ХИМЕРНЫЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ВИРУСОВ РОДОВ FLAVIVIRUS И LYSSAVIRUS Российский патент 2024 года по МПК A61K39/12 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к химерным вакцинам на основе флавивируса. Настоящее изобретение, кроме того, относится к вакцинам против вируса бешенства.

Уровень техники

Вакцины против вируса бешенства для применения у людей представляют собой очищенную клеточную культуру и являются вакцинами против вируса бешенства, полученными с использованием яиц с развивающимся эмбрионом (CCEEV), которые содержат инактивированный вирус бешенства (RABV).

Эти вакцины представляют собой инактивированные вирусные вакцины, для которых требуются схемы с многократными дозами, холодовая цепь и высокие затраты на их производство и поддержание. Эти вакцины не в состоянии предотвратить бешенство у человека в основной целевой группе, которая включает людей в эндемичных регионах. Кроме того, иммунная защита, индуцированная профилактической вакцинацией, относительно быстро ослабевает, что требует постконтактного лечения с помощью комбинации иммуноглобулинов (RIG) и вакцинации по схеме.

Гликопротеин G вируса бешенства (RabG), который отвечает за прикрепление клеток и слияние мембран, является ключевым иммуногеном, на который нацелена разработка вакцины. Обзор гликопротеина G вируса бешенства и его эпитопов представлен в Kuzmina et al. (2013) J antivir antiretrovir. 5:2 37-43.

В Bonaldo et al. (2014) Human Vacc. & Immunother. 10, 1256-1265, рассматриваются химерные конструкции вируса желтой лихорадки (YFV), в которых антигены, не являющиеся флавивирусом, встроены в геном YFV.

Подход, предусматривающий дефектную по репликации платформу вакцины RepliVax™ (RV) на основе вируса Западного Нила (WNV), использовали для получения вакцины против вируса бешенства (RV-RabG) (Giel-Moloney et al. (2017) Vaccine. 35(49PtB), 6898-6904). В этом подходе создавали несколько конструкций на основе RV-RabG путем вставки гена гликопротеина G вируса бешенства в различные варианты WN с делениями (гены С, prME или CprME WN были заменены на ген RabG). Использовали полноразмерный белок RabG, включающий нативную сигнальную последовательность RabG с элементом саморасщепления 2А на С-конце.

Эти конструкции подлежат транскрипции и трансфекции in vitro в хелперные клетки (НС) почек детеныша хомяка (BHK), экспрессирующие структурные белки C-prM-E WN, необходимые для упаковки репликонов RV-RabG в виде однокомпонентных псевдоинфекционных вирусов (sPIV), которые используются в качестве вакцины. Эти PIV вызывают специфический ответ антител против вируса бешенства и WN.

Вирус желтой лихорадки 17D использовали в качестве вектора для гликопротеина вируса Ласса (GPC) или его субъединиц GP1 и GP2 (Bredenbeek et al. (2006) Virology 345, 299-304, и Jiang et al. (2011) Vaccine. 29, 1248-1257). В этих конструкциях ген GP (с отсутствующим сигнальным пептидом, SSP) (или последовательности GP1 или GP2) вставляли между YF-E/NS1. Эти конструкции имеют на С-конце слитых последовательностей вставки, полученных из YF-E (23 С-концевые гидрофобные аминокислоты YF-E), WNV-E или искусственно сконструированных последовательностей. Этими конструкциями необходимо трансфицировать клетки, а полученные из них вирусы используют в качестве вакцин.

Конструкции RepliVax™-RabG (RV-RabG) не могут быть использованы непосредственно в качестве вакцин, они необходимы для создания первых псевдоинфекционных вирусов (PIV) в хелперных клетках (НС) BHK, которые поставляют белки, удаленные из остова WNV в транс-положение для получения PIV, используемых для вакцинирования. Это связано с высокими затратами на производство, а также требует наличия холодовой цепи для сохранения PIV.

Что касается применения YFV17D в качестве вектора для экспрессии предшественника гликопротеина, основная проблема с этим рекомбинантным вирусом заключается в нестабильности, которая не позволяла масштабировать технологию, необходимую для производства вакцины.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении описываются химерные конструкции на основе флавивируса, содержащие белки G лиссавируса в межгенной области E/NS1.

Новую трансгенную вакцину на основе вируса желтой лихорадки конструировали путем вставки RabG в межгенную область E/NS1 вируса желтой лихорадки YFV-17D следующим образом: N-концевой (Nt) сигнальный пептид RabG подвергали делеции, первые 9 аминокислот NS1 (27 нуклеотидов) добавляли к N-концу RabG для обеспечения надлежащего высвобождения белка RabG, цитоплазматическую С-концевую последовательность RabG сохраняли и сливали с трансмембранным доменом 2 WNV (вируса Западного Нила). Полученная конструкция на основе вируса бешенства/YFV-17D инициирует жизнеспособные живые аттенуированные вирусы, экспрессирующие функциональные белки RabG и YFV-17D. Искусственная бактериальная хромосома, содержащая такую конструкцию YFV17D-RabG, может использоваться непосредственно в качестве вакцины, что указывает на то, что такая форма конструкции YFV17D-RabG на основе ДНК может быть использована в качестве термостабильной вакцины. Вакцина вызывает иммунный ответ как против RABV, так и YFV после однократной дозы.

YFV17D-RabG представляет собой двойную вакцину, вызывающую специфический иммунитет к YFV и вирусу бешенства. ВАС, содержащую YFV17D-RabG, также можно использовать для производства живой аттенуированной вакцины, полученной из культуры ткани.

Настоящее изобретение обобщенно представлено в следующих утверждениях.

1. Полинуклеотид, содержащий последовательность живого инфекционного аттенуированного флавивируса, где нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере часть белка G лиссавируса, вставлена/размещена в межгенной области между генами Ε и NS1 указанного флавивируса, так что экспрессируется химерный вирус, отличающийся тем, что кодируемая последовательность на С-конце белка Ε указанного флавивируса и на N-конце сигнального пептида белка NS1 указанного флавивируса содержит в следующем порядке:

- дополнительный сигнальный пептид белка NS1 флавивируса,

- белок G лиссавируса, содержащий дефектный функциональный сигнальный пептид или не содержащий функциональный сигнальный пептид, содержащий эпитоп IIb, содержащий С-концевой ТМ-домен и содержащий С-концевую цитоплазматическую последовательность, и

- ТМ2-домен флавивирусного белка Е.

2. Полинуклеотид согласно утверждению 1, где последовательность живого инфекционного аттенуированного флавивируса представляет собой вирус желтой лихорадки, как правило, штамм YF17D.

3. Полинуклеотид согласно утверждению 2, где остов флавивируса представляет собой химерный вирус.

4. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-3, где лиссавирус представляет собой вирус бешенства.

5. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-4, где белок G вируса бешенства получен из штамма ERA.

6. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-5, где нуклеотидная последовательность белка G является кодон-оптимизированной для улучшения экспрессии в клетках млекопитающих.

7. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-6, где дополнительный сигнальный пептид белка NS1 живого инфекционного аттенуированного флавивируса содержит последовательность DQGCAINFG [SEQ ID NO: 6] или состоит из таковой.

8. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-6, где сигнальный пептид белка NS1, размещенный на С-конце ТМ2-домена, содержит последовательность DQGCAINFG [SEQ ID NO: 6] или состоит из таковой.

9. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-8, где эпитоп IIb имеет последовательность GCTNLSGFS [SEQ ID NO: 15].

10. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-9, где ТМ2-домен флавивирусного белка Ε получен из вируса Западного Нила.

11. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-10, где ТМ2-домен флавивирусного белка Ε имеет последовательность RSIAMTFLAVGGVLLFLSVNVHA [SEQ ID NO: 13].

12. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-11, где дефектный функциональный сигнальный пептид G Rab представляет собой мутацию F14S.

13. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-12, где G Rab не имеет N-концевой сигнальной последовательности из аминокислот 1-19 MVPQALLFVPLLVFPLCFG [SEQ ID NO: 18].

14. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-13, где последовательность химерного вируса содержит в области соединения гена Ε флавивируса, сигнального пептида NS1 и белка G Rab последовательность LGVGA DQGCAINFG KFPIY [SEQ ID NO: 21].

15. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-14, где последовательность химерного вируса содержит в области соединения ТМ2-домена WNV и белка YFV последовательность VNVHA DQGCAINFG KRELK [SEQ ID NO: 22].

16. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-15, где кодируемая последовательность химерного вируса содержит последовательность под SEQ ID NO: 2 или последовательность, характеризующуюся 95% или 99% идентичностью последовательностей, или полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-15, где полинуклеотид содержит последовательность под SEQ ID NO: 1 или последовательность, характеризующуюся 95% или 99% идентичностью последовательностей с ней.

17. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-16, который представляет собой искусственную бактериальную хромосому.

18. Полинуклеотид согласно любому из утверждений 1-17 для применения в качестве лекарственного препарата.

19. Полинуклеотид для применения в качестве лекарственного препарата согласно утверждению 18, где лекарственный препарат представляет собой вакцину.

20. Полинуклеотидная последовательность согласно любому из утверждений 1-19 для применения в вакцинации против лиссавируса.

21. Химерный живой инфекционный аттенуированный флавивирус, где по меньшей мере часть белка G лиссавируса, такого как белок G вируса бешенства, размещена между белками Ε и NS1 указанного флавивируса, так что от С-конца белка Ε до N-конца сигнального пептида белка NS1 вирус содержит в следующем порядке:

- дополнительный сигнальный пептид белка NS1 флавивируса,

- белок G лиссавируса, содержащий дефектный функциональный сигнальный пептид или не содержащий функциональный сигнальный пептид и содержащий эпитоп IIb, содержащий С-концевой ТМ-домен и С-концевую цитоплазматическую последовательность, и

- ТМ2-домен флавивирусного белка Е.

22. Химерный вирус согласно утверждению 21 для применения в качестве лекарственного препарата.

23. Химерный вирус согласно утверждению 22 для применения при предотвращении инфекции, вызванной лиссавирусом.

24. Химерный вирус, кодируемый нуклеотидом согласно утверждению 23, для применения при предотвращении инфекции, вызванной лиссавирусом и в предупреждении инфекции, вызванной флавивирусом.

