкультивируют. Клеткам не дают возможности разрастаться до конфлюэнтности больше 80%.

Когда размер тканевых эксплантатов составляет приблизительно 1-3 мм, и культивирование тканевого эксплантата/культуры клеток осуществляют в 175 мм культуральных квадратных чашках, тогда среднее количество мезенхимальных стволовых клеток, собираемых с эксплантата, как правило, составляет приблизительно 4000 - 6000 клеток/эксплантат.Соответственно, когда мезенхимальные стволовые клетки одновременно выращивают в 48 эксплантатах, тогда приблизительно 300000 клеток могут быть получены во время сбора. Эти 300000 мезенхимальных стволовых клеток, собранные с эксплантатов, затем могут быть использованы для субкультивирования путем высевания в 175 см² флакон для клеточной культуры этих 300000 клеток, как описано в следующем примере 2.5 (это можно назвать пассажем 1). Мезенхимальные стволовые клетки, полученные после этого пассажа 1, затем могут быть использованы для повторного засевания 175 см² флаконов (пассаж 2) и размножения клеток, как описано в следующем примере 2.5. Клетки, полученные после пассажа 1 и пассажа 2, могут быть "банкированы" путем криоконсервации, причем мезенхимальные стволовые клетки, полученные после пассажа 2, рассматриваются как составляющие главный банк клеток, который предназначен для дальнейшего наращивания мезенхимальных стволовых клеток, например, в биореакторе, как объясняется ниже в примере 2.7.

2.5. Субкультивирование МСК в чашках для культур клеток

а. С жизнеспособными частицами работают в боксе биологической безопасности. Все среды уравновешивают перед применением до комнатной температуры.

б. Когда разрастание клеток достигает приблизительно 70-80% конфлюэнтности, тогда клетки субкультивируют.

1. Удаляют РТТ6 из чашки Петри.

2. Промывают HBSS без кальция или магния.

3. Добавляют 0,2 мл IX TrypLE-EDTA и перемешивают в течение 1-2 минут.

4. Наклоняют чашку на 30-45° для того, чтобы дать возможность клеткам сползти вниз за счет силы тяжести. Осторожное постукивание по стороне планшета ускоряет отделение клеток.

5. Добавляют 1 мл РТТ6. Клетки осторожно засасывают/выталкивают из наконечника пипетки, затем их переносят в центрифужную пробирку объемом 15 мл.

Для каждой лунки используют чистый наконечник на пипеточный дозатор. Клетки со всех 6 лунок могут быть объединены в одной пробирке объемом 15 мл.

6. Центрифугируют в течение 10 минут при 1200 об./мин.

7. Супернатант удаляют и клетки ресуспендируют с 5 мл РТТ6. в. Субкультивирование МСК

1. Аликвотируют 50 мкл клеточной суспензии и измеряют TNC и жизнеспособность при помощи анализа с исключением трипанового синего.

2. Клетки подсчитывают с использованием гемоцитометра. Ожидают количество 20-100 клеток/квадрант.Если количество превышает 100, разбавляют исходный образец 1:5 и повторяют способ с трипановым синим с использованием гемоцитометра.

3. Рассчитывают жизнеспособность клеток/мл и общую жизнеспособность клеток:

1. Жизнеспособные клетки/мл=количество жизнеспособных клеток×фактор разведения×10⁴

2. Общее количество жизнеспособных клеток=количество жизнеспособных клеток×фактор разведения×общий объем×10⁴

4. Рассчитывают % жизнеспособности:

1.% жизнеспособности = количество жизнеспособных клеток×100 /(количество жизнеспособных клеток + количество мертвых клеток)

5. Клеточную суспензию разбавляют до 1,0×10⁶ клеток/мл:

1. "X" объем = общее количество жизнеспособных клеток/10⁶ клеток/мл

2. Например, если общее количество жизнеспособных клеток составляет 1,0×10⁷;

3. "X"=10⁷/10⁶ клеток/мл или 10 мл, таким образом, таким образом, возможно довести общий объем клеток до 10 мл путем добавления в клеточную суспензию 5 мл (то же самое для 5 мл).

6. Если клеточная суспензия меньше, чем 10⁶/мл, тогда определяют объем, требующийся для высевания 2×10⁶ клеток для каждой 150 мм чашки Петри или 175 см² флакона.

1. Объем для 2×10^б клеток=2×10⁶ клеток количество жизнеспособных клеток/мл

2. Например, если количество жизнеспособных клеток/мл составляет 8×10⁵ клеток/мл, тогда необходимо 2×10⁶ клеток+8×10⁵ клеток/мл или 2,5 мл.

7. Оставляют 0,5 мл для анализа маркеров МСК.

8. Высевают 2×10⁶ клеток в каждую 150 мм чашку Петри или 175 см² флакон с 30 мл РТТ6.

9. Каждые трое суток наблюдают за присоединением клеток, образованием колоний и конфлюэнтностью. Когда клетки достигают 40-50% конфлюэнтности, тогда за клетками наблюдают каждые один-двое суток для предупреждения чрезмерного роста. НЕЛЬЗЯ давать клеткам возможности разрастаться до конфлюэнтности больше 80%. Вместо светового микроскопа может быть использована система контроля за культивированием клеток в режиме реального времени.

10. Среды меняют каждые 2-3 суток.

2.6 Криоконсервация клеток МСК

а. С жизнеспособными частицами работают в боксе биологической безопасности. Все среды уравновешивают перед применением до комнатной температуры.

б. Когда клетки достигают 70-80% конфлюэнтности, тогда клетки отделяют с использованием 2 мл IX TrypLE-EDTA для каждой 150 мм чашки Петри или 175 см² флакона.

1. РТТ6 удаляют из чашки Петри.

2. Промывают 5 мл HBSS или PBS без кальция или магния.

3. Добавляют 2 мл IX TrypLE-EDTA и перемешивают в течение 1-2 минут.

4. Наклоняют чашку на 30-45° для того, чтобы дать возможность клеткам сползти вниз за счет силы тяжести. Осторожное постукивание по стороне планшета ускоряет отделение клеток

5. Добавляют 10 мл РТТ6 для инактивации TrypLE. Хорошо перемешивают для диссоциации клеточных сгустков.

6. Клетки переносят в центрифужную пробирку объемом 15 мл посредством пипетки Пастера.

7. Центрифугируют в течение 10 минут при 1200 об./мин.

8. Среду отбирают и клетки ре суспендируют в 10 мл РТТ6.

9. Отбирают аликвоту 50 мкл и определяют общее количество жизнеспособных клеток и % жизнеспособности как указано выше. Подсчет клеток необходимо производить в течение 15 минут, поскольку клетки могут начать образовывать агломераты.

в. Приготовление клеток для криоконсервации

1. Готовят среды для клеточной суспензии и среды для криоконсервации и замораживания клеток.

2.7. Субкультивирование (размножение) МСК в биореакторе Quantum (Terumo ВТС, Inc.)

Также возможно использовать биореактор Quantum для размножения МСК. Исходное количество клеток для культивирования в биореакторе Quantum должно находиться в диапазоне от 20 до 30 миллионов клеток на запуск. Типичный выход на запуск составляет от 300 до 700 миллионов МСК после сбора. Биореактор функционирует в соответствии с протоколом производителя. Полученные таким образом мезенхимальные стволовые клетки обычно подвергают криоконсервации (см. ниже) и они служат в качестве рабочего банка клеток.

Материалы/ реактивы:

1. Набор для расширения Quantum

2. Контейнер для отходов Quantum

3. Контейнер для сред Quantum

4. Входной контейнер Quantum

5. РТТ6

6. PBS

7. Фибронектин

8. TrypLE

9. 3 мл шприц

10. Полоски для определения уровня глюкозы

11. Полоски для определения уровня лактата

12. 60 мл планшет для культур клеток или эквивалент

13. Газовая смесь 5% CO₂ для медицинского применения

14. 50 мл наконечники Combi-tip Оборудование:

1. Бокс биологической безопасности

2. Глюкометр (Bayer Healthcare/Ascensia Contour Blood Glucose Meter)

3. Лактат плюс (Nova Biomedical)

4. Перистальтический насос с блоком для трубок

5. Центрифуга Eppendorf 5810

6. Стерильный трубчатый соединитель

7. Шаговый пипеточный дозатор М4

8. Запаиватель RF

Процедура:

1. Подготовка биореактора Quantum

а) Инициируют биореактор Quantum

б) Закрывают биореактор:

1) В боксе биологической безопасности готовят раствор фибронектина.

1) Дают лиофилизированному фибронектину возможность дойти до комнатной температуры (≥15 мин при комнатной температуре)

2) Добавляют 5 мл стерильной дистиллированной воды; не перемешивают и не встряхивают

3) Дают фибронектину возможность перейти в фазу раствора в течение 30 мин.

4) С использованием 10 мл шприца, на который надета игла 18g, переносят раствор фибронектина во входной контейнер для клеток, содержащий 95 мл PBS.

2) Контейнер присоединяют к линии для "реактива"

3) Проверяют на наличие пузырьков (пузырьки могут быть удалены с использованием "Remove 1С Air" или "Remove ЕС Air" и с использованием "Промывания" в качестве входного источника.

4) Открывают или устанавливают программу для закрытия биореактора (фиг. 1. стадии 3-5).

5) Запускают программу

6) Во время работы программы для закрывания биореактора, готовят контейнер для среды с 4 л среды РТТ6.

7) Присоединяют контейнер для среды к линии 1С Media посредством стерильного трубчатого соединителя.

8) Когда стадии закрывания биореактора завершены, тогда отсоединяют входной контейнер для клеток, использованный для раствора фибронектина с использованием запаивателя RF.

а) Отмывают избыток фибронектина

б) Кондиционируют биореактор со средами

2. Культивирование клеток в биореакторе Quantum

а) Загрузка и прикрепление клеток с однородной суспензией:

б) Заполнение и культивирование клеток

1) Выбирают скорость потока среды для загрузки клеток.

2) Каждые сутки отбирают пробы на анализ лактата и глюкозы.

3) Корректируют скорость потока среды по мере увеличения уровней лактата. Реальная максимально допустимая концентрация лактата будет определяться флаконом с культурой, из которой происходят клетки. Определяют то, находится ли в контейнере для среды подходящая среда РТТ6. При необходимости, контейнер со средой РТТ6 заменяют на контейнер со свежей средой РТТ6.

4) Когда скорость потока достигает желаемой величины, уровень лактата измеряют каждые 8-12 часов. Если уровень лактата не уменьшается или если уровень лактата продолжает увеличиваться, клетки собирают.

3. Сбор клеток из биоректора Quantum

а) Когда концентрация лактата не уменьшается, тогда клетки собирают после последнего отбора пробы для анализа лактата и глюкозы.

б) Сбор клеток:

1) Присоединяют входной контейнер для клеток, заполненный 100 мл TrypLE, в линии для "реактива" посредством стерильного трубчатого соединителя.

2) Подтверждают то, что в контейнере для PBS находится достаточное количество PBS. Если количество недостаточно, то присоединяют новый контейнер с по меньшей мере 1,7 литрами PBS к линии "Промывка" посредством стерильного трубчатого соединителя.

3) Запускают программу сбора.

4. Криоконсервация клеток

1) После сбора клеток их переносят в 50 мл центрифужную пробирку для осаждения клеток.

2) Ресуспендируют с использованием 25 мл охлажденного раствора для суспендирования клеток. Клеток подсчитывают с использованием счетчика клеток Sysmex или Biorad. Отчет о подсчете клеток прикрепляют к соответствующему отчету о партии Quantum Processing Batch.

3) Доводят концентрацию клеток до 2×10⁷/мл

4) Добавляют равный объем раствора для криоконсервации и хорошо перемешивают (не встряхивают и не перемешивают на вортексе)

5) Посредством шагового пипеточного дозатора добавляют 1 мл клеточной суспензии в криоконсерванте в каждый флакон объемом 1,8 мл. Подвергают криоконсерванции с использованием программы CRF, как описано в SOP D6.100 СВ Cryopreservation с использованием замораживатель с контролируемой скоростью.

6) Флаконы хранят в определенном пространстве для хранения в жидком азоте.

7) Отчет программы CRF прикрепляют к форме соответствующего отчета о партии МСК P3-Quantum Processing Batch Record.

