СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА К АНТИГЕНАМ ВИРУСА КОРИ И КРАСНУХИ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/533 G01N33/62 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения специфического клеточного иммунного ответа.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения специфического клеточного иммунного ответа к вирусам кори и краснухи у переболевших и привитых людей. Известно, что после вакцинации 5-10% привитых остаются серонегативными, в то же время, при контакте с инфекционными больными, такие люди могут не заболеть, так как имеют сформированный специфический клеточный иммунитет, тогда как другие, также серонегативные привитые лица заболевают, так как не имеют специфической клеточной защиты. В рамках программы ВОЗ по глобальной эрадикации кори и краснухи важное значение имеет мониторинг привитых лиц. Особое значение оценка специфического клеточного иммунитета приобретает у больных первичными иммунодефицитами, например агаммаглобулинемией, при которой отсутствует способность синтезировать антитела, а также у пациентов, получающих курс цитостатической и иммуносупрессивной терапии. На сегодняшний момент нет стандартного, удобного в исполнении метода оценки специфического клеточного иммунного ответа.

Для определения специфического клеточного иммунного ответа применяют реакцию торможения миграции лейкоцитов [1]. Недостатком метода является сложность стандартизации и некоторая субъективность в оценке результатов, также существует довольно много дополнительных факторов, способных маскировать результаты. Известен метод оценки секреторной активности клеток путем определения иммуноферментных пятен - ELISPOT [2].Недостатком метода является большой объем крови для исследования (10-40 мл по разным авторам) и необходимость специального дорогостоящего импортного оборудования для учета реакции, что могут себе позволить только очень крупные лаборатории. Существует метод определения антиген-специфических Т-лимфоцитов с использовнаием МНС-пептидных тетрамеров [3]. Недостатком метода является HLA-рестрикция, то есть необходимость совпадения HLA тетрамера и пациента, ввиду высокой степени полиморфизма системы HLA это весьма затруднительно. Кроме того, создание тетрамеров дорого и требует очень высокой квалификации. Также используют для определения цитолитических CD8⁺ Т-клеток реакцию специфической дегрануляции [4], например для оценки эффективности лечения больных меланомой специфической вакциной [5],

Однако неизвестно, возможно ли применение этой реакции для оценки специфического клеточного иммунного ответа в отношении антигенов вирусов кори и краснухи.

Известно, что после перенесенной вирусной инфекции, равно как и после вакцинации в иммунной системе остается «след» в виде антиген специфических CD8⁺клеток памяти. Эти клетки вооружены лизосомальными гранулами, нагруженными цитолитическими белками. В составе мембран этих гранул присутствует антиген CD107a. При повторной встрече с «причинным» антигеном эти клетки выбрасывают содержимое и экспрессируют на поверхности CD107a, этот феномен может быть использован в качестве функционального маркера цитолитических CD8⁺ лимфоцитов.

Наиболее близкое техническое решение описано в статье М.В.Пащенкова и соавт.[6]. В этой работе определяли процент CD107a⁺ клеток от CD8^hiqh субпопуляции лимфоцитов. Отличие состоит в том, что индукторами дегрануляции CD8⁺ цитотоксических лимфоцитов в указанной работе были неспецифическими: анти-CD3-антитела, форбол-12-миристат-13 ацетат, иономицин, цитохолазин, что позволяет определять тотальную, максимально возможную дегрануляцию CD8⁺ лимфоцитов. В предложенном нами методе индукторами дегрануляции являются антигены вирусов кори и краснухи, что приводит к дегрануляции только тех цитотоксических лимфоцитов, которые распознали «свой» антиген, а это, в свою очередь, позволяет оценить именно специфический к данным вирусам клеточный иммунитет. Также различным было время инкубации клеток с индукторами дегрануляции. В работе М.В.Пащенкова инкубация длилась 5 часов, так как используемые индукторы действуют на клетки практически сразу. В предложенном нами методе инкубация длится 15 часов, так как вносимые вирусные антигены должны быть сначала поглощены моноцитами, которые процессируют антигены и, затем презентируют антигенные пептиды в комплексе с собственными молекулами HLA-I цитотоксическим CD8⁺ лимфоцитам, а на это требуется дополнительное время. Также в нашем методе используется существенно меньшее количество оборудования и расходных материалов (не нужны 96-луночные планшеты, не нужно лишний раз переносить клетки в центрифужные пробирки для отмывки - отмывка проходит в тех же пробирках, в которых проходила реакция, а это существенно сокращает потери клеток в процессе постановки реакции, не нужна центрифуга для планшетов).