25. Способ получения вакцины против инфекции, вызванной лиссавирусом, такой как бешенство, предусматривающий стадии:

a) обеспечения ВАС, которая содержит последовательность индуцируемой бактериальной точки начала репликации для амплификации указанной ВАС до более чем 10 копий на бактериальную клетку и вирусную кассету экспрессии, содержащую cDNA химерного вируса на основе флавивируса и лиссавируса согласно любому из утверждений 1-15 и содержащую цис-регуляторные элементы, для транскрипции указанной вирусной cDNA в клетках млекопитающих и для процессирования транскрибированной РНК в инфекционном РНК-вирусе,

b) трансфекции клеток млекопитающих с помощью ВАС стадии а) и пассирования инфицированных клеток,

c) проверки реплицированного вируса трансфицированных клеток стадии b) на вирулентность и способность вырабатывать антитела и индуцировать защиту против инфекции, вызванной лиссавирусом,

d) клонирования вируса, проверенного на стадии с, в вектор,

e) составления вектора в вакцинный состав.

26. Способ согласно утверждению 25, где вектор представляет собой ВАС, которая содержит последовательность индуцируемой бактериальной точки начала репликации для амплификации указанной ВАС до более чем 10 копий на бактериальную клетку.

Данный проект получил финансирование в рамках исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения №733176 RABYD-VAX.

Подробное описание

Фигура 1. А) Схематическое представление YFV17D-RabG-ERA (E/NS1). SP: сигнальный пептид; ТМ: трансмембранный домен. В) Фенотип бляшки YFV17D-RabG-ERA (E/NS1) по сравнению с YFV17D. С) Схема вакцинации для тестирования иммуногенности YFV17D-RabG-ERA (E/NS1) у мышей AG129. Смертность и серологический ответ на YFV17D-RabG-ERA(E/NS1) у мышей AG129 (таблица) (IP - интраперитонеально; TCID₅₀ - средняя инфекционная доза в тканевой культуре; PEI - полиэтиленимин).

Фигура 2. А) Фенотип бляшки потомства ВАС, экспрессирующего ERA-RabG или Δ82-ERA-RabG, вставленный в сайт YF-E/NS1. В) Легенда к конструкциям, изображенным на панели А.

Фигура 3. А) Схема вакцинации для тестирования иммуногенности YFV17D-RabG-ERA-Δ82 и Rabipur у мышей AG129. (IP - интраперитонеально; TCID₅₀ - средняя инфекционная доза в тканевой культуре). В) Титр нейтрализующих антител к RABV.

Фигура 4. А) Схематическое представление YFV17D-RabG-CVS (E/NS1). SP: сигнальный пептид; ТМ: трансмембранный домен. В) Фенотип бляшки YFV17D-RabG-CVS (E/NS1) по сравнению с YFV17D.

Фигура 5. А) Схема вакцинации для тестирования иммуногенности YFV17D-RabG-CVS (E/NS1) у мышей AG129. В) Смертность и серологический ответ на YFV17D-RabG-CVS(E/NS1) у мышей AG129 (IP - интраперитонеально).

Фигура 6. A) RabG-ERA вставляли между YF-E/NS1 следующим образом: N-концевой сигнальный пептид (SP) RabG удаляли для размещения RabG в полипротеине YF, первые 9 аминокислот NS1 добавляли к Nt из G Rab для обеспечения надлежащего высвобождения RabG, цитоплазматический домен RabG на С-конце сохраняли и сливали с якорем-2 трансмембранного домена WNV для соответствия RabG в топологии полипротеина YF. В) Схематическое представление конструкции YFV17D-RabG_ERAΔSP.

Фигура 7. А) Фенотип бляшки потомства ВАС, экспрессирующего RabG_ERAΔSP. В) Совместная экспрессия антигенов RabG_ERAΔSP и YFV, выявляемых с помощью иммунофлуоресценции клеток BHK21J, инфицированных надосадочной жидкостью клеток, трансфицированных с помощью pShuttle-YF17D-RabG_ERAΔSP. Клетки фиксировали через 48 часов p.i. и окрашивали на RabG и YFV.

Фигура 8. RT-PCR-анализ образцов вируса, собранных во время серийного пассирования вируса YF17D-RabG_ERAΔSP. С+, контрольный положительный pSYF17D-YF17D-RabG_ERAΔSP; -RT: реакция RT-PCR без ретротранскриптазы; РНК: реакция RT-PCR с вирусной РНК. (Панель А: пассажи 1-6; панель В: пассажи 7-10).

Фигура 9. А) Схема вакцинации для тестирования иммуногенности вируса YF17D-RabG_ERAΔSP у мышей AG129. В) Титр сывороточных нейтрализующих антител (SNA) против вируса бешенства.

Фигура 10. Схема однократной вакцинации для тестирования иммуногенности in vivo (i) PLLAV-YF17D-RabG_ERAΔSP, (ii) вируса YF17D-RabG_ERAΔSP, (iii) ВАС, содержащей YF17D-CVS-RabG-F14S, и (iv) вируса YF17D-CVS-RabG-F14S у мышей AG129. YFV-17D-NLuc и Rabipur (однократную или двукратную схему вакцинации) использовали в качестве положительных контролей для вакцинации против вирусов YF и бешенства, соответственно.

Фигура 11. Титр сывороточных нейтрализующих антител (SNA) к RABV после (А) дня 07, (В) дня 14, (С) дня 21 и (D) дня 28 после IP вакцинации с помощью (i) PLLAV-YF17D-RabG_ERAΔSP, (ii) вируса YF17D-RabG_ERAΔSP, (iii) ВАС с YF17D-CVS-RabG-F14S, (iv) YF17D-CVS-RabG-F14S, (v) YFV-17D-Nluc и (vi) при однократной и (vii) двукратной схеме иммунизации с помощью Rabipur у мышей AG129. 2 дозы Rabipur: данные соответствуют дням 7, 14, 21 и 28 после введения бустерной дозы Rabipur мышам.

Фигура 12. А) Схематическое представление RabG, вставленного между JE-E и YF-NS1 (остов ChimeriVax JE). В) Фенотип бляшки ChimeriVaxJE-RabG по сравнению с YF17D. С) Анализ RT-PCR образцов вируса, собранных во время серийного пассирования вируса ChimeriVaxJE-RabG. С+, контрольный положительный pShuttle-ChimeriVaxJE-RabG; -RT: реакция RT-PCR без ретротранскриптазы; РНК: реакция RT-PCR с вирусной РНК.

Фигура 13. А) Схема вакцинации для тестирования иммуногенности ChimeriVaxJE-RabG у мышей AG129. В) Смертность и серологический ответ на ChimeriVaxJE-RabG у мышей AG129 (IP - интраперитонеально).

Фигура 14. А) Схематическое представление RabG, вставленного между ZIK-E и YF-NS1 (остов ChimeriVaxZIK). В) Фенотип бляшки ChimeriVaxZIK-RabG по сравнению с YF17D. С) Анализ RT-PCR образцов вируса, собранных во время серийного пассирования вируса ChimeriVaxZIK-RabG. С+, контрольный положительный pShuttle-ChimeriVaxZIK-RabG; -RT: реакция RT-PCR без ретротранскриптазы; РНК: реакция RT-PCR с вирусной РНК.

Фигура 15. А) Схема вакцинации для тестирования иммуногенности ChimeriVaxZIK-RabG у мышей AG129. В) Смертность и серологический ответ на ChimeriVaxZIK-RabG у мышей AG129 (IP - интраперитонеально).

Фигура 16. Варианты осуществления модификаций остова.

(A) Остовы вектора на основе флавивируса. Схематическое представление организации генома типичных живых аттенуированных флавивирусов, используемых в качестве живых вакцин. Каждый вакцинный вирус кодирует остов (1), содержащий гены С и NS1-5, и вирусные поверхностные белки prME (2). Компоненты (1) и (2), как известно, вызывают специфический в отношении вируса гуморальный и клеточный иммунитет; компонент (2), в частности, нейтрализующие антитела (nAb).

YF17D - вакцинный штамм вируса желтой лихорадки 17D; JE SA14-14-2 - вакцинный штамм вируса японского энцефалита SA14-14-2; ZIKV - вирус Зика или его вариант живого аттенуированного вируса Зика для использования в качестве вакцины.

(B) Прототипная вакцина против лиссавируса, экспрессируемая из остова вектора YF17D с вариацией поверхностных белков флавивируса. Схематическое представление организации генома типичных живых аттенуированных флавивирусов, которые являются трансгенными по белку G вируса бешенства (RabG, компонент 3) в качестве защитного антигена, полученного из прототипного лиссавируса, представляющего собой вирус бешенства, для использования в качестве вакцины против вируса бешенства. Показаны три возможных варианта с использованием в качестве остова компонентов (1) вируса YF17D и в качестве поверхностных белков флавивируса компонента (2) из YF17D, JE SA14-14-2 и ZIKV, соответственно.

YF17D-RabG - рекомбинантный YF 17D, экспрессирующий RabG; CVax-JE-RabG - химерный вакцинный штамм YF17D JE (как описано, например, Arroyo et al. 2001 PMID: 11134306), экспрессирующий RabG; Cvax-ZIK-RabG - вакцинный штамм YF17D/ZIK (как описано, например, Kum et al., 2018 PMID: 30564463), экспрессирующий RabG.

(C) Варианты антигенной вакцины против лиссавируса, экспрессируемые из остова вектора YF17D. Схематическое представление организации генома типичных живых аттенуированных флавивирусов, в которых используются в качестве остова компоненты (1) вируса YF17D и в качестве трансгена компонент (3) последовательности белка G ряда лиссавирусов, представляющих различающиеся по антигенным свойствам филогруппы I (вируса бешенства), II (вируса лагосских летучих мышей, LBV, и вируса Мокола, MOKV) и III (вируса летучих мышей Lleida, LLEBV), соответственно. Каждый белок G считается защитным антигеном, вызывающим иммунитет против родственных лиссавирусов, по меньшей мере против вирусов, принадлежащих к одной и той же филогруппе.

YF17D-RabG - рекомбинантный YF 17D, экспрессирующий RabG; YF17D-LBV-G - рекомбинантный YF17D, экспрессирующий белок G LBV; YF17D-MOKV-G - рекомбинантный YF17D, экспрессирующий белок G MOKV; YF17D-LLEBV - рекомбинантный YF17D, экспрессирующий белок G LLEBV.

(D) Прототипная вакцина против лиссавируса, экспрессируемая из остова вектора JE SA14-14-2. Схематическое представление организации генома живых аттенуированных флавивирусов, в которых используются в качестве остова компоненты (1) вируса JE SA14-14-2 и в качестве трансгена компонент (3).