3. Анализ экспрессии маркеров стволовых клеток в популяциях выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток выделенных из ткани пуповины, с использованием различных культуральных сред

Эксперименты с использованием проточной цитометрии осуществляют для анализа мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из пуповины, для экспрессии маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105.

Для этих экспериментов мезенхимальные стволовые клетки выделяли из ткани пуповины путем культивирования ткани пуповины в трех различных средах для культивирования с последующим пассированием мезенхимальных стволовых клеток в соответствующих средах, как представлено в примере 2.

Три следующие культуральные среды использовали в этих экспериментах: а) 90% (об./об./ DMEM, дополненной 10% FBS (об./об.), б) культуральная среда РТТ-4, описанная в заявке на патент США 2008/0248005 и соответствующей международной патентной заявке WO 2007/046775, которая состоит из 90% (об./об.) CMRL1066, и 10% (об./об.) FBS (см. абзац [0183] WO 2007/046775), и в) культуральная среда по настоящему изобретению РТТ-6, состав которой описан в настоящем документе. В этом анализе путем проточной цитометрии два отличающихся образца популяции мезенхимальных стволовых клеток, выстилающих пуповину (CLMC), анализировали в отношении каждой из трех используемых культуральных сред.

Следующий протокол использовали для анализа путем проточной цитометрии.

Материалы и методы

Способ

а) Клетки, выделенные и выращиваемые из выстилающей мембраны пуповины

1. Образцы тканевых эксплантатов инкубировали в планшете для культур клеток и погружали в соответствующие среды, затем оставляли в инкубаторе СО2 при 37°С, как объясняется в примере 2.

2. Среду меняли каждые 3 суток.

3. Разрастание клеток из эксплантов культуры ткани контролировали путем световой микроскопии.

4. При конфлюэнтности приблизительно 70% клетки отделяли от чашки путем трипсинизации (0,0125% трипсин/0,05% EDTA) и использовали в экспериментах по проточной цитометрии.

б) Трипсинизация клеток для экспериментов

1. Удаляют среду из планшета для культуры клеток

2. Осторожно промывают стерильным IX PBS для удаления следов FBS, поскольку FBS влияет на ферментативное действие трипсина.

3. IX Трипсин добавляют в планшет для культуры клеток и инкубируют в течение 3-5 мин при 37°С.

4. Клетки наблюдают под микроскопом для того, чтобы убедиться, что они отделены. Трипсин нейтрализуют путем добавления полных сред, содержащих FBS (DMEM с 10% FBS).

5. Используют пипетку для разрушения клеточных сгустков путем пипетирования клеток в средах на стенку планшета. Клеточную суспензию собирают и переносят в центрифужные пробирки объемом 50 мл.

6. В планшет добавляют стерильный IX PBS и его промывают, клеточную суспензию собирают в ту же самую центрифужную пробирку.

7. Пробирку центрифугируют при 1800 об./мин в течение 10 минут.

8. Супернатант удаляют и клеточный осадок ресуспендируют средой РВА.

в) Подсчет клеток

1. Убеждаются, что гемоцитометр и его покровное стекло являются чистыми и сухими, предпочтительно путем их промывания 70% этанолом, и оставляют их сушиться перед их протиранием салфетками Kim (безворсовой бумагой).

2. Аликвотируют небольшое количество клеток в суспензии в микроцентрифужную пробирку и удаляют из бокса биологической безопасности.

3. Клетки окрашивают в суспензии равным объемом трипанового синего, например, для 500 мкл суспензии добавляют 500 мкл трипанового синего (фактор разведения = 2Х, что приводит к 0,2% раствору трипанового синего).

4. Избегают воздействия на клетки трипанового синего в течение больше чем 30 мин, поскольку трипановый синий является токсичным и приводит к увеличению количества нежизнеспособных клеток и ошибке в подсчете клеток.

5. В каждую камеру гемоцитометра добавляют по 20 мкл смеси клеточной суспензии и смотрят под световым микроскопом.

а. Количество жизнеспособных клеток подсчитывают (светящиеся клетки; нежизнеспособные клетки легко захватывают трипановый синий и поэтому являются темными) в каждом квадранте гемоцитометра в общей сложности для 8 квадрантов в верхней и нижней камере.

Общее количество клеток приведено как (среднее количество клеток/квадрант)×10⁴ клеток/мл.

г) Окрашивание клеток

1. Приготовление перед окрашиванием клеток

- Клеточную суспензию аликвотируют в 3 пробирки (CD73, CD90, CD105) в двух параллелях и в 2 пробирки (отрицательный контроль), каждая из которых содержит 50000 клеток.

2._Окрашивание первичным антителом (АЬ)

- Добавляют 1 мкл [0,5 мг/мл АЬ] первичного антитела к 100 мкл клеточной суспензии. Инкубируют при 4°С в течение 45 мин.

- Доводят до 1 мл при помощи РВА.

- Центрифугируют при 8000 об./мин при 4°С в течение 5 минут.

- Супер натант удаляют.

- Добавляют 1 мл РВА и осадок ресуспендируют.

- Центрифугируют при 8000 об./мин при 4°С в течение 5 минут.

- Супер натант удаляют.

- Ресуспендируют в 100 мкл РВА.

3._Окрашивание вторичным Ab - в темноте

- Добавляют 1 мкл [0,5 мг/мл ab] вторичного антитела к 100 мкл клеточной суспензии. Инкубируют при 4°С в течение 30 мин.

- Доводят до 1 мл при помощи РВА.

- Центрифугируют при 8000 об./мин при 4°С в течение 5 минут.

- Супер натант удаляют.

- Добавляют 1 мл РВА и осадок ресуспендируют.

- Центрифугируют при 8000 об./мин при 4°С в течение 5 минут.

- Супер натант удаляют.

- Ресуспендируют в 200-300 мкл РВА для анализа путем проточной цитометрии.

- Клетки переносят в пробирку FACS для анализа путем проточной цитометрии BD FACS CANDO.

Результаты анализов при помощи проточной цитометрии представлены на фиг. 6а-фиг. 6 с. На фиг. 6а показана процентная доля выделенных выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток экспрессирующих маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105, после выделения из ткани пуповины и культивирования в DMEM/10% FBS. На фиг. 6b показана процентная доля выделенных выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток экспрессирующих маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105, после выделения из ткани пуповины и культивирования в РТТ-4, и на фиг. 6 с показана процентная доля выделенных выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток экспрессирующих маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105, после выделения из ткани пуповины и культивирования в РТТ-6. Как можно видеть на фиг. 6а, популяция клеток, выделенных с использованием DMEM/10% FBS в качестве культуральной среды для культивирования, имеет приблизительно 75% клеток CD73+, 78% клеток CD90+и 80% клеток CD 105+(усредненное значение для двух экспериментов), тогда как после выделения/культивирования ткани пуповины с использованием культуральной среды РТТ-4 (см. фиг. 6b) количество мезенхимальных стволовых клеток, которые являются CD73-положительными, СО90-положительными и СО105-положительными, составляет, приблизительно 87% (клетки CD73+), 93% (клетки CD90+) и 86% (клетки CD105+) в среднем из двух экспериментов. Чистота популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую получают путем культивирования в среде РТТ-6 по настоящему изобретению, составляет по меньшей мере 99,0% в отношении всех трех маркеров (CD73, CD90, CD 105), что означает то, что чистота этой популяции клеток значительную выше, чем при культивировании с использованием среды РТТ-4 или DMEM/10% FBS. Дополнительно и что даже более важно то, что популяция мезенхимальных стволовых клеток, которую получают путем культивирования в РТТ-6, является по существу на 100% чистой и определенной популяцией стволовых клеток. Это приводит к тому, что популяция стволовых клеток по настоящему изобретению представляет собой идеальный кандидат для методов терапии на основе стволовых клеток. Таким образом, эта популяция выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток может представлять собой золотой стандарт для таких терапевтических подходов, основанных на стволовых клетках.

Экспериментальные данные, показанные на фиг. 6, дополнительно подтверждались результатами анализа путем проточной цитометрии, которые представлены на фиг. 7а и фиг. 7b. На фиг. 7а показана процентная доля выделенных выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток (мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины), которые экспрессируют маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105, и не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR, после выделения из ткани пуповины и культивирования в среде РТТ-6. Как показано на фиг. 7а, популяция мезенхимальных стволовых клеток содержит 97,5% жизнеспособных клеток, которые на 100% экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD 105 (см. стрелки "CD73+CD90+" и "CD73+CD105+"), тогда как 99,2% популяции стволовых клеток не экспрессируют CD45, и 100% популяции стволовых клеток не экспрессируют CD34 и HLA-DR (см. стрелки "CD34-CD45- и "CD34-HLA-DR-). Таким образом, популяция мезенхимальных стволовых клеток, которую получают при помощи культивирования в среде РТТ-6, по-существу на 100% является чистой и определенной популяцией стволовых клеток, которая удовлетворяет критериям, которым должны удовлетворять мезенхимальные стволовые клетки, используемые для клеточной терапии (95% или более популяции стволовых клеток экспрессируют CD73, CD90 и CD 105, тогда как 98% или более популяции стволовых клеток не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR, см. Sensebe et al."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review", выше). В настоящем документе отмечено, что представленные в настоящем документе мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны адгезируют с пластиком в стандартных условиях культивирования и дифференцируются in vitro на остеобласты, адипоциты и хондробласты, см. патент США 9085755, патент США 8287854 или WO 2H007/046775, и, таким образом, удовлетворяют общепринятым критериям для применения мезенхимальных стволовых клеток в клеточной терапии.

На фиг. 7b показана процентная доля выделенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, которые экспрессируют CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR. Как показано на фиг. 7b, популяция мезенхимальных стволовых клеток костного мозга содержит 94,3% жизнеспособных клеток, которые на 100% экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD 105 (см. стрелки "CD73+CD90+" и "CD73+CD105+"), тогда как только 62,8% популяции стволовых клеток костного мозга не экспрессируют CD45 и 99,9% популяции стволовых клеток не экспрессируют CD34 и HLA-DR (см. стрелки "CD34-CD45- и "CD34-HLA-DR-). Таким образом, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, которые рассматривают как золотой стандарт мезенхимальных стволовых клеток, в значительной степени являются менее гомогенными/чистыми с точки зрения маркеров стволовых клеток, чем популяция мезенхимальных стволовых клеток (амниотической мембраны пуповины) в соответствии с настоящей заявкой на изобретение. Эти экспериментальные данные также демонстрируют то, что популяция стволовых клеток по настоящему изобретению может представлять собой идеальный кандидат для методов терапии на основе стволовых клеток, и может представлять собой золотой стандарт для терапевтических подходов, основанных на стволовых клетках.

4. Эксперименты, демонстрирующие то, что популяция мезенхимальных стволовых клеток в соответствии с изобретением может быть транспортирована/хранитья в HypoThermosol™:

Для анализа здоровья и жизнеспособности описанных в настоящем документе мезенхимальных стволовых клеток в различных носителях для хранения или транспортировки два различных носителя сравнивали друг с другом. А именно, носитель HypoThermosol™-FRS сравнивали с носителем Плазмалит-А. Оба имеется в продаже. Описание продукта HypoThermosol™ -FRS представлено на фиг. 30 и его состав описан в настоящем документе. Каждые 100 мл плазмалита содержат 526 мг хлорида натрия, USP (Фармакопея США) (NaCl); 502 мг глюконата натрия (C₆H₁₁NaO₇); 368 мг тригидрата ацетата натрия, USP (C₂H₃O₂⋅3Н₂О); 37 мг хлорида калия, USP (KCl); и 30 мг хлорида магния, USP (MgCl₂⋅6H₂O). Плазмалит не содержит антимикробные агенты. рН плазмалита корректируют при помощи гидроксида натрия до 7,4 (от 6,5 до 8,0).

