Способ оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток и родственные способы отбора мезенхимальных стволовых клеток и идентификации ткани в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 A61K35/28 

ССЫЛКА НА ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящей заявке на изобретение заявлен приоритет предварительной заявки на патент США No. 62/912,374, поданной 8 октября 2019 года, содержание которой включено сюда путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP (текущая надлежащая производственная практика) и к способу отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток для последующего фармацевтического введения. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для генерирования главного банка клеток и к способу идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования. Настоящее изобретение также относится к применению по меньшей мере одного белка для оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток. Настоящее изобретение также относится к применению по меньшей мере одного белка для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного белка для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток для последующего фармацевтического введения. Настоящее изобретение также относится к применению по меньшей мере одного белка для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для генерирования главного банка клеток и к применению по меньшей мере одного белка для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) способны к самообновлению и дифференцировке. Таким образом, эти клетки представляют собой привлекательное и перспективное средство для регенеративной медицины. МСК могут быть выделены из различных тканей, таких как строма костного мозга, жировая ткань, дерма, плацента, пуповинная кровь или различные ткани пуповины, содержащие вартонов студень, субэндотелиальный слой пупочной вены или амниотическая ткань пуповины (Mitchell, K.Е. et al. (2003) Stem Cells 21, 50-60; патент США №5919702; заявка на патент США №2004/0136967; Romanov, Y.A et al. (2003) Stem Cells 21, 105-110; Covas, D.T. et al. (2003) Braz. J. Med. Biol. Res. 36, 1179-1183; US2006/0078993). О мезенхимальных стволовых клетках, выделенных из амниотической мембраны пуповины, исходно сообщали в заявке на патент США №2006/0078993 (на основании которой выданы патенты США №9085755, 9737568 и 9844571) и в соответствующей международной патентной заявке WO2006/019357. Кроме того, популяция таких мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины недавно описали в заявке на патент США №20181/27721 или в соответствующей международной заявке WO 2018/067071.

Популяции мезенхимальных стволовых клеток, описанные в заявке на патент США 20181/27721 или соответствующей заявке на международный патент WO 2018/067071, обладают преимуществом, заключающемся в том, что 99% или более стволовых клеток этой популяции экспрессируют три маркера МСК CD73, CD90, и при этом не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR (человеческий лейкоцитарный антиген DR). Таким образом, эта чрезвычайно гомогенная и хорошо определенная клеточная популяция представляет собой идеальный кандидат для клинических исследований и способов клеточной терапии, поскольку она, например, полностью удовлетворяет критериям, в общем принятым для человеческих МСК, используемых для клеточной терапии, как определено, например, в Dominici et al, "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy (2006) Vol. 8, No. 4, 315-317, Sensebe et al,. "Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a, review", Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:66), Vonk et al., Stem Cell Research & Therapy (2015) 6:94, or Kundrotas Acta Medica Lituanica. 2012. Vol. 19. No. 2. P. 75-79. Как описано в международной патентной заявке WO 2018/067071, эта популяция мезенхимальных стволовых клеток может, например, использоваться в своем недифференцированном состоянии для задач заживления ран, таких как лечение ожогов или ран вследствие хронического диабета. Альтернативно, эта популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть дифференцирована, например, в инсулинпродуцирующие β-островковые клетки, которые затем могут быть введены, например, путем имплантации, пациенту, страдающему от дефицита инсулина, такого как сахарный диабет (в этой связи см. также международную патентную заявку WO2007/046775).

Способ получения этой популяции мезенхимальных стволовых клеток, также описанный в международной патентной заявке WO 2018/067071, подходит для реализации в соответствии с условиями Надлежащей производственной практики (GMP), требующимися для таких способов аллогенной клеточной терапии. Однако продукция в соответствии с GMP требует контроля качества производимого лекарственного продукта независимо от того, представляет ли собой лекарственный продукт небольшую органическую молекулу, биологическую молекулу или даже клеточную популяцию, как в случае популяции мезенхимальных стволовых клеток в соответствии с международной патентной заявкой WO 2018/067071. Таким образом, было бы желательно иметь под рукой анализ для контроля качества удовлетворяющей GMP продукции популяции мезенхимальных стволовых клеток согласно международной патентной заявки WO 2018/067071.

В этом контексте, известно, что мезенхимальные стволовые клетки, как любой другой биологический материал, обладают присущей им вариабельностью. Например, в исследованиях клеточной биологии мезенхимальных стволовых клеток идентифицировали различные факторы, которые влияют на срок их жизни и способность к делению. Описано, что аспекты, такие как источник донорной ткани, возраст донора, экологический фон и способы выделения, влияют на общее качество мезенхимальных стволовых клеток (см. Paladino, et al. "Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells," Cell and Tissue Banking, vol. 17, no. 1, pp. 123 136, (2016), https://doi.org/10.1007/s10561-015-9525-6). Кроме того, в Paladino, et al., 2016 (см. выше) рассматривается индивидуальная вариабельность мезенхимальных стволовых клеток путем сравнения трех различных способов выделения МСК из пуповины с целью создания банка клеток и для идентификации того, существуют ли преимущества с точки зрения клеточной жизнеспособности, срока жизни в культуре, потенциала к размножению и способностей к дифференцировке. Эти авторы сообщают о том, что поскольку одни и те же образцы обрабатывали в соответствии с по меньшей мере двумя из трех исследуемых протоколов и в экспериментальных условиях с высокой степенью контроля, эти результаты выявили, что часть обнаруженной вариабельности явно присуща каждому донору в отношении времени удвоения и срока жизни. В последующем исследовании Paladino et al. (2017) "Intrinsic Variability Present in Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells and T Cell Responses May Impact Cell Therapy". Hindawi, Stem Cells International Volume 2017, Article ID 8492797, 12 страниц, https://doi.org/10.1155/2017/8492797 показано то, что генная экспрессия иммуномодулирующих молекул варьирует между образцами мезенхимальных стволовых клеток вартонова студеня (WJ-MCK) при отсутствии специфической картины. При совместном культивировании WJ-MCK были способны ингибировать митогенактивируемую пролиферацию CD3+ Т-клеток, хотя и в различной степени, а каждая РВМС (мононуклеарная клетка периферической крови) отвечала с разным уровнем ингибирования. Авторы предположили, что каждая WJ-MCK демонстрирует уникальное поведение, отличающееся паттернами экспрессии мРНК цитокинов и иммуномодулирующей способностью. Авторы также предположили, что вариабельность между образцами может играть роль в эффективности терапевтического использования WJ-MCK.

В свете этих результатов вероятно, что МСК из амниотической мембраны пуповины также обладают присущей вариабельностью в отношении продукции специфических молекул, которые, в свою очередь, могут влиять на терапевтические применения, такие как заживление ран или диабет. Таким образом, может быть предпочтительно иметь под рукой способ идентификации популяции МСК или содержащей МСК донорной ткани, которая подходит для использования, например, в целях заживления ран. Такой способ в идеале был бы полезен для генерирования главного банка клеток (необходимого для получения лекарственного продукта для клеточной терапии) или для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP для последующего фармацевтического введения.

Соответственно, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ, который может, например, быть использован для идентификации донора ткани, содержащей МСК, или впоследствии для популяции МСК, пригодной для терапевтических применений, таких как заживление ран.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Эта задача достигается при помощи способов и применений, имеющих признаки, изложенные в независимых пунктах формулы изобретения.

В первом аспекте изобретения предложен способ оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

Во втором аспекте изобретения предложен способ отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

В третьем аспекте изобретения предложен способ отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток для последующего фармацевтического введения, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

В четвертом аспекте изобретения предложен способ отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для генерирования главного банка клеток, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

В пятом аспекте изобретения предложен способ идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования, где способ включает определение уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанным образцом ткани или клеткой, выделенной из указанной ткани.

В шестом аспекте изобретения предложено применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из белка ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток.

В седьмом аспекте изобретения предложено применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из белка ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактор роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP.

В восьмом аспекте изобретения предложено применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из белка ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток для последующего фармацевтического введения.

В девятом аспекте изобретения предложено применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из белка ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для генерирования главного банка клеток.

В десятом аспекте изобретения предложено применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из белка ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования.

В одиннадцатом аспекте изобретения предложен способ идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

В двенадцатом аспекте изобретения предложено применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из белка ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Изобретение будет лучше понятно со ссылкой на подробное описание, рассматриваемое в связи с не ограничивающими объем изобретения примерами и графическими материалами, в которых:

На фиг. 1 показана блок-схема, схематически представляющая экспериментальные стадии иллюстративного примера способа получения терапевтической композиции, содержащей популяции МСК, обладающие подходящим потенциалом к заживлению ран. Этот способ включает идентификацию ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции МСК, оценку ранозаживляющего потенциала популяции МСК, отбор популяции МСК для продуцирования главного банка клеток и отбор популяции МСК для фармацевтического введения. Стволовые клетки, используемые в этом примере, выделены из амниотической мембраны пуповины - также названные в настоящем документе как стволовые клетки, выстилающие пуповину (CLSC). Этот пример начинается с учреждения банка тканей, содержащего ткань пуповины, которая может быть использована в качестве исходного материала для культивирования МСК. Для этой задачи может быть отобран донор, давший согласие на забор ткани (стадия 1). Затем материнские образцы крови и образцы крови новорожденного исследуют в отношении инфекционных заболеваний, и образцы пуповин тестируют в отношении микробной контаминации. Например, 100 образцов пуповины могут быть собраны в таком банке тканей. Ткань, для которой обнаружено, что она не является неприемлемой из-за контаминации или инфекционных заболеваний донора, используют для получения культур, которые используют для продуцирования чистых линий МСК (стадия 2). С этой целью разрастания от приблизительно 10 индивидуальных амниотических мембран пуповины выращивают для 0-2 пассажей для культивирования. МСК из пассажа 2 (Р2) оценивают путем проточной цитометрии в отношении маркеров МСК, и супернатанты оценивают в отношении продукции цитокинов. Используемые технологические критерии выпуска МСК на стадии 2 включают >95% позитивных в отношении CD73, CD90, CD105, и <5% позитивных в отношении CD34, CD45 и HLA-DR, с >500 пг/мл продукцией in vitro ангиопоэтина-1 и TGF-β, и >100 пг/мл VEGF и HGF и отрицательную стерильность. Клеточные линии, которые удовлетворяют технологическим критериям выпуска на стадии 2, затем дополнительно оставляют размножаться в биореакторе Terumo Quantum для стадии 3 технологического процесса. Технологические критерии выпуска для МСК на стадии 3 включают >95% позитивных в отношении CD73, CD90, CD105, и <5% позитивных в отношении CD34, CD45 и HLA-DR, тестируемых в отношении стерильности, эндотоксинов, микоплазмы, патогенного вируса человека и постороннего вируса. Мезенхимальные клеточные линии (популяции), которые прошли тесты, подвергают банкированию в качестве главного банка клеток (стадия 3). Главные банки клеток оттаивают и высевают в культуры, и критерии выпуска представляют собой стерильность, микоплазму и эндотоксин, и, наконец, 1×, 3× и 5×10⁶ МСК, которые проходят тесты, закупоривают в несущую среду, такую как 1 мл гипотермозоль®, и хранят при 2-8°С до фармацевтического введения (стадия 4).