Настоящее изобретение проиллюстрировано в отношении вируса желтой лихорадки, но также применимо с использованием других вирусных остовов видов флавивируса, таких как без ограничения вирус японского энцефалита, вирус денге, вирус энцефалита долины Мюррей (MVE), вирус энцефалит Сент-Луиса (SLE), вирус Западного Нила (WN), вирус клещевого энцефалита (ТВЕ), вирус таежного весенне-летнего энцефалита (RSSE), вирус Кунджин, вирус Повассан, вирус киасанурской лесной болезни, вирус Зика, вирус Усуту, вирус лихорадки Весселсброн и омской геморрагической лихорадки.

Настоящее изобретение, кроме того, применимо к семейству Flaviviridae, которое включает род Flavivirus, но также роды Pegivirus, Hepacivirus и Pestivirus.

Род Hepacivirus включает, например, Hepacivirus С (вирус гепатита С) и Hepacivirus В (вирус GB В).

Род Pegivirus включает, например, Pegivirus А (вирус GB A), Pegivirus С (вирус GB С) и Pegivirus В (вирус GB D).

Род Pestivirus включает, например, вирус диареи крупного рогатого скота 1 и вирус классической чумы свиней (ранее вирус холеры свиней).

Флавивирус, который используется в качестве остова, сам может представлять собой химерный вирус, состоящий из частей различных флавивирусов.

Например, области С и NS1-5 происходят из вируса желтой лихорадки, а область prME происходит из вируса японского энцефалита или вируса Зика. Их примеры представлены в таблице 2 и на фигуре 16.

Настоящее изобретение проиллюстрировано в отношении белка G вируса Rabies lyssavirus, но также применимо к белкам G других лиссавирусов. Их примерами являются араванский лиссавирус вирус Араван (ARAV), австралийский лиссавирус летучих мышей, лиссавирус летучих мышей Бокело, лиссавирус Дювенхаге, европейский лиссавирус летучих мышей 1, европейский лиссавирус летучих мышей 2, лиссавирус Икома, лиссавирус Иркут, худжандский лиссавирус, лиссавирус летучих мышей Лагоса, лиссавирус Мокола, лиссавирус летучих мышей Шимони и лиссавирус летучих мышей Западного Кавказа, а также их возможные химеры и антигенные варианты. Многие из этих видов встречаются у летучих мышей. Однако передача вирусов от летучих мышей людям представляет значительный риск для здоровья.

Конструкции по настоящему изобретению обеспечивают надлежащее представление кодируемой вставки в просвет ER и протеолитическое процессирование. Как показано на примере белка G Rab, белок, кодируемый вставкой, содержит только около С-конца трансмембранный домен, за которым следует пептид, находящийся в цитозоле. Для достижения этой конфигурации N-концевой сигнальный пептид G Rab удаляли (или делали нефункциональным). На основании этого принципа любой иммуногенный белок может быть представлен посредством вектора по настоящему изобретению, при этом белок не имеет N-концевого мембранного целевого домена и содержит на С-конце нацеливающую мембрану, за которой следует цитоплазматическая последовательность для обеспечения соединения с трансмембранным доменом перед белком NS1.

Далее в настоящем изобретении описываются варианты осуществления, в которых флавивирус применяют в качестве остова, а белок G лиссавируса в качестве вставки.

Обзор белка G вируса бешенства представлен в Kuzmina et al. (2013) J antivir antiretrovir. 5:2, 37-43. Нумерация признаков в последовательности относится к зрелому белку, которому предшествует сигнальный пептид, состоящий из 19 аминокислот (MVPQALLFVPLLVFPLCFG) [SEQ ID NO: 18]. Соответствующими элементами последовательности в зрелом белке являются эпитоп IIb GCTNLSGFS (АА 34-42) [SEQ ID NO: 15], трансмембранный домен VLLSAGALTALMLIIFLMTCC (АА 440-461) [SEQ ID NO: 19] и цитоплазматический домен RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL [SEQ ID NO: 20] (АА 462-505).

Высокая идентичность последовательностей между белками G различных лиссавирусов не представляет проблем для специалиста при идентификации в родственных последовательностях элементов последовательности, соответствующих элементам, присутствующим в белке G вируса бешенства.

Флавивирусы имеют положительный геном однонитевой РНК длиной приблизительно 11000 нуклеотидов. Геном содержит 5'-нетранслируемую область (UTR), длинную открытую рамку считывания (ORF) и 3'-UTR. ORF кодирует три структурных (капсида [С], предшественника мембраны [prM] и оболочки [Е]) белка и семь неструктурных (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5) белков. Структурные белки вместе с геномной РНК образуют вирусные частицы. Неструктурные белки участвуют в процессировании вирусных полипротеинов, репликации, сборке вирионов и уклонении от иммунного ответа хозяина. Сигнальный пептид на С-конце белка С (С-сигнальный пептид, также называемый С-якорным доменом) регулирует упаковку флавивируса посредством координации последовательных расщеплений на N-конце (вирусной протеазой NS2B/NS3 в цитоплазме) и С-конце (посредством сигналазы хозяина в просвете эндоплазматического ретикулума [ER]) последовательности сигнального пептида.

Положительно-смысловой однонитевой геном транслируется в один полипротеин, который совместно и посттрансляционно расщепляется вирусными белками и белками хозяина на три структурных [капсида (С), премембраны (prM), оболочки (Е)] и семь неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Структурные белки отвечают за формирование (сферической) структуры вириона, инициируя адгезию вириона, интернализацию и высвобождение вирусной РНК в клетки, что тем самым инициирует жизненный цикл вируса. Неструктурные белки, с другой стороны, отвечают за вирусную репликацию, модуляцию и уклонение от иммунных ответов в инфицированных клетках, а также за передачу вирусов комарам. Внутри- и межмолекулярные взаимодействия между структурными и неструктурными белками играют ключевые роли в вирусной инфекции и патогенезе.

Белок Ε содержит на своем С-конце две трансмембранные последовательности, обозначенные, например, как ТМ1 и ТМ2 на фигуре 6.

NS1 транслоцируется в просвет ER посредством сигнальной последовательности, соответствующей последним 24 аминокислотам Е, и высвобождается из Ε на его аминоконце посредством расщепления сигнальной пептидазой хозяина, резидентного ER (Nowak et al. (1989) Virology 169, 365-376). NS1 содержит на своем С-конце сигнальную последовательность из 8-9 аминокислот, которая содержит сайт распознавания для протеазы (Muller & Young (2013) Antiviral Res. 98, 192-208).

Конструкции по настоящему изобретению представляют собой химерные вирусы, в которых белок G лиссавируса вставлен на границе между белками Ε и NS1. Однако дополнительные элементы последовательности предусмотрены на N-конце и С-конце вставки белка G.

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность живого инфекционного аттенуированного флавивируса, где нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере часть белка G лиссавируса, вставлена в межгенной области между генами Ε и NS1 указанного флавивируса, так что экспрессируется химерный вирус, отличающийся тем, что кодируемая последовательность на С-конце белка Ε указанного флавивируса и на N-конце белка NS1 указанного флавивируса содержит в следующем порядке:

- элемент последовательности, обеспечивающий протеолитическое процессирование белка G из белка Ε с помощью сигнальной пептидазы,

- белок G лиссавируса, содержащий дефектный функциональный сигнальный пептид или не содержащий функциональный сигнальный пептид, содержащий эпитоп IIb, содержащий С-концевой ТМ-домен и содержащие С-концевую цитоплазматическую последовательность, и

- ТМ2-домен флавивирусного белка Е.

Для обеспечения протеолитического процессирования белка G лиссавируса из белка Ε флавивируса на его аминоконце и обеспечения протеолитического процессирования белка G лиссавируса из белка NS1 флавивируса на его С-конце предусмотрены элементы последовательности, которые являются субстратами для сигнальной пептидазы. Они могут варьировать по длине и последовательности и могут представлять собой всего лишь одну аминокислоту, как показано у Jang et al., цитируемых выше. Обсуждение подходящих сайтов распознавания для сигнальных протеаз можно найти в Nielsen et al. (1997) Protein Eng. 10, 1-6.

Как правило, на С-конце белка G будет использоваться сигнальный пептид на N-конце белка NS1 (или фрагмент, который обеспечивает протеолитическое процессирование).

Как правило, на N-конце белка G вводится тот же сигнальный пептид (или фрагмент) белка NS1 остова флавивируса.

Настоящее изобретение в равной степени относится к полинуклеотидам, содержащим последовательность живого инфекционного аттенуированного флавивируса. В данном случае нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере часть белка G лиссавируса, вставлена в межгенную область между генами Ε и NS1 указанного флавивируса. Предоставлены дополнительные последовательности, так что, когда химерный вирус экспрессируется таким образом, что кодируемая последовательность от С-конца белка Ε до Ν-конца сигнального пептида белка NS1 содержит в следующем порядке:

дополнительный сигнальный пептид (или его расщепляемый фрагмент) гена NS1 флавивируса, С-концевой по отношению к белку Ε и N-концевой по отношению к белку NS1,

белок G лиссавируса, содержащий дефектный функциональный сигнальный пептид или не содержащий функциональный сигнальный пептид, содержащий эпитоп IIb, содержащий С-концевой ТМ-домен мембранного белка и С-концевую цитоплазматическую последовательность. Этот белок G расположен на С-конце сигнального пептида NS1. С-конец белка G представляет собой последовательность трансмембранного домена ТМ2 флавивируса. С-конец этой последовательности ТМ2 следует за белком NS1, в том числе его нативной последовательностью сигнального пептида.

Таким образом, белок G и ТМ2-домен фланкированы на N-конце и С-конце последовательностью NS1. В вариантах осуществления, раскрываемых в примерах, последовательность белка и ДНК обеих NS1 идентичны.

В типичных вариантах осуществления обе сигнальные последовательности NS1 представляют собой последовательность DQGCAINFG [SEQ ID NO: 6].

Конструкции по настоящему изобретению не демонстрировали рекомбинации по причине присутствия этой повторяющейся последовательности. Могут быть введены модификации последовательностей или могут быть использованы последовательности NS1 от разных флавивирусов, чтобы избежать присутствия идентичных последовательностей, при условии, что кодируемый пептид остается мишенью для протеазы, которая процессирует эти N-концевые сигнальные последовательности NS1.

В типичных вариантах осуществления, раскрываемых в примерах, белок G получен из вируса бешенства, предпочтительно из штамма ERA вируса бешенства.

Для облегчения продуцирования вируса у млекопитающих-хозяев нуклеотидная последовательность белка G кодон-оптимизирована.

Белок G в конструкциях по настоящему изобретению обеспечивает иммуногенность, когда присутствует эпитоп IIb. Эпитоп IIb вируса бешенства, как правило, имеет последовательность GCTNLSGFS [SEQ ID NO: 15].