Схема эксперимента сравнения представлена на фиг. 8. Сначала описанную в настоящем документе популяцию мезенхимальных стволовых клеток выращивали во флаконах для культур клеток. Количество живых мезенхимальных стволовых клеток подсчитывали, и затем 2 миллиона клеток/флакон хранили в течение различных периодов времени в Плазмалит-А или Hypothermosol™-FRS. После хранения клетки подсчитывали в образце ≤50 мкл ежедневно в течение суток 1-5 (общий извлекаемый объем жидкости 250 мкл) и проверяли в отношении жизнеспособности путем окрашивания клеток трипановым синим. Кроме того, на 1, 3 и 5 сутки образец ≤80 мкл отбирали и анализировали. Дополнительно, супернатант получали и замораживали. Затем PDGF-AA, PDGF-BB, VEGF, IL-10, Ang-1, HGF и TGFβ1 измеряли при помощи системы FLEXMAP 3D.

На фиг. 9 обобщены данные о жизнеспособности. Как можно видеть на левом графике, 73% от общего количества клеток (приблизительно 95%) с момента начала хранения все еще сохраняли жизнеспособность в течение 7 суток после хранения в HypoThermosol™. Напротив, после 7 суток хранение в Плазмалит-А только 42% от общего количества клеток (приблизительно 94%) с момента начала хранения все еще сохраняли жизнеспособность. Все подсчеты основаны на регистрировании в двух параллелях, которые находятся друг от друга в пределах 10% (в соответствии с SOP (стандартные операционные процедуры) CR D2.600.1). Во время подсчета клетки, которые хранили в HypoThermosol™, были отчетливо меньше с ровными и очерченными краями. Напротив, клетки в Плазмалит-А оказались разного размера. HypoThermosol™ заметно поддерживает целостность мембраны и предположительно выживание в течение недели (6 суток). Аналогичные результаты также представлены на графике с правой стороны.

На фиг. 10 показаны результаты, полученные при измерении диаметра клеток. Описанная в настоящем документе популяция мезенхимальных стволовых клеток при хранении в HypoThermosol™ обладала меньшим диапазоном диаметров по сравнению с клетками, которые хранили в Плазмалит-А. Сравнение сделано после 3 суток хранения.

На фиг. 11 показана концентрация TGF61 в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А после 48 часов хранения. Как можно видеть на графике на правой стороне, клетки секретируют приблизительно столько же TGFB1 при хранении в HypoThermosol™, а также при хранении в Плазмалит-А. В целом, с течением времени, количество секретируемого TGFB1 уменьшалось (график с правой стороны).

На фиг. 12 и 13 показаны контрольные эксперименты. В настоящем документе концентрации PDGF-BB и IL-10 измеряли в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А в течение 48 ч. Поскольку PDGF-BB или IL-10 в норме не секретируются описанной в настоящем документе популяцией мезенхимальных стволовых клеток, то ни PDGF-BB, ни IL-10 не обнаруживались ни в одном из образцов.

На фиг. 14 показана концентрация VEGF в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А в течение 48 ч. Как можно видеть на графике на правой стороне, клетки секретируют приблизительно столько же VEGF при хранении в HypoThermosol™, как и при хранении в Плазмалит-А на 0 сутки. На 1 и 5 сутки клетки секретировали больше VEGF при хранении в Плазмалит-А. Примечательно, что, когда клетки хранили в течение 3 суток, тогда они секретировали больше VEGF при хранении в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А. Таким образом, HypoThermosol™ превзошел Плазмалит-А на 3 сутки хранения. Чем больше VEGF обнаруживается, тем здоровее культура. Таким образом, за счет секретирования большего количества VEGF после 3 суток хранения в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А, клетки были более здоровыми в HypoThermosol™, чем в Плазмалит-А. С 5 суток хранения плазмалит, по-видимому, становятся более благоприятным носителем, поскольку в момент хранения клеток в Плазмалит-А, они секретировали больше VEGF. В целом, с течением времени количество секретируемого VEGF уменьшалось (график с правой стороны).

На фиг. 15 показана концентрация PDGF-AA в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А в течение 48 ч. Как можно видеть на графике на правой стороне, клетки секретируют приблизительно столько же PDGF-AA при хранении в HypoThermosol™, как при хранении в Плазмалит-А на 0 сутки. На 1 и 5 сутки клетки секретировали больше PDGF-AA при хранении в Плазмалит-А. Примечательно, что, когда клетки хранили в течение 3 суток, тогда они секретировали больше PDGF-AA при хранении в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А. Таким образом, клетки, которые хранили в HypoThermosol™, здоровее, чем клетки, которые хранили в Плазмалит-А после 3 суток хранения. С 5 суток хранения и далее плазмалит, по-видимому, представляет собой более благоприятный носитель, поскольку с этого момента времени клетки, которые хранили в Плазмалит-А, секретировали больше PDGF-AA. В целом, с течением времени количество секретируемого PDGF-AA уменьшалось (график с правой стороны).

На фиг. 16 показана концентрация Ang-1 в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которую хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А в течение 48 ч. Как можно видеть на графике на правой стороне, клетки секретируют приблизительно столько же Ang-1 при хранении в HypoThermosol™, как при хранении в Плазмалит-А на 0 и 3 сутки. На 5 сутки клетки секретировали больше Ang-1 при хранении в Плазмалит-А. Примечательно, что, когда клетки хранили в течение 1 суток, тогда они секретировали гораздо больше Ang-1 при хранении в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А. Таким образом, клетки, которые хранили в HypoThermosol™, выглядели более здоровыми чем при хранении в Плазмалит-А в течение по меньшей мере от 48 часов до 3 суток хранения. С 5 суток плазмалит, по-видимому, представлет собой более благоприятный носитель, поскольку с этого момента времени клетки, которые хранили в Плазмалит-А, секретировали больше Ang-1. В целом, с течением времени, количество секретируемого Ang-1 уменьшалось (график с правой стороны).

На фиг. 17 показана концентрация HGF в супернатанте описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток, которые хранили в HypoThermosol™ или Плазмалит-А после 48 часов хранения. Как можно видеть на графике на правой стороне, клетки секретируют приблизительно столько же HGF при хранении в HypoThermosol™, как при хранении в Плазмалит-А на 0 сутки. На 3 и 5 сутки клетки секретировали больше HGF при хранении в Плазмалит-А. Примечательно, что, когда клетки хранили в течение 1 суток, тогда они секретировали гораздо больше HGF при хранении в HypoThermosol™, чем при хранении в Плазмалит-А. Таким образом, клетки, которые хранили в HypoThermosol™, по-видимому, были более здоровыми, чем клетки, которые хранили в Плазмалит-А, с по меньшей мере 1 суток (48 часов) до 3 суток хранения. С 3 суток и далее Плазмалит-А, по-видимому, представляет собой более благоприятный носитель, поскольку в моменты времени 3 и 5 суток, клетки, которые хранили в Плазмалит-А, секретировали больше HGF. В целом, с течением времени количество секретируемого HGF уменьшалось (график с правой стороны).

В обобщение вышеприведенных данных можно сделать заключение о том, хранение популяции мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению в HypoThermosol™ превосходит хранение в Плазмалит-А, особенно в течение первых 3 суток хранения.

5. Эксперименты, демонстрирующие то, что популяция мезенхимальных стволовых клеток в соответствии с изобретением обладает свойствами заживления ран при местном лечении свиней:

Также проводили доклинические исследования с использованием 10-недельных самок свиней Йоркшир-Ландрас (50 кг). Обработки осуществляли в Экспериментальном медицинском центре в Сингапуре SingHealth Experimental Medicine Centre. У свиней вызывали диабет при помощи 120 мг/кг стрептозотоцина и оставляли восстанавливаться в течение 45 суток перед нанесением на их спины шести ран полной ширины 5 см×5 см (см. фиг. 18). Свиней (n=2) обрабатывали дважды в неделю описанной в настоящем документе популяцией 10⁵ человеческих мезенхимальных стволовых клеток на см² в течение 4 недель. Двух контрольных свиней обрабатывали PBS. Раны фотографировали на 0 сутки после операции (PODay 0) и каждые семь суток вплоть до 35 суток после операции. Раны анализировали в отношении площади поверхности при помощи ImageJ. На 35 сутки добавление описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток приводило к закрытию 10 из 12 диабетических ран (83%) по сравнению с только 3 из 12 (25%) контрольных ран, обработанных PBS. Скорость заживления ран составляла 0,8 см²/сутки при использовании описанной в настоящем документе популяцией мезенхимальных стволовых клеток по сравнению с 0,6 см²/сутки у контрольных животных, что представляет собой улучшение на 33%. Результаты этого исследования обобщена на фиг. 18.

Свиная модель не является спонтанной, поскольку архитектура кожи наиболее близко напоминает человеческую. Эти данные свидетельствуют о том, что популяция выстилающих пуповину мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению улучшает заживление ран без риска серьезных побочных эффектов. Таким образом, эти данные убедительно поддерживают гипотезу о том, что описанная в настоящем документе популяция выстилающих человеческую пуповину мезенхимальных стволовых клеток может способствовать заживлению хронических ран путем подавления воспаления и стимулирования ангиогенеза. Кроме того, очевидно отсутствуют признаки воспаления при применении ксеногенных мезенхимальных стволовых клеток у мышей или свиней, и, таким образом, вероятность того, что аллогенные мезенхимальные стволовые клетки будут вызывать какое-либо неблагоприятное побочное действие у людей, является очень низкой.

6. Эксперименты, демонстрирующие то, что описанные в настоящем документе мезенхимальные стволовые клетки эффективны при местном лечении людей:

Эксперименты, демонстрирующие то, что описанные в настоящем документе мезенхимальные стволовые клетки эффективны при местном лечении людей, описаны в WO 2007/046775. В частности, как объясняется в примерах 23-26 WO 2007/046775, мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины (UCMC) могут облегчать глубокие ожоги (пример 23), поверхностные раны (пример 24), незаживающие радиационные раны (пример 25) а также незаживающие диабетические раны и незаживающие диабетические раны стопы (пример 26). Отмечается, что в соответствии с примером 2 в WO 2007/046775 мезенхимальные стволовые клетки ресуспендировали в среде РТТ-4.

Отмечается то, что как представлено на фиг. 6b и 6 с, популяция стволовых клеток, которую получают при культивировании с использованием ростовой среды РТТ6 (как используется в настоящем документе) является значительно более гомогенной, чем популяция клеток, которую получают с использованием среды РТТ4 (использованной в WO 2007/046775). Поскольку РТТ-4 использовали в качестве среды для мезенхимальных стволовых клеток в примерах 23-26 в WO 2007/046775, очевидно, что даже более гомогенная популяция мезенхимальных стволовых клеток, выделенных после культивирования в РТТ-6 (как используется в настоящем документе), будет обладать теми же самыми благоприятными эффектами при применении для заживления ран, таких как глубокие ожоги, поверхностные раны, незаживающие радиационные раны, а также незаживающие диабетические раны и незаживающие диабетические раны стопы.

7. Эксперименты, демонстрирующие то, что описанные в настоящем документе мезенхимальные стволовые клетки эффективны при местном лечении людей:

Это исследование представляет собой запланированное исследование возрастающих доз популяции мезенхимальных стволовых клеток, полученной как описано в настоящем документе, проведенное в медицинском кампусе Аншютца Университета Колорадо (University of Colorado Anschutz Medical Campus) в Авроре, Колорадо. Цель этого исследования заключалась в определении безопасной дозы описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток (выстилающие человеческую пуповину мезенхимальные стволовые клетки). Это исследование представляло собой одноцентровое исследование с возрастающими дозами, в котором для каждого из трех уровней доз были задействованы пять субъектов, в общей сложности пятнадцать субъектов. Первая группа из 5 пациентов получала 100000 МСК/см² (площадь кожи/раны) дважды в неделю на протяжении 8 недель. Вторая группа из 5 пациентов получала 300000 МСК/см² дважды в неделю на протяжении 8 недель. Третья группа из 5 пациентов получала 500000 МСК/см² дважды в неделю на протяжении 8 недель. Эту схему продолжали до достижения самой высокой дозы или до тех пор, пока по меньшей мере у 2 субъектов при уровне дозы не возникала аллергическая реакция>2 уровня, которая, как предполагается, связана с полученной в настоящем документе популяцией мезенхимальных стволовых клеток, или у 2 или более чем двух субъектов при уровне дозы возникали неожиданные связанные с лечением серьезные неблагоприятные явления или дозолимитирующая токсичность в течение 14 суток после применения исходной дозы описанной в настоящем документе полученной популяции мезенхимальных стволовых клеток. Всех из этих пациентов оценивали через 30 суток после лечения в отношении продукции антител против HLA и в отношении затягивания раны. В настоящее время авторы изобретения рассматривают продукцию антител против HLA не как абсолютное противопоказание к конкретной дозе, а как фактор для общей оценки безопасности. Это исследование представляет собой исследование без контроля плацебо, в котором все субъекты принимали исследуемое лекарственное средство и весь исследовательский персонал знал дозу, которую получал каждый субъект. Вторичный ожидаемый результат этого исследования представляет собой значительное улучшение состояния раны. Этот результат основан на скорости затягивания раны, процентной доле успешного затягивания площади раны и процентной доле полностью затянувшихся ран, измеренных с использованием Silhouette Wound Measurement and Documentation System. Это устройство одобрено FDA для этой задачи.