На фиг. 2 показан результат анализа уровня секреции Ang-1, VEGF, HGF и TGF-β (здесь TGF-β1) в 10 отдельных популяциях МСК, полученных у 10 различных доноров пуповины, выращиваемых, как описано для фиг. 1 после стадии 2. На фиг. 2А показан уровень секреции трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) для индивидуальных популяций МСК 8049356, 8049358, 8049359, 8049364, 8049365, 8049369, 8049370, 8049372, 8049373 и 8049384. Уровень секреции для всех 10 популяций превышал пороговое значение для TGF-β, которое составляет приблизительно 500 пг/мл и обозначено красной линией. На фиг. 2В показан уровень секреции фактора роста гепатоцитов (HGF) для индивидуальных популяций МСК 8049356, 8049358, 8049359, 8049364, 8049365, 8049369, 8049370, 8049372, 8049373 и 8049384. Уровень секреции 8049365, 8049369, 8049372, 8049373 и 8049384 превышал пороговое значение для HGF, которое составляет приблизительно 100 пг/мл и обозначено красной линией. На фиг. 2С показан уровень секреции ангиопоэтина 1 (Ang-1) для индивидуальных популяций МСК 8049356, 8049358, 8049359, 8049364, 8049365, 8049369, 8049370, 8049372, 8049373 и 8049384. Уровень секреции для всех 10 популяций превышал пороговое значение для Ang-1, которое составляет приблизительно 500 пг/мл и обозначено красной линией. На фиг. 2D показан уровень секреции фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) для индивидуальных популяций МСК 8049356, 8049358, 8049359, 8049364, 8049365, 8049369, 8049370, 8049372, 8049373 и 8049384. За исключением 8049358, 8049359 и 8049370, уровень секреции для всех популяций превышал пороговое значение для VEGF, которое составляет приблизительно 100 пг/мл и обозначено красной линией.

На фиг. 3 показана оценка стабильности цитокиновой секреции в популяции МСК (8049372). Для этой задачи уровень секреции каждого из TGF-β, HGF, Ang-1 и VEGF определяли и сравнивали в двух отдельных образцах одной и той же популяции после стадии 4. На фиг. 3А показан уровень секреции TGF-β в двух отдельных образцах, свидетельствующий о стабильной белковой секреции приблизительно 2230 пг/мл и 2419 пг/мл после стадии 4, соответственно. На фиг. 3В показан уровень секреции HGF в двух отдельных образцах, свидетельствующий о стабильной белковой секреции приблизительно 933 пг/мл и 985 пг/мл после стадии 4, соответственно. На фиг. 3С показан уровень секреции Ang-1 в двух отдельных образцах, свидетельствующий о стабильной белковой секреции приблизительно 1800 пг/мл и 1854 пг/мл после стадии 4, соответственно. На фиг. 3D показан уровень секреции VEGF в двух отдельных образцах, свидетельствующий о стабильной белковой секреции приблизительно 210 пг/мл и 219 пг/мл после стадии 4, соответственно.

На фиг. 4 показаны результаты анализов для идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток. МСК, полученные из плаценты, вартонова студня (WJ-MCK) и амниотической мембраны пуповины, также называемые МСК, выстилающие пуповину (CL-MCK), выращивали в различных средах, подходящих для культивирования МСК (РТТ4, РТТ6 и DMEM/F12). Обнаружение белка осуществляли в супернатантах МСК, и анализ проводили с использованием Luminex 200 и программного обеспечения Xponent. На фиг. 4А обобщено измерение Ang-1. S1 обозначает самый высокий стандарт, используемый в анализе. Любые образцы, которые оказываются выше, рассматривают как экстраполяционные (слишком концентрированные). На графике изображено, что все из CL-MCK, WJ-MCK и плацентарных МСК, продуцируют гораздо более высокие уровни Ang-1 при культивировании в РТТ6 по сравнению с тем, когда МСК выращивали в РТТ4 или DMEM/F12. На фиг. 4В обобщено измерение VEGF в анализируемых супернатантах CL-MCK, WJ-MCK и плацентарных МСК, выращиваемых в РТТ6, РТТ4 или DMEM/F12. S1 обозначает самый высокий стандарт, используемый в анализе. Любые образцы, которые оказываются выше, рассматривают как экстраполяционные (слишком концентрированные). Как можно видеть на графике, все из CL-MCK, WJ-MCK и плацентарных МСК продуцируют гораздо более высокие уровни VEGF при культивировании в РТТ6 по сравнению с тем, когда МСК выращивали в РТТ4 или DMEM/F12. На фиг. 4С обобщено измерение HGF. На графике изображено, что все из CL-MCK, WJ-MCK и плацентарных МСК продуцируют гораздо более высокие уровни Ang-1 при культивировании в РТТ6 по сравнению с тем, когда МСК выращивали в РТТ4 или DMEM/F12. На фиг. 4D продемонстрировано одноплексное измерение TGF-β1. Как можно видеть на графике, все CL-MCK, WJ-MCK и плацентарных МСК продуцируют больше TGF-β при культивировании в РТТ6 чем при культивировании в DMEM/F12.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к нескольким способам, все из которых подходят для валидации и/или контроля качества для различных стадий способа получения популяций мезенхимальных стволовых клеток для терапевтического применения в соответствии с GMP. Во всех этих способах используется определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

Здесь неожиданно обнаружили, что определение уровень секреции Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF в среде популяции МСК представляет собой подходящий критерий для нескольких аспектов в способе получения популяции МСК в соответствии с GMP. Определение уровня секреции Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF в среде, в которой популяции МСК культивируют или хранят, может быть использовано для оценки ранозаживляющего потенциала популяции МСК, для идентификации (донора) ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции МСК с подходящим потенциалом к заживлению ран, для отбора популяции МСК для получения в соответствии с cGMP или для отбора популяции МСК для последующего фармацевтического введения или для генерирования главного банка клеток. Кроме того, определение уровня секреции Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF может быть использовано для идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток.

Здесь отмечается, что вовлечение Ang-1, TGF-β1, VEGF и HGF в процесс заживления ран известно специалистам в данной области техники. В отношении вовлечения Ang-1 (SEQ ID NO: 1) в заживление ран см., например, Li et al. Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:113 "Mesenchymal stem cells modified with angiopoietin-1 gene promote wound healing" или Bitto et al., "Angiopoietin-1 gene transfer improves the impaired wound healing of the genetically diabetic mice without increasing VEGF expression", Clinical Science May 14, 2008, 114 (12) 707-718. В исследовании Li et al. ген Ang-1 встраивали в мезенхимальные стволовые клетки костного мозга и результаты показали, что "Ang1-MCK значительно способствовали заживлению ран с повышенной эпидермальной и дермальной регенерацией и усиленным ангиогенезом по сравнению с МСК, Ad-Ang1 или ложной обработкой ". Примечательно, что авторы Li et al. указывают на то, что МСК сами по себе не продуцируют Ang-1 в достаточном количестве, и по этой причине авторы изобретения встроили ген Ang-1 в МСК, чтобы получить генетически модифицированную клетку.

В отношении вовлечения трансформирующего фактора роста бета, включая TGF-β1 (SEQ ID NO: 2), TGF-β2 и TGF-β3, в заживление ран, в частности заживление хронических/не заживающих ран, см., например, Ramirez et al. "The Role of TGFb Signaling in Wound Epithelialization" Advances In Wound Care, Volume 3, Number 7, 2013, 482-491 или Pakyari et al., Critical Role of Transforming Growth Factor Beta in Different Phases of Wound Healing, Advances In Wound Care, Volume 2, Number 5, 2012, 215-224.

В отношении вовлечения VEGF (SEQ ID NO: 3) в заживление ран, в частности заживление хронических/не заживающих ран, см., например, Froget et al., Eur. Cytokine Netw., Vol.14, March 2003, 60-64 или Bao et al., "The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Wound Healing" J Surg Res. 2009 May 15; 153(2): 347-358.

В отношении HGF (SEQ ID NO: 4) в заживлении ран, в частности заживлении хронических/не заживающих ран, см., например, Yoshida et al., "Neutralization of Hepatocyte Growth Factor Leads to Retarded Cutaneous Wound Healing Associated with Decreased Neovascularization and Granulation Tissue Formation" J. Invest. Dermatol. 120:335-343, 2003, Li, Jin-Feng et al. "HGF Accelerates Wound Healing by Promoting the Dedifferentiation of Epidermal Cells through β 1-Integrin/ILK Pathway." BioMed Research International 2013 (2013): 470418 или Conway et al, "Hepatocyte growth factor regulation: An integral part of why wounds become chronic". Wound Rep Reg (2007) 15 683-692.

Ранозаживляющий потенциал может описывать возможность, способность, компетентность или эффективность к облегчению или ускорению заживления ран. В настоящем изобретении популяции МСК рассматривают как обладающие достаточным потенциалом к заживлению ран, например, или ткань рассматривают как подходящую в качестве исходного материала для продуцирования фармацевтически подходящей популяции МСК, если уровень секреции (также называемый концентрацией) одного, двух, трех или всех четырех из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF равен или больше чем порог, специфичный для каждого из определенных здесь белков (см. также пример 2). Таким образом, оценка заживления ран включает определение уровня секреции Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF и последующее определение того, что достигаются или превышаются специфические пороговые значения. Оценка ранозаживляющего потенциала популяции МСК может быть осуществлена на различных стадиях культивирования МСК. Ранозаживляющий потенциал может быть оценен в ткани непосредственно перед культивированием МСК для идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции МСК, обладающей ранозаживляющим потенциалом и которая поэтому может подходить для последующего фармацевтического применения. Для того, чтобы быть подходящими для фармацевтического использования, популяции МСК могут быть получены в соответствии с условиями текущей Надлежащей Производственной Практики (cGMP). Таким образом, определение уровень секреции Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF до продуцирования популяции МСК может быть подходящим для отбора популяции МСК для продуцирования популяции МСК в условиях cGMP. Кроме того, популяция МСК может быть отобрана для последующего фармацевтического введения с использованием описанных в настоящем документе способов.

Популяцию МСК, отобранная в соответствии с настоящим изобретением, также может быть использована для генерирования главного банка клеток. В этом контексте, выбранная популяция МСК может быть дополнительно охарактеризована и протестирована в отношении целостности и контаминантов, таких как бактерии, грибы, микоплазмы и вирусы, перед криоконсервацией. После создания главный банк клеток МСК может обеспечить расширение конкретной популяции МСК для формирования культур для дальнейшего исследования или способов получения в зависимости оттого, что необходимо. Например, главный банк клеток МСК, содержащий МСК со свойствами заживления ран, может обеспечить размножение конкретной популяции МСК, которая может секретировать количество Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, идеальное для заживления ран.

Уровень секреции Ang-1, TGF-β, VEGF и/или HGF используется в качестве критерия отбора в описанных здесь способах. Уровень секреции, равный или превышающий порог, может, например, указывать на (1) потенциал популяции МСК к заживлению ран или на (2) ткань или выделенную клеточную популяцию, подходящую в качестве исходного материала для продуцирования популяции МСК. В настоящем изобретении порог для Ang-1 может составлять приблизительно 100 пг/мл, приблизительно 200 пг/мл, приблизительно 300 пг/мл, приблизительно 400 пг/мл, приблизительно 500 пг/мл, приблизительно 600 пг/мл, приблизительно 700 пг/мл, приблизительно 800 пг/мл, приблизительно 900 пг/мл или приблизительно 1000 пг/мл. Предпочтительно, для Ang-1 порог составляет приблизительно 500 пг/мл. Порог для TGF-β может составлять приблизительно 100 пг/мл, приблизительно 200 пг/мл, приблизительно 300 пг/мл, приблизительно 400 пг/мл, приблизительно 500 пг/мл, приблизительно 600 пг/мл, приблизительно 700 пг/мл, приблизительно 800 пг/мл, приблизительно 900 пг/мл или приблизительно 1000 пг/мл. Предпочтительно, для TGF-β порог составляет приблизительно 500 пг/мл. В отношении VEGF порог может составлять приблизительно 80 пг/мл, приблизительно 100 пг/мл, приблизительно 120 пг/мл, приблизительно 140 пг/мл, приблизительно 160 пг/мл, приблизительно 180 пг/мл или приблизительно 200 пг/мл, где порог для VEGF предпочтительно составляет приблизительно 100 пг/мл. Возвращаясь к HGF порог может составлять приблизительно 80 пг/мл, приблизительно 100 пг/мл, приблизительно 120 пг/мл, приблизительно 140 пг/мл, приблизительно 160 пг/мл, приблизительно 180 пг/мл или приблизительно 200 пг/мл. Предпочтительно, для HGF порог составляет приблизительно 100 пг/мл.