Кроме того, для получения желаемой топологии белка G вируса бешенства во время процессирования вируса необходимо присутствие трансмембранной последовательности белка G, а также С-концевой цитоплазматической последовательности. Последовательности ТМ-домена и цитоплазматическая последовательность белка G обычно представляют собой последовательности аминокислот 440-461 и аминокислот 462-505, соответственно, белка G вируса бешенства.

Предполагается, что незначительные модификации последовательности в белке G и в С-концевом хвосте могут быть введены без потери функции этих элементов последовательности. Например, аминокислотные замены, при которых гидрофобные боковые цепи сохраняются в трансмембранном домене, или усеченные версии цитоплазматического домена с длиной, достаточной для обеспечения надлежащей локализации трансмембранных доменов на N-конце и С-конце цитоплазматического домена.

Выяснили, что присутствие функционального сигнального пептида белка G приводит к селективному давлению, в результате чего часть белка G, содержащая его сигнальный пептид, подвергается делеции или мутации. Таким образом, конструкции по настоящему изобретению, как правило, содержат сигнал дефектного белка G за счет частичного или полного удаления этой последовательности или за счет введения мутаций, которые делают сигнальный белок нефункциональным (таких как, мутация G Rab F14S в сигнальном пептиде MVPQALLFVPLLVFPLCFG [SEQ ID NO: 18]).

Домен ТМ, который расположен на С-конце белка G и на N-конце NS1, обычно получен из флавивируса, как правило, из белка Е, и более типичным является ТМ2-домен белка Е. В предпочтительных вариантах осуществления этот ТМ2-домен белка Ε получен из флавивируса, отличного от вируса, образующего остов. В примерах настоящего изобретения описывается ТМ2-домен белка Ε вируса Западного Нила. Этот домен имеет последовательность RSIAMTFLAVGGVLLFLSVNVHA [SEQ ID NO: 13].

В приведенном ниже разделе примеров и в схематическом представлении все элементы последовательности образуют непрерывную последовательность без каких-либо промежуточных элементов последовательности. Предполагается, что между этими элементами последовательности могут присутствовать дополнительные аминокислоты, при условии, что не нарушается локализация белка либо в просвете ER, либо в цитозоле и поддерживается протеолитическое процессирование.

Описываемая выше нуклеотидная последовательность может быть нуклеотидной последовательностью самого вируса или может относиться к последовательности в векторе. Подходящим вектором для клонирования флавивируса и его химерной версии являются искусственные бактериальные хромосомы, как более подробно описано ниже.

Способы и соединения по настоящему изобретению находят медицинское применение, тем самым вирус или вектор, кодирующий вирус, можно использовать для вакцинации против лиссавируса, который содержит белок G, который был клонирован в флавивирус. Кроме того, белки из флавивирус в равной степени обеспечивают защиту, так что соединения по настоящему изобретению можно использовать для вакцинации против флавивируса и лиссавируса с использованием одной вирусной или ДНК-вакцины.

Применение искусственных бактериальных хромосом и особенно применение индуцибельных ВАС, раскрываемых авторами настоящего изобретения в WO 2014174078, особенно подходит для амплификации cDNA РНК-вирусов с высоким выходом и высоким качеством, например, химерных конструкций по настоящему изобретению.

ВАС, при этом описываемая в этой публикации ВАС, содержит:

- последовательность индуцируемой бактериальной точки начала репликации для амплификации указанной ВАС до более чем 10 копий на бактериальную клетку, и

- вирусную кассету экспрессии, содержащую cDNA генома РНК-вируса и содержащую цис-регуляторные элементы для транскрипции указанной вирусной cDNA в клетках млекопитающих и для процессирования транскрибированной РНК в инфекционном РНК-вирусе.

Как и в случае настоящего изобретения, геном РНК-вируса представляет собой химерную конструкцию вирусной cDNA генома РНК-вируса и белка G вируса бешенства.

В этих ВАС вирусная кассета экспрессии содержит cDNA вирусного генома с положительной нитью РНК, как правило,

- управляемый РНК-полимеразой промотор, предшествующий 5'-концу указанной cDNA, для инициации транскрипции указанной cDNA, и

- элемент для саморасщепления РНК после 3'-конца указанной cDNA для расщепления РНК-транскрипта указанной вирусной cDNA в заданном положении.

ВАС может дополнительно содержать дрожжевую автономно реплицирующуюся последовательность для перемещения и поддержания указанной бактериальной искусственной хромосомы в дрожжах. Примером дрожжевой последовательность точки начала репликации является точка начала репликации 2μ-плазмидного происхождения или ARS1 (автономно реплицирующаяся последовательность 1) или ее функционально гомологичные производные.

Управляемый РНК-полимеразой промотор по этому первому аспекту настоящего изобретения может представлять собой промотор РНК-полимеразы II, такой как немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE) или промотор вируса обезьян 40, или его функционально гомологичные производные.

Управляемый РНК-полимеразой промотор в равной степени может представлять собой промотор РНК-полимеразы I или III.

ВАС может также содержать элемент для саморасщепления РНК, такой как cDNA геномного рибозима вируса гепатита дельта или функционально гомологичные элементы РНК.

Составление ДНК в вакцинный препарат известно из уровня техники и подробно описано, например, в главах 6-10 работы «DNA Vaccines» Methods in Molecular Medicine Vol 127, (2006) Springer Saltzman, Shen and Brandsma (Eds.) Humana Press. Totoma, N.J., и в главе 61 работы Alternative vaccine delivery methods, Ρ 1200-1231, в Vaccines (6th Edition) (2013) (Plotkin et al. Eds.). Подробности о приемлемом носителе, разбавителях, вспомогательном веществе и адъюванте, подходящих для приготовления ДНК-вакцин, также можно найти в WO 2005042014, как указано ниже.

«Приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество» относится к дополнительному веществу, которое является приемлемым для применения в медицине и/или ветеринарии, особенно в иммунотерапии.

В качестве примера приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество может представлять собой твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или инкапсулирующее вещество, которое можно безопасно использовать при системном или местном введении. В зависимости от конкретного пути введения можно использовать ряд носителей, хорошо известных из уровня техники. Эти носители могут быть выбраны из группы, включающей сахара, крахмалы, целлюлозу и ее производные, солод, желатин, тальк, сульфат и карбонаты кальция, растительные масла, синтетические масла, многоатомные спирты, альгиновую кислоту, забуференные фосфатом растворы, эмульгаторы, изотонический солевой раствор и соли, такие как соли минеральных кислот, в том числе гидрохлориды, бромиды и сульфаты, органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты и малонаты, а также апирогенную воду.

Полезной ссылкой, описывающей фармацевтически приемлемые носители, разбавители и вспомогательные вещества, является работа Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, (1991)), которая включена в данный документ посредством ссылки.

Для обеспечения пациента ДНК-вакциной можно использовать любой безопасный путь введения. Например, можно использовать пероральный, ректальный, парентеральный, сублингвальный, буккальный, внутривенный, внутрисуставный, внутримышечный, внутрикожный, подкожный, ингаляционный, внутриглазный, интраперитонеальный, интрацеребровентрикулярный, трансдермальный путь введения и т.п. Внутримышечная и подкожная инъекция может быть подходящей, например, для введения иммунотерапевтических композиций, белковых вакцин и вакцин на основе нуклеиновых кислот. Также предполагается, что бомбардировка микрочастицами или электропорация могут быть особенно применимыми для доставки вакцин на основе нуклеиновых кислот.

Дозированные формы включают таблетки, дисперсии, суспензии, инъекции, растворы, сиропы, пастилки, капсулы, суппозитории, аэрозоли, трансдермальные пластыри и т.п. Эти дозированные формы также могут включать инъекционные или имплантационные устройства контролируемого высвобождения, разработанные специально для этой цели, или другие формы имплантатов, модифицированных для дополнительного действия таким образом. Контролируемое высвобождение терапевтического средства может осуществляться путем покрытия его, например, гидрофобными полимерами, включающими в себя акриловые смолы, воски, высшие алифатические спирты, полимолочную и полигликолевую кислоты, а также некоторые производные целлюлозы, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза. Кроме того, контролируемое высвобождение можно осуществлять с использованием других полимерных матриц, липосом и/или микросфер.

ДНК-вакцины, подходящие для перорального или парентерального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, саше или таблетки, каждые из которых содержат предварительно определенное количество плазмидной ДНК, в виде порошка или гранул, или в виде раствора или суспензии в водной жидкости, неводной жидкости, эмульсии типа «масло в воде» или жидкой эмульсии типа «вода в масле». Такие композиции могут быть приготовлены любым из фармацевтических способов, но все способы предусматривают стадию объединения одного или нескольких средств, описываемых выше, с носителем, который представляет собой один или несколько необходимых ингредиентов. Обычно композиции готовят путем равномерного и тщательного смешивания ДНК-плазмид с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или и с теми и другими, а затем, при необходимости, придания продукту формы желаемого вида.

Указанные выше композиции можно вводить способом, совместимым с дозированным составом, и в таком количестве, которое является эффективным. Доза, вводимая пациенту, должна быть достаточной, чтобы вызвать положительный ответ у пациента на протяжении соответствующего периода времени. Количество средства(средств), подлежащего(их) введению, может зависеть от субъекта, который подвергается лечению, в том числе от его возраста, пола, веса и общего состояния здоровья, факторов, которые будут зависеть от суждения практикующего врача.

Кроме того, ДНК-вакцина может быть доставлена с помощью бактериальной трансдукции с использованием живого аттенуированного штамма Salmonella, трансформированного указанными ДНК-плазмидами, как поясняется в работе Darji et al. (2000) FEMS Immunol Med Microbiol 27, 341-349, и Cicin-Sain et al. (2003) J Virol 11, 8249-8255, приведенной в качестве ссылки.

Как правило, ДНК-вакцины используют для профилактической или терапевтической иммунизации людей, но против некоторых вирусов также могут применяться у позвоночных животных (как правило, млекопитающих, птиц и рыб), включая домашних животных, таких как домашний скот и животные-компаньоны. Предусмотрена вакцинация животных, которые являются живым резервуаром вирусов (зооноза), таких как обезьяны, собаки, мыши, крысы, птицы и летучие мыши.