Популяция субъектов. Пациенты, страдающие от сахарного диабета I или II типов с хроническими язвами стопы, которые не выздоравливали после по меньшей мере 30 суток обычной терапии и были отрицательными в отношении антител HLA к описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток. Пациенты продолжали получать обычное лечение раны в течение первых 2 недель, начиная с момента включения в лечение, после чего их исследовали в отношении наличия язвы, обусловленной синдромом диабетической стопы, которая не зажила в течение 30 суток. В этот момент начинали фотодокументирование и измерение параметров раны. Обычные замены повязки осуществляли два раза в неделю на протяжении первых 2 недель, после чего в отношении раны применяли описанную в настоящем документе популяцию мезенхимальных стволовых клеток в определенной концентрации два раза в неделю. Раны, которые лечили описанной в настоящем документе популяцией мезенхимальных стволовых клеток также закрывали при помощи Tegaderm^® и фиксирующего бинта.

Уровни доз. Целью этого исследования было определение безопасной дозы описанных в настоящем документе выстилающих человеческую пуповину мезенхимальных стволовых клеток для дальнейшего исследования. Пациентов лечили одной из трех доз: 100000 МСК/см² площадь кожи/раны, 300000 МСК/см² или 500000 МСК/см² дважды в неделю на протяжении 8 недель. Каждая доза в 100000 клеток представляет собой 0,1 мл описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток из флакона содержащего 1 миллион клеток/мл в HypoThermosol.

Режим дозирования. Это исследование представляло собой исследование безопасности и переносимости возрастающих доз описанных в настоящем документе мезенхимальных стволовых клеток. Цель этого исследования заключалась в определении безопасной дозы описанных в настоящем документе выстилающих человеческую пуповину мезенхимальных стволовых клеток для дальнейшего исследования. Для каждого из трех уровней доз были задействованы пять субъектов. Первая группа из 5 пациентов получала 100000 МСК/см² площадь кожи/раны дважды в неделю на протяжении 8 недель. Вторая группа из 5 пациентов получала 300000 МСК/см² дважды в неделю на протяжении 8 недель. Третья группа из 5 пациентов получала 500000 МСК/см² дважды в неделю на протяжении 8 недель. Эту схему продолжали до достижения самой высокой дозы или до тех пор, пока по меньшей мере у 2 субъектов при уровне дозы не возникала аллергическая реакция>2 уровня, которая, как предполагается, связана с описанной в настоящем документе популяцией мезенхимальных стволовых клеток, или у 2 или более чем двух субъектов при уровне дозы возникали неожиданные связанные с лечением серьезные неблагоприятные явления или дозолимитирующая токсичность в течение 30 суток после применения исходной дозы описанной в настоящем документе популяции мезенхимальных стволовых клеток. Всех из этих пациентов оценивали через 30 суток после лечения в отношении продукции антител против HLA и в отношении затягивания раны. В настоящее время авторы изобретения рассматривают продукцию антител против HLA не как абсолютное противопоказание к конкретной дозе, а как фактор для общей оценки безопасности. Это исследование представляет собой исследование без контроля плацебо, в котором все субъекты принимали исследуемое лекарственное средство и весь исследовательский персонал знал дозу, которую получал каждый субъект.

Путь введения. Описанную в настоящем документе популяцию мезенхимальных стволовых клеток наносят местно на очищенные язвы, обусловленные синдромом диабетической стопы, и удерживают на месте нанесения при помощи бинта Tegaderm^®.

Процедура введения дозы. После подходящего очищения при необходимости пациент располагается в лежачее положение на животе и пораженную ногу изгибают под углом 90°. Флакон с описанной в настоящем документе популяцией мезенхимальных стволовых клеток осторожно перемешивают для обеспечения равномерного распределения клеток. Поднятую стопу затем обрабатывают путем отбора от 100000 (0,1 мл) до 500000 (0,5 мл) клеток на см² из флакона посредством стерильного шприца и нанесения их в центр раны. Рану затем закрывают мембраной Tegaderm^® и осторожно массируют для однородного распределения клеток. Стопу поддерживают в поднятом положении в течение пяти минут для того, чтобы клетки осели и прикрепились. Стопу затем перематывают фиксирующим бинтом, покрывающим бинт Tegaderm^®.

8. Приготовление композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток (содержащей популяцию стволовых клеток, в которой более чем 99% клеток экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют CD34 и HLA-DR)

Подготовка к обработке после четвертого пассирования клеток (стадия 4 обработки):

Стадию 4 обработки как правило осуществляют в чистой комнате с контролем окружающей среды (ЕМ). Требуемые растворы и лабораторную посуду следует заблаговременно подготовить для применения.

Клетки переносят из криофлакона в маркированную 50 мл центрифужную пробирку.

Полную среду РТТ6 используют в течение 5 минут после извлечения из холодильника (регистрируют время извлечения сред РТТ6 из холодильника). К клеткам медленно добавляют 9 мл полной среды РТТ6 при осторожном перемешивании для облегчения смешивания.

Центрифугируют при 1200 об./мин при комнатной температуре (15-25°С) в течение 5 минут для осаждения клеток. Регистрируют использование центрифуги в Форме для периодического профилактического обслуживания центрифуги - CR и подтверждают рабочие параметры в соответствии с SOP Профилактическое обслуживание центрифуги.

Супернатант удаляют и клеток ресуспендируют в достаточно полной среде РТТ6 для подсчета.

Подсчет:

Для определения концентрации клеток (с трипановым синим или без него), осуществляют подсчет клеток с использованием ТС20. В большинстве случаев никакого разбавления образца не требуется, поскольку ТС20 работает с широким диапазоном концентраций клеток (от 5×10⁴ до 1×10⁷ клеток/мл).

Для определения жизнеспособности осуществляют подсчет с использованием гемоцитометра в соответствии с тем же самым SOP. Убедитесь в том, что в общей сложности подсчитано по меньшей мере 200 клеток.

Если желательно с использованием гемоцитометра определять как жизнеспособность, так и концентрацию клеток, тогда суспензия может быть разбавлена для того, чтобы соответствовать диапазону гемоцитометра (20-100 клеток на внешний квадрант). Если необходимо ресуспендировать примерно 10 миллионов размороженных клеток, тогда объем 6 мл должен обеспечивать этот диапазон. Терапевтическая культура (Р4):

Высевают 300000 живых клеток на 175 см² флакон объемом в 30 мл полной среды РТТ6 и инкубируют при 35-39°С с 4-6% СО₂. Необходимо убедиться в том, что профилактическое обслуживание инкубатора было произведено своевременно в соответствии с SOP Профилактическое обслуживание инкубатора и общее использование (Incubator Preventative Maintenance and General Use). Флаконы маркируют технологической меткой МСК PI - Р4.

Как только большинство клеток адгезирует (предпочтительно в течение ночи), осуществляют беглую проверку сентинельного флакона под инвертированным микроскопом Nikon, расположенным в чистой комнате для определения того, имеется ли площадь флакона, которая содержит заметно большую плотность клеток. Если это так, используют эту площадь для непрерывного мониторинга при помощи CytoSmart. Если засевают множество флаконов, то один флакон может быть использован в качестве типичного "сентинельного" флакона. В качестве возможности CytoSmart оповещение на электронную почту устанавливают при 60%, 70% и 80% конфлюэнтности для "сентинельного" флакона.

Среды меняют на 30 мл предварительно нагретой свежей полной РТТ6 на флакон каждые 2-3 суток и инкубацию продолжают.

Когда клеточное разрастание достигает 80%±10% конфлюэнтности, тогда МСК собирают следующим образом:

Каждый флакон ополаскивают 10 мл HBSS без Са²⁺ или Mg²⁺.

Добавляют по 5 мл IX TrypLE на флакон. Флакон наклоняют для покрытия всей поверхности и немедленно отбирают TrypLE путем того, что флакон наклоняют и удаляют большую часть TrypLE при помощи стерильной серологической пипетки, оставляя TrypLE в количестве, которое достаточно только для покрывания поверхности. Удаляют отобранный TrypLE.

Клеткам дают возможность отделяться (10-20 минут при 15-25°С). Наклоняют флакон на 30-45° для того, чтобы дать возможность клеткам сползти вниз за счет силы тяжести. Осторожное постукивание по стороне планшета ускоряет отделение клеток. Флакон контролируют под инвертированным микроскопом для обеспечения того, что все клетки отделились.

В первый флакон добавляют 5 мл HBSS без Са²⁺ или Mg²⁺. Клетки осторожно засасывают/выталкивают из наконечника пипетки, затем клеточную суспензию переносят в следующий флакон. Повторяют до тех пор, пока все клетки не соберут из всех флаконов, и переносят в 50 мл центрифужную пробирку, маркированную технологической меткой.

Заменяют 5 мл свежей HBSS без Са²⁺ или Mg²⁺ и комбинируют с суспензией.

Под микроскопом подтверждают, что все клетки удалены и при необходимости повторяют сбор клеток из всех флаконов третий раз.

Центрифугируют комбинированную клеточную суспензию в течение 5 минут при 1200 об./мин при 15-25°С. Регистрируют использование центрифуги в Форме для периодического профилактического обслуживания центрифуги - CR и подтверждают рабочие параметры.

Приготовление суспензии собранных клеток:

Супернатант удаляют без нарушения осадка и клетки ресуспендируют в 1,0 мл полной среды РТТ6 на собираемый флакон при помощи серологической пипетки подходящего размера. Необходимости предварительно нагревать среду нет.

Клетки, ресуспендированные в полной среде РРТ6, осаждают при 1200 об./мин в течение 5 минут при комнатной температуре.

Весь супернатант РТТ6 удаляют без нарушения осадка и осторожно ресуспендируют осадок в 1,0 мл "1% HSA в Плазмалит" на собранный флакон при помощи серологической пипетки подходящего размера. Получают суспензию собранных клеток. С этого момента времени суспензию собранных клеток сохраняют в охлаждающем блоке.

Подсчет в суспензии собранных клеток:

Перед каждым отбором образцов для подсчета клеток в суспензии собранных клеток обеспечивают их хорошее перемешивание.

Для определения концентрации клеток (с трипановым синим или без него) подсчеты осуществляют с использованием ТС20 в соответствии с SOP Подсчет клеток и анализ жизнеспособности. В большинстве случаев никакого разбавления образца не требуется, поскольку ТС20 работает с широким диапазоном концентраций клеток (от 5×10⁴ до 1×10⁷ клеток/мл).

Для определения жизнеспособности осуществляют подсчет с использованием гемоцитометра в соответствии с тем же самым SOP. Убедитесь в том, что в общей сложности подсчитано по меньшей мере 200 клеток.

Готовят суспензию для загрузки флаконов (сохраняют охлажденной в конической пробирке объемом 50 в охлаждающем блоке):

На основании предшествующего подсчета суспензии собранных клеток определяют объем собранной клеточной суспензии и "1% HSA в HypoThermosol", необходимой для приготовления требуемой для пациента дозы. Коническую пробирку маркируют соответствующей меткой. Конические пробирки, содержащие суспензию для загрузки флаконов, хранят в предварительно охлажденном охлаждающем блоке.

Используют HypoThermosol, и приготовленный "1% HSA в HypoThermosol" хранят и используют в диапазоне температур охлаждения (2-8°С), таким образом, что суспензию для загрузки флаконов сохраняют в охлаждающем блоке.