В одном из примеров в соответствии с настоящим изобретением используют следующие пороговые уровни (величины):

- порог приблизительно 400 пг/мл для ангиопоэтина 1 (Ang-1)

- порог приблизительно 400 пг/мл для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β)

- порог приблизительно 80 пг/мл для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) - порог приблизительно 80 пг/мл для фактора роста гепатоцитов (HGF).

В еще одном примере в соответствии с настоящим изобретением используют следующие пороговые уровни (величины):

- порог приблизительно 500 пг/мл для ангиопоэтина 1 (Ang-1)

- порог приблизительно 500 пг/мл для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β)

- порог приблизительно 100 пг/мл для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF)

- порог приблизительно 100 пг/мл для фактора роста гепатоцитов (HGF).

В этих двух примерах уровень секреции для всех четырех белков, равный или превышающий соответствующую пороговое значение уровня секреции/концентрации (см., например, пример 2), например, соответствует популяции МСК, обладающей подходящими ранозаживляющими свойствами или ткани, подходящей для исходного материала для продуцирования фармацевтически подходящей популяции МСК. Здесь отмечается, что концентрации, определенные в настоящем изобретении, и, таким образом, пороговые уровни, предпочтительно представляют собой абсолютные концентрации.

Любые фармацевтически подходящие популяции МСК могут быть использованы в настоящем изобретении. Таким образом, популяции МСК могут быть получены из любой ткани млекопитающего или компартмента/части организма, которые, как известно, содержат МСК. В иллюстративных примерах популяции МСК могут представлять собой популяции МСК пуповины, плацентарные популяции МСК, популяции МСК пуповинно-плацентарного сочленения, популяции МСК пуповинной крови, МСК костного мозга или происходящие из популяции МСК жировой ткани. Популяции МСК пуповины могут быть (получены) из любого компартмента ткани пуповины, который содержит МСК, такого как амнион, периваскулярная популяция МСК, популяция МСК вартонова студеня, популяция МСК амниотической мембраны пуповины, а также смешанная популяция МСК пуповины, означающая популяцию МСК, которая включает стволовые клетки из двух или более чем двух из этих компартментов. МСК из этих компартментов и их выделение из компартментов известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в Subramanian et al "Comparative Characterization of Cells from the Various Compartments of the Human Umbilical Cord Shows that the Wharton's Jelly Compartment Provides the Best Source of Clinically Utilizable Mesenchymal Stem Cells", PLoS ONE 10(6): e0127992, 2015 и цитированных в нем ссылках, Van Pham et al. "Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications", Cell Tissue Bank (2016) 17:289-302, 2016. Например, смешанная популяция МСК пуповины может быть получена путем удаления артерий и вен из ткани пуповины, нарезания оставшейся ткани и вартонова студня на кусочки и культивирования ткани пуповины (в виде тканевого эксплантата) в культуральной среде в соответствии с настоящим изобретением. Смешанная популяция МСК пуповины также может быть получена путем культивирования всей ткани пуповины с интактными пупочными сосудами в виде тканевого эксплантата в условиях (культивирование в сывороточной DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) с 10% фетальной телячьей сывороткой, 10% лошадиной сывороткой и 1% пенициллином/стрептомицином), как описано в Schugar et al. "High harvest yield, high expansion, and phenotype stability of CD146 mesenchymal stromal cells from whole primitive human umbilical cord tissue. Journal of biomedicine & biotechnology. 2009; 2009:789526". В этом контексте отмечается, что популяции МСК пуповинно-плацентарного сочленения могут быть выделены, как описано в Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp.2017; (122): 55224. В примерах в соответствии с настоящим изобретением популяции МСК получены из пуповины или амниотической мембраны пуповины (см. примеры 1-4). Популяции МСК амниотической мембраны пуповины могут быть четко определенными и гомогенными. Таким образом, в одном из воплощений в соответствии с настоящим изобретением используют популяции мезенхимальных стволовых клеток, описанные в международной патентной заявке WO 2018/067071. Таким образом, в типичных примерах способа по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более МСК экспрессируют следующие маркеры: CD73 (SEQ ID NO. 5), CD90 (SEQ ID NO. 6) и CD105 (SEQ ID NO. 7). Кроме того, в этих примерах по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более МСК могут не экспрессируют следующие маркеры: CD34 (SEQ ID NO. 8), CD45 (SEQ ID NO. 9) и HLA-DR (SEQ ID NO. 10). В конкретных примерах приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более или приблизительно 99% или более популяции МСК экспрессируют CD73, CD90 и CD105, но не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR. В предпочтительных примерах по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток популяции МСК экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105, тогда как по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более МСК могут не экспрессировать CD34, CD45 и HLA-DR. В конкретных примерах приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более или приблизительно 99% или более популяции МСК экспрессируют CD73, CD90 и CD105, но не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR.

В настоящем изобретении уровень Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF как правило определяют в супернатанте среды, в которой популяции МСК хранили, транспортировали или культивировали. Популяции МСК могут храниться в течение длительного или короткого периода времени. Примеры сред для длительного хранения включают без ограничения глицерин и трегалозу, дающие возможность для хранения при приблизительно -80°С, или криопротектор, такой как диметилсульфоксид (DMSO), дающий возможность для хранения при приблизительно -195°С. Краткосрочное хранение может включать транспортировку к месту введения (такому как врачебный кабинет или госпиталь) и/или хранение в течение некоторого периода времени до тех пор, пока популяция МСК не будет введена субъекту. Эксципиент HypoThermosol® представляет собой иллюстративный пример среды для кратковременного хранения. Эта среда для консервации подходит для транспортировки, обеспечивая хранение МСК при приблизительно от 2 до 8°С. Еще один пример среды, подходящей для транспортировки, представляет собой плазмалит. Примеры сред, подходящих для культивирования МСК, могут включать без ограничения имеющуюся в продаже среду, такую как CTS StemPro МСК SFM, MesenPRO RS Medium, StemPro МСК SFM XenoFree. В одном из примеров в соответствии с настоящим изобретением культуральная среда для клеток МСК может представлять собой среду для культивирования РТТ6, которая описана в международной патентной заявке WO 2018/067071. Таким образом, в соответствии с описанием международной заявки на патент WO 2018/067071, культуральная среда для клеток МСК может включать модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), среду Хэма F12 (F12), бессывороточную базовую среду, такую как М171, и фетальную телячью сыворотку (FBS). Таким образом, в одном из примеров среда может содержать DMEM в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно от 5 до 15% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно от 15 до 30% (об./об.) и FBS в конечной концентрации приблизительно от 1 до 8% (об./об.). Используемая в настоящем документе величина "% (об./об.)" относится к объему индивидуального компонента относительно конечного объема среды. Это означает, что, если DMEM, например представлен в среде в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% (об./об.), то 1 литр среды содержит приблизительно от 550 до 650 мл DMEM. В других примерах среда может содержать DMEM в конечной концентрации приблизительно от 57,5 до 62,5% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно от 7,5 до 12,5% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно от 17,5 до 25,0% (об./об.) и FBS в конечной концентрации приблизительно от 1,75 до 3,5% (об./об.). В других примерах среда может содержать DMEM в конечной концентрации приблизительно 61,8% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 11,8% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно 23,6% (об./об.) и FBS в конечной концентрации приблизительно 2,5% (об./об.). Дополнительно к вышеупомянутым компонентам среда может содержать добавки, которые являются благоприятными для культивирования МСК. В настоящем изобретении культуральная среда для МСК может, например, содержать эпидермальный фактор роста (EGF). Если EGF присутствует, то он может быть представлен в культуральной среде в конечной концентрации приблизительно от 1 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл. В некоторых из этих примеров культуральная среда может содержать EGF в конечной концентрации приблизительно 10 нг/мл. Культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением также может содержать инсулин. Если инсулин присутствует, то он может быть представлен в конечной концентрации приблизительно от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. В некоторых из этих примеров культуральная среда может содержать инсулин в конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл. Культуральная среда может дополнительно содержать по меньшей мере одну из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). В таких примерах культуральная среда может содержать все три из аденина, гидрокортизона и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). В этих примерах, культуральная среда может содержать аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл. В этом контексте, отмечается то, что путем культивирования популяции МСК в среде, как в настоящем документе описано, может быть увеличена экспрессия и/или секреция по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF.

В способе в соответствии с настоящем изобретении может потребоваться подвергать среду центрифугированию для определения концентрации Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF в среде, которая содержит МСК, как правило после подходящего периода времени. В этом контексте подходящей период времени может представлять собой любой период инкубации (если клеточную популяцию, например, хранят или транспортируют в среде для хранения или транспортировочной среде, такой как гипотермозоль) или период культивирования (если клеточную популяцию выращивают в культуральной среде), подходящий для секреции популяцией МСК белков в детектируемом количестве. В иллюстративном примере подходящий период времени может представлять собой период инкубации или культивирования приблизительно 6 ч, приблизительно 12 ч, приблизительно 18 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 30 ч, приблизительно 36 ч, приблизительно 42 ч, приблизительно 46 ч, приблизительно 48 ч, приблизительно 50 ч или приблизительно 54 ч. После центрифугирования супернатант подвергнутой центрифугированию среды может быть подвергнут иммуноанализу для определения уровней/концентрации секретируемых белков. Любой иммуноанализ, подходящий для обнаружения одного или нескольких секретируемых белков в среде, может применяться в настоящем изобретении. Иллюстративные примеры подходящих иммуноанализов для обнаружения белка в среде представляет собой иммуноферментный анализ (ELISA) или одноплексный анализ. Одноплексные анализы (имеющиеся в продаже, например, от Bio Vendor, Brno, Czech Republic, под товарным знаком Q-Plex или от R&D Systems Inc, Minneapolis, USA) могут быть осуществлены путем нанесения двух пятен, состоящих из захваченных антител, в определенной матрице на дно каждой лунки 96-луночного планшета для ИФА (дополнительно к анализируемому пятну второе пятно представляет собой пятно положительного контроля для обеспечения надлежащей процедуры анализа). Пример подходящего анализа, который обнаруживает множество белков в среде, представляет собой мультиплексный анализ. В таком мультиплексном анализе множество анализируемых веществ может быть иммобилизовано на твердой поверхности, такой как планшет для ИФА, который разделяет анализируемые вещества в пространстве. Альтернативно, мультиплексный анализ также может быть осуществлен с использованием анализируемых веществ, которые иммобилизированы на микрошариках или частицах. В таком случае в анализах для каждого анализируемого вещества используют различные микрошарики/частицы. В иллюстративных примерах мультиплексный анализ, основанный на микрошариках, может быть использован для обнаружения секретируемого Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF в среде (см. пример 1 и пример 4). Такие системы мультиплексного анализа для одновременного обнаружения и количественного определения множества желаемых анализируемых веществ в сложных образцах, таких как клеточная культуральная среда, имеются в продаже, например, от R&D Systems Inc, Minneapolis, USA, такие как анализы Luminex® и высокоэффективные анализы Luminex®.

Настоящее изобретение также относится к применению по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, для оценки ранозаживляющего потенциала популяции МСК. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, для отбора популяции МСК для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP. Следовательно, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, для отбора популяции МСК для продуцирования популяции стволовых клеток для последующего фармацевтического введения. Настоящее изобретение также относится к применению по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, для отбора популяции МСК для генерирования главного банка клеток.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, для отбора популяции МСК для идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции МСК для фармацевтического использования. В настоящем изобретении, такая ткань может представлять собой любую ткань млекопитающего или компартмент/часть организма, которая, как известно, содержит МСК. Примеры такой ткани включают без ограничения костный мозг, жировую ткань, плацентарную ткань, ткань пуповинно-плацентарного сочленения, ткань пуповины, такую как вартонов студень, представляющий собой название амниотической мембраны пуповины, и представляют собой немногие из тканей-источников МСК. В одном примере ткань представляет собой пуповину или амниотическую мембрану пуповины, и получаемые из нее популяции МСК, могут представлять собой популяции МСК амниотической мембраны пуповины.

