СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS MITIS И STREPTOCOCCUS ORALIS Российский патент 2025 года по МПК G01N21/65 C12Q1/14 C12R1/46 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для дифференциации между собой штаммов Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis и Streptococcus oralis.

Уровень техники

Известен способ дифференциации Streptococcus pneumoniae от других представителей Streptococcus mitis group c помощью теста на чувствительность к оптохину. Подлежащую дифференцировке культуру засевают газоном на чашку Петри с кровяным агаром. Стерильным пинцетом на середину посева накладывают коммерческий диск, пропитанный оптохином. После инкубации в течении 18-22 часов рост Streptococcus pneumoniae вокруг диска отсутствует.[Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга I / Колл. Авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. - М: Издательский дом БИНОМ, 2020. - 1080 с.: ил.].

Недостатками данного способа являются временные затраты на культивирование штаммов, невозможность дифференциации штаммов Streptococcus pneumoniae, не чувствительных к оптохину, а также невозможность дифференциации других представителей Streptococcus mitis group друг от друга.

Известен способ дифференциации Streptococcus pneumoniae от других представителей Streptococcus mitis group c помощью желчного теста. На 20-часовую испытуемую культуру, засеянную газоном на кровяном агаре, накладывают стерильный диск фильтровальной бумаги, диаметром 1,0 см, пропитанный 20% раствором желчи. Чашку снова помещают в термостат на 2-3 ч. По истечении времени на чашке наблюдают зону полного исчезновения колоний Streptococcus pneumoniae вокруг диска, диаметром 1-2 мм. [Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга I / Колл. Авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. - М.: Издательский дом БИНОМ, 2020. - 1080 с.: ил.].

Недостатками данного способа являются временные затраты на культивирование штаммов, невозможность дифференциации штаммов Streptococcus pneumoniae, не чувствительных к оптохину, а также невозможность дифференциации других представителей Streptococcus mitis group друг от друга.

За прототип принимается способ дифференциации изолятов Streptococcus pneumoniae с помощью поверхностно-усиленной спектроскопии комбинационного рассеяния [Berus S., Witkowska Е., Niciński К., Sadowy Е., Puzia W., Ronkiewicz P., Kamińska A. Surface-ermanced Raman scattering as discrimination method of Streptococcus spp. and altemative approach for identifying capsular types of S. pneumoniaeisolates // Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. - 2020. - vol. 233. - P. 118088].

Суть метода заключается в следующем: применяется метод дисперсионной рамановской спектроскопии с технологией подавления автофлуоресценции. Мощность лазера составляет b100 мВт, а спектральное разрешение от 2 до 4 см^-1. Ускоряющее напряжение находится в диапазоне от 2 кВ до 10 кВ. Спектры обрабатываются с помощью программного обеспечения OPUS версии 2012 (Bruker Optic Gmbh, Германия). Сглаживание спектров происходит с использованием фильтра Савицкого-Голея. Нормализация происходит с использованием Min-Max. Фон удаляется с помощью коррекции базовой линии. Экспозиция для получения одного спектра составляет 45 с. Наиболее важные диагностические переменные располагаются на 1220, 1330 и 1450 см^-1. Затем выполняется 2D и 3D анализ главных компонентов.

Недостатком методики является отсутствие конкретных данных для интерпретации полученных результатов для дифференциации Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis и Streptococcus oralis.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является улучшение дифференциации между собой штаммов Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis и Streptococcus oralis с помощью анализа спектров комбинационного рассеяния.

Это достигается тем, что в отличие от известных способов, дифференциация проводится методом спектроскопии комбинационного рассеяния, регистрируются спектры комбинационного рассеяния с помощью оптического зонда, который располагался над объектом на расстоянии 7 мм. Мощность лазера при экспозиции в 60 секунд составляет 450 мВт. Нормализация спектров проводится методом Extended multiplicative signal correction. Сглаживание осуществляется с использованием Maximum Like Lihood Estimation Savitzky-Golayfilter с параметром σ=4. Для исключения вклада автофлуоресценции в спектре комбинационного рассеяния использовался модифицированный метод вычитания флуоресцентной составляющей полиномиальной аппроксимацией Improved Modified Multi-Polynomial Fitting со степенью полинома 8. Анализ спектров комбинационного рассеяния проводился в диапазоне от 450 до 1800 см^-1. Затем проводится нелинейный регрессионный анализ полученных спектров, с помощью разложения на сумму асимметричных линий Гаусса, и последующего линейного дискриминантного анализа. За критериальную переменную принимается амплитуда линий а, зависящая от значений независимых регрессоров dx и х0, определяющих начальные условия анализа.