Регистрируют объем каждого компонента (HSA, Плазмалит-А и HypoThermosol-FRS), используемого для приготовления этой конечной суспензии. На основе этого объема также регистрируют объемы HSA, плазмалита и HypoThermosol, которые находятся в каждом АТ-закрытом флаконе.

Подсчет клеток в суспензии для загрузки флаконов:

Перед каждым отбором образцов для подсчета из суспензии для загрузки флаконов убеждаются, что клетки хорошо перемешаны.

Для определения концентрации клеток (с трипановым синим или без него) подсчитывают с использованием ТС20 в соответствии с SOP Подсчет клеток и анализ жизнеспособности.

Для определения жизнеспособности клеток их подсчитывают с использованием гемоцитометра в соответствии с тем же самым SOP. Необходимо убедиться в том, что в общем подсчитывают по меньшей мере 200 клеток. Анализ жизнеспособности может быть осуществлен только однократно VLS.

Загружают АТ-закрытые флакона следующим образом:

Извлекают из холодильника ранее помещенные туда шприцы+иглы и помещают в бокс биологической безопасности (BSC).

Извлекают из холодильника АТ-закрытые флакона, ранее помещенные в охлаждающий модуль CoolRackSV10/XT Cooling Core, и переносят в бокс BSC. Запускают таймер для обеспечения завершения загрузки в течение 30 минут.

Отверстие для инжекции протирают спиртовой салфеткой.

Перед загрузкой флакона стерильную иглу 22G вставляют в пробку около центра для вентилирования флакона (для того, чтобы избежать избыточного давления во флаконе аво время заполнения).

Суспензию для загрузки флакона перемешивают, затем медленно засасывают в шприц без пузырьков. Протыкают центр пробки шприцом и в каждую АТ-закрытую флакон инжектируют по 1,0 мл (регистрация по градуировке на шприце), соблюдая осторожность, чтобы не вызвать образование пузырьков.

Удаляют шприц для загрузки, затем удаляют иглу для вентилирования.

Закрывают отверстие флакона соответствующим колпачком и его плотно опрессовывают.Возвращают в CoolRackSVIO и хранят при 2-8°С для транспортировки до места назначения.

Сбор образца для анализа цитокинов после Р4 (анализ цитокинов осуществляют по меньшей мере однократно для каждого номера партии, т.е. идентичный CBU # и партия # ткани донора):

Основываясь на вышеуказанной концентрации суспензии для загрузки флакона, вносят достаточный объем суспензии для загрузки флакона в по меньшей мере одну лунку 6-луночного планшета, таким образом, чтобы в общем 100000 (живых+мертвых) клеток было внесено в лунку. Добавляют суспензию для загрузки флакона непосредственно в достаточное количество полной среды РТТ6, ранее добавленной в каждую лунку, таким образом, что общий объем в каждой лунке составляет 2 мл. Маркируют время начала инкубации.

Инкубируют в течение 48 часов ±1 час. После завершения инкубирования:

Получают единичное типичное изображение CytoSmart произвольным образом приблизительно в центре каждой лунки.

Измеряют лактат в каждой лунке и регистрируют в Форме результатов тестирования лактата.

Отбирают среду из каждой лунки и центрифугируют при 1200 об./мин при комнатной температуре в течение 5 минут.Регистрируют использование центрифуги в Форме для периодического профилактического обслуживания центрифуги CR и подтверждают рабочие параметры.

Супернатанты сред вносят в криопробирки и замораживают в течение 1 часа после отбора. Место хранения маркируют в регистраторе партии.

9. Исследование стабильности пролиферации и метаболизма МСК во время хранение/транспортировки

Ткани пуповины и клетки после ранних пересевов хранят при -195°С и тестируют в отношении стабильности.

Исходное тестирование стабильности описанных в настоящем документе мезенхимальных стволовых клеток, выстилающих пуповину (МСК), имеющих чистоту более чем 99%, в отношении положительных и отрицательных маркеров (см. фиг. 7 в этой связи) осуществляли с конечным продуктом, который состоял из жизнеспособных МСК в одном лишь HypoThermosol^®. Во время фактических производственных операций обнаружили, что адгезия мезенхимальных стволовых клеток возникает вследствие присущих мезенхимальным стволовым клеткам свойств и вязкости HypoThermosol^®.

Для того, чтобы уменьшить потерю клеток вследствие переноса МСК в HypoThermosol^® при распределении, адгезию МСК на пластикой посуде на различных этапах стадии 4 обработки и для максимизации выделения лекарственного продукта из флакона, используемой при распределении, обнаружили, что плазмалит и человеческий сывороточный альбумин (HSA), представляющие собой два фармацевтически не активных ингредиента, при добавлении оптимизируют количество конечного лекарственного продукта.

Новое исследование стабильности осуществляли для подтверждения того, что добавление этих двух фармацевтически не активных ингредиента не оказывает неблагоприятного действия на стабильность конечного лекарственного продукта. Результаты представлены на фиг. 33.

Анализ жизнеспособности

Мезенхимальные стволовые клетки высевали в АТ-закрытые флакона (AT-Closed Vials^®) в количестве 10⁶ клеток на флакон в 1 мл плазмалит/HSA/HypoThermosol^®. Образцы из отдельных флаконов собирали в различные моменты времени, при этом, жизнеспособность измеряли вручную при помощи трипанового синего (гемоцитометр) и общее количество клеток подсчитывали при помощи автоматизированной системы (ТС20).

МСК хранили при 2-8°С в течение 1-3 суток для имитации транспортировки и хранения продукта перед нанесением на раны. Как показано на фиг. 33а, клетки не демонстрировали значительную потерю жизнеспособности до 3 суток в этих условиях.

Анализ внешнего вида

МСК фотографировали после извлечения из АТ-закрытых флаконов и выращивали в течение 24 часов при 37°С. Как можно видеть ниже, клетки, полученные до 2 суток хранения при охлаждении, были способны адгезировать на планшетах для культуры ткани и образовывать типичные веретенообразные структуры. После хранения в течение 2,5 суток при 2-8°С клетки демонстрировали увеличение сфероидных форм, свидетельствующее о гибели клеток. Результаты представлены на фиг. 33b. Анализ пролиферации и метаболизма

МСК из одних и тех же культур, представленных на фиг. 33а, исследовали в отношении продукции лактата в качестве показателя метаболизма и роста в течение 48-часового периода в культуре при 37°С.Клетки, которые хранили в течение 24 часов при 2-8°С, были эквивалентны по метаболизму и росту клеткам, которые хранили в течение О часов, и клетки, которые хранили в течение 36 часов, демонстрировали 86% относительно контроля продукции лактата. После 72 часов при 2-8°С клетки демонстрировали только 46% метаболизма при последующем культивировании. Результаты представлены на фиг. 33 с.

Отдельные флакона дополнительно тестировали на 0, 1, 1,5, 2, 2,5 и 3 сутки на основе признанного анализа порога жизнеспособности на 3 сутки. Анализ жизнеспособности с трипановым синим осуществляли немедленно после удаления клеток из закрытых флаконов, и отсутствовала значимая потеря жизнеспособности в течение 2,5 суток (диапазон 92-98%). Клетки также высевали в планшет в количестве 10⁵ клеток/см² в стандартной среде РТТ6, и продукцию лактата измеряли через 24 и 48 часов. Лактат представляет собой продукт метаболизма глюкозы, который, как подтвердили авторы изобретения, непосредственно пропорционален скорости роста клеток МСК. На Фиг. 33d показана продукцию лактата МСК, которые хранили в течение 0, 1, 1,5, 2, 2,5 или 3 суток в Плазмалит/HS A/HypoThermosol^®, и затем измеряли через 24 часа и 48 часов в культуре. Продукция лактата МСК через 24 часа и 48 часов после хранения в Плазмалит/HSA/HypoThermosol^® в течение 24 часов (1 сутки) была идентична МСК, которые не подвергали хранению (0 сутки). После 3 суток продукция лактата падала на 40-45%.

Анализ продукции цитокинов

Продукцию цитокинов измеряли из одних и тех же культур через 24 часа при 37°С. В согласии с данными по метаболизму способность МСК продуцировать Ang-1, TGF р, VEGF и HGF составляла 10-20% относительно контролей (0 сутки), когда клетки хранили при 2-8°С в течение 24 часов. Результаты, представленные на фиг. 33е, указывают на то, что способность МСК продуцировать VEGF, ангиопоэтин-1, TGF-β и HGF сохранялась, когда клетки хранили в Плазмалит/HSA/HypoThermosol^® при 2-8°С в течение 24 часов. Однако способность МСК продуцировать VEGF и ангиопоэтин-1 уменьшалась приблизительно на 50% после хранения в течение>2 суток. Результаты для HGF аналогично сохранялись в течение 24 часов, но падали на >70% при хранении в течение >2 суток. Результаты для TGF-β демонстрируют то, что способность МСК продуцировать TGF-β сохранялась приблизительно на уровне 75% при хранении в течение >2 суток в Плазмалит/HSA/HypoThermosol^® при 2-8°С.

Еще один анализ продукции цитокинов в МСК, которые хранили в течение 0, 1, 1,5, 2, 2,5 или 3 суток в Плазмалит/HSA/HypoThermosol^®, подтверждал результаты, полученные при первом анализе цитокинов (Фиг. 33е). Результаты демонстрируют то, что способность МСК продуцировать VEGF, ангиопоэтин-1 и TGF-β, сохранялась, когда клетки хранили в Плазмалит/HSA/HypoThermosol^® при 2-8°С в течение 24 часов. Кроме того, уровень секреции VEGF и ангиопоэтина-1 уменьшался приблизительно на 50% при хранении в течение >2 суток, при этом, уровень секреции TGF-β уменьшался приблизительно на 25%.

В целом, на основе анализа жизнеспособности, внешнего вида, метаболизма и продукции цитокинов, демонстрируемых клетками в этих исследованиях, может быть установлен срок годности 72 часа с момента закрытия флакона с продуктом. Таким образом, поскольку в принципе в любое место в (развитом) мире можно попасть при помощи воздушного перелета в течение 72 часов, композиция для хранения и транспортировки в соответствии с изобретением по существу обеспечивает транспортирование живых МСК от предприятия по производству МСК по существу в любое место в мире, где МСК вводят субъекту. Таким образом, композиция для хранения и/или транспортировки по настоящему изобретению по существу уменьшает сложность производства GMP и цепочки поставки фармацевтически приемлемых мезенхимальных стволовых клеток/популяций стволовых клеток, таким образом, приводя к тому, что терапевтические методы, основанные на мезенхимальных стволовых клетках, становятся более легкодоступными для большего количества населения.

Изобретение дополнительно охарактеризовано следующими пунктами:

1. Способ приготовления композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, где композиция содержит от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток, где способ включает:

а) суспендирование мезенхимальных стволовых клеток в предварительно определенном объеме кристаллоидного раствора, где кристаллоидный раствор содержит от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масс./об.) сывороточного альбумина с получением таким образом первой клеточной суспензии,

б) определение концентрации мезенхимальных стволовых клеток в первой клеточной суспензии и определение объема первой клеточной суспензии, необходимого для приготовления композиции, содержащей от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток,

в) смешивание определенного объема первой клеточной суспензии с объемом жидкого носителя, где указанный жидкий носитель содержит от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масс./об.) сывороточного альбумина, а также

1) Тролокс;

2) Na⁺;

3) K+;

4) Са²⁺,

5) Mg²⁺;

6) Cl^-;

7) Н₂РО₄^-;

8) HEPES;

9) Лактобионат;

10) сахарозу;

11) маннит;

12) глюкозу;

13) декстран-40;

14) аденозин и

15) глутатион,

с получением таким образом композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, содержащей от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток.

2. Способ по п. 1, где предварительно определенный объем кристаллоидного раствора, используемого для суспендирования мезенхимальных стволовых клеток, составляет от приблизительно 1 мл до приблизительно 10 мл.

3. Способ по п. 1 или 2, где, после смешивания определенного объема первой клеточной суспензии с объемом жидкого носителя общий объем композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток составляет приблизительно 1 мл.