В некоторых вариантах осуществления вакцины могут включать в себя адъювант, т.е. одно или несколько веществ, которые усиливают иммуногенность и/или эффективность вакцинной композиции. Однако в конечном итоге живые вакцины могут быть повреждены адъювантами, которые могут стимулировать врожденный иммунный ответ независимо от репликации вируса. Неограничивающие примеры подходящих адъювантов включают сквалан и сквален (или другие масла животного происхождения); блок-сополимеры; поверхностно-активные вещества, такие как Твин-80; Квил А, минеральные масла, такие как Drakeol или Marcol, растительные масла, такие как арахисовое масло; адъюванты, полученные из Corynebacterium, например, Corynebacterium parvum; адъюванты, полученные из Propionibacterium, например, Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (бациллу Кальмета-Герена или BCG); интерлейкины, такие как интерлейкин 2 и интерлейкин 12; монокины, такие как интерлейкин 1; фактор некроза опухоли; интерфероны, такие как гамма-интерферон; комбинации, такие как сапонин-гидроксид алюминия или гидроксид алюминия Квил А; липосомы; адъювант ISCOMt и ISCOMATRIX (В); экстракт клеточной стенки микобактерий; синтетические гликопептиды, такие как мурамилдипептиды или другие производные; авридин; производные липида А; сульфат декстрана; DEAE-декстран или с фосфатом алюминия; карбоксиполиметилен, такой как Carbopol'EMA; эмульсии акриловых сополимеров, такие как Neocryl А640; белки вируса коровьей оспы или поксвируса животных; адъюванты с субвирусными частицами, такие как токсин холеры, или их смеси.

Примеры

Пример 1. Вставка G Rab в E/NS1

1.1. PLLAV-YFV17D-RabG-ERA

Первую конструкцию, несущую полноразмерный RabG (штамм ERA), вставленный в межгенную область между генами YF-E/NS1, клонировали следующим образом: первые 9 аминокислот NS1 (27 нуклеотидов) добавляли перед сигнальным пептидом (SP) RabG для воспроизведения сайта расщепления сигнальной пептидазой между Ε и NS1 и обеспечения высвобождения белка RabG, С-конец RabG сохраняли и сливали со вторым трансмембранным доменом WNV-E (фиг. 1А).

Анализ последовательности серийного пассирования и очищенного от бляшек вируса YFV17D-RabG-ERA(E/NS1) выявлял делецию 246 п. н. (82 аминокислоты) в начале кодирующей последовательности ERA-RabG, что указывает на нестабильность конструкции. Эта делеция начинается с первой аминокислоты сигнального пептида (SP) RabG и включает потерю части эпитопа II, а также некоторых дисульфидных мостиков, необходимых для сворачивания белка. Однако этот живой аттенуированный вирус YFV-ERA-RabG(E/NS1) был способен индуцировать нейтрализующие антитела против RABV у мышей, которые сероконвертировали как в отношении вируса YF, так и в отношении вируса бешенства (фигура. 1С). Поскольку этот белок Δ82-ERA-RabG, по-видимому, являлся иммуногенным, cDNA, полученную из очищенного от бляшек вируса, клонировали в описанный выше вектор ВАС с индуцибельной точкой начала репликации (PLLAV-YFV17D). Четыре варианта, несущие различные мутации, выявляли после секвенирования 13 клонов E.coli (pSYF17D-Δ82-ERA-RabG-ENS1 №1, №2, №9 и №12, соответственно, фигура 2). Каждой из этих новых конструкций pSYF17D-Δ82-ERA-RabG(E/NS1) трансфицировали клетки BHK21J. Все они демонстрировали последовательную индукцию типичного индуцированного вирусом цитопатогенного эффекта (СРЕ). Подобным образом, содержащие вирус супернатанты, собранные из трансфицированных клеток, содержали инфекционные частицы, способные образовывать характерные вирусные лизисные бляшки (фигура 2). Очищенный от бляшек вирус, который также использовали для создания cDNA, инокулировали мышам AG129, и, хотя отмечали сероконверсию в отношении YF, никаких нейтрализующих антител к вирусу бешенства не выявляли (фигура 3). Поэтому дальнейшую характеристику этих конструкций in vitro и/или in vivo не проводили.

1.2. PLLAV-YFV17D-RabG-CVS

Было показано, что белок ERA-RabG индуцировал выраженный апоптоз (Prehaud et al. (2003) J Virol. 77, 10537-10547). Кодон-оптимизированный полноразмерный RabG из неапоптотического контрольного штамма вируса бешенства (CVS) вставлен между E/NS1 в той же конфигурации, что описана для штамма ERA (фигура 4А).

Эту конструкцию трансфицировали в BHK-21J и наблюдали индуцированный вирусом СРЕ. Супернатант с полученным из ткани вирусом был способен индуцировать СРЕ и бляшки (фигура 4В). Дальнейшая характеристика трех очищенных от бляшек вирусов, полученных из этой конструкции, показала, что в этом случае не отмечали делеций в последовательности RabG, но была выявлена одна точечная нуклеотидная мутация в сигнальном пептиде белка RabG. Эта мутация изменила аминокислоту фенилаланин на серии (F14S). Супернатант с культивированным в ткани вирусом, собранный после трансфекции конструкцией и вирусом, очищенным от бляшек, инокулировали мышам AG129 для определения иммуногенности. У всех мышей была сероконверсия как в отношении RABV, так и в отношении YFV (фигура 5). Следовательно, поскольку этот CVS-RabG-F14S оказался иммуногенным, cDNA, полученную из очищенного от бляшек вируса, клонировали в pShuttle-YF17D (PLLAV), и эта новая конструкция была охарактеризована, как описано выше для предыдущих конструкций (СРЕ и фенотипирование бляшек), демонстрируя, что она способна инициировать жизнеспособные и полностью репликационно-компетентные рекомбинантные трансгенные вакцинные вирусы. PLLAV-YFV17D-RabG-CVS-F14S параллельно с очищенным от бляшек вирусом YF17D-CVS-RabG-F14S вводили мышам AG129 (n=10), и 4/10 животных и 9/10 были сероконвертированы как в отношении RABV, так и в отношении YFV, соответственно (таблица 1 и фигура 11). Этот результат дает основание предполагать, что для улучшения иммуногенности PLLAV YF17D-RabG (E/NS1) требуется дальнейшая оптимизация PLLAV.

Приведенные выше примеры указывают на необходимость получения нефункциональных вариантов исходного сигнального пептида белка G Rab либо путем делеции всего сигнального пептида, либо путем введения мутаций в сигнальный пептид.

Таким образом, создавали новые конструкции sYF17D-RabG, в которых последовательность SP RabG подвергалась делеции для улучшения иммуногенности экспрессированного белка RabG.

Пример 2. Конструкции PLLAV YF17D-RabG-ASP (E/NS1)

Сигнальный пептид G Rab вовлечен в иммуногенность белка. Белок RabG необходимо приспособить к общей топологии полипротеина YF для обеспечения надлежащей экспрессии трансгена и репликации вектора YFV (фиг. 6). Присутствие полноразмерного RabG SP добавляет один дополнительный трансмембранный домен в вирусную конструкцию, что нарушает конформацию полипротеина YF и влияет на нативное сворачивание RabG, которое необходимо для полной антигенности.

Оптимизированную конструкцию, несущую RabG_ERAΔSP (фиг. 3), создавали и характеризовали in vitro, как описано ранее (фигура 7А). Совместная экспрессия RabG вместе с полипротеином YFV может быть подтверждена (фигура 7В), что указывает на надлежащее сворачивание RabG. По сравнению с конструкцией, изображенной на фигуре 1А и описанной в примере 1, последовательность, кодирующая 19 N-концевых аминокислот, подвергалась делеции.

Стабильность полученных из pShuttle-YF17D-RabG_ERAΔSP вирусов определяли путем проведения RT-PCR для выявления вставки трансгена в вирусных образцах, которые собирали в ходе серийного пассирования вируса YF17D-RabG_ERAΔSP (фиг. 8). Секвенирование продуктов RT-PCR показало, что вставка усеченного на N-конце RabG может быть выявлена до пассажа 7 без мутаций.

Иммуногенность конструкции ВАС PLLAV-YFT7D-RabG_ERAΔSP оценивали in vivo на мышах AG129 (n=5) после IP инокуляции рекомбинантным вирусом, полученным после трансфекции клеток этой PLLAV (фигура 9А). Все животные, вакцинированные вирусом, полученным из этой усеченной на N-конце конструкции RabG, после однократной вакцинации были сероконвертированы как в отношении YFV, так и в отношении RABV. Также выяснили, что титры сывороточных нейтрализующих антител (SNA) против вируса бешенства превышают 10 МЕ/мл. Титр впоследствии повышался после каждой бустерной дозы (фигура 9В).

Для подтверждения результатов, полученных для вируса YF17D-RabG_ERAΔSP, и оценки иммуногенности его соответствующей индуцибельной ВАС in vivo, авторы настоящего изобретения проводили новый эксперимент параллельно с коммерчески доступной вакциной против вируса бешенства Rabipur® после введения по однократной (день 0) и двукратной схеме (день -7 и день 0) вакцинации (фигура 10). Учитывая иммуногенную природу конструкции первого поколения YF17D-CVS-RabG-F14S, авторы настоящего изобретения также включили ВАС PLLAV-YF17D-CVS-RabG-F14S в исследование (см. раздел В.1). YFV-17-NLuc использовали в качестве положительного контроля для вакцинации против YF (таблица 3). Все манипуляции проводили IP.

Впервые серологический анализ показал, что не только вирусы YFV17D-RabG, но и соответствующие ВАС способны индуцировать антитела к YFV и к RABV (таблица 1 и фигура 11). Конструкция ВАС PLLAV-YF17D-RabG_ERAΔSP была в равной степени действенной по сравнению с вирусной вакциной YF17D-RabG_ERAΔSP в индуцировании специфических антител как к YFV, так и к RABV по эффективности (n=9/10 относительно n=8/9 для ВАС относительно вирусной вакцины на день 21 после вакцинации), а также по кинетическим показателям (индукция антител через 7 дней после вакцинации). Как и предполагали, все животные, вакцинированные с помощью YFV-17D-NLuc или Rabipur, были сероконвертированы в отношении YFV или RABV на день 7 или день 14 после вакцинации, соответственно. Вакцина на основе вируса YFV17D-RabG-CVS-F14S также вызвала в равной степени сильный иммунный ответ, что и YFV17D-RabG_ERAΔSP, по эффективности (двойной иммунный ответ в отношении YFV и RABV у n=9/10 животных через 21 день после вакцинации), но с замедленными кинетическими показателями (двойной иммунный ответ через 14 дней после вакцинации). Кроме того, PLLAV-YFV17D-RabG-CVS-F14S также вызывала двойной иммунный ответ против YFV и RABV, однако он был значительно менее эффективным (n=4/10) и более медленным по кинетическим показателям (начинается через 21 день после вакцинации) по сравнению с оптимизированной конструкцией. Однократная вакцинация с помощью Rabipur, YF17D-RabG_ERAΔSP и конструкции ВАС PLLAV-YF17D-RabG_ERAΔSP могла вызывать подобный двойной иммунный ответ по эффективности (у > 90% животных через 7 дней после вакцинации), а также по интенсивности (через 14 дней после вакцинации). Хотя однократная вакцинация с помощью Rabipur осуществлялась быстрее, чем с помощью YF17D-RabG_ERAΔSP и конструкции ВАС PLLAV-YF17D-RabG_ERAΔSP (SNA, 10 МЕ/мл, 7 дней против 14 дней после вакцинации, соответственно), тем не менее, все животные показали значительно более высокий иммунный ответ, чем рекомендованный ВОЗ защитный титр (0,5 МЕ/мл) после вакцинации. Схема вакцинации с двукратным введением с помощью Rabipur (день -07 и день 0) показывала значительно более высокий иммунный ответ против RABV по сравнению со схемами вакцинации с однократным введением для YF17D-RabG_ERAΔSP и конструкции на основе ВАС PLLAV-YF17D-RabG_ERAΔSP. Это указывает на то, что сравнительно более низкий иммунный ответ на Rabipur скорее связан с оптимизацией эффективной дозы YF17D-RabG_ERAΔSP и PLLAV-YF17D-RabG_ERAΔSP для вакцинации и может быть оптимизирован в исследованиях с повышением дозы.

