Интегративная кассета для экспрессии генов и ее использование при конструировании трансформанта дрожжей Komagataella mondaviorum Российский патент 2025 года по МПК C12N15/56 C12N15/81 C12N9/30 C12N1/19 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для экспрессии интересующих генов и получения продуцентов белков с помощью дрожжей Komagataella mondaviorum.

Уровень техники

Метилотрофные дрожжи рода Komagataella (Pichia pastoris) являются одной из наиболее перспективных и удобных платформ для экспрессии генов, кодирующих рекомбинантные белки [Вавиловский журнал генетики и селекции. 2020, 24(2), 149-157 и FEMS Microbiol Rev. 2000, 24, 45-66]. Они имеют статус непатогенного и безопасного микроорганизма GRAS согласно постановлению управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) [ActaNaturae (русскоязычная версия). 2020, 12(2(45), 28-39].

При конструировании дрожжевых штаммов-продуцентов рекомбинантных белков используют интегративные экспрессионные кассеты.

Так, с использованием интегративной экспрессионной кассеты на основе вектора pPIC9K, содержащей промотор P_AOX1 из дрожжей вида K. phaffii, нуклеотидную последовательность сигнального пептида α-фактора из Saccharomyces cerevisiae, ген RmAmyA, кодирующий α-амилазу из Rhizomucor miehei, терминатор транскрипции ТТАОХ1, селективный маркер - ген устойчивости к антибиотику генетицину G418 - KanMX, область интеграции - 3'- фрагмент нуклеотидной последовательности гена АОХ1 из K. phaffii, был получен штамм на основе K. phaffii GS115 (Invitrogen, USA) - продуцент α-амилазы [Food Chemistry. 2020, 305, 125447].

Для получения продуцента фитазы на основе дрожжей Komagataella mondaviorum [Antonie van Leeuwenhoek. 2018, 111(7), 1197-1207] использовалась аналогичная экспрессионная кассета на основе вектора , содержащая в отличие от вышеописанной кассеты ген, кодирующий фитазу Citrobacter freundii [Биотехнология. 2021, 37(4), 5-13].

Исследование литературных источников показывает, что в настоящее время для получения продуцентов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella, широко используют штаммы K. phaffii GS115 и K. phaffii Х-33, принадлежащие компании Invitrogen (www.invitrogen.com) и интегративные экспрессионные кассеты на основе векторов, также принадлежащих этой компании. Однако, применение полученных продуцентов в коммерческих целях в этом случае ограничено политикой распространения материала [Вавиловский журнал генетики и селекции. 2020, 24(2), 149-157].

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является расширение арсенала интегративных экспрессионных кассет для получения штаммов - продуцентов метилотрофных дрожжей на основе отечественных научных разработок.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является получение штаммов-продуцентов рекомбинантных белков на основе метилотрофных дрожжей K. mondavioum, с использованием интегративной экспрессионной кассеты.

Технический результат достигается тем, что предложена интегративная экспрессионная кассета, включающая индуцибельный промотор Р_АОМ, нуклеотидную последовательность сигнального пептида, ген, кодирующий белок, терминатор транскрипции, селективный маркер для отбора трансформантов в клетках дрожжей, область интеграции - фрагмент нуклеотидной последовательности M1.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана интегративная экспрессионная кассета 1.

На фиг. 2 показана интегративная экспрессионная кассета 2.

Осуществление изобретения

Существенным отличием заявляемой интегративной экспрессионной кассеты является:

- использование в качестве промотора последовательности Ρ_AOM, которая представляет из себя нативный промотор гена алкогольоксидазы из дрожжей вида K. mondaviorum, и может быть получена методом ПЦР с помощью пар праймеров:

и геномной ДНК штамма K. mondaviorum ВКПМ Y-4330.

- использование области интеграции Ml, которая представляет собой фрагмент последовательности ДНК хромосомы дрожжей вида K. mondaviorim и может быть получена методом ПЦР с помощью пар праймеров:

и геномной ДНК штамма K. mondaviorum ВКПМ Y-4330.