4. Способ по п. 2, где композиция содержит от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов жизнеспособных мезенхимальных стволовых клеток.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где композиция содержит приблизительно 1, приблизительно 3 или приблизительно 5 миллионов мезенхимальных стволовых клеток.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где "приблизительно" в отношении количества мезенхимальных стволовых клеток означает ±1%, ±2%, ±3%, ±4%, ±5%, ±6%, ±7%, ±8%, ±9% или ±10%.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где мезенхимальные стволовые клетки собирают из сосуда для культивирования клеток перед ресуспендированием указанных мезенхимальных стволовых клеток в предварительно определенном объеме кристаллоидного раствора.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель содержат одну и ту же концентрацию сывороточного альбумина.

9. Способ по п. 8, где как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель содержат от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масс/об.) сывороточного альбумина.

10. Способ по п. 8 или 9, где как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель содержат от приблизительно 1% до приблизительно 5% (масс/об.) сывороточного альбумина.

11. Способ по любому из пп. 8-10, где как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель содержат от приблизительно 1% до приблизительно 3% (масс/об.) сывороточного альбумина.

12. Способ по любому из пп. 8-11, где как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель содержат приблизительно 1% (масс/об.) сывороточного альбумина.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где кристаллоидный раствор содержит натрий, калий, магний и хлорид.

15. Способ по любому из пп. 1-14, где кристаллоидный раствор представляет собой плазмалит (PlasmaLyte) или лактат рингера.

16. Способ по п. 15, где композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток содержит не более чем 20% плазмалита.

17. Способ по любому из пп. 1-16, где мезенхимальные стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки, выбранные из группы, состоящей из мезенхимальных стволовых клеток пуповины, плацентарных мезенхимальных стволовых клеток, мезенхимальных стволовых клеток пуповинно-плацентарного сочленения, мезенхимальных стволовых клеток пуповинной крови, мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и мезенхимальных стволовых клеток, имеющих происхождение из жировой ткани.

18. Способ по п. 17, где мезенхимальные стволовые клетки пуповины выбраны из группы, состоящей из мезенхимальных стволовых клеток амниона, периваскулярных мезенхимальных стволовых клеток, мезенхимальных стволовых клеток вартонова студня, мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины.

19. Способ по п. 17 или 18, где мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины представляют собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток, где по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD 105.

20. Способ по п. 19, где по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток не экспрессируют следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA DR (человеческий лейкоцитарный антиген - родственный антигену D).

21. Способ по п. 19 или 20, где по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD 105 и не экспрессируют каждый из CD34, CD45 и HLA- DR.

22. Композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, полученная способом, определенным в любом из пп. 1-21.

23. Композиция для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, которую можно получить способом, определенным в любом из пп. 1-21.

24. Способ транспортирования мезенхимальных стволовых клеток, включающий транспортирование указанных мезенхимальных стволовых клеток в композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, определенной в п. 22 или п. 23.

25. Способ по п. 24, где транспортирование осуществляют в течение приблизительно 7 суток или меньше.

26. Способ по п. 24 или 25, где транспортирование осуществляют в течение приблизительно 6 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 3 суток, приблизительно 2 суток, приблизительно 1 суток или менее чем приблизительно 1 суток.

27. Способ по любому из пп. 24-26, где транспортирование осуществляют в течение приблизительно 48 часов или приблизительно 24 часов или меньше.

28. Способ по любому из пп. 24-27, где транспортирование осуществляют при температуре от приблизительно -5°С до приблизительно 15°С.

29. Способ по любому из пп. 24-28, где транспортирование осуществляют при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 8°С.

30. Способ по любому из пп. 24-29, где транспортирование осуществляют при температуре более чем приблизительно -5°С, более чем приблизительно -10°С, более чем приблизительно -15°С или более чем приблизительно -20°С.

31. Способ лечения субъекта, страдающего от заболевания, включающий местное введение мезенхимальных стволовых клеток, которые хранят или транспортируют в композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, определенной в п. 22 или п. 23.

32. Способ по п. 31, где мезенхимальные стволовые клетки вводят субъекту после отделения мезенхимальных стволовых клеток от композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток.

33. Способ по п. 32, где отделение мезенхимальных стволовых клеток от композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток включает центрифугирование.

34. Способ по п. 32 и 33, где отделение мезенхимальных стволовых клеток от композиции для хранения или транспортировки мезенхимальных стволовых клеток включает извлечение популяции клеток из флакона посредством шприца.

35. Способ по любому из пп. 31-34, включающий введение мезенхимальных стволовых клеток посредством шприца.

36. Способ по любому из пп. 31-35, где мезенхимальные стволовые клетки используют в дозе приблизительно 3, приблизительно 5 или приблизительно 10 миллионов клеток.

37. Способ по любому из пп. 31-36, где популяцию мезенхимальных стволовых клеток используют в течение приблизительно 72 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 6 часов или меньше с момента сбора популяции мезенхимальных стволовых клеток.

38. Способ по п. 37, где мезенхимальные стволовые клетки используют в течение приблизительно 72 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 6 часов или меньше с момента отбора мезенхимальных стволовых клеток.

39. Способ по любому из пп. 31-38, где заболевание представляет собой заболевание кожи или рану.

40. Способ по п. 39, где рана вызвана ожогом, укусом, травмой, хирургическим вмешательством или заболеванием.

41. Способ по п. 40, где рана вызвана диабетическим заболеванием, где рана предпочтительно представляет собой диабетическую рану.

42. Способ по п. 41, где рана представляет собой язву, обусловленную синдромом диабетической стопы.

43. Способ по любому из пп. 31-42, где дозу приблизительно 10 миллионов клеток, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 4 миллиона клеток, приблизительно 3 миллиона клеток, приблизительно 2 миллиона клеток, приблизительно 1 миллион клеток, приблизительно 0,5 миллиона клеток, приблизительно 0,25 миллиона клеток или менее чем 0,25 миллиона клеток вводят один раз или дважды в неделю.

44. Способ по п. 43, где дозу приблизительно 10 миллионов клеток, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 4 миллиона клеток, приблизительно 3 миллиона клеток, приблизительно 2 миллиона клеток, приблизительно 1 миллион клеток, приблизительно 0,5 миллиона клеток, приблизительно 0,25 миллиона клеток или менее чем 0,25 миллиона клеток вводят один раз или дважды в неделю в течение периода времени три недели, четыре недели, или пять недель, или шесть недель, или семь недель, или восемь недель или десять недель или более чем десять недель.

45. Способ по любому из пп. 31-44, где мезенхимальные стволовые клетки используют местно и покрывают пленкой или бинтом.

46. Способ по любому из пп. 31-45, где мезенхимальные стволовые клетки используют в дозе от приблизительно 1000 клеток/см² до приблизительно 5 миллионов клеток/см².

47. Способ по любому из пп. 31-46, где мезенхимальные стволовые клетки используют в дозе приблизительно 100000 клеток/см², приблизительно 300000 клеток/см² или приблизительно 500000 клеток/см².

48. Способ по любому из пп. 31-47, где мезенхимальные стволовые клетки используют один раз, дважды или более раз в неделю.

49. Способ по любому из пп. 31-48, где мезенхимальные стволовые клетки используют в течение одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати недель или более чем одиннадцати недель.

50. Способ по любому из пп. 31-49, где мезенхимальные стволовые клетки используют два раза в неделю в течение приблизительно 8 недель в дозе приблизительно 100000 клеток/см², приблизительно 300000 клеток/см² или приблизительно 500000 клеток/см².

51. Однократная доза мезенхимальных стволовых клеток, полученная способом, определенным в любом из пп. 1-21.

52. Однократная доза мезенхимальных стволовых клеток, которую можно получить способом, определенным в любом из пп. 1-21.

53. Однократная доза по п. 51 или 52, где однократная доза содержит от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток в объеме 1 мл.

54. Однократная доза по п. 53, где однократная доза содержит приблизительно 1 миллион, приблизительно 3 миллиона или приблизительно 5 миллионов клеток.

55. Однократная доза по любому из пп. 52-54, где мезенхимальные стволовые клетки пуповины выбраны из группы, состоящей из мезенхимальных стволовых клеток амниона, периваскулярных мезенхимальных стволовых клеток, мезенхимальных стволовых клеток вартонова студня, мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины.

56. Однократная доза по п. 55, где мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины представляют собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток, где по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD 105.

57. Однократная доза по п. 56, где по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток не экспрессируют следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA DR.

58. Однократная доза по п. 56 или 57, где по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют каждый из CD34, CD45 и HLA-DR (человеческий лейкоцитарный антиген - родственный антигену D).

Специалисту в данной области техники понятно, что различные изменения и модификации могут быть осуществлены в раскрытом здесь изобретении без отступления от объема и сущности изобретения.

Все патенты и публикации, упомянутые в описании, указывают на уровни специалистов в области техники, к которой относится изобретение. Все патенты и публикации включены сюда путем ссылки в той же самой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация была специфически и индивидуально включена сюда путем ссылки.

Изобретения, иллюстративно описанные здесь, могут быть подходящим образом практически реализованы при отсутствии любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, конкретно не раскрытых здесь. Таким образом, например, термины "содержащий", "включающий", "охватывающий" и т.д. следует рассматривать расширенно и без ограничений. Кроме того, термины и выражения, используемые здесь, использовались в качестве терминов описания, а не ограничения, и при использовании таких терминов и выражений нет намерения исключать любые эквиваленты представленных и описанных характеристик или их частей, и понятно, что возможны различные модификации в пределах объема заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что, хотя настоящее изобретение конкретно раскрыто с помощью предпочтительных воплощений и необязательных признаков, специалисты в данной области техники могут прибегнуть к модификации и изменению изобретений, воплощенных здесь, и что такие модификации и изменения рассматриваются как входящие в объем данного изобретения. Изобретение описано здесь широко и обобщенно. Каждый из более узких видов и субродовых групп, подпадающих под общее описание, также составляет часть изобретения. Последнее включает в себя общее описание изобретения с оговоркой или отрицательным ограничением, устраняющим любой предмет из рода, независимо от того, конкретно ли здесь указан удаляемый материал или нет.Кроме того, когда характеристики или аспекты изобретения описаны в терминах групп Маркуша, тогда специалистам в данной области техники понятно, что изобретение также описано в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша. Дополнительные воплощения изобретения станут очевидными из следующей формулы изобретения.

Понятно, что используемый в настоящем документе термин "приблизительно" означает то, что может существовать вариация в соответствующей величине или диапазоне (такой как рН, концентрация, процентная доля, молярность, количество аминокислот, время и т.п.), которые могут составлять до 5%, до 10%, до 15% или до 20% и включая 20% от заданной величины. Например, если композиция содержит от приблизительно 5 мг/мл соединения, то следует понимать, что это означает то, что композиция может содержать от 4 до 6 мг/мл, предпочтительно от 4,25 до 5,75 мг/мл, более предпочтительно от 4,5 до 5,5 мг/мл и еще более предпочтительно от 4,75 до 5,25 мг/мл, при том, что наиболее предпочтительно содержать 5 мг/мл. Используемый в настоящем документе интервал, который обозначен как "(от) X до Y" равен интервалу, который обозначается как "X-Y". Оба интервала специфическим образом включают верхний предел, а также нижний предел. Последнее означает, что, например, интервал "от 5 мг/мл до 10 мг/мл" или "5 мг/мл -10 мг/мл" включает концентрацию 5, 6, 7, 8, 9 и 10 мг/мл, а также любой любую промежуточную величину.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CellResearch Corporation Pte Ltd

The Regents of the University of Colorado

<120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ ИЛИ ТРАНСПОРТИРОВКИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОК И СПОСОБЫ ЕЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> human