В дополнение к PLLAV-YFV17D-RabG_ERAΔSP создавали подобную конструкцию (ASP), несущую последовательность RabG из штамма CVS. Кроме того, в литературном источнике (Bonaldo et al. (2007), который цитируется выше; Trindade et al. (2012) Mem Inst Oswaldo Cruz 107, 262-272) описано, что представляется возможным, что белок, вставленный между белками Ε и NS1 YF, может удерживаться в ER за счет сигналов удерживания, обнаруженных в трансмембранных доменах YFV или обычно флавивируса (Op De Beeck et al. (2004) J Virol. 78, 12591-125602; Op De Beeck et al. (2003) J Virol. 77, 813-820) на конце вставки, описанной в этих работах. Хотя авторы настоящего изобретения сохранили исходный трансмембранный домен RabG в конструкциях по настоящему изобретению, который имеет сигналы, отличные от сигналов YF ТМ1, они клонировали еще два PLLAV (ERA-ΔSP и CVS-ΔSP RabG), в которые добавляли саморасщепляющийся пептид 2А на конце цитоплазматического хвоста RabG для компенсации сигнала удерживания в ER.

Неожиданно и в отличие от оптимальной экспрессии RabG, предложенной Giel-Moloney et al., 2017 (цитируется выше), репликационная способность YFV17D-RabG_ERAΔSP/2A была намного ниже по сравнению с вирусом YFV17D-RabG_ERAΔSP, не имеющим 2А, в отношении выходов вируса после трансфекции ВАС в клетки BHK21J, как измерено путем титрования вируса, примером чего являются титры, составляющие 0,8-1,4×10⁴ TCID₅₀/мл для YFV17D-RabG_ERAΔSP/2A и 8×10⁵ TCID₅₀/мл для YFV17D-RabG_ERAΔSP, соответственно. Подобное снижение выхода вируса наблюдали для pShuttle-YFV17D-RabG_cvsΔSP/2A по сравнению с pShuttle-YFV17D-RabG_CVSΔSP.

Однако мыши AG129 (n=9), вакцинированные с помощью YFV17D-RabG_ERAΔSP/2A (вирус), были сероконвертированы в отношении как вируса бешенства, так и вируса YF (7 из 9 мышей).

Пример 3. ChimeriVax-JE-RabG

На основании информации, полученной с помощью поколения PLLAV-YF17D-RabG_ERAΔSP (фигура 6), создавали оптимизированную вакцинную конструкцию на основе вируса бешенства/ChimeriVax-JE PLLAV, несущую оптимизированную последовательность белка G (RabG_ERAΔSP). Предполагается, что эта конструкция вызывает специфические иммунные ответы против RABV, JEV и YFV.

Последовательность RabG_ERAΔSP вводили в остов PLLAV ChimeriVax-JE остов для создания вакцинной конструкции PLLAV ChimeriVaxJE-RabG (фигура 12А). Эта PLLAV ChimeriVax-JE несет кодирующую область prME (поверхностный гликопротеин) вируса японского энцефалита LAV (JE SA14-14-2). Последовательность RabG_ERAΔSP вставляли между генами JE-E и YF17D-NS1.

PLLAV ChimeriVaxJE-RabG трансфицировали в клетки BHK21J и наблюдали типичный СРЕ, а также в собираемом из них супернатанте с вирусом образовывались бляшки заметно меньшего размера по сравнению с фенотипом бляшек YFV17D (фигура 12В). Следовательно, полученный химерный (JEV/YFV) трансгенный (RabG) вирус дополнительно аттенуирован, и выход вируса при применении конструкции на основе вируса бешенства/химерного вируса (JEV/YFV) PLLAV был по меньшей мере в 100 раз меньше, чем при гомологичной конструкции на основе вируса бешенства/YFV PLLAV.

Стабильность PLLAV ChimeriVaxJE-RabG определяли путем проведения RT-PCR для выявления вставки трансгена в вирусных образцах, которые были собраны во время серийного пассирования вируса ChimeriVaxJE-RabG (фиг. 12С). Секвенирование продуктов RT-PCR показало, что вставка RabG без мутаций может быть выявлена по меньшей мере до пассажа 4 (дальнейшие пассажи будут проанализированы).

Что касается иммуногенности PLLAV-ChimeriVaxJE-RabG, рекомбинантный вирус, полученный после трансфекции клеток этим PLLAV, оценивали in vivo на мышах AG129 (n=9) после IP инокуляции (фигура 13А). Ответы специфичных в отношении JEV, YFV и RABV антител количественно оценивали с помощью непрямого иммунофлуоресцентного анализа (UFA) (Euroimmune YFV и JEV) и/или анализа сывороточной нейтрализации (SNA) (JEV и RABV).

Вакцинированных мышей ежедневно наблюдали на предмет заболеваемости/смертности и забирали кровь для серологического анализа в начале и с двухнедельными интервалами. Некоторых животных (4 из 9 мышей) повторно иммунизировали через две недели после первой инокуляции с помощью ChimeriVaxJE-RabG (вируса) с использованием тех же дозы и пути, что и при первой вакцинации (фигура 13А).

Анализ иммуногенности ChimeriVaxJE-RabG показал, что восемь из девяти мышей, вакцинированных IP введением вируса, полученного из клеточной культуры, были сероконвертированы в отношении JEV, YFV и RABV через 14 дней после вакцинации (фигура 13 В). Более того, антитела к RABV выше 0,5 МЕ/мл могли быть выявлены у двух вакцинированных вирусом мышей в день 7 после вакцинации, а у 4 животных титр антител, составляющий 0,48 МЕ/мл, уже наблюдали в одно и то же время. Следует отметить, что в соответствии с рекомендациями ВОЗ минимальную концентрацию антител в сыворотке крови 0,5 МЕ/мл используют как меру адекватной сероконверсии после вакцинации. Кроме того, тест SNA JEV (образцы сыворотки крови, собранные в день 42 после вакцинации) подтвердил присутствие нейтрализующих антител к JEV у тех 8 мышей, у которых связывающие антитела выявляли с помощью UFA. Кроме того, что касается безопасности вакцины, отмечали отсутствие смертности после инокуляции мышей AG129 вакцинным вирусом.

Эти результаты показали, что даже доза, составляющая всего 1,2 БОЕ, вызывала сильный иммунный ответ против трех вирусов: JEV, RABV и YFV.

Пример 4. ChimeriVax-ZIK-RabG

Подобно описанному для PLLAV ChimeriVaxJE-RabG, создавали оптимизированную вакцинную конструкцию вирус бешенства/ChimeriVax-ZIKV PLLAV, несущую оптимизированную последовательность белка G (RabG_ERAΔSP). Предполагается, что эта конструкция вызывает специфические иммунные ответы против RABV, ZIKV и YFV.

Последовательность RabG_ERAΔSP вводили в остов PLLAV ChimeriVax-ZIKV для создания вакцинной конструкции на основе PLLAV ChimeriVaxZIKV-RabG (фигура 14А). Эта PLLAV ChimeriVax-ZIKV несет кодирующую область prME (поверхностный гликопротеин) вируса Зика (азиатская линия, остров Яп 2007, номер доступа в Genbank EU545988). Последовательность RabG_ERAΔSP вставляли между генами ZIKV-E и YF17D-NS1.

PLLAV ChimeriVaxZIKV-RabG трансфицировали в клетки BHK21J и наблюдали типичный СРЕ, а также в собираемом из них супернатанте с вирусом образовывались бляшки заметно меньшего размера по сравнению с фенотипом бляшек YFV17D (фигура 14В). Следовательно, полученный химерный (ZIKV/YFV) трансгенный (RabG) вирус дополнительно аттенуирован, и выход вируса при применении конструкции на основе вируса бешенства/ZIKV PLLAVs был по меньшей мере в 100 раз меньше, чем при применении гомологичной конструкции на основе вируса бешенства/YFV PLLAV.

Стабильность PLLAV ChimeriVaxZIKV-RabG определяли путем проведения RT-PCR для выявления вставки трансгена в образцах вируса, которые были собраны во время серийного пассирования вируса ChimeriVaxJE-RabG (фигура 14С). Секвенирование продуктов RT-PCR показало, что вставка RabG без мутаций может быть выявлена до пассажа 2.

Иммуногенность конструкции на основе PLLAV-ChimeriVaxZIKV-RabG и рекомбинантный вирус, полученный после трансфекции клеток этим PLLAV, оценивали in vivo на мышах AG129 (n=5) после IP инокуляции (фигура 15А). Ответы специфичных в отношении ZIKV, YFV и RABV антител количественно оценивали с помощью непрямых иммунофлуоресцентных анализов (UFA) (Euroimmune YFV и ZIKV) и/или анализов сывороточной нейтрализации (SNA) (JEV и RABV).

Вакцинированных мышей ежедневно наблюдали на предмет заболеваемости/смертности и забирали кровь для серологического анализа в начале и с двухнедельными интервалами.

Анализ иммуногенности ChimeriVaxZIKV-RabG показал, что все мыши, вакцинированные полученным из клеточной культуры вирусом (i.p.), были сероконвертированы в отношении ZIKV, YFV и RABV через 17 дней после вакцинации (фигура 15В). SNA для ZIKV, проводимый в день 28 после вакцинации (данные не показаны), подтвердил присутствие нейтрализующих антител против ZIKV у 4 из 5 мышей, вакцинированных вирусом, полученным из клеточных культур, которые были положительными по связывающим антителам (UFA).