Для штаммов Streptococcus mitis характерна амплитуда линии КР ~1182 см^-1 больше значения 1258 и амплитуда линии КР ~1805 см^-1 больше 573. Для штаммов Streptococcus oralis характерна амплитуда линии КР ~1182 см^-1 меньше значения 1258 и амплитуда линии КР ~1881 см^-1 меньше 414. Для штаммов Streptococcus pneumoniae характерна амплитуда линии КР ~1805 см^-1 меньше значения 573 или амплитуда линии 1881 см^-1 больше 414.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного метода заключается в следующем: проводится дифференциации между собой штаммов Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis и Streptococcus oralis спектроскопией комбинационного рассеяния (Рамановская спектроскопия) с использованием комплекса аппаратного обеспечения: диодный лазер LML-785.0RB-04 (PDLD Inc., США), оптический модуль PBL-785 (InPhotonics, США), спектрометр Shamrock SR-303i (Andor Technology Ltd., Великобритания), цифровая охлаждаемая камера ANDOR DV-420A-OE (Andor Technology Ltd., Великобритания) и персональный компьютер. Диодный лазер фокусирует излучение на объекте на расстоянии 7 мм от выходного окна и собирает рассеянное назад излучение, которое затем направляется по оптоволокну в спектрометр. Мощность лазера при экспозиции в 60 секунд составляет 450 мВт. Нормализация спектров проводится методом Extended multiplicative signal correction. Сглаживание осуществляется с использованием Maximum Like Lihood Estimation Savitzky-Golayfilter с параметром σ=4. Для исключения вклада автофлуоресценции в спектре комбинационного рассеяния использовался модифицированный метод вычитания флуоресцентной составляющей полиномиальной аппроксимацией Improved Modified Multi-Polynomial Fitting со степенью полинома 8. Анализ спектров комбинационного рассеяния проводился в диапазоне от 450 до 1800 см^-1. Затем проводится нелинейный регрессионный анализ полученных спектров, с помощью разложения на сумму асимметричных линий Гаусса, и последующего линейного дискриминантного анализа. За критериальную переменную принимается амплитуда линий а, зависящая от значений независимых регрессоров dx и х0, определяющих начальные условия анализа.

Для штаммов Streptococcus mitis характерна амплитуда линии КР ~1182 см^-1 больше значения 1258 и амплитуда линии КР ~1805 см-1 больше 573. Для штаммов Streptococcus oralis характерна амплитуда линии КР ~1182 см^-1 меньше значения 1258 и амплитуда линии КР ~1881 см^-1 меньше 414. Для штаммов Streptococcus pneumoniae характерна амплитуда линии КР ~1805 см^-1 меньше значения 573 или амплитуда линии 1881 см^-1 больше 414. Предлагаемый способ может быть использован в микробиологии для дифференциации между собой штаммов Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis и Streptococcus oralis.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для дифференциации между собой штаммов Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis и Streptococcus oralis. Дифференциация проводится методом спектроскопии комбинационного рассеяния. Регистрируют спектры с помощью оптического зонда, проводят нормализацию спектров и сглаживание, исключают вклад автофлуоресценции в спектре комбинационного рассеяния. Проводят разложение спектров на сумму асимметричных линий Гаусса и дискриминантный анализ, в результате которых дифференцируют между собой штаммы Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis и Streptococcus oralis.

Способ дифференциации между Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis и Streptococcus oralis, отличающийся тем, что методом спектроскопии комбинационного рассеяния регистрируются спектры с помощью оптического зонда, который располагают над объектом на расстоянии 7 мм, мощность лазера при экспозиции в 60 секунд составляет 450 мВт, нормализацию спектров проводят методом Extended multiplicative signal correction, сглаживание осуществляют с использованием Maximum Like Lihood Estimation Savitzky-Golay filter с параметром σ=4, для исключения вклада автофлуоресценции в спектре комбинационного рассеяния используют модифицированный метод вычитания флуоресцентной составляющей полиномиальной аппроксимацией Improved Modified Multi-Polynomial Fitting со степенью полинома 8, анализ спектров комбинационного рассеяния проводят в диапазоне от 450 до 1800 см^-1, далее проводят разложение на сумму асимметричных линий Гаусса и дискриминантный анализ, в результате которых, если амплитуда линии КР 1182 см^-1 больше значения 1258 и амплитуда линии КР 1805 см^-1 больше 573, то стрептококки определяют как Streptococcus mitis, если амплитуда линии КР 1182 см^-1 меньше значения 1258 и амплитуда линии КР 1881 см^-1 меньше 414, то стрептококки определяют как Streptococcus oralis, если амплитуда линии КР 1805 см^-1 меньше значения 573 или амплитуда линии КР 1881 см^-1 больше 414, то стрептококки определяют как Streptococcus pneumoniae.