Для определения того, подходит ли ткань, например, от конкретного донора, в качестве исходного материала для продуцирования популяции МСК для фармацевтического использования, ткань, например, может быть непосредственно выращена в виде тканевого экспланта. Для такого тканевого экспланта образец соответствующей ткани (например, вартонов студень, плацентарный амнион или амниотическая мембраны пуповины) может быть помещен в тканевые культуральные чашки и выращиваться в подходящей среде для культивирования/ростовой среде, как в настоящем документе описано (в этой связи см. также патент США №9085755 или 9737568). Затем происходит клеточное разрастание из ткани (миграция МСК из ткани на поверхность культуральной чашки) после подходящего периода культивирования, и культуральная среда затем может быть проанализирована в отношении секреции Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF. Альтернативно, популяция МСК сначала может быть выделена из выбранной ткани с использованием известного способа выделения, и выделенная популяции МСК затем может быть выделена в подходящей среде и проверена в отношении секреции Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF. Независимо от ткани применение Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF для описанных в настоящем документе способов может включать определение в среде по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или всех четырех из указанных белков, секретируемых в указанную среду указанной популяцией МСК или образцом ткани, или клеткой, выделенной из образца ткани.

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток. Также этот способ включает определение уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, секретируемого в клеточную культуральную среду указанной популяцией МСК. Следовательно, настоящее изобретение также относится к применению по меньшей мере одного белка для идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств мезенхимальных стволовых клеток. Это применение может включать определение в клеточной культуральной среде уровня по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, секретируемых в указанную клеточную культуральную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

Изобретение далее будет проиллюстрировано следующими неограничивающими объем изобретения экспериментальными примерами.

Последовательности описанных в настоящем документе полипептидов представлены в таблице 1.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ

Пример 1: Идентификация подходящей пуповины, содержащей МСК, оценка и отбор популяции МСК, полученных из пуповины, для создания фармацевтической композиции, подходящей для заживление ран.

МСК получали из свежей ткани пуповины, отобранной в госпитале Университета Колорадо.

Стадия 1: Банк тканей

На первой стадии отбирают пуповины из ткан донора, обычно после получения согласия Комиссии по биомедицинской этике (IRB). Свежеотобранную пуповину, нарезанную на срезы от 1 до 2 мм³, замораживают с контролируемой скоростью во флаконах, содержащих от 4 до 5 сегментов, и хранят в карантине в парах жидкого азота (LN₂) при -196°С (см. фиг. 1). Материнские образцы крови, отобранные в течение семи суток после доставки, исследуют в отношении инфекционных заболеваний, и ткани тестируют в отношении микробной контаминации. Технологические критерии выпуска для стадии 1 включают отрицательный результат по инфекционному заболеванию для всех тестов за исключением CMV, отрицательную стерильность, и приемлемый опросник матери. Хотя пуповины естественным образом контаминируются вагинальной флорой во время доставки, подбор антибиотиков обеспечат некоторым из них стерильность. До 100 образцов пуповины могут быть отобраны в такой банк тканей. Стерильные ткани будут использованы на стадии 2.

Стадия 2: Развитие культур

Развивающиеся культуры представляют собой разрастания пуповинных тканей, которые используют для получения чистых линий МСК. 10 сегментов тканей по отдельности помещают в 6-луночные планшеты и оставляют для размножения в течение приблизительно 10-20 суток с получением клеток 0 пассажа (Р0). Клетки Р0 высевают в колбу 175 см² и культивируют для получения клеток 1 пассажа 1 (Р1). Клетки Р1 замораживают в количестве 1-3×10⁶ клеток/флакон в CryoStor 5 или высевают в культуру. Клетки 1 пассажа высевают в количестве 2-3×10⁵ клеток/175 см² флакон. Во время размножения регистрируют клеточную морфологию. Клетки 2 пассажа (Р2) оценивают путем проточной цитометрии в отношении маркеров МСК, и супернатанты оценивают в отношении продукции цитокинов. Подробнее, клетки Р2 подвергают мультиплексному анализу (R&D Systems/Bio-techne кат №LXSAHM) в отношении следующих аналитов: Ang-1, VEGF, HGF, и одноплексный анализ осуществляли в отношении TGF-β. Анализы осуществляли следующим образом:

Мультиплексный анализ:

(1) Стандарт готовили путем комбинирования 100 мкл каждого стандарта в одной микроцентрифужной пробирке, уже содержащей подходящий объем полной среды РТТ6, с получением общего объема 1000 мкл. Стандарт S1 содержал все мультиплексные стандарты, комбинированные вместе в одном флаконе. Для приготовления 3-кратного серийного разведения S1 200 мкл полной среды РТТ6 пипетировали в каждую из пяти 1,5 мл полипропиленовых пробирок, помеченных как S2-S6. Затем 100 мкл переносили из S1 в S2. После перемешивания вихревым способом 100 мкл переносили из S2 в S3. Процедуру продолжали вплоть до S6. Полная среда РТТ6 служила в качестве контроля.

(2) Микрошарики готовили путем осторожного перемешивания вихревым способом флакона для ресуспендирования. Было важно соблюдать осторожность, чтобы не переворачивать флакон. Если использовали весь планшет, тогда 500 мкл микрошариков комбинировали с 5,0 мл разбавителя RD2-1. Если использовали меньшее количество лунок, тогда объемы корректировали соответствующим образом. Флакон или лунки защищали от света.

(3) При необходимости: приготовление образца. Все образцы использовали неразбавленными, если только концентрация образца не превышала самое высокое значение стандарта (S1). В таком случае анализ повторяли с образцом, разведенным подходящим образом. Для разведения использовали РТТ6. Все образцы измеряли в трех параллелях.

(4) Микрошарики осторожно перемешивали вихревым способом перед добавлением 50 мкл в каждую лунку с использованием многоканального дозатора и резервуара.

(5) 50 мкл стандарта или образца добавляли в лунку. Затем планшет закрывали при помощи приспособления для заклеивания планшетов и инкубировали без света в течение 2 ч при комнатной температуре (RT) в орбитальном шейкере при 800 об/мин.

(6) Во время инкубирования образца коктейль из биотина и антитела готовили путем осторожного перемешивания вихревым способом флакона для ресуспендирования. Было важно соблюдать осторожность, чтобы не переворачивать флакон. Затем 500 мкл коктейля из биотина и антитела комбинировали с 5,0 мл разбавителя RD2-1. Раствор тщательно перемешивали.

(7) Стрептавидин с фикоэритрином (РЕ) готовили путем осторожного перемешивания вихревым способом флакона для ресуспендирования (осторожно, чтобы не переворачивать флакон). Затем 200 мкл концентрата стрептавидин-РЕ комбинировали с 5,35 мл буфера для промывания. Раствор тщательно перемешивали и защищали от света.

(8) Планшет промывали следующим образом: планшет прикрепляли к магниту и оставляли по меньшей мере на минуту. Пока планшет был прикреплен к магниту, его быстро переворачивали для выливания содержимого планшета в раковину, а затем мощно стряхивали вниз (1-2 раза) для опустошения лунок. Полное удаление жидкости путем переворачивания, а не промакивание планшета, было необходимо. Магнит отсоединяли и лунки заполняли 100 мкл буфера для промывания с использованием многоканального дозатора. После этого, магнит повторно прикрепляли и оставляли на минуту перед осуществлением выливания, как описано ранее. Промывание повторяли в общей сложности 3 раза.

(9) 50 мкл разведенного биотинилированного антитела добавляли в каждую лунку с использованием многоканального дозатора. Планшет закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в шейкере при 800 об/мин. После этого планшет 3 раза промывали, как ранее.

(10) 50 мкл разбавленного стрептавидина-РЕ добавляли в каждую лунку. Планшет закрывали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в шейкере, как ранее. После этого, планшет 3 раза промывали, как ранее.

(11) 100 мкл буфера для промывания добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре в шейкере, как ранее. Затем, содержимое лунок немедленно переносили в 96-луночный планшет Costar 6509 с использованием многоканального дозатора, установленного на 120 мкл. Планшет затем помещали в направляющее гнездо сканера Luminex 3D.

(12) Планшет считывали и анализировали с использованием Luminex 3D и программного обеспечения Xponent.

Моноплекс TGF-β1:

(1) Стандарт готовили с использованием полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл для осуществления разведений. С этой целью 500 мкл стандарта S1 пипетировали в пробирку S1. В пробирки S2-S6 добавляли по 200 мкл полной среды РТТ6. Путем серийного переноса 100 мкл из одной S1 вплоть до S7 и обеспечения тщательного перемешивания стандарт разбавляли 1:3.

(2) Микрошарики готовили путем осторожного перемешивания вихревым способом флакона для ресуспендирования. Было важно соблюдать осторожность, чтобы не переворачивать флакон. Если использовали весь планшет, тогда 50 мкл микрошариков комбинировали с 5,0 мл разбавителя для микропланшет RD2-1. Если использовали меньшее количество лунок, тогда объемы корректировали соответствующим образом. Флакон или лунки защищали от света.

(3) Для приготовления иммунореактивного TGF-β1 (только образцы, не стандарт) 30 мкл активирующего реактива добавляли к 150 мкл супернатанта. Раствор тщательно перемешивали и инкубировали в течение 10 мин при КТ. Все образцы использовали неразбавленными, если только концентрация образца не превышала самое высокое значение стандарта (S1). В таком случае анализ повторяли с образцом, разведенным подходящим образом. Для разведения использовали РТТ6. Все образцы измеряли в трех параллелях.

(4) Микрошарики осторожно перемешивали вихревым способом перед добавлением 50 мкл в каждую лунку с использованием многоканального дозатора и резервуара.

(5) 50 мкл стандарта или образца добавляли в лунку. Затем планшет закрывали при помощи приспособления для заклеивания планшетов и инкубировали без света в течение 2 ч при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 800 об/мин.

(6) Во время инкубирования образца коктейль из биотина и антитела готовили путем осторожного перемешивания вихревым способом флакона для ресуспендирования. Было важно соблюдать осторожность, чтобы не переворачивать флакон. Затем 50 мкл концентрата биотинилированного антитела комбинировали с 5,0 мл разбавителя для биотинилированного антитела. Раствор тщательно перемешивали.

(7) Стрептавидин с фикоэритрином (РЕ) готовили путем осторожного перемешивания вихревым способом флакона для ресуспендирования (осторожно, чтобы не переворачивать флакон). Затем 55 мкл 100 × концентрата стрептавидина-РЕ комбинировали с 5,35 мл буфера для промывания. Раствор тщательно перемешивали и защищали от света.

(8) Планшет промывали следующим образом: планшет прикрепляли к магниту и оставляли по меньшей мере на минуту. Пока планшет был прикреплен к магниту, его быстро переворачивали для выливания содержимого планшета в раковину, а затем мощно стряхивали вниз (1-2 раза) для опустошения лунок. Полное удаление жидкости путем переворачивания, а не промакивание планшета, было необходимо. Магнит отсоединяли и лунки заполняли 100 мкл буфера для промывания с использованием многоканального дозатора. После этого, магнит повторно прикрепляли и оставляли на минуту перед осуществлением выливания, как описано ранее. Промывание повторяли в общей сложности 3 раза.

(9) 50 мкл разведенного биотинилированного антитела добавляли в каждую лунку с использованием многоканального дозатора. Планшет закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в шейкере при 800 об/мин. После этого планшет 3 раза промывали, как ранее.