Задачей заявленного изобретения является разработка на основе реакции специфической дегрануляции CD8⁺ Т-клеток простого и удобного в использовании метода оценки специфического клеточного иммунного ответа на антигены вирусов кори и краснухи.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения специфического клеточного иммунного ответа к антигенам вирусов кори и краснухи. Способ предусматривает определение с помощью проточной цитометрии процента дегранулировавших CD8^hiqh в присутствии специфического антигена по экспрессии CD107a молекулы. CD107a входит в состав мембраны цитотоксических гранул и отсутствует на поверхности покоящихся CD8⁺ Т-клеток. При дегрануляции CD8⁺ Т-клеток происходит слияние мембраны гранул с цитоплазматической мембраной, в результате чего CD107a появляется на поверхности CD8⁺ Т-клеток.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа для определения специфического клеточного иммунного ответа на антигены вирусов кори и краснухи, который является удобным и простым методом оценки как инфекционного, так и вакцинного иммунитета против вирусов кори и краснухи.

Пример. Определение специфического клеточного иммунного ответа на антигены вирусов кори и краснухи в образцах крови доноров, не болевших и не прививавшихся от этих инфекций - группа 1, перенесших в анамнезе корь и краснуху - группа 2 и прививавшихся от этих инфекций - группа 3.

Из 3 мл гепаринизированной венозной крови центрифугированием на слое фиколла-верографина выделяют мононуклеарную фракцию в стерильных условиях. Для обязательного освобождения от тромбоцитов мононуклеары 3-кратно отмывают в 5 мл среды центрифугированием при 600 g в течение 10 мин. Отмытые мононуклеары ресуспензируют в 1 мл полной питательной среды (среды RPMI с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина и гентамицина).

Жизнеспособность клеток (по данным окрашивания трипановым синим) не должна быть ниже 95%. В 3 стерильные пробирки типа эппендорф (объем 1,5 мл) вносят: по 50 мкл раствора моненсина (до конечной концентрации 10 мкМ - для предотвращения закисления лизосом), суспензии мононуклеаров (10⁶ клеток на пробирку), моноклональных антител к CD107a-PE-Су5 (конечное разведение 1:100) и 10 мкл антигенов вирусов кори (пробирка 2) или краснухи (пробирка 3), в контрольную пробирку вместо антигенов вносят 10 мкл среды (пробирка 1). Содержимое каждой пробирки однократно перемешивают пипеткой, после чего эппендорфы центрифугируют для осаждения клеток (200g, 1 мин) и инкубируют 15 ч при 37°С в атмосфере 5% СO₂ и 100% влажности. После окончания инкубации пробирки еще раз центрифугируют (500g, 1 мин), аккуратно отбирают супернатант и ресуспендируют клетки в забуференном фосфатами физиологическом растворе с добавлением 0,02% азида натрия и 0,02% Nа₂-ЭДТА для разрушения клеточных агрегатов, после этого клетки отмывают и окрашивают FITC-меченными антителами к CD8. Лимфоциты анализируют на проточном цитометре (например FACSCa- libur, Becton Dickinson, США) с помощью программы CellQuest: в координатах дот-плот отбирают гейт мононуклеаров (R1). В нем в режиме FL-1 выделяют клетки с высокой экспрессией CD8 (R2). Создают график дот-плот CD107a-PE-Cy5 (FL-3) против CD8-FITC (FL-1). При этом регистрируется облако CD107a⁺ CD8^hiqh клеток, которые соответствуют дегранулированным цитотоксическим Т-лимфоцитам. Поскольку количество специфических цитотоксических лимфоцитов к каждой из инфекций не может быть большим в принципе, необходимо подсчитывать 50-100 тысяч клеток для получения репрезентативных результатов.

Схема анализа результатов представлена на рисунке. В качестве положительного контроля на схеме представлена дегрануляция цитотоксических CD8^hiqh лимфоцитов, вызванная добавлением 5 мкл антиCD3 антител (поликлональный индуктор дегрануляции). Положительный контроль не обязателен для оценки специфического иммунного ответа и свидетельствует лишь о том, что тест-система работает. Результат выражается в виде процента СD107a⁺ клеток от CD8^hiqh субпопуляции лимфоцитов.

Результаты определений приведены в таблице 1.

Таблица 1 Определение дегрануляции цитотоксических Т-лмифоцитов (%) № пациента Спонтанная дегрануляция (№1) Дегрануляция, вызванная антигенами вируса кори (№2) Дегрануляция, вызванная антигенами вируса краснухи (№3) Группа 1 1 1,24 1,14 1,31 2 0,92 0,88 0,96 3 1,03 0,98 1,16 4 0,78 0,84 0,89 5 0,36 0,44 0,41 Группа 2 6 0,3 5,01 4,74 7 0,46 3,46 3,5 8 0,98 7,94 6,83 9 1,41 4,56 4,07 10 0,88 4,05 4,36 Группа 3 11 0,45 1,66 3,58 12 0,79 2,17 3,42 13 0,3 2,16 2,72 14 1,01 4,43 3,65 15 0,82 2,38 1,93