Р_АОМ индуцируется метанолом и проявляет промоторную активность в клетках дрожжей K. mondaviorim. Использование нативной нуклеотидной последовательности M1 из K. mondaviorim обеспечивает эффективную гомологичную интеграцию в хромосому штаммов данного вида.

Заявляемую интегративную экспрессионную кассету для экспрессии генов в дрожжах конструируют с использованием стандартных генно-инженерных методик.

Включение в экспрессионную кассету этих элементов позволяет увеличить эффективность экспрессии генов и гомологичной рекомбинации.

В качестве гена, кодирующего белок, могут быть использованы гены, способные к экспрессии в K. mondaviorum и кодирующие белки различного назначения, например, ферменты α-амилазу, фитазу, бета-глюканазу и др.

Составные части экспрессионной кассеты, а именно, нуклеотидная последовательность, кодирующая лидерный пептид, селективный маркер, терминатор транскрипции варьируются в зависимости от природы экспрессируемого белка, предполагаемого технологического процесса и т.д.

Так экспрессионные кассеты, используемые в дрожжах рода Komagataella, могут содержать в качестве селективного маркера - Zeocin либо HIS4, в качестве сигнального пептида а- амилазный сигнальный пептид из дрожжей S. cerevisiae, сигнальный пептид α-фактора из S. cerevisiae, MF41 и другие.

С использованием предложенной экспрессионной кассеты получен трансформант, продуцирующий рекомбинантную α-амилазу из R. miehei.

С использованием предложенной экспрессионной кассеты получен трансформант, продуцирующий рекомбинантную фитазу из Citrobacter freundii.

Трансформант-продуцент получают путем трансформации клеток K. mondaviorum ВКПМ Y-4330 [Methods Mol Biol. 2014, 1152, 43-62] заявляемой экспрессионной кассетой любым подходящим способом, в частности, методом электропорации [Current Genetics, 1990, 18, 169-170] или методом с использованием ацетата лития [Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. 1982, 3].

Пример 1: Получение интегративной экспрессионной кассеты для экспрессии гена RmAmyA, кодирующего α-амилазу из R. miehei.

Получение интегративной экспрессионной кассеты показано на примере интегративной кассеты для экспрессии гена RmAmyA, кодирующего α-амилазу из R. miehei.

На первом этапе конструирования интегративной экспрессионной кассеты синтезируют следующие генетические элементы:

1. Ген RmAmyA, кодирующий α-амилазу из R. miehei, синтезируют методом ПЦР с использованием пар праймеров:

В качестве матрицы используют кДНК, синтезированную методом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) с использованием хромосомальной ДНК штамма R. miehei ВКПМ F-989 и набора "MMLV RT kit" (Евроген, Москва).

Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (30 с), 59°С - отжиг (30 с), 72°С - полимеризация (1,5 мин). Всего проводят 30 циклов амплификации.

2. Нуклеотидную последовательность промотора Ρ_AOM синтезируют методом ПЦР с с помощью пар праймеров:

В качестве матрицы используют геномную ДНК штамма K. mondaviorum ВКПМ Y-4330, выделенную фенольным методом [Gene. 1989, 77(1), 61-68].

Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (30 с), 61°С - отжиг (30 с), 72°С - полимеризация (1 мин). Всего проводят 30 циклов амплификации.

Размер синтезированного фрагмента ДНК составляет 915 п. н.

3. Нуклеотидную последовательность сигнального пептида α-фактора из S. cerevisiae синтезируют методом ПЦР с помощью пар праймеров:

В качестве матрицы используют плазмидную ДНК вектора [6].

Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (30 с), 59°С - отжиг (30 с), 72°С - полимеризация (30 с). Всего проводят 30 циклов амплификации.

4. Терминатор транскрипции ТТАОХ1 синтезируют методом ПЦР с использованием пар праймеров:

В качестве матрицы используют плазмидную ДНК вектора [6].

Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (30 с), 57°С - отжиг (30 с), 72°С - полимеризация (30 с). Всего проводят 30 циклов амплификации.