(10) 50 мкл разбавленного стрептавидина-РЕ добавляли в каждую лунку. Планшет закрывали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в шейкере, как ранее. После этого, планшет 3 раза промывали, как ранее.

(11) 100 мкл буфера для промывания добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре в шейкере, как ранее. Затем, содержимое лунок немедленно переносили в 96-луночный планшет Costar 6509 с использованием многоканального дозатора, установленного на 120 мкл. Планшет затем помещали в направляющее гнездо сканера Luminex 3D.

(12) Планшет считывали и анализировали с использованием Luminex 3D и программного обеспечения Xponent.

Стадия 3: Главный банк клеток

3 клеточные линии, которые удовлетворяли технологическим критериям выпуска стадии 2, затем высевали в биореактор Terumo Quantum в количестве 20-40×10⁶ жизнеспособных клеток и оставляли расти в течение приблизительно 7-14 суток. Клетки после культивирования в Quantum тестировали в отношении стерильности, эндотоксина, микоплазмы, патогенного вируса человека и постороннего вируса. Клетки подвергали криоконсервации в количестве 9-10×10⁶ клеток/флакон (50-70 флаконов в партии). МСК выращивали в колбах и в Terumo Quantum в культуральной среде РТТ6, имеющей следующий состав: на 1000 мл (500 мл базовой среды РТТ6, 236 мл М171, 236 мл DMEM F12, 25 мл фетальной телячьей сыворотки, 0,1 мл 0,1 мг/мл эпидермального фактора роста [конечная концентрация 10 нг/мл]), 0,35 мл инсулина (конечная концентрация 5 мкг/мл), и инкубировали при 37°С в 5% CO₂.

Стадия 4: Терапевтические культуры

1×, 3× и 5×10⁶ МСК, которые были позитивными при тестировании в отношении Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, разливали по флаконам в Hypothermosol® и хранили при 2-8°С до фармацевтического введения.

Пример 2: Анализ уровня секреции белка для идентификации подходящих донорных пуповин

Для анализа 10 пуповин отбирали у различных доноров. Эти пуповины использовали для продуцирования 10 индивидуальных популяций МСК, полученных из амниотической мембраны пуповины.

Задача эксперимента заключалась в том, чтобы определить уровень секреции Ang-1, VEGF, HGF и TGF-β1 для того, чтобы сделать заключение о переменных в профиле секреции индивидуальных популяций МСК и для идентификации популяции МСК с достаточной секрецией Ang-1, VEGF, HGF и TGF-β1.

Таким образом, индивидуальные популяции МСК выращивали в соответствии с настоящим изобретением и после стадии 2 уровень секреции Ang-1, VEGF, HGF и TGF-β (здесь TGF-β1) определяли для каждой популяции МСК, как описано в примере 1. Результаты анализа уровня секреции представлены на фиг. 2, где специфический порог для белка (500 пг/мл для Ang-1 и TGF-β, соответственно, и 100 пг/мл для VEGF и HGF, соответственно), обозначен горизонтальной черной линией.

Как можно видеть из результата, уровень секреции TGF-β1 больше чем вдвое выше чем пороговое значение во всех 10 индивидуальных популяциях МСК. Таким образом, пороговое значение 500 пг/мл для TGF-β1 было превышено для всех индивидуальных популяций МСК. Отложенные на графике уровни секреции HGF демонстрируют, что 5 из 10 образцов превышают пороговое значение 100 пг/мл, а именно: популяция МСК 8049365, демонстрирующая уровень секреции приблизительно 600 пг/мл, популяция МСК 8049369, демонстрирующая уровень секреции приблизительно 300 пг/мл, популяция МСК 8049372, демонстрирующая уровень секреции приблизительно 1450 пг/мл, популяция МСК 8049373, демонстрирующая уровень секреции приблизительно 380 пг/мл, и популяция МСК 8049384, демонстрирующая уровень секреции приблизительно 190 пг/мл. Отложенные на графике уровни секреции Ang-1 демонстрируют, что все индивидуальные популяции МСК превышали пороговое значение 500 пг/мл. Уровни секреции VEGF демонстрируют, что пороговое значение 100 пг/мл было превышено для всех образцов, за исключением 8049358, 8049359 и 8049370. В этом контексте, уровень секреции 8049359 составлял лишь приблизительно 50 пг/мл, тогда как уровни 8049358 и 8049359 были близки к нулю.

Результаты показывают, что уровень секреции белка для различных индивидуальных популяций МСК варьирует, подтверждая то, что МСК обладают индивидуальными профилями секреции. Для идентификации популяции МСК с достаточной секрецией Ang-1, VEGF, HGF и TGF-β1 анализировали уровень секреции этих белков.

В этом контексте МСК проявляют достаточную секрецию Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, если уровни этих белков превышают их соответствующие пороговые величины. Соответственно, популяции МСК 8049365, 8049369, 8049372, 8049373 и 8049384 (каждая из которых получена от различных доноров пуповины) проявляют достаточную секрецию Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF, поскольку они представляют собой единственные популяции МСК, у которых превышена пороговая величина, заданная для каждого из четырех выбранных белков. Для последующих экспериментов (основание главного банка клеток и продукция клеток для фармацевтических задач) здесь выбрали популяцию МСК 8049372.

Пример 3: Анализ стабильности уровня секреции

Популяцию МСК 8049372, демонстрирующую достаточную секрецию белков Ang-1, TGF-β, VEGF и HGF в примере 2, использовали для анализа стабильности уровня белковой секреции. Таким образом, популяцию МСК дополнительно культивировали до четвертого клеточного пассажа. Затем два образца популяции МСК после стадии 4 (МСК из лунки 1 и МСК из лунки 2) анализировали в отношении уровня секреции Ang-1, VEGF, HGF и TGF-β (здесь TGF-β1), как описано в примере 1. Уровень белковой секреции для популяции МСК 8049372, определенный в этом эксперименте (после стадии 4), затем сравнивали с уровнями секреции популяции МСК 8049372, определенными в примере 2 (после стадии 2). Таким образом, могут быть выявлены изменения уровней секреции в различные моменты времени. Следовательно, можно сделать заключение о стабильности уровня секреции белка и, вследствие этого, о достаточности белковой секреции с течением времени. Результаты представлены на фиг. 3.

После стадии 2 популяция МСК 8049372 проявляла уровень секреции приблизительно 2200 пг/мл для TGF-β1. После еще двух пассажей клеток популяция МСК 8049372 после стадии 4 проявляет в среднем приблизительно 2345 пг/мл TGF-β1. Таким образом, уровень секреции популяции МСК 8049372 увеличивался приблизительно на 7% после еще двух пассажей клеток. Уровень секреции HGF уменьшался приблизительно на 33% после еще двух пассажей клеток от приблизительно 1450 пг/мл после стадии 2 до приблизительно 959 пг/мл в среднем после стадии 4. Популяция МСК 8049372 после стадии 4 проявляет в среднем приблизительно 1827 пг/мл Ang-1, что представляет собой уменьшение приблизительно на 9% относительно 2000 пг/мл Ang-1 после стадии 2. Уровень секреции VEGF увеличивался приблизительно на 43% после еще двух пассажей клеток от приблизительно 150 пг/мл после стадии 2 до приблизительно 215 пг/мл в среднем после стадии 4.

Результаты демонстрируют, что уровень секреции белков Ang-1, VEGF, HGF и TGF-β (здесь TGF-β1) также варьирует после еще двух пассажей клеток. Тем не менее, выбранные здесь соответствующие пороговые величины все еще были превышены для всех анализированных белков после еще двух пассажей клеток. Следовательно, результаты этого эксперимента указывают на то, что популяция МСК 8049372 сохраняла относительную стабильность белковой секреции и, таким образом, свой ранозаживляющий потенциал. Таким образом, эти результаты показывают, что ранозаживляющий потенциал популяции МСК может быть стабилен в течение определенного периода. На основе этого результата популяция МСК 8049372 представляет собой подходящий кандидат в качестве исходного материала для генерирования главного банка клеток или для приготовления фармацевтической композиции для последующего введения субъекту.

Пример 4: Идентификация среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств мезенхимальных стволовых клеток

Для этого эксперимента различные выделенные популяции МСК амниотической мембраны пуповины выращивали в РТТ4, РТТ6 или DMEM/F12, как описано в международной патентной заявке WO 2018/067071, и затем анализировали в отношении секреции ранозаживляющих маркерных белков для сравнения. Протокол культивирования выделенных МСК

5 миллионов МСК высевали в чашки для культуры тканей 100 мм в DMEM/F12/10%FCS в течение 24 ч.

Среду сливали и РТТ4, РТТ6 / DMEM/F12 добавляли в культуру на 24 ч.

Среду сливали и клетки промывали PBS.

10 мл DMEM добавляли в культуру на 24 ч.

Среду сливали и в культуру добавляли 5 мл DMEM.

После культивирования в течение 24 ч кондиционированные среды собирали, центрифугировали для удаления клеточного дебриса, супернатант аликвотировали в пробирки для хранения при -80°С и последующего анализа секреции маркерного белка при помощи цитокиновых анализов.

Анализ уровня секреции в супернатантах на средах РТТ4, РТТ6 по сравнению с супернатантами на средах DMEM/F12

Анализ уровня секреции осуществляли в супернатантах МСК. Измерение и анализ осуществляли с использованием Luminex 200 и программного обеспечения Xponent.

Каждый образец тестировали в трех параллелях за исключением образцов супернатанта плаценты. Задача этого эксперимента заключалась в получении цитокиновых профилей МСК, выращиваемых в РТТ4 или РТТ6, и в сравнении профилей МСК из различных тканей (выстилка пуповины по сравнению с вартоновым студнем по сравнению с плацентарными МСК). Измерения уровней цитокинов осуществляли, как описано ниже. Полученный профиль проливает свет на то, какие популяции стволовых клеток при выращивании в какой среде, могут секретировать больше интересующих цитокинов, что указывает на то, какая среда подходит для индуцирования или стимулирования ранозаживляющих свойств МСК.

Мультиплексный анализ

Информация о мультиплексе:

R&D Systems/Bio-techne кат №LXSAHM. Набор представляет собой партию №L123680, срок годности 08/28/18, со следующими анализируемыми веществами:

Ang-1, ангиопоэтин

VEGF, фактор роста эндотелия сосудов

HGF, фактор роста гепатоцитов

Информация об моноплексе TGFβ1: R&D Systems/Bio-techne:

Основной набор, кат.№LTGM00, партия №Р156217, получен 02/27/18, срок годности 08/30/18.

Компонент TGFβ1, кат. №LTGM100, партия №Р161760, получен 02/27/18, срок годности 11/27/19.

Информация о мультиплексе:

R&D Systems/Bio-techne кат №LXSAHM Набор представляет собой партию №L123999, срок годности 09/25/18, включающий следующие анализируемые вещества:

Ang-1, ангиопоэтин

VEGF, фактор роста эндотелия сосудов

HGF, фактор роста гепатоцитов

Ввод данных

Вывод не обработанных данных осуществляли в форматах PDF и Excel. Данные в формате Excel использовали для обработки.

Процедура

Обнаружение белка в супернатантах МСК осуществляли в соответствии с информацией о подробном протоколе. Как часть этого эксперимента, протокол имеет единственную поправку: стандарт 8 в мультиплексном наборе больше не используется. Причина для удаления стандарта 8 заключается в том, что в самом протоколе R&D используются только стандарты 1-6. Кроме того, стандарт 8 валидирован только для двух из шести анализируемых веществ, которые содержит мультиплексный набор: HGF. В случае HGF это анализируемое вещество оказывается в средней области стандартной кривой. Поскольку стандарты разводят с использованием ростовых сред, то стандартные кривые строили с использованием как РТТ4, так и РТТ6. Тестируемые образцы, выращенные в РТТ4 или РТТ6, экстраполировали по соответствующим стандартным кривым. Результаты экстраполировали при помощи программного обеспечения Luminex по специфической для анализируемого вещества стандартной кривой, которую строили при помощи того же самого программного обеспечения: алгоритм анализа установлен на режим Logistic 5Р Весовые коэффициенты определяли при помощи взвешенного анализа с использованием 1/у2 для определения весовых коэффициентов.

