Линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455,используемая для культивирования вирусов Советский патент 1983 года по МПК C12N5/00 

со

00

4;i

tNO Изобретение относится к области вирусологии и микробиологии. Известна линия перевиваемых клеток, полученная из почек зеленых мартышек, использу емая для культиви рования вирусов 1J . Однако известная линия перевивае мых клеток не обеспечивает растущих потребностей в .этих биологических . Моделях. Целью изобретения является расши рение области клеточных субстратов. Линия перевиваемых клеток селезе ки взрослой зеленой мартышки 455, и пользуемая для культивирования виру сов , хранится в коллекции шта:ммов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под № 45. Линию перевиваемых клеток получают следующим образом. Животных обескровливают путем перерезания яремных вен. Селезенки экстирпируют и помещают во флакон с питательной средой. В асептических условиях удаляют сосудистый пучок, селезенку переносят в чашку Петри и отмывают от крови 0,02%-ным раствором версена, затем обрабатывают 0,025%-ным раствором трипсина. Диспергенты нагнетают непосредственно в устья трабекулярных артерий с помощью аппарата Боброва (можно использовать перистальческий насос)По окончании перфузии орган помещаю в сосуд с питательной средой и размешивают на магнитной машалке. Полу ченную клеточную взвесь высевают в культуральные сосуды. В качестве ростовой среды для получения первич ной культуры используют О,5%-ный раствор гидролизата тактальбумина на растворе Хенкса со средой Игла в равных соотношениях с добавлением 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота. При субкультивировании можно использовать основную среду Игла,сред Игла MEM с добавлением 3-10%-ной сы воротки крупного рогатого скота. Полученная линия перевиваемых кл ток селезенки взрослой зеленой мартышки 455 имеет следующие.морфологи ческие и биологические свойства,Кул тура представлена полигональными эп телиоподобными клетками, цитоплазма не вакуолизирована, ядро содержит мелкозернистый гетерохроматин с 2-3 ядрышками. Клетки линии 455 -образую монослой через 24-48 ч после субкул тивирования, причем монослой удается получить даже при,внесении в 1,5 матрасную колбу 310 клеток. Количество клеток при образовании монослоя в 1,5 л матрасной колбе достигает 35-40 млн,клеток. Время удвоения поппуляции обычно составляет 18 ч. Коэффициент развивки достигает величг1Н 1:3, 1:4. Для пассирования клеток используют основную среду Игл среду Игла MEM, О,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса со средой Игла в равных соотношениях с добавлением 2-10%-ной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки линии 455 не контаминирова- ны бактериямиJ грибами, микоплазмами. Посторонние вирусы не выявлены ни в культуральной жидкости, ни в самих клет1сах. Тесты на онкогенность также были отрицательными. По мере размножения клетки замораживают на разных уровнях пассажей для хранения в жидком азоте, таким образом создан их запас (lO-lo клеток). Клетки линии 455 сохраняются в жидком азоте без снижения пролиферативной активности, при восстановлении сохраняют жизнеспособность на 85-90% в течение 3 лет (время наблюдения). Клетки линии 455 способны длительное время (20 дней) оставаться на стекле без субкультивирования и смены среды, а также выдерживать агаровое покрытие с аминопептидом и бикарбонатом натрия. Клетки линии 455 чувствительны к различным вирусам; вакцинным штаммам виру;са полиомиелита, рино- и эховирусам. При заражении вирусом среду из культуральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и вводят вирусосодержащую жидкость. Затем добавляют, поддерживающую среду , в качестве которой используют смесь 0.,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина на растворе Эрла со средой Игла в равных количествах. Инфицированные культуры инкубируют при оптимальных температурах затем проводят сбор .вируса и определяют его титр по методу образования бляшек или по цитопатогенному действию. Приводятся примеры культивирования вирусов на линии клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455, Пример, Культивирование вируса полиомиелита, штамм Сэбина 1 типа. Монослой линии перевиваемых клеток 455 на уровне 32 пассажа снимают с поверхности 1,5л матрасной колбы следующим образом; сливают культуральную жидкость, клеточный слой ополаскивают холодным () 0,02%-ным раствором версена, затем обрабатывают в течение 15-ЗОЪ холодным () 0,25%-ным раствором трипсина, фипин сливают и матрасную колбу с клетками оставляют при комнатной темпеатуре на 1-2 мин до начала отслоения клеток со стекла. Клетки ресусендируют в среде роста - Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота. звесь разливают на 3 матрасные колы. Эти культуры на уровне 33 пассаа инкубируют при в течение 2 суток до формирования сплошного плас та клеток. При заражении вирусом полиомиелита штамм Сэбина 1 типа среду из куль туральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и вводят вируссодёржащую жидкость из расчета 3БОЕ на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качестве которой используют смесь 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина на растворе Эрла со средой Игла в ран ных количествах. Инфицированные