Кроме того, что касается безопасности вакцины, отмечали отсутствие смертности после инокуляции мышей AG129 вакцинным вирусом.

В заключение, ChimeriVaxZIKV-RabG индуцировала сильный иммунный ответ против вирусов ZIKV, YFV и RABV, несмотря на то, что она был значительно ослаблена по сравнению с YF17D-RabG.

Пример 5. Конструкция с химерным остовом флавивируса

Получали различные конструкции, которые содержали белки G лиссавирус, и при этом остов флавивируса сам представлял собой химеру из двух разных флавивирусов. На фигуре 16 представлен обзор типичных конструкций, в которых остов может содержать части вируса желтой лихорадки, вируса Зика или вируса японского энцефалита.

Это позволяет получать вакцины, которые обеспечивают защиту от лиссавируса и более одного флавивируса. Это проиллюстрировано в таблице 2, где указано, какие части вакцины обеспечивают гуморальный иммунитет, клеточный иммунитет и нейтрализующие антитела.

[RabG - белок G вируса бешенства; CMI - клеточный иммунитет; nAb - нейтрализующее антитело; prME - поверхностные гликопротеины флавивируса; YFV - вирус желтой лихорадки]

ОБЗОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОКАЗАННЫХ В НАСТОЯЩЕЙ ЗАЯВКЕ

SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 3

С-концевая часть белка YF-E

SEQ ID NO: 4 YFE-TM1

SEQ ID N0:5 YFE-TM2

SEQ ID NO: 6

9 N-концевых аминокислот NS1

DQGCAINFG

SEQ ID NO: 7

N-концевая часть G Rab (без сигнального пептида)

SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 9

Трансмембранный домен G Rab

С-концевые цитоплазматические хвосты G Rab

TM2-домен вируса Западного Нила

Сигнальный пептид NS1

SEQ ID NO: 10

С-концевая часть гликопротеина G вируса бешенства

SEQ ID NO: 11

ТМ гликопротеина G вируса бешенства

SEQ ID NO: 12

Цитоплазматический С-конец Rab

SEQ ID NO: 13 WNV TM-2

SEQ ID NO: 14

N-концевая часть NS1 YF

SEQ ID NO: 15

Эпитоп IIb гликопротеина G вируса бешенства GCTNLSGFS

SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17

Гликопротеин G вируса бешенства (кодон-оптимизированный штамм ERA)

SEQ ID NO:17

Последовательность белка G Rab

SEQ ID NO: 18

AA 1-18 гликопротеина G вируса бешенства

SEQ ID NO: 19

ТМ домен гликопротеина G вируса бешенства

SEQ ID NO: 20

Цитоплазматический хвост RABG

SEQ ID NO: 21

Соединение сигнального пептида NS1 YFV - гликопротеин G вируса бешенства

SEQ ID NO: 22

Соединение TM2 WNV - сигнальная последовательность NS1 YFV

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Католике Университейт Лёвен

<120> Химерные вакцины на основе вирусов родов Flavivirus и Lyssavirus

<130> ZL917184GB

<150> GB1814563.1

<151> 2018-09-07

<160> 22

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 441

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент YFV - химерная конструкция Rab G

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(441)

<400> 1

gga aag ttg ttc act cag acc atg aaa ggc gtg gaa cgc ctg gcc gtc 48

Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val

1 5 10 15

atg gga gac acc gcc tgg gat ttc agc tcc gct gga ggg ttc ttc act 96

Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr

20 25 30

tcg gtt ggg aaa gga att cat acg gtg ttt ggc tct gcc ttt cag ggg 144

Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly

35 40 45

cta ttt ggc ggc ttg aac tgg ata aca aag gtc atc atg ggg gcg gta 192

Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val

50 55 60

ctt ata tgg gtt ggc atc aac aca aga aac atg aca atg tcc atg agc 240

Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser

65 70 75 80

atg atc ttg gta gga gtg atc atg atg ttt ttg tct cta gga gtt ggc 288

Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly

85 90 95

gcc gac cag ggc tgc gcg ata aat ttc ggt aaa ttt cca ata tac aca 336

Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr

100 105 110

att ccc gac aaa ctt gga ccc tgg agt ccg ata gac att cac cat ttg 384

Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu

115 120 125

tct tgc cct aat aac ctt gtg gtt gag gac gag ggg tgt act aac ttg 432

Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu

130 135 140

agt ggg ttc 441

Ser Gly Phe

145

<210> 2

<211> 147

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val

1 5 10 15

Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr

20 25 30

Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly

35 40 45

Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val

50 55 60

Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser

65 70 75 80

Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly

85 90 95

Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr

100 105 110

Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu

115 120 125

Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu

130 135 140

Ser Gly Phe

145

<210> 3

<211> 93

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-концевая часть белка YF-E

<400> 3

Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val

1 5 10 15

Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr

20 25 30

Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly

35 40 45

Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val

50 55 60

Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser

65 70 75 80

Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu

85 90

<210> 4

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> YFE-TM1

<400> 4

Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile

1 5 10 15

Trp Val Gly Ile Asn Thr

20

<210> 5

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> YFE-TM2

<400> 5

Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe

1 5 10 15

Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala

20

<210> 6

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 9 N-концевых аминокислот NS1

<400> 6

Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly

1 5

<210> 7

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 7

Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro

1 5 10 15

Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp

20 25 30

Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe

35 40

<210> 8

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент YFV - химерная конструкция Rab G

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(540)

<400> 8

aat caa gtt tct gga gtc gac ctc gga ttg cca aat tgg ggg aag tat 48

Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr

1 5 10 15

gtt ctt ctg tct gcg gga gcg ctc acc gcg ctg atg ttg atc att ttc 96

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

20 25 30

ctc atg act tgc tgt aga agg gtg aat aga tcc gaa cct act caa cac 144

Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His

35 40 45

aac ctt cga ggc aca ggt cga gaa gta tcc gtc aca cct caa tct ggc 192

Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly

50 55 60

aag att atc tca agt tgg gag tcc cat aag tca ggt ggt gag acc cgg 240

Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg

65 70 75 80

ctg agg tca att gct atg acg ttt ctt gcg gtt gga gga gtt ttg ctc 288

Leu Arg Ser Ile Ala Met Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu

85 90 95

ttc ctt tcg gtc aac gtc cat gct gat caa gga tgc gcc atc aac ttt 336

Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe

100 105 110

ggc aag aga gag ctc aag tgc gga gat ggt atc ttc ata ttt aga gac 384

Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp

115 120 125

tct gat gac tgg ctg aac aag tac tca tac tat cca gaa gat cct gtg 432

Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val

130 135 140

aag ctt gca tca ata gtg aaa gcc tct ttt gaa gaa ggg aag tgt ggc 480

Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly

145 150 155 160

cta aat tca gtt gac tcc ctt gag cat gag atg tgg aga agc agg gca 528

Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala

165 170 175

gat gag atc aat 540

Asp Glu Ile Asn

180

<210> 9

<211> 180

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr

1 5 10 15

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

20 25 30

Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His

35 40 45

Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly

50 55 60

Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg

65 70 75 80

Leu Arg Ser Ile Ala Met Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu

85 90 95

Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe

100 105 110

Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp

115 120 125

Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val

130 135 140

Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly

145 150 155 160

Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala

165 170 175

Asp Glu Ile Asn

180

<210> 10

<211> 81

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 10

Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr

1 5 10 15

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

20 25 30

Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His

35 40 45

Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly

50 55 60

Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg

65 70 75 80

Leu

<210> 11

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 11

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

1 5 10 15

Leu Met Thr Cys Cys

20

<210> 12

<211> 44

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 12

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

1 5 10 15

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

20 25 30

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

35 40

<210> 13

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Вирус Западного Нила

<400> 13

Arg Ser Ile Ala Met Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Ser Val Asn Val His Ala

20

<210> 14

<211> 76

<212> БЕЛОК

<213> Вирус желтой лихорадки

<400> 14

Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr

20 25 30

Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala

35 40 45

Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu

50 55 60

His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala Asp Glu Ile Asn

65 70 75

<210> 15

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 15

Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser

1 5

<210> 16

<211> 1572

<212> ДНК

<213> Вирус бешенства

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1572)