Образцы

1. Среды DMEM/F12 и РТТ6 и РТТ4 (не контактировали с МСК)

2. Тестируемые супернатанты МСК

3. Необязательно: супернатанты от различных доноров; CR001 А, С, D, и G.

Результаты для Ang-1 представлены на фиг. 4А и демонстрируют то, что МСК амниотической мембраны пуповины продуцируют больше Ang-1 при культивировании в РТТ6, чем при культивировании в DMEM/F12 или РТТ4. Результаты для VEGF представлены на фиг. 4В и демонстрируют то, что МСК амниотической мембраны пуповины продуцируют больше VEGF при культивировании в РТТ6, чем при культивировании в DMEM/F 12 или РТТ4. Результаты для HGF представлены на фиг. 4С и демонстрируют то, что МСК амниотической мембраны пуповины продуцируют больше HGF при культивировании в РТТ6, чем при культивировании в DMEM/F12 или РТТ4. Наконец, результаты для TGF-β1 представлены на фиг. 4D и демонстрируют то, что МСК амниотической мембраны пуповины продуцируют больше TGF-β1 при культивировании в РТТ6, чем при культивировании в DMEM/F12 или РТТ4.

Из вышеописанных экспериментов можно сделать следующие выводы. Когда МСК выращивают в среде РТТ6, тогда секреция Ang-1, TGF-β1, VEGF и HGF популяцией МСК была значительно увеличена по сравнению с уровнем их секреции в РТТ4 или имеющейся в продаже культуральной среде, такой как DMEM/F12. Среда РТТ6 обладала наибольшей способностью вызывать или улучшать ранозаживляющие свойства популяции МСК путем стимулирования секреции всех из Ang-1, TGF-β1, VEGF и HGF (вовлечение которых в заживление ран известно, как обсуждается в настоящем документе) в популяциях МСК. Таким образом, определение уровня секреции Ang-1, TGF-β1, VEGF и HGF может быть использовано для идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток.

Специалисту в данной области техники понятно, что различные изменения и модификации могут быть осуществлены в раскрытом здесь изобретении без отступления от объема и сущности изобретения.

Все патенты и публикации, упомянутые в описании, указывают на уровни специалистов в области техники, к которой относится изобретение. Все патенты и публикации включены сюда путем ссылки в той же самой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация была специфически и индивидуально включена сюда путем ссылки.

Изобретения, иллюстративно описанные здесь, могут быть подходящим образом практически реализованы при отсутствии любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, конкретно не раскрытых здесь. Таким образом, например, термины "содержащий", "включающий", "охватывающий" и т.д. следует рассматривать расширенно и без ограничений. Кроме того, термины и выражения, используемые здесь, использовались в качестве терминов описания, а не ограничения, и при использовании таких терминов и выражений нет намерения исключать любые эквиваленты представленных и описанных характеристик или их частей, и понятно, что возможны различные модификации в пределах объема заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что, хотя настоящее изобретение конкретно раскрыто с помощью предпочтительных воплощений и необязательных признаков, специалисты в данной области техники могут прибегнуть к модификации и изменению изобретений, воплощенных здесь, и что такие модификации и изменения рассматриваются как входящие в объем данного изобретения. Изобретение описано здесь широко и обобщенно. Каждый из более узких видов и субродовых групп, подпадающих под общее описание, также составляет часть изобретения. Последнее включает в себя общее описание изобретения с оговоркой или отрицательным ограничением, устраняющим любой предмет из рода, независимо от того, конкретно ли здесь указан удаляемый материал или нет. Кроме того, когда характеристики или аспекты изобретения описаны в терминах групп Маркуша, тогда специалистам в данной области техники понятно, что изобретение также описано в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша. Дополнительные воплощения изобретения станут очевидными из следующей формулы изобретения.

Изобретение дополнительно охарактеризовано следующими пунктами.

1. Способ оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

2. Способ идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования, где указанный способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанным образцом ткани или клеткой, выделенной из указанной ткани.

3. Способ отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

4. Способ отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток для последующего фармацевтического введения, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

5. Способ отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для генерирования главного банка клеток, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

6. Способ по любому из пунктов 1-5, где способ включает определение в среде уровня по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

7. Способ по любому из пунктов 1-6, где уровень секреции, равный или превышающий пороговое значение, указывает на:

(1) эффективность заживления ран популяцией мезенхимальных стволовых клеток; или

(2) ткань или выделенную клетку, подходящую в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток.

8. Способ по пункту 7, где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или приблизительно 500 пг/мл.

9. Способ по пунктам 7 или 8, где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или приблизительно 500 пг/мл.

10. Способ по любому из пунктов 7-9, где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 мг/мл или приблизительно 100 пг/мл.

11. Способ по любому из пунктов 7-10, где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или приблизительно 100 пг/мл.

12 Способ по любому из пунктов 8-11, где уровень секреции для всех четырех белков равен или превышает их соответствующее пороговое значение, и где пороговое значение составляет:

- пороговое значение приблизительно 400 пг/мл для ангиопоэтина 1 (Ang-1),

- пороговое значение приблизительно 400 пг/мл для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β),

- пороговое значение приблизительно 80 пг/мл для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), и

- пороговое значение приблизительно 80 пг/мл для фактора роста гепатоцитов (HGF).

13. Способ по любому из пунктов 8-11, где уровень секреции для всех четырех белков равен или превышает соответствующую пороговое значение, и где пороговое значение составляет:

- пороговое значение приблизительно 500 пг/мл для ангиопоэтина 1 (Ang-1),

- пороговое значение приблизительно 500 пг/мл для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β),

- пороговое значение приблизительно 100 пг/мл для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), и

- пороговое значение приблизительно 100 пг/мл для фактора роста гепатоцитов (HGF).

14. Способ по любому из пунктов 1-13, где популяции мезенхимальных стволовых клеток выбраны из группы, состоящей из популяции мезенхимальных стволовых клеток пуповины, плацентарной популяции мезенхимальных стволовых клеток, популяции мезенхимальных стволовых клеток пуповинно-плацентарного сочленения, популяции мезенхимальных стволовых клеток пуповинной крови, популяции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и происходящей из жировой ткани популяции мезенхимальных стволовых клеток.

15. Способ по пункту 14, где популяции мезенхимальных стволовых клеток пуповины выбраны из группы, состоящей из популяции мезенхимальных стволовых клеток амниона (AM), периваскулярной (PV) популяции мезенхимальных стволовых клеток, популяции мезенхимальных стволовых клеток вартонова студня (WJ), популяции мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины и смешанной популяции мезенхимальных стволовых клеток пуповины (МС).

16. Способ по пункту 2, где ткань представляет собой пуповину или амниотическую мембрану пуповины и популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию стволовых клеток амниотической мембраны пуповины.

17. Способ по пунктов 15 или 16, где популяция мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток, где по меньшей мере приблизительно 90% или более стволовых клеток популяции экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 HCD105.

18. Способ по пункту 17, где по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток не экспрессируют следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA-DR.

19. Способ по пункту 17 или 18, где по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более приблизительно 99% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют каждый из CD34, CD45 и HLA-DR.

20. Способ по любому из предшествующих пунктов, где среда представляет собой клеточную культуральную среду или среду для хранения.

21. Способ по пункту 20, где среда для хранения представляет собой гипотермозоль или плазмалит.

22. Способ по любому из пунктов 1-19, где среда включает модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% (об./об.), среду Хэма F12 (F12) в конечной концентрации приблизительно от 5 до 15% (об./об.), бессывороточную базовую среду в конечной концентрации приблизительно от 15 до 30% (об./об.) и фетальную телячью сыворотку (FBS) в конечной концентрации приблизительно от 1 до 8% (об./об.). е

23. Способ по пункту 22, где среда включает модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) в конечной концентрации приблизительно от 57,5 до 62,5% (об./об.), среду Хэма F12 (F12) в конечной концентрации приблизительно от 7,5 до 12,5% (об./об.), бессывороточную базовую среду в конечной концентрации приблизительно от 17,5 до 25,0% (об./об.) и фетальную телячью сыворотку (FBS) в конечной концентрации приблизительно от 1,75 до 3,5% (об./об.).

24. Способ по пункту 23, где среда включает модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) в конечной концентрации приблизительно 61,8% (об./об.), среду Хэма F12 (F12) в конечной концентрации приблизительно 11,8% (об./об.), бессывороточную базовую среду в конечной концентрации приблизительно 23,6% (об./об.) и фетальную телячью сыворотку (FBS) в конечной концентрации приблизительно 2,5% (об./об.).

25. Способ по пунктов 23 или 24, где бессывороточная базовая среда представляет собой M171.

26. Способ по любому по пунктов 22-25, где среда дополнительно включает эпидермальный фактор роста (EGF) в конечной концентрации приблизительно от 1 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл.

27. Способ по пункту 26, где среда включает эпидермальный фактор роста (EGF) в конечной концентрации приблизительно 10 нг/мл.

28. Способ по любому по пунктов 22-27, где среда включает инсулин в конечной концентрации приблизительно от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл.

29. Способ по пункту 28, где среда включает инсулин в конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл.

30. Способ по любому по пунктов 22-29, где среда дополнительно включает по меньшей мере одну из следующих добавок: аденин, гидрокортизон, и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).

31. Способ по любому из пунктов 22-30, где среда включает все три: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).

32. Способ по пункту 30 или 31, где среда включает аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл.

33. Способ по любому из пунктов 1-32, где культивирование популяции мезенхимальных стволовых клеток в среде по любому из пунктов 22-32 приводит к увеличению экспрессии и/или секреции по меньшей мере одного из белков, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β; в частности TGF-β1), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), популяцией мезенхимальных стволовых клеток по сравнению с референсной средой, которая не содержит все из DMEM (модифицированной Дульбекко среды Игла), F12 (среды Хэма F12), М171 (среды 171) и FBS (фетальной телячьей сыворотки).

34. Способ по любому из пунктов 1-33, где клеточную среду подвергают центрифугированию после подходящего периода культивирования.

35. Способ по пункту 34, где подходящей период культивирования включает приблизительно 12 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 36 ч, приблизительно 46 ч, приблизительно 48 ч или приблизительно 50 ч, предпочтительно составляет 48 ч.

36. Способ по пунктов 34 или 35, где супернатант центрифугированной клеточной культуральной среды подвергают мультиплексному анализу.

37. Способ по пункту 36, где мультиплексный анализ основан на частицах.

38. Применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток.

39. Применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP.

40. Применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток для последующего фармацевтического введения.

41. Применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для генерирования главного банка клеток.

42. Применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования.

43. Применение по пункту 42, где ткань представляет собой пуповину или амниотическую мембрану пуповины и популяции мезенхимальных стволовых клеток представляют собой популяции стволовых клеток амниотической мембраны пуповины.

44. Применение по любому по пунктов 38-41, где применение включает определение в клеточной культуральной среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в клеточную культуральную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

45. Применение по пункту 42 или 43, включающее определение в клеточной культуральной среде уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в клеточную культуру образцом указанной ткани или клеткой, выделенной из указанной ткани.

46. Применение по любому по пунктов 38-44, включающее определение в клеточной культуральной среде уровня по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемых в указанную клеточную культуральную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

47. Способ идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток, где способ включает определение уровня по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемого в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

48. Применение по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для идентификации среды, подходящей для индуцирования или улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток.

49. Применение по пункту 48, включающее определение в среде уровня по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или всех четырех белков, секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток.