Результаты учитывали как разницу между антигениндуцированной и спонтанной дегрануляцией (см. таблицу 2). Из таблицы 2 хорошо видно, что у лиц, не болевших корью и краснухой и не прививавшихся от этих инфекций (группа 1) в ответ на антигены вирусов кори и краснухи не происходит дегрануляции цитотоксических Т-лимфоцитов, в то время как у иммунных доноров (группы 2 и 3) в ответ на указанные антигены происходит дегрануляция примерно 1-3% цитотоксических лимфоцитов. Таким образом, предложенный метод является: 1) функционально значимым, поскольку позволяет идентифицировать именно цитолитические АГ-специфичные CD8⁺ Т-клетки; 2) количественным, поскольку позволяет определять частоту таких клеток; 3) высокочувствительным, т.к. позволяет выявлять популяции CD107a⁺ клеток, имеющих частоту менее 1%. Он не требует специальной дорогостоящей аппаратуры, кроме проточного цитометра, однако этот прибор распространен довольно широко, так как необходим и для других иммунологических исследований.

Таблица 2 Определение специфической дегрануляции цитотоксических Т-лимфоцитов № пациента Дегрануляция, вызванная антигенами вируса кори (№2-№1) Дегрануляция, вызванная антигенами вируса краснухи (№3-№1) Группа 1 1 -0,1 0,07 2 -0,04 0,04 3 -0,05 0,13 4 0,06 0,11 5 0,08 0,05 средняя -0,01 0,08 Группа 2 6 4,71 4,44 7 3,00 3,04 8 6,96 5,85 9 3,15 2,66 10 3,17 3,48 средняя 4,2 3,89 Группа 3 11 1,21 3,13 12 1,38 2,63 13 1,86 2,42 14 3,42 2,64 15 1,56 1,11 средняя 1,89 2,39

ЛИТЕРАТУРА

1. Rodriguez-Sosa M., Rosas L.E., David J.R., Bojalil R., Satoskar A.R., Terrazas L.I.: Macrophage Migration Inhibitory Factor plays a critical role in mediating protection against the helminth parasite taenia crassiceps. Infection and Immunity. 2003; 71: 1247-1254.

2. Scheibenbogen С., Romero P., Rivoltini L., Herr W., Schmittel A., Cerottini J.C., Woelfel Т., Eggermont A.M., Keilholz U. Quantitation of antigen-reactive Т cells in peripheral blood by IFNgamma-ELISPOT assay and chromium-release assay: a four-centre comparative trial.

J. Immunol. Methods. 2000; 244:81-89.

3. Altman J.D., Moss P.A., Goulder P.J., Barouch D.H., McHeyzer-Williams M.G., Bell J.I., McMichael A.J., Davis M.M. Phenotypic analysis of antigen-specific Т lymphocytes. Science. 1996; 274:94-96.

4. Betts M.R., Brenchley J.M., Price D.A., De Rosa S.C., Douek D.C., Roederer M., Koup R.A. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8⁺ Т cells by a flow cytometric assay for degranulation. J. Immunol. Methods 2003; 281: 65-78.

5. Rubio V., Stuge T.B., Singh N.. Betts M.R., Weber J.S., Roederer M., Lee P.P. Ex vivo identification, isolation and analysis of tumor-cytolytic Т cells. Nat. Med. 2003; 9:1377-1382.

6. Пащенков М.В., Муругина Н.Е., Муругин Б.В., Пинегин Б.В. Выявление и характеризация цитолитических CD8⁺- и CD4⁺- Т-клеток. Иммунология 2010; 31:4-12.

Способ по изобретению предусматривает инкубацию суспензии выделенных из крови мононуклеаров, 10 мкМ моненсина, меченных флюорохромом моноклональных антител к CD107a и индукторов дегрануляции цитотоксических Т-лимфоцитов - вирусов кори или краснухи в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 15 часов при 37°С в атмосфере 5% СO₂ и 100% влажности. После инкубации осуществляют окрашивание Т-лимфоцитов меченными флюорохромом антителами к CD8 и регистрацию на проточном цитофлюорометре субпопуляции Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD8^hiqh и CD107a. Количественная оценка искомых Т-лимфоцитов выражается в процентах по сравнению с контролем (без индукторов дегрануляции). Способ по изобретению прост и удобен в осуществлении и позволяет оценивать как инфекционный, так и вакцинный иммунитет против вирусов кори и краснухи. 1 ил., 2 табл.

Способ определения специфического клеточного иммунного ответа к антигенам вирусов кори и краснухи, предусматривающий инкубацию при 37°С в атмосфере 5% СО₂ и 100% влажности суспензии выделенных из крови мононуклеаров с добавлением 10 мкМ моненсина, меченных флюорохромом моноклональных антител к CD107a и индукторов дегрануляции в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, последующее окрашивание меченными флюорохромом антителами к CD8 и регистрацию на проточном цитофлюориметре субпопуляции Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD8^high и CD107a, выраженную в процентах по сравнению с отрицательным контролем без индукторов дегрануляции, отличающийся тем, что индукторами дегрануляции цитотоксических Т-лимфоцитов являются антигены вирусов кори и краснухи, и процесс инкубации осуществляют в течение 15 ч.