<400> 1

Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu

20 25 30

His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu

50 55 60

Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu

65 70 75 80

Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr

85 90 95

Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala

100 105 110

Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile

115 120 125

Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile

130 135 140

Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro

145 150 155 160

Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val

180 185 190

Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys

195 200 205

Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu

210 215 220

Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val

225 230 235 240

Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys

245 250 255

Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly

260 265 270

Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly

275 280 285

Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His

290 295 300

Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile

305 310 315 320

Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr

325 330 335

Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met

355 360 365

Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val

370 375 380

Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu

385 390 395 400

Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro

405 410 415

Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys

420 425 430

Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu

435 440 445

Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys

450 455 460

Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg

465 470 475 480

Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile

485 490 495

Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys

500 505 510

Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val

515 520 525

Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly

530 535 540

Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu

545 550 555 560

Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln

565 570

<210> 2

<211> 161

<212> PRT

<213> human

<400> 2

Met Asn Leu Ala Ile Ser Ile Ala Leu Leu Leu Thr Val Leu Gln Val

1 5 10 15

Ser Arg Gly Gln Lys Val Thr Ser Leu Thr Ala Cys Leu Val Asp Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Arg His Glu Asn Thr Ser Ser Ser Pro Ile

35 40 45

Gln Tyr Glu Phe Ser Leu Thr Arg Glu Thr Lys Lys His Val Leu Phe

50 55 60

Gly Thr Val Gly Val Pro Glu His Thr Tyr Arg Ser Arg Thr Asn Phe

65 70 75 80

Thr Ser Lys Tyr Asn Met Lys Val Leu Tyr Leu Ser Ala Phe Thr Ser

85 90 95

Lys Asp Glu Gly Thr Tyr Thr Cys Ala Leu His His Ser Gly His Ser

100 105 110

Pro Pro Ile Ser Ser Gln Asn Val Thr Val Leu Arg Asp Lys Leu Val

115 120 125

Lys Cys Glu Gly Ile Ser Leu Leu Ala Gln Asn Thr Ser Trp Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Thr Asp Phe Met Ser

145 150 155 160

Leu

<210> 3

<211> 658

<212> PRT

<213> human

<400> 3

Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser

1 5 10 15

Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu

20 25 30

Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln

35 40 45

Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val

50 55 60

His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu

65 70 75 80

Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu

85 90 95

Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu

100 105 110

Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln

115 120 125

Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr

130 135 140

Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala

145 150 155 160

Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln

165 170 175

Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg

180 185 190

Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His

195 200 205

Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu

210 215 220

Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu

225 230 235 240

Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro

245 250 255

Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp

260 265 270

Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg

275 280 285

Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg

290 295 300

Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala

305 310 315 320

Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr

325 330 335

Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro

340 345 350

Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met

355 360 365

Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile

370 375 380

Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly

385 390 395 400

Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val

405 410 415

Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser

420 425 430

Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu

435 440 445

Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser

450 455 460

Asn Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser Phe Val Gln Val Arg Val Ser

465 470 475 480

Pro Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp

485 490 495

Leu Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala

500 505 510

Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro

515 520 525

Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr

530 535 540

Gly Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln

545 550 555 560

Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser

565 570 575

Pro Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Pro Ala Val

580 585 590

Leu Gly Ile Thr Phe Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala

595 600 605

Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Arg Ser Pro Ser Lys Arg Glu

610 615 620

Pro Val Val Ala Val Ala Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr

625 630 635 640

Asn His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser

645 650 655

Met Ala

<210> 4

<211> 385

<212> PRT

<213> human

<400> 4

Met Leu Val Arg Arg Gly Ala Arg Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Gly

1 5 10 15

Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gly Phe Met Ser

20 25 30

Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr

35 40 45

Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr Thr Thr Pro

50 55 60

Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser Gln His Gly Asn

65 70 75 80

Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys Phe Thr Ser Thr

85 90 95

Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln Ser

100 105 110

Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro Ala Asn Val Ser

115 120 125

Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro Gly Asn Val Ser

130 135 140

Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Pro

145 150 155 160

Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys Ala Glu Ile Lys

165 170 175

Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly Ile Cys Leu Glu

180 185 190

Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys Asp Arg Gly Glu

195 200 205

Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala Asp Ala Asp Ala

210 215 220

Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser Glu Val Arg Pro

225 230 235 240

Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu Ile Ser Ser Lys

245 250 255

Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Ile

260 265 270

Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln Ser Tyr Ser Gln

275 280 285

Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu Leu Ala Val Leu

290 295 300

Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser Trp Ser Pro Thr

305 310 315 320

Gly Glu Arg Leu Gly Glu Asp Pro Tyr Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Gly

325 330 335

Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Pro Gly Thr Ser Pro Glu Ala Gln Gly Lys

340 345 350

Ala Ser Val Asn Arg Gly Ala Gln Glu Asn Gly Thr Gly Gln Ala Thr

355 360 365

Ser Arg Asn Gly His Ser Ala Arg Gln His Val Val Ala Asp Thr Glu

370 375 380

Leu

385

<210> 5

<211> 1304

<212> PRT

<213> human

<400> 5

Met Tyr Leu Trp Leu Lys Leu Leu Ala Phe Gly Phe Ala Phe Leu Asp

1 5 10 15

Thr Glu Val Phe Val Thr Gly Gln Ser Pro Thr Pro Ser Pro Thr Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ala Lys Met Pro Ser Val Pro Leu Ser Ser Asp Pro Leu

35 40 45

Pro Thr His Thr Thr Ala Phe Ser Pro Ala Ser Thr Phe Glu Arg Glu

50 55 60

Asn Asp Phe Ser Glu Thr Thr Thr Ser Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser

65 70 75 80

Thr Gln Val Ser Pro Asp Ser Leu Asp Asn Ala Ser Ala Phe Asn Thr

85 90 95

Thr Gly Val Ser Ser Val Gln Thr Pro His Leu Pro Thr His Ala Asp

100 105 110

Ser Gln Thr Pro Ser Ala Gly Thr Asp Thr Gln Thr Phe Ser Gly Ser

115 120 125

Ala Ala Asn Ala Lys Leu Asn Pro Thr Pro Gly Ser Asn Ala Ile Ser

130 135 140

Asp Val Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ala Ser Thr Phe Pro Thr Asp Pro

145 150 155 160

Val Ser Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ala His His Ser Ser Ala

165 170 175

Ala Leu Pro Ala Arg Thr Ser Asn Thr Thr Ile Thr Ala Asn Thr Ser

180 185 190

Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Ser Glu Thr Thr Thr Leu Ser Pro Ser Gly

195 200 205

Ser Ala Val Ile Ser Thr Thr Thr Ile Ala Thr Thr Pro Ser Lys Pro

210 215 220

Thr Cys Asp Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Lys Glu Thr Lys Leu Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val

245 250 255

Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr

260 265 270

Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala

275 280 285

Pro Asp Lys Thr Leu Ile Leu Asp Val Pro Pro Gly Val Glu Lys Phe

290 295 300

Gln Leu His Asp Cys Thr Gln Val Glu Lys Ala Asp Thr Thr Ile Cys

305 310 315 320

Leu Lys Trp Lys Asn Ile Glu Thr Phe Thr Cys Asp Thr Gln Asn Ile

325 330 335

Thr Tyr Arg Phe Gln Cys Gly Asn Met Ile Phe Asp Asn Lys Glu Ile

340 345 350

Lys Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu His Glu Tyr Lys Cys Asp Ser Glu

355 360 365

Ile Leu Tyr Asn Asn His Lys Phe Thr Asn Ala Ser Lys Ile Ile Lys

370 375 380

Thr Asp Phe Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gln Ile Ile Phe Cys Arg Ser

385 390 395 400

Glu Ala Ala His Gln Gly Val Ile Thr Trp Asn Pro Pro Gln Arg Ser

405 410 415

Phe His Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Glu Lys Asp Cys

420 425 430

Leu Asn Leu Asp Lys Asn Leu Ile Lys Tyr Asp Leu Gln Asn Leu Lys

435 440 445

Pro Tyr Thr Lys Tyr Val Leu Ser Leu His Ala Tyr Ile Ile Ala Lys

450 455 460

Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr Lys Ser

465 470 475 480

Ala Pro Pro Ser Gln Val Trp Asn Met Thr Val Ser Met Thr Ser Asp

485 490 495

Asn Ser Met His Val Lys Cys Arg Pro Pro Arg Asp Arg Asn Gly Pro

500 505 510

His Glu Arg Tyr His Leu Glu Val Glu Ala Gly Asn Thr Leu Val Arg

515 520 525

Asn Glu Ser His Lys Asn Cys Asp Phe Arg Val Lys Asp Leu Gln Tyr

530 535 540

Ser Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Ala Tyr Phe His Asn Gly Asp Tyr Pro

545 550 555 560

Gly Glu Pro Phe Ile Leu His His Ser Thr Ser Tyr Asn Ser Lys Ala

565 570 575

Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile Ala Leu

580 585 590

Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg Ser Cys

595 600 605

Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu Lys Gln

610 615 620

Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu Thr Tyr

625 630 635 640

Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu Phe Gln

645 650 655

Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala Arg Lys

660 665 670

Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu Pro Tyr Asp

675 680 685

Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala Gly Ser Asn

690 695 700

Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro Arg Lys Tyr

705 710 715 720

Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe Trp Arg

725 730 735

Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr Arg Cys

740 745 750

Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser Met Glu

755 760 765

Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn Gln His

770 775 780

Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val Asn Lys

785 790 795 800

Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe Thr Ser

805 810 815

Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu Lys Leu

820 825 830

Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro Ile Val

835 840 845

Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ile

850 855 860

Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp Val Tyr

865 870 875 880

Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val Gln Val

885 890 895

Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr Asn Gln

900 905 910

Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro Tyr Leu His

915 920 925

Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu Glu Ala

930 935 940

Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln His Ile

945 950 955 960

Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn Val Ile

965 970 975

Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu Met Ser

980 985 990

Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp

995 1000 1005

Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser

1010 1015 1020

Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys

1025 1030 1035

Glu Thr Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val

1040 1045 1050

Lys Val Ile Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu

1055 1060 1065

Ile Cys Ala Gln Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp

1070 1075 1080

Ile Glu Val Asp Leu Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr

1085 1090 1095

Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg

1100 1105 1110

Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu

1115 1120 1125

Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile Ser Met Ile Gln Val Val Lys

1130 1135 1140

Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser Glu Gly Asn Lys His His

1145 1150 1155

Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg Asp Gly Ser Gln Gln

1160 1165 1170

Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Glu Ser Ala Glu

1175 1180 1185

Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys Ala Leu Arg

1190 1195 1200

Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr Gln Phe

1205 1210 1215

Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly Gln

1220 1225 1230

Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn

1235 1240 1245

Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu

1250 1255 1260

Gly Ala Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly

1265 1270 1275

Ser Glu Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn

1280 1285 1290

Gly Pro Ala Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser

1295 1300

<210> 6

<211> 254

<212> PRT

<213> human

<400> 6

Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val

1 5 10 15

Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala Ile Lys Glu Glu His Val Ile

20 25 30

Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met

35 40 45

Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys

50 55 60

Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu

65 70 75 80

Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu

85 90 95

Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn Val Pro Pro

100 105 110

Glu Val Thr Val Leu Thr Asn Ser Pro Val Glu Leu Arg Glu Pro Asn

115 120 125

Val Leu Ile Cys Phe Ile Asp Lys Phe Thr Pro Pro Val Val Asn Val

130 135 140

Thr Trp Leu Arg Asn Gly Lys Pro Val Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr

145 150 155 160

Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu

165 170 175

Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val Tyr Asp Cys Arg Val Glu His

180 185 190

Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Phe Asp Ala Pro

195 200 205

Ser Pro Leu Pro Glu Thr Thr Glu Asn Val Val Cys Ala Leu Gly Leu

210 215 220

Thr Val Gly Leu Val Gly Ile Ile Ile Gly Thr Ile Phe Ile Ile Lys

225 230 235 240

Gly Val Arg Lys Ser Asn Ala Ala Glu Arg Arg Gly Pro Leu

245 250

<210> 7

<211> 503

<212> PRT

<213> human

<400> 7

Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr

20 25 30

Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys

35 40 45

Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys

50 55 60

Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg

65 70 75 80

Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr

85 90 95

Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro

100 105 110

Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala

115 120 125

Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met

130 135 140

Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn

145 150 155 160

Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr

165 170 175

Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly

180 185 190

Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln

195 200 205

Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp

210 215 220

Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg

225 230 235 240

Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His

245 250 255

Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr

260 265 270

Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu

275 280 285

Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys

290 295 300

Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile

305 310 315 320

Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser

325 330 335

Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu

340 345 350

Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala

355 360 365

Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu

370 375 380

Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp

385 390 395 400

Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser

405 410 415

Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val

420 425 430

Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln

435 440 445

Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu

450 455 460

Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala

465 470 475 480

Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser

485 490 495

Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met

500

<210> 8

<211> 232

<212> PRT

<213> human

<400> 8

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

130 135 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp

165 170 175

Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys

180 185 190

His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn

195 200 205

Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr

210 215 220

Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

225 230

<210> 9

<211> 1089

<212> PRT

<213> human

<400> 9

Met Gly Thr Ser His Pro Ala Phe Leu Val Leu Gly Cys Leu Leu Thr

1 5 10 15

Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys Gln Leu Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro

20 25 30

Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg

35 40 45

Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu

50 55 60

Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile Arg Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu

65 70 75 80

Phe Val Thr Val Leu Glu Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly

85 90 95

Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu

100 105 110

Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe

115 120 125

Val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp

130 135 140

Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr

145 150 155 160

Leu His Asn Ser Glu Gly Val Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln

165 170 175

Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr

180 185 190

Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu

195 200 205

Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val

210 215 220

Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn

225 230 235 240

Glu Val Val Asp Leu Gln Trp Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys

245 250 255

Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val

260 265 270

Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr

275 280 285

Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys

290 295 300

Val Thr Ile Ser Val His Glu Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr

305 310 315 320

Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val

325 330 335

Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn

340 345 350

Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu

355 360 365

Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala

370 375 380

Lys Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp

385 390 395 400

Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser

405 410 415

Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr

420 425 430

Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met

435 440 445

Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile

450 455 460

Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp

465 470 475 480

Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr

485 490 495

Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg

500 505 510

Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala

515 520 525

Ala Ala Val Leu Val Leu Leu Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val

530 535 540

Leu Val Val Ile Trp Lys Gln Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg

545 550 555 560

Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp

565 570 575

Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly

580 585 590

Leu Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val

595 600 605

Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val

610 615 620

Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala

625 630 635 640

Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn

645 650 655

Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile

660 665 670

Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys

675 680 685

Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu

690 695 700

Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr

705 710 715 720

Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln

725 730 735

Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser

740 745 750

Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr

755 760 765

Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp

770 775 780

Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr

785 790 795 800

Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His

805 810 815

Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val

820 825 830

Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn

835 840 845

Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro

850 855 860

Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser

865 870 875 880

Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr

885 890 895

Pro Gly Met Met Val Asp Ser Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly

900 905 910

Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile

915 920 925

Met Val Lys Cys Trp Asn Ser Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr

930 935 940

His Leu Ser Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys

945 950 955 960

Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala

965 970 975

Val Ala Arg Met Arg Val Asp Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr

980 985 990

Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp

995 1000 1005

Glu Gln Arg Leu Ser Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro

1010 1015 1020

Asp Ile Asp Pro Val Pro Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn

1025 1030 1035

Arg His Ser Ser Gln Thr Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly

1040 1045 1050

Ser Ser Ser Ser Thr Phe Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu

1055 1060 1065

Asp Ile Asp Met Met Asp Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu

1070 1075 1080

Val Glu Asp Ser Phe Leu

1085

<210> 10

<211> 498

<212> PRT

<213> human

<400> 10

Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His

1 5 10 15

Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg

20 25 30

Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro

35 40 45

Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr

50 55 60

Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser

65 70 75 80

Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met

100 105 110

Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu

115 120 125

Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys

130 135 140

Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu

145 150 155 160

Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln

165 170 175

Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser

180 185 190

Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu

195 200 205

Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr

210 215 220

Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala

225 230 235 240

Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp

245 250 255

Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu

260 265 270

Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp

275 280 285

Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile

290 295 300

Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn

305 310 315 320

Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp

325 330 335

Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser

340 345 350

Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln

355 360 365

Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg

370 375 380

Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn

385 390 395 400

Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser

405 410 415

Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn

420 425 430

Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp

435 440 445

Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala

450 455 460

Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu

485 490 495

Asp Phe

<210> 11

<211> 728

<212> PRT

<213> human

<400> 11

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr

165 170 175

Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser

180 185 190

Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu

195 200 205

Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp

210 215 220

His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro

225 230 235 240

His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp

245 250 255

Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr

260 265 270

Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys

275 280 285

Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu

290 295 300

Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile

305 310 315 320

Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu

325 330 335

His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn

340 345 350

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr

355 360 365

Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp

370 375 380

Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met

385 390 395 400

Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp

405 410 415

Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala

420 425 430

Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His

435 440 445

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys

450 455 460

Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu

465 470 475 480

Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val

485 490 495

Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg

500 505 510

Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp

515 520 525

Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr

530 535 540

Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys

545 550 555 560

Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly

565 570 575

Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp

580 585 590

Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu

595 600 605

Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn

610 615 620

Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu

625 630 635 640

Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu

645 650 655

Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp

660 665 670

Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu

675 680 685

Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly

690 695 700

Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile

705 710 715 720

Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser

725

<210> 12

<211> 241

<212> PRT

<213> human

<400> 12

Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu Arg

1 5 10 15

Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met

20 25 30

Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gln Arg Leu Leu

35 40 45

His Gly Asp Pro Gly Glu Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met

50 55 60

Thr Arg Ser His Ser Gly Gly Glu Leu Glu Ser Leu Ala Arg Gly Arg

65 70 75 80

Arg Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu

85 90 95

Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp

100 105 110

Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln

115 120 125

Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr

130 135 140

Gln Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg

145 150 155 160

Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu

165 170 175

Ala Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser

180 185 190

Pro Gly Gly Ser Gln Glu Gln Arg Ala Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val

195 200 205

Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg

210 215 220

Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Thr Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly

225 230 235 240

Ala

<210> 13

<211> 178

<212> PRT

<213> human

<400> 13

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

165 170 175

Arg Asn

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу приготовления композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, где указанные мезенхимальные стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины. Также раскрыта композиция для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток. Изобретение также относится к способу транспортирования мезенхимальных стволовых клеток и к применению композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток для изготовления фармацевтической композиции для лечения субъекта, страдающего от заболевания, где заболевание представляет собой рану. Изобретение обеспечивает эффективное хранение и транспортировку мезенхимальных стволовых клеток. 4 н. и 23 з.п. ф-лы, 33 ил., 5 табл., 9 пр.

1. Способ приготовления композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, где указанные мезенхимальные стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины, где указанная композиция содержит от 0,5 до 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток, где способ включает:

а) суспендирование мезенхимальных стволовых клеток в предварительно определенном объеме кристаллоидного раствора, подходящем для достаточного ресуспендирования мезенхимальных стволовых клеток, где указанный кристаллоидный раствор представляет собой плазмалит (PlasmaLyte) и содержит от 0,5 до 3% масс./об. сывороточного альбумина с получением таким образом клеточной суспензии,

б) определение концентрации мезенхимальных стволовых клеток в клеточной суспензии и определение объема клеточной суспензии, необходимого для приготовления композиции, содержащей от 0,5 до 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток,

в) смешивание определенного объема клеточной суспензии с объемом жидкого носителя, где после смешивания композиция для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток содержит не более чем 20% плазмалита, где указанный жидкий носитель содержит от 0,5 до 3% масс./об. сывороточного альбумина, а также

1) тролокс;

2) Na⁺;

3) K⁺;

4) Ca²⁺,

5) Mg²⁺;

6) Cl^-;

7) H₂PO₄^-;

8) HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту);

9) лактобионат;

10) сахарозу;

11) маннит;

12) глюкозу;

13) декстран-40;

14) аденозин и

15) глутатион,

с получением таким образом композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, содержащей от 0,5 до 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток.

2. Способ по п. 1, где предварительно определенный объем кристаллоидного раствора, используемого для суспендирования мезенхимальных стволовых клеток, составляет от 1 до 10 мл.

3. Способ по п. 1 или 2, где после смешивания определенного объема клеточной суспензии с объемом жидкого носителя общий объем композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток составляет 1 мл.

4. Способ по п. 2, где композиция содержит от 0,5 до 10 миллионов жизнеспособных мезенхимальных стволовых клеток.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где композиция содержит 1, 3 или 5 миллионов мезенхимальных стволовых клеток.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где мезенхимальные стволовые клетки собирают из сосуда для культивирования клеток перед ресуспендированием мезенхимальных стволовых клеток в предварительно определенном объеме кристаллоидного раствора.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель содержат одну и ту же концентрацию сывороточного альбумина.

8. Способ по п. 7, где как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель содержат от 1 до 3% масс./об. сывороточного альбумина.

9. Способ по любому из пп. 7 или 8, где как кристаллоидный раствор, так и жидкий носитель содержат 1% масс./об. сывороточного альбумина.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины представляют собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток, где по меньшей мере 90% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD105.

12. Способ по п. 11, где по меньшей мере 90% или более клеток указанной популяции мезенхимальных стволовых клеток не экспрессируют следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA-DR (человеческий лейкоцитарный антиген – родственный антигену D).

13. Способ по п. 11 или 12, где по меньшей мере 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более клеток указанной популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют каждый из CD34, CD45 и HLA-DR.

14. Композиция для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, которая получена или может быть получена способом, определенным в любом из пп. 1-13, где указанная композиция содержит от 0,5 до 10 миллионов мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины и смесь кристаллоидного раствора и жидкого носителя,

где указанный кристаллоидный раствор представляет собой плазмалит (PlasmaLyte) и содержит от 0,5 до 3% масс./об. сывороточного альбумина,

где указанный жидкий носитель содержит от 0,5 до 3% масс./об. сывороточного альбумина, а также

1) тролокс;

2) Na⁺;

3) K⁺;

4) Ca²⁺,

5) Mg²⁺;

6) Cl^-;

7) H₂PO₄^-;

8) HEPES;

9) лактобионат;

10) сахарозу;

11) маннит;

12) глюкозу;

13) декстран-40;

14) аденозин и

15) глутатион, и

где указанная композиция содержит не более чем 20% плазмалита.

15. Способ транспортирования мезенхимальных стволовых клеток, включающий транспортирование указанных мезенхимальных стволовых клеток в композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, определенной в п. 14.

16. Способ по п. 15, где транспортирование осуществляют в течение 7 суток или меньше.

17. Способ по п. 15 или 16, где транспортирование осуществляют при температуре от -5°C до 15°C.

18. Применение композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, определенной в п. 14, для изготовления фармацевтической композиции для лечения субъекта, страдающего от заболевания, где заболевание представляет собой рану, и где применение включает местное введение мезенхимальных стволовых клеток, которые хранят или транспортируют в композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток, определенной в п. 14, где применение включает отделение указанных мезенхимальных стволовых клеток от указанной композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток и введение указанных мезенхимальных стволовых клеток указанному субъекту.

19. Применение по п. 18, где отделение мезенхимальных стволовых клеток от композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток включает центрифугирование.

20. Применение по п. 18 или 19, где отделение мезенхимальных стволовых клеток от композиции для хранения и транспортировки мезенхимальных стволовых клеток включает извлечение клеточной популяции из флакона посредством шприца.

21. Применение по любому из пп. 18-20, где мезенхимальные стволовые клетки используют в дозе 3, 5 или 10 миллионов клеток.

22. Применение по любому из пп. 18-21, где популяцию мезенхимальных стволовых клеток используют в течение 72 часов, 48 часов, 24 часов, 12 часов, 6 часов или менее с момента сбора популяции мезенхимальных стволовых клеток.

23. Применение по любому из пп. 18-22, где рана вызвана ожогом, укусом, травмой, хирургическим вмешательством или заболеванием.

24. Применение по п. 23, где рана вызвана диабетическим заболеванием, где рана предпочтительно представляет собой диабетическую рану.

25. Применение по п. 24, где рана представляет собой язву, обусловленную синдромом диабетической стопы.

26. Применение по любому из пп. 18-25, где дозу 10 миллионов клеток, 5 миллионов клеток, 4 миллиона клеток, 3 миллиона клеток, 2 миллиона клеток, 1 миллион клеток, 0,5 миллиона клеток, 0,25 миллиона клеток или менее чем 0,25 миллиона клеток вводят один раз или дважды в неделю.

27. Применение по п. 26, где дозу 10 миллионов клеток, 5 миллионов клеток, 4 миллиона клеток, 3 миллиона клеток, 2 миллиона клеток, 1 миллион клеток, 0,5 миллиона клеток, 0,25 миллиона клеток или менее чем 0,25 миллиона клеток вводят один раз или дважды в неделю в течение периода времени три недели, четыре недели, или пять недель, или шесть недель, или семь недель, или восемь недель, или десять недель, или более чем десять недель.