--->

Перечень последовательностей

<110> CELLRESEARCH CORPORATION PTE LTD

<120> СПОСОБ ОЦЕНКИ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕГО ПОТЕНЦИАЛА ПОПУЛЯЦИИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И РОДСТВЕННЫЕ СПОСОБЫ ОТБОРА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ИДЕНТИФИКАЦИИ ТКАНИ В КАЧЕСТВЕ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА

ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ПОПУЛЯЦИИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

<130> SCH-5600-PV

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 498

<212> PRT

<213> human

<400> 1

Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His

1 5 10 15

Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg

20 25 30

Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro

35 40 45

Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr

50 55 60

Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser

65 70 75 80

Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met

100 105 110

Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu

115 120 125

Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys

130 135 140

Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu

145 150 155 160

Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln

165 170 175

Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser

180 185 190

Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu

195 200 205

Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr

210 215 220

Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala

225 230 235 240

Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp

245 250 255

Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu

260 265 270

Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp

275 280 285

Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile

290 295 300

Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn

305 310 315 320

Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp

325 330 335

Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser

340 345 350

Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln

355 360 365

Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg

370 375 380

Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn

385 390 395 400

Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser

405 410 415

Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn

420 425 430

Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp

435 440 445

Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala

450 455 460

Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu

485 490 495

Asp Phe

<210> 2

<211> 503

<212> PRT

<213> human

<400> 2

Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr

20 25 30

Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys

35 40 45

Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys

50 55 60

Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg

65 70 75 80

Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr

85 90 95

Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro

100 105 110

Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala

115 120 125

Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met

130 135 140

Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn

145 150 155 160

Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr

165 170 175

Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly

180 185 190

Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln

195 200 205

Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp

210 215 220

Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg

225 230 235 240

Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His

245 250 255

Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr

260 265 270

Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu

275 280 285

Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys

290 295 300

Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile

305 310 315 320

Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser

325 330 335

Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu

340 345 350

Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala

355 360 365

Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu

370 375 380

Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp

385 390 395 400

Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser

405 410 415

Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val

420 425 430

Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln

435 440 445

Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu

450 455 460

Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala

465 470 475 480

Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser

485 490 495

Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met

500

<210> 3

<211> 232

<212> PRT

<213> human

<400> 3

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

130 135 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp

165 170 175

Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys

180 185 190

His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn

195 200 205

Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr

210 215 220

Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

225 230

<210> 4

<211> 728

<212> PRT

<213> human

<400> 4

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr

165 170 175

Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser

180 185 190

Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu

195 200 205

Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp

210 215 220

His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro

225 230 235 240

His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp

245 250 255

Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr

260 265 270

Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys

275 280 285

Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu

290 295 300

Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile

305 310 315 320

Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu

325 330 335

His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn

340 345 350

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr

355 360 365

Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp

370 375 380

Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met

385 390 395 400

Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp

405 410 415

Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala

420 425 430

Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His

435 440 445

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys

450 455 460

Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu

465 470 475 480

Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val

485 490 495

Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg

500 505 510

Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp

515 520 525

Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr

530 535 540

Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys

545 550 555 560

Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly

565 570 575

Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp

580 585 590

Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu

595 600 605

Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn

610 615 620

Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu

625 630 635 640

Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu

645 650 655

Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp

660 665 670

Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu

675 680 685

Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly

690 695 700

Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile

705 710 715 720

Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser

725

<210> 5

<211> 574

<212> PRT

<213> human

<400> 5

Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu

20 25 30

His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu

50 55 60

Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu

65 70 75 80

Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr

85 90 95

Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala

100 105 110

Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile

115 120 125

Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile

130 135 140

Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro

145 150 155 160

Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val

180 185 190

Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys

195 200 205

Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu

210 215 220

Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val

225 230 235 240

Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys

245 250 255

Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly

260 265 270

Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly

275 280 285

Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His

290 295 300

Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile

305 310 315 320

Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr

325 330 335

Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met

355 360 365

Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val

370 375 380

Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu

385 390 395 400

Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro

405 410 415

Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys

420 425 430

Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu

435 440 445

Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys

450 455 460

Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg

465 470 475 480

Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile

485 490 495

Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys

500 505 510

Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val

515 520 525

Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly

530 535 540

Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu

545 550 555 560

Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln

565 570

<210> 6

<211> 161

<212> PRT

<213> human

<400> 6

Met Asn Leu Ala Ile Ser Ile Ala Leu Leu Leu Thr Val Leu Gln Val

1 5 10 15

Ser Arg Gly Gln Lys Val Thr Ser Leu Thr Ala Cys Leu Val Asp Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Arg His Glu Asn Thr Ser Ser Ser Pro Ile

35 40 45

Gln Tyr Glu Phe Ser Leu Thr Arg Glu Thr Lys Lys His Val Leu Phe

50 55 60

Gly Thr Val Gly Val Pro Glu His Thr Tyr Arg Ser Arg Thr Asn Phe

65 70 75 80

Thr Ser Lys Tyr Asn Met Lys Val Leu Tyr Leu Ser Ala Phe Thr Ser

85 90 95

Lys Asp Glu Gly Thr Tyr Thr Cys Ala Leu His His Ser Gly His Ser

100 105 110

Pro Pro Ile Ser Ser Gln Asn Val Thr Val Leu Arg Asp Lys Leu Val

115 120 125

Lys Cys Glu Gly Ile Ser Leu Leu Ala Gln Asn Thr Ser Trp Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Thr Asp Phe Met Ser

145 150 155 160

Leu

<210> 7

<211> 658

<212> PRT

<213> human

<400> 7

Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser

1 5 10 15

Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu

20 25 30

Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln

35 40 45

Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val

50 55 60

His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu

65 70 75 80

Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu

85 90 95

Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu

100 105 110

Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln

115 120 125

Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr

130 135 140

Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala

145 150 155 160

Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln

165 170 175

Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg

180 185 190

Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His

195 200 205

Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu

210 215 220

Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu

225 230 235 240

Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro

245 250 255

Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp

260 265 270

Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg

275 280 285

Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg

290 295 300

Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala

305 310 315 320

Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr

325 330 335

Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro

340 345 350

Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met

355 360 365

Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile

370 375 380

Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly

385 390 395 400

Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val

405 410 415

Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser

420 425 430

Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu

435 440 445

Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser

450 455 460

Asn Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser Phe Val Gln Val Arg Val Ser

465 470 475 480

Pro Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp

485 490 495

Leu Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala

500 505 510

Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro

515 520 525

Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr

530 535 540

Gly Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln

545 550 555 560

Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser

565 570 575

Pro Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Pro Ala Val

580 585 590

Leu Gly Ile Thr Phe Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala

595 600 605

Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Arg Ser Pro Ser Lys Arg Glu

610 615 620

Pro Val Val Ala Val Ala Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr

625 630 635 640

Asn His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser

645 650 655

Met Ala

<210> 8

<211> 385

<212> PRT

<213> human

<400> 8

Met Leu Val Arg Arg Gly Ala Arg Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Gly

1 5 10 15

Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gly Phe Met Ser

20 25 30

Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr

35 40 45

Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr Thr Thr Pro

50 55 60

Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser Gln His Gly Asn

65 70 75 80

Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys Phe Thr Ser Thr

85 90 95

Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln Ser

100 105 110

Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro Ala Asn Val Ser

115 120 125

Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro Gly Asn Val Ser

130 135 140

Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Pro

145 150 155 160

Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys Ala Glu Ile Lys

165 170 175

Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly Ile Cys Leu Glu

180 185 190

Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys Asp Arg Gly Glu

195 200 205

Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala Asp Ala Asp Ala

210 215 220

Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser Glu Val Arg Pro

225 230 235 240

Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu Ile Ser Ser Lys

245 250 255

Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Ile

260 265 270

Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln Ser Tyr Ser Gln

275 280 285

Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu Leu Ala Val Leu

290 295 300

Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser Trp Ser Pro Thr

305 310 315 320

Gly Glu Arg Leu Gly Glu Asp Pro Tyr Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Gly

325 330 335

Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Pro Gly Thr Ser Pro Glu Ala Gln Gly Lys

340 345 350

Ala Ser Val Asn Arg Gly Ala Gln Glu Asn Gly Thr Gly Gln Ala Thr

355 360 365

Ser Arg Asn Gly His Ser Ala Arg Gln His Val Val Ala Asp Thr Glu

370 375 380

Leu

385

<210> 9

<211> 1304

<212> PRT

<213> human

<400> 9

Met Tyr Leu Trp Leu Lys Leu Leu Ala Phe Gly Phe Ala Phe Leu Asp

1 5 10 15

Thr Glu Val Phe Val Thr Gly Gln Ser Pro Thr Pro Ser Pro Thr Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ala Lys Met Pro Ser Val Pro Leu Ser Ser Asp Pro Leu

35 40 45

Pro Thr His Thr Thr Ala Phe Ser Pro Ala Ser Thr Phe Glu Arg Glu

50 55 60

Asn Asp Phe Ser Glu Thr Thr Thr Ser Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser

65 70 75 80

Thr Gln Val Ser Pro Asp Ser Leu Asp Asn Ala Ser Ala Phe Asn Thr

85 90 95

Thr Gly Val Ser Ser Val Gln Thr Pro His Leu Pro Thr His Ala Asp

100 105 110

Ser Gln Thr Pro Ser Ala Gly Thr Asp Thr Gln Thr Phe Ser Gly Ser

115 120 125

Ala Ala Asn Ala Lys Leu Asn Pro Thr Pro Gly Ser Asn Ala Ile Ser

130 135 140

Asp Val Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ala Ser Thr Phe Pro Thr Asp Pro

145 150 155 160

Val Ser Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ala His His Ser Ser Ala

165 170 175

Ala Leu Pro Ala Arg Thr Ser Asn Thr Thr Ile Thr Ala Asn Thr Ser

180 185 190

Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Ser Glu Thr Thr Thr Leu Ser Pro Ser Gly

195 200 205

Ser Ala Val Ile Ser Thr Thr Thr Ile Ala Thr Thr Pro Ser Lys Pro

210 215 220

Thr Cys Asp Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Lys Glu Thr Lys Leu Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val

245 250 255

Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr

260 265 270

Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala

275 280 285

Pro Asp Lys Thr Leu Ile Leu Asp Val Pro Pro Gly Val Glu Lys Phe

290 295 300

Gln Leu His Asp Cys Thr Gln Val Glu Lys Ala Asp Thr Thr Ile Cys

305 310 315 320

Leu Lys Trp Lys Asn Ile Glu Thr Phe Thr Cys Asp Thr Gln Asn Ile

325 330 335

Thr Tyr Arg Phe Gln Cys Gly Asn Met Ile Phe Asp Asn Lys Glu Ile

340 345 350

Lys Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu His Glu Tyr Lys Cys Asp Ser Glu

355 360 365

Ile Leu Tyr Asn Asn His Lys Phe Thr Asn Ala Ser Lys Ile Ile Lys

370 375 380

Thr Asp Phe Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gln Ile Ile Phe Cys Arg Ser

385 390 395 400

Glu Ala Ala His Gln Gly Val Ile Thr Trp Asn Pro Pro Gln Arg Ser

405 410 415

Phe His Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Glu Lys Asp Cys

420 425 430

Leu Asn Leu Asp Lys Asn Leu Ile Lys Tyr Asp Leu Gln Asn Leu Lys

435 440 445

Pro Tyr Thr Lys Tyr Val Leu Ser Leu His Ala Tyr Ile Ile Ala Lys

450 455 460

Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr Lys Ser

465 470 475 480

Ala Pro Pro Ser Gln Val Trp Asn Met Thr Val Ser Met Thr Ser Asp

485 490 495

Asn Ser Met His Val Lys Cys Arg Pro Pro Arg Asp Arg Asn Gly Pro

500 505 510

His Glu Arg Tyr His Leu Glu Val Glu Ala Gly Asn Thr Leu Val Arg

515 520 525

Asn Glu Ser His Lys Asn Cys Asp Phe Arg Val Lys Asp Leu Gln Tyr

530 535 540

Ser Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Ala Tyr Phe His Asn Gly Asp Tyr Pro