<400> 16

atg gtc cct caa gcg ctg ctt ttc gtt ccc ctc ctt gtc ttt cca ctt 48

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu

1 5 10 15

tgt ttt gga aaa ttt cca ata tac aca att ccc gac aaa ctt gga ccc 96

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro

20 25 30

tgg agt ccg ata gac att cac cat ttg tct tgc cct aat aac ctt gtg 144

Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val

35 40 45

gtt gag gac gag ggg tgt act aac ttg agt ggg ttc agt tat atg gaa 192

Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu

50 55 60

ctt aag gtg ggg tat ata ttg gct att aaa atg aac ggg ttc aca tgc 240

Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys

65 70 75 80

aca ggt gtt gtc acg gag gca gag acc tat aca aac ttt gtt ggg tac 288

Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr

85 90 95

gta act act acg ttc aag agg aaa cat ttt cgc ccg act cct gat gct 336

Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala

100 105 110

tgt cgc gcg gcc tat aac tgg aaa atg gcc ggg gac cca cgg tac gag 384

Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu

115 120 125

gag agc ctc cac aat cca tat ccc gac tac cgg tgg ctc cgc aca gta 432

Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val

130 135 140

aag acg act aag gaa tct ctg gtt ata ata tcc ccc tca gtc gcc gac 480

Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp

145 150 155 160

ctc gat cca tat gat cgg tca ctt cat agt cgc gta ttt cca tcc ggt 528

Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly

165 170 175

aaa tgt agt ggg gta gcc gtc agt agc acg tac tgt tcc act aat cac 576

Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His

180 185 190

gat tac act att tgg atg ccg gaa aac ccg cgg ctt ggg atg agt tgc 624

Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys

195 200 205

gat att ttc acg aac tct cgg gga aag cgc gca agt aag ggt tct gag 672

Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu

210 215 220

acc tgt ggt ttc gtg gat gaa cga ggt ctc tac aag tca ctc aag ggt 720

Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly

225 230 235 240

gcc tgc aag ctt aag ctt tgt gga gta ctg gga ctc agg ctg atg gac 768

Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp

245 250 255

ggc aca tgg gtg gct atg caa acg tca aat gaa acc aag tgg tgt ccg 816

Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro

260 265 270

cca gat caa ctc gta aat ctt cac gat ttt cgc agt gac gag att gaa 864

Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu

275 280 285

cat ctt gta gtc gaa gaa ctc gtt aga aag agg gaa gaa tgt ctc gac 912

His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp

290 295 300

gca ctc gaa tct atc atg act act aaa tct gtc tca ttt cga cgc ctc 960

Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu

305 310 315 320

agt cac ctg aga aaa ctc gtg cca gga ttc ggc aaa gct tat act atc 1008

Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile

325 330 335

ttc aac aag acg ttg atg gaa gcg gac gct cat tac aaa tca gta aga 1056

Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg

340 345 350

act tgg aat gaa att ctg cca tcc aag ggc tgc ctt cgc gta gga ggg 1104

Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly

355 360 365

cga tgc cat cct cat gta aat ggg gtc ttc ttt aac ggg ata atc ttg 1152

Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu

370 375 380

gga ccc gac ggc aac gta ctt ata cca gag atg cag agt agt ctc ctc 1200

Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu

385 390 395 400

caa cag cac atg gag ttg ttg gaa tcc agc gtg atc cct ctc gtt cac 1248

Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His

405 410 415

ccc ttg gct gat ccg agc act gtg ttc aaa gat gga gac gag gcg gag 1296

Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu

420 425 430

gat ttc gtc gaa gtt cac ctc ccg gat gtc cat aat caa gtt tct gga 1344

Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly

435 440 445

gtc gac ctc gga ttg cca aat tgg ggg aag tat gtt ctt ctg tct gcg 1392

Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala

450 455 460

gga gcg ctc acc gcg ctg atg ttg atc att ttc ctc atg act tgc tgt 1440

Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys

465 470 475 480

aga agg gtg aat aga tcc gaa cct act caa cac aac ctt cga ggc aca 1488

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

485 490 495

ggt cga gaa gta tcc gtc aca cct caa tct ggc aag att atc tca agt 1536

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

500 505 510

tgg gag tcc cat aag tca ggt ggt gag acc cgg ctg 1572

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

515 520

<210> 17

<211> 524

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 17

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu

1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro

20 25 30

Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val

35 40 45

Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu

50 55 60

Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys

65 70 75 80

Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr

85 90 95

Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala

100 105 110

Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu

115 120 125

Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val

130 135 140

Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp

145 150 155 160

Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly

165 170 175

Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His

180 185 190

Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys

195 200 205

Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu

210 215 220

Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly

225 230 235 240

Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp

245 250 255

Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro

260 265 270

Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu

275 280 285

His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp

290 295 300

Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu

305 310 315 320

Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile

325 330 335

Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg

340 345 350

Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly

355 360 365

Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu

370 375 380

Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His

405 410 415

Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu

420 425 430

Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly

435 440 445

Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala

450 455 460

Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys

465 470 475 480

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

485 490 495

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

500 505 510

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

515 520

<210> 18

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 18

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu

1 5 10 15

Cys Phe Gly

<210> 19

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 19

Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe

1 5 10 15

Leu Met Thr Cys Cys

20

<210> 20

<211> 44

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 20

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

1 5 10 15

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

20 25 30

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu

35 40

<210> 21

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Соединение сигнальный пептид NS1 YFV – гликопротеин G вируса бешенства

<400> 21

Leu Gly Val Gly Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Phe

1 5 10 15

Pro Ile Tyr

<210> 22

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Соединение TM2 WNV - сигнальная последовательность NS1 - YFV

<400> 22

Val Asn Val His Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg

1 5 10 15

Glu Leu Lys

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан полинуклеотид для вакцинации против лиссавируса, содержащий последовательность живого инфекционного аттенуированного флавивируса, где нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере часть белка G лиссавируса, размещена в межгенной области между генами E и NS1 указанного флавивируса, так что экспрессируется химерный вирус. Притом кодируемая последовательность от С-конца белка Е указанного флавивируса до N-конца сигнального пептида белка NS1 указанного флавивируса содержит в следующем порядке: дополнительный сигнальный пептид белка NS1 флавивируса, белок G лиссавируса, содержащий дефектный функциональный сигнальный пептид или не содержащий функциональный сигнальный пептид, содержащий эпитоп IIb, содержащий С-концевой ТМ-домен и содержащий С-концевую цитоплазматическую последовательность, и TM2-домен флавивирусного белка Е. Также описан химерный живой инфекционный аттенуированный флавивирус для вакцинации против лиссавируса, где по меньшей мере часть белка G лиссавируса размещена между белками E и NS1 указанного флавивируса, так что от С-конца белка Е до N-конца сигнального пептида белка NS1 вирус содержит в следующем порядке: дополнительный сигнальный пептид белка NS1 флавивируса, белок G лиссавируса, содержащий дефектный функциональный сигнальный пептид или не содержащий функциональный сигнальный пептид и содержащий эпитоп IIb, содержащий С-концевой ТМ-домен и С-концевую цитоплазматическую последовательность, и TM2-домен флавивирусного белка Е. Также раскрыт способ получения вакцинного состава против инфекции, вызванной лиссавирусом. Изобретение расширяет арсенал средств для предупреждения лиссавируса. 4 н. и 21 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

1. Полинуклеотид для вакцинации против лиссавируса, содержащий последовательность живого инфекционного аттенуированного флавивируса, где нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере часть белка G лиссавируса, размещена в межгенной области между генами E и NS1 указанного флавивируса, так что экспрессируется химерный вирус, характеризующийся тем, что кодируемая последовательность от С-конца белка Е указанного флавивируса до N-конца сигнального пептида белка NS1 указанного флавивируса содержит в следующем порядке:

- дополнительный сигнальный пептид белка NS1 флавивируса,

- белок G лиссавируса, содержащий дефектный функциональный сигнальный пептид или не содержащий функциональный сигнальный пептид, содержащий эпитоп IIb, содержащий С-концевой ТМ-домен и содержащий С-концевую цитоплазматическую последовательность, и

- TM2-домен флавивирусного белка Е.

2. Полинуклеотид по п. 1, где последовательность живого инфекционного аттенуированного флавивируса представляет собой вирус желтой лихорадки, как правило, штамм YF17D.

3. Полинуклеотид по п. 1, где живой инфекционный аттенуированный флавивирус представляет собой химерный вирус.

4. Полинуклеотид по любому из пп. 1-3, где лиссавирус представляет собой вирус бешенства.

5. Полинуклеотид по п. 4, где белок G вируса бешенства получен из штамма ERA. 6. Полинуклеотид по любому из пп. 1-5, где нуклеотидная последовательность белка G является кодон-оптимизированной для улучшения экспрессии в клетках млекопитающих.

7. Полинуклеотид по любому из пп. 1-6, где сигнальный пептид белка NS1 содержит последовательность DQGCAINFG [SEQ ID NO:6] или состоит из нее.

8. Полинуклеотид по любому из пп. 1-7, где эпитоп IIb имеет последовательность GCTNLSGFS [SEQ ID NO:15].

9. Полинуклеотид по любому из пп. 1-8, где TM2-домен флавивирусного белка Е получен из вируса Западного Нила.

10. Полинуклеотид по любому из пп. 1-9, где TM2-домен флавивирусного белка Е имеет последовательность RSIAMTFLAVGGVLLFLSVNVHA [SEQ ID NO:13].

11. Полинуклеотид по любому из пп. 1-10, где дефектный функциональный сигнальный пептид G Rab содержит мутацию F14S.

12. Полинуклеотид по любому из пп. 1-10, где G Rab не имеет N-концевой сигнальной последовательности из аминокислот 1-19 MVPQALLFVPLLVFPLCFG [SEQ ID NO:18].

13. Полинуклеотид по любому из пп. 1-12, где последовательность химерного вируса содержит в области соединения последовательности гена Е флавивируса, сигнального пептида NS1 и белка G Rab последовательность LGVGA DQGCAINFG KFPIY [SEQ ID NO:21].

14. Полинуклеотид по любому из пп. 1-13, где последовательность химерного вируса содержит в области соединения TM2-домена WNV, сигнальной последовательности NS1 и последовательности YFV последовательность VNVHA DQGCAINFG KRELK [SEQ ID NO:22].

15. Полинуклеотид по любому из пп. 1-14, где кодируемая последовательность химерного вируса включает в себя последовательность под SEQ ID NO:2 или

последовательность, характеризующуюся 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

16. Полинуклеотид по любому из пп. 1-15, где полинуклеотид включает в себя последовательность под SEQ ID NO:1 или последовательность, характеризующуюся 95% или 99% идентичностью последовательностей с ней.

17. Полинуклеотид по любому из пп. 1-16, который представляет собой искусственную бактериальную хромосому.

18. Химерный живой инфекционный аттенуированный флавивирус для вакцинации против лиссавируса, где по меньшей мере часть белка G лиссавируса размещена между белками E и NS1 указанного флавивируса, так что от С-конца белка Е до N-конца сигнального пептида белка NS1 вирус содержит в следующем порядке:

- дополнительный сигнальный пептид белка NS1 флавивируса,

- белок G лиссавируса, содержащий дефектный функциональный сигнальный пептид или не содержащий функциональный сигнальный пептид и содержащий эпитоп IIb, содержащий С-концевой ТМ-домен и С-концевую цитоплазматическую последовательность, и

- TM2-домен флавивирусного белка Е.

19. Химерный флавивирус по п. 18, где флавивирус представляет собой YFV.

20. Химерный флавивирус по п. 18 или 19, где лиссавирус представляет собой вирус бешенства.

21. Применение химерного вируса по любому из пп. 18-20 для предотвращения инфекции, вызванной лиссавирусом и флавивирусом.

22. Способ получения вакцинного состава против инфекции, вызванной лиссавирусом, предусматривающий стадии:

a) получения BAC, которая содержит:

последовательность индуцируемой бактериальной точки начала репликации для амплификации указанной BAC до более чем 10 копий на бактериальную клетку, и

вирусную кассету экспрессии, содержащую cDNA химерного вируса на основе флавивируса и лиссавируса по любому из пп. 1-15, и содержащую цис-регуляторные элементы для транскрипции указанной вирусной cDNA в клетках млекопитающих и для процессирования транскрибированной РНК с образованием инфекционного РНК-вируса;

b) трансфекции клеток млекопитающих с помощью ВАС из стадии a) и пассирования инфицированных клеток;

c) проверки вируса, реплицированного в трансфицированных клетках стадии b), в отношении вирулентности и способности обеспечивать выработку антител и индуцировать защиту против инфекции, вызванной лиссавирусом;

d) клонирования вируса, проверенного на стадии с), в вектор, и

e) введения вектора в вакцинный состав.

23. Способ по п. 22, где флавивирус представляет собой вирус желтой лихорадки.

24. Способ по п. 22 или 23, где лиссавирус представляет собой вирус бешенства.

25. Способ по любому из пп. 22-24, где вектор представляет собой BAC, которая содержит последовательность индуцируемой бактериальной точки начала репликации для амплификации указанной BAC до более чем 10 копий на бактериальную клетку.