5. Дрожжевой селективный маркер - ген устойчивости к антибиотику генетицину G418 - KanMX синтезируют методом ПЦР с использованием пар праймеров:

В качестве матрицы используют плазмидную ДНК вектора pFA-6a-Kan-МХ6, выделенного из штамма Escherichia coli ВКПМ В-9283. Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (1 мин.), 63°С - отжиг (1 мин.), 72°С - полимеризация (1,5 мин.). Всего проводят 30 циклов амплификации.

6. Область интеграции - фрагмент нуклеотидной последовательности Ml синтезируют методом ПЦР с использованием пар праймеров:

В качестве матрицы используют геномную ДНК штамма K. mondaviorum ВКПМ Y-4330, выделенную фенольным методом [Gene. 1989, 77(1), 61-68].

Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (30 с), 60°С - отжиг (30 с), 72°С - полимеризация (40 с). Всего проводят 30 циклов амплификации.

Размер синтезированного фрагмента ДНК составляет 700 п. н.

На втором этапе амплифицированные генетические элементы очищают после электрофореза в 1% агарозном геле при помощи «DNA extraction KIT» (Thermo Fisher Scientific) и подвергают сшивке по методу "фьюжн-пцр" [Anal. Chem. 1959, 1(31), 426-429] и получают интегративную экспрессионную кассету 1, содержащую промотор Ρ_AOM из штамма дрожжей вида K. mondaviorum ВКПМ Y-4330, нуклеотидную последовательность сигнального пептида α-фактора из S. cerevisiae, ген RmAmyA, кодирующий α-амилазу из R. miehei, терминатор транскрипции ТТАОХ1, селективный маркер - ген устойчивости к антибиотику генетицину G418 - KanMX, область интеграции - фрагмент нуклеотидной последовательности M1 из хромосомы K. mondaviorum ВКПМ Y-4330 (фиг. 1).

Пример 2: Конструирование трансформанта дрожжей K. mondaviorum, продуцирующего α-амилазу R. miehei

Полученную интегративную экспрессионную кассету 1 трансформируют в штамм K. mondaviorum ВКПМ Y-4330, который предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) до концентрации 1x10⁸ клеток на 1 мл. Клетки отделяют центрифугированием, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Далее клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 M сорбитола в концентрации 1-5x10⁹ клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1М сорбитола.

Селекцию трансформантов ведут в течение 3 суток при температуре 30°С на агаризованной среде следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, вода - остальное. Антибиотик G418 добавляют до конечной концентрации 0,1 мг/мл.

Наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием праймеров:

Режим реакции ПЦР: 94°С - 3 мин - 1 цикл; 30 циклов: 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 90 с; 72°С - 5 мин - 1 цикл.

Наличие ПЦР-фрагмента размером 1341 п. н. подтверждает присутствие гена RmAmyA, кодирующего α-амилазу из R. miehei, в составе хромосомы полученных трансформантов.

Пример 3: Оценка уровня амилазной активности трансформантов дрожжей K. mondaviorum

Оценку эффективности экспрессии гена, кодирующего α-амилазу, и входящего в состав экспрессионной кассеты 1 оценивали по уровню амилазной активности трансформантов.

Посевную культуру каждого из трансформантов в отдельности выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Засев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10 для каждого трансформанта в отдельности.

Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением 1% глюкозы в течение 24 ч. Экспрессию гена, кодирующего α-амилазу, индуцируют путем добавления метанола до конечной концентрации 1% каждые 24 ч в течение 2 суток. Продуктивность каждого из полученных трансформантов K. mondaviorum оценивают по активности α-амилазы, накопившейся в культуральной жидкости. Для этого клетки трансформанта осаждают центрифугированием, а супернатант используют для определения α-амилазной активности методом с 3,5-динитросалициловой кислотой (ДНС) [The yeast of toponomic study. Ed.N.J.W.Kreger-van Rij, Amsterdam, Elsevier Sci. Publ.B.V., 1984, 421]. Результаты культивирования приведены в табл.1.

Полученные результаты показывают, что использование интегративной экспрессионной кассеты позволяет получить трансформанты, продуцирующие рекомбинантную α-амилазу.

Наиболее продуктивный трансформант №10 синтезирует α-амилазу в количестве 120 ед/мл.

Пример 4: Получение интегративной экспрессионной кассеты для экспрессии гена phyCf(op), кодирующего фитазу из С.freundii.

Получение интегративной экспрессионной кассеты 2 для экспрессии гена phyCf(op), кодирующего фитазу из С.freundii, осуществляют по примеру 1, использовав для ПЦР синтеза гена phyCf(op) следующую пару праймеров:

В качестве матрицы используют плазмидную ДНК pCIT-Km [6].

Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (30 с), 57°С - отжиг (30 с), 72°С - полимеризация (90 с). Всего проводят 30 циклов амплификации.

Получена интегративная экспрессионная кассета 2, включающая промотор P_AOM из штамма дрожжей вида K. mondaviorum ВКПМ Y-4330, нуклеотидную последовательность сигнального пептида α-фактора из S. cerevisiae, ген phyCf(op), кодирующий фитазу из С.freundii, терминатор транскрипции ТТАОХ1, селективный маркер - ген устойчивости к антибиотику генетицину G418 - KanMX, область интеграции - фрагмент нуклеотидной последовательности M1 из хромосомы K. mondaviorum ВКПМ Y-4330 (фиг. 2)

Пример 5: Конструирование трансформанта дрожжей K. mondaviorum, продуцирующего фитазу из С.freundii, и оценка уровня фитазной активности

Конструирование трансформанта дрожжей K. mondaviorum, продуцирующего фитазу из С.freundii, проводят по примеру 2, использовав для трансформации интегративную экспрессионную кассету 2.

Наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием праймеров:

Режим реакции ПЦР: 94°С - 3 мин - 1 цикл; 30 циклов: 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 90 с; 72°С - 5 мин - 1 цикл.

Наличие ПЦР-фрагмента размером 1236 п. н. подтверждает присутствие гена phyCf(op), кодирующего фитазу из С.freundii, в составе хромосомы полученных трансформантов.

Оценку эффективности экспрессии гена, кодирующего фитазу, и входящего в состав экспрессионной кассеты 2 оценивали по уровню фитазной активности трансформантов.

Супернатант используют для определения фитазной активности методом, описанным в [Биотехнология. 2021, 37(4), 5-13]. Результаты культивирования приведены в табл. 2.

Полученные результаты показывают, что использование интегративной экспрессионной кассеты 2 позволяет получить трансформанты, продуцирующие рекомбинантную фитазу.

Наиболее продуктивный трансформант №5 синтезирует фитазу в количестве 89 ед/мл.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена интегративная экспрессионная кассета для экспрессии гена RmAmyA, кодирующего рекомбинантную α-амилазу из R. miehei, включающая промотор P_AOM, нуклеотидную последовательность сигнального пептида, ген RmAmyA, кодирующий рекомбинантную α-амилазу из R. miehei, терминатор транскрипции, селективный маркер для отбора трансформантов в клетках дрожжей, область интеграции, в качестве которой используют фрагмент нуклеотидной последовательности M1 из хромосомы K. mondaviorum ВКПМ Y-4330. Также предложено применение указанной интегративной экспрессионной кассеты для получения трансформанта дрожжей вида K. mondaviorum, продуцирующего рекомбинантную α-амилазу из R. miehei и содержащего ген RmAmyA. Изобретение обеспечивает получение штаммов-продуцентов рекомбинантных белков на основе метилотрофных дрожжей K. mondaviorum. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Интегративная экспрессионная кассета для экспрессии гена RmAmyA, кодирующего рекомбинантную α-амилазу из R. miehei, включающая промотор P_AOM, нуклеотидную последовательность сигнального пептида, ген RmAmyA, кодирующий рекомбинантную α-амилазу из R. miehei, терминатор транскрипции, селективный маркер для отбора трансформантов в клетках дрожжей, область интеграции, в качестве которой используют фрагмент нуклеотидной последовательности M1 из хромосомы K. mondaviorum ВКПМ Y-4330.

2. Применение интегративной экспрессионной кассеты по п. 1 для получения трансформанта дрожжей вида K. mondaviorum, продуцирующего рекомбинантную α-амилазу из R. miehei и содержащего ген RmAmyA.