545 550 555 560

Gly Glu Pro Phe Ile Leu His His Ser Thr Ser Tyr Asn Ser Lys Ala

565 570 575

Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile Ala Leu

580 585 590

Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg Ser Cys

595 600 605

Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu Lys Gln

610 615 620

Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu Thr Tyr

625 630 635 640

Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu Phe Gln

645 650 655

Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala Arg Lys

660 665 670

Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu Pro Tyr Asp

675 680 685

Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala Gly Ser Asn

690 695 700

Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro Arg Lys Tyr

705 710 715 720

Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe Trp Arg

725 730 735

Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr Arg Cys

740 745 750

Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser Met Glu

755 760 765

Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn Gln His

770 775 780

Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val Asn Lys

785 790 795 800

Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe Thr Ser

805 810 815

Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu Lys Leu

820 825 830

Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro Ile Val

835 840 845

Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ile

850 855 860

Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp Val Tyr

865 870 875 880

Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val Gln Val

885 890 895

Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr Asn Gln

900 905 910

Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro Tyr Leu His

915 920 925

Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu Glu Ala

930 935 940

Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln His Ile

945 950 955 960

Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn Val Ile

965 970 975

Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu Met Ser

980 985 990

Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp

995 1000 1005

Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser

1010 1015 1020

Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys

1025 1030 1035

Glu Thr Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val

1040 1045 1050

Lys Val Ile Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu

1055 1060 1065

Ile Cys Ala Gln Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp

1070 1075 1080

Ile Glu Val Asp Leu Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr

1085 1090 1095

Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg

1100 1105 1110

Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu

1115 1120 1125

Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile Ser Met Ile Gln Val Val Lys

1130 1135 1140

Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser Glu Gly Asn Lys His His

1145 1150 1155

Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg Asp Gly Ser Gln Gln

1160 1165 1170

Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Glu Ser Ala Glu

1175 1180 1185

Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys Ala Leu Arg

1190 1195 1200

Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr Gln Phe

1205 1210 1215

Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly Gln

1220 1225 1230

Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn

1235 1240 1245

Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu

1250 1255 1260

Gly Ala Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly

1265 1270 1275

Ser Glu Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn

1280 1285 1290

Gly Pro Ala Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser

1295 1300

<210> 10

<211> 254

<212> PRT

<213> human

<400> 10

Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val

1 5 10 15

Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala Ile Lys Glu Glu His Val Ile

20 25 30

Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met

35 40 45

Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys

50 55 60

Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu

65 70 75 80

Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu

85 90 95

Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn Val Pro Pro

100 105 110

Glu Val Thr Val Leu Thr Asn Ser Pro Val Glu Leu Arg Glu Pro Asn

115 120 125

Val Leu Ile Cys Phe Ile Asp Lys Phe Thr Pro Pro Val Val Asn Val

130 135 140

Thr Trp Leu Arg Asn Gly Lys Pro Val Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr

145 150 155 160

Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu

165 170 175

Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val Tyr Asp Cys Arg Val Glu His

180 185 190

Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Phe Asp Ala Pro

195 200 205

Ser Pro Leu Pro Glu Thr Thr Glu Asn Val Val Cys Ala Leu Gly Leu

210 215 220

Thr Val Gly Leu Val Gly Ile Ile Ile Gly Thr Ile Phe Ile Ile Lys

225 230 235 240

Gly Val Arg Lys Ser Asn Ala Ala Glu Arg Arg Gly Pro Leu

245 250

<---

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток (МСК), отбора популяции МСК для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP и для последующего фармацевтического введения, отбора популяции МСК для формирования главного банка клеток и идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции МСК для фармацевтического использования. Способы включают определение в среде уровня всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов B(HGF), секретируемых в среду указанными МСК. Способы могут быть использованы для идентификации донора ткани, содержащей МСК, или впоследствии для популяции МСК, пригодной для терапевтических применений, таких как заживление ран. 12 н. и 25 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Способ оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток, где популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток пуповины, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где способ включает определение в среде уровня всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на ранозаживляющий потенциал указанной популяции мезенхимальных стволовых клеток,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

2. Способ идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования, где популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток пуповины, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где способ включает определение в среде уровня всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемых в указанную среду образцом указанной ткани или клеткой, выделенной из указанной ткани, где ткань представляет собой пуповину или амниотическую мембрану пуповины и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная ткань или выделенная клетка подходит в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

3. Способ отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP (текущей надлежащей производственной практики), где популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток пуповины, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где способ включает определение в среде уровня всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная популяция мезенхимальных стволовых клеток подходит в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток в условиях cGMP,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

4. Способ отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток для последующего фармацевтического введения, где популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток пуповины, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где способ включает определение в среде уровня всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная популяция мезенхимальных стволовых клеток подходит в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для последующего фармацевтического введения,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

5. Способ отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для генерирования главного банка клеток, где популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток пуповины, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где способ включает определение в среде уровня всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная популяция мезенхимальных стволовых клеток подходит для генерирования главного банка клеток,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 500 пг/мл.

7. Способ по п. 6, где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 500 пг/мл.

8. Способ по п. 6 или 7, где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 100 пг/мл.

9. Способ по любому из пп. 6-8, где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 100 пг/мл.

10. Способ по любому из пп. 1-5, где уровень секреции всех четырех белков равен или превышает их соответствующее пороговое значение и где пороговое значение составляет:

- пороговое значение приблизительно 400 пг/мл для ангиопоэтина 1 (Ang-1),

- пороговое значение приблизительно 400 пг/мл для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β),

- пороговое значение приблизительно 80 пг/мл для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и

- пороговое значение приблизительно 80 пг/мл для фактора роста гепатоцитов (HGF).

11. Способ по любому из пп. 6-9, где уровень секреции всех четырех белков равен или превышает их соответствующее пороговое значение и где пороговое значение составляет:

- пороговое значение приблизительно 500 пг/мл для ангиопоэтина 1 (Ang-1),

- пороговое значение приблизительно 500 пг/мл для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β),

- пороговое значение приблизительно 100 пг/мл для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и

- пороговое значение приблизительно 100 пг/мл для фактора роста гепатоцитов (HGF).

12. Способ по любому из пп. 1-11, где популяция мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток, где по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток популяции стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD105.

13. Способ по п. 12, где по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток не экспрессируют следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA-DR (человеческий лейкоцитарный антиген DR).

14. Способ по п. 12 или 13, где по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют каждый из CD34, CD45 и HLA-DR.

15. Способ по любому из пп. 1-14, где среда представляет собой клеточную культуральную среду или среду для хранения.

16. Способ по п. 15, где среда для хранения представляет собой гипотермозоль (Hypothermosol) или плазмалит (Plasmalyte).

17. Способ по любому из пп. 1-14, где среда включает модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% об./об., среду Хэма F12 (F12) в конечной концентрации приблизительно от 5 до 15% об./об., бессывороточную базовую среду в конечной концентрации приблизительно от 15 до 30% об./об. и фетальную телячью сыворотку (FBS) в конечной концентрации приблизительно от 1 до 8% об./об.

18. Способ по п. 17, где среда включает модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) в конечной концентрации приблизительно от 57,5 до 62,5% об./об., среду Хэма F12 (F12) в конечной концентрации приблизительно от 7,5 до 12,5% об./об., бессывороточную базовую среду в конечной концентрации приблизительно от 17,5 до 25,0% об./об. и фетальную телячью сыворотку (FBS) в конечной концентрации приблизительно от 1,75 до 3,5% об./об.

19. Способ по п. 18, где среда включает модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) в конечной концентрации приблизительно 61,8% об./об., среду Хэма F12 (F12) в конечной концентрации приблизительно 11,8% об./об., бессывороточную базовую среду в конечной концентрации приблизительно 23,6% об./об. и фетальную телячью сыворотку (FBS) в конечной концентрации приблизительно 2,5% об./об.

20. Способ по п. 18 или 19, где бессывороточная базовая среда представляет собой М171.

21. Способ по любому из пп. 18-20, где среда дополнительно включает эпидермальный фактор роста (EGF) в конечной концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 20 нг/мл.

22. Способ по п. 21, где среда включает эпидермальный фактор роста (EGF) в конечной концентрации приблизительно 10 нг/мл.

23. Способ по любому из пп. 17-22, где среда включает инсулин в конечной концентрации приблизительно от 1 до 10 мкг/мл.

24. Способ по п. 23, где среда включает инсулин в конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл.

25. Способ по любому из пп. 17-24, где среда дополнительно включает по меньшей мере одну из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).

26. Способ по любому из пп. 1-25, где культивирование популяции мезенхимальных стволовых клеток в среде, определенной в любом из пп. 17-25, приводит к увеличению экспрессии и/или секреции по меньшей мере одного из белков, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β; в частности TGF-β1), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), популяцией мезенхимальных стволовых клеток по сравнению с референсной средой, которая не содержит все из DMEM (модифицированной Дульбекко среды Игла), F12 (среды Хэма F12), М171 (среды 171) и FBS (фетальной телячьей сыворотки).

27. Способ по любому из пп. 1-26, где среду подвергают центрифугированию после подходящего периода культивирования.

28. Способ по п. 27, где подходящей период культивирования включает приблизительно 12 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 36 ч, приблизительно 46 ч, приблизительно 48 ч или приблизительно 50 ч, предпочтительно приблизительно 48 ч.

29. Способ по п. 27 или 28, где супернатант центрифугированной клеточной культуральной среды подвергают мультиплексному анализу.

30. Способ по п. 29, где мультиплексный анализ основан на микрошариках.

31. Применение всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для оценки ранозаживляющего потенциала популяции мезенхимальных стволовых клеток пуповины, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где применение включает определение в среде уровня всех четырех белков, секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на ранозаживляющий потенциал указанной популяции мезенхимальных стволовых клеток,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

32. Применение всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток в условиях cGMP, где популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток пуповины, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где применение включает определение в среде уровня всех четырех белков, секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная популяция мезенхимальных стволовых клеток подходит в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток в условиях cGMP,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

33. Применение всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для продуцирования популяции стволовых клеток для последующего фармацевтического введения, где популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток пуповины, плацентарной популяции мезенхимальных стволовых клеток, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где применение включает определение в среде уровня всех четырех белков, секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная популяция мезенхимальных стволовых клеток подходит в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для последующего фармацевтического введения,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

34. Применение всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для отбора популяции мезенхимальных стволовых клеток для генерирования главного банка клеток, где популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток пуповины, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где применение включает определение в среде уровня всех четырех белков, секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная популяция мезенхимальных стволовых клеток подходит для генерирования главного банка клеток,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

35. Применение всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для идентификации ткани, подходящей в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования, где популяция мезенхимальных стволовых клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток пуповины, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где ткань представляет собой пуповину или амниотическую мембрану пуповины, где применение включает определение в среде уровня всех четырех белков, секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная ткань или выделенная клетка подходит в качестве исходного материала для продуцирования популяции мезенхимальных стволовых клеток для фармацевтического использования,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

36. Способ идентификации среды, подходящей для улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток, где способ включает определение уровня всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где способ включает определение в среде уровня всех четырех белков, секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная среда подходит для улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.

37. Применение всех четырех белков, выбранных из группы, состоящей из ангиопоэтина 1 (Ang-1), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF), для идентификации среды, подходящей для улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток, где популяция мезенхимальных стволовых клеток пуповины представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, где применение включает определение в среде уровня всех четырех белков, секретируемых в указанную среду указанной популяцией мезенхимальных стволовых клеток, и где уровень секреции всех четырех белков, равный или превышающий пороговое значение, указывает на то, что указанная среда подходит для улучшения ранозаживляющих свойств популяции мезенхимальных стволовых клеток,

где для ангиопоэтина 1 (Ang-1) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) пороговое значение составляет приблизительно 400 пг/мл или более,

где для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более и

где для фактора роста гепатоцитов (HGF) пороговое значение составляет приблизительно 80 пг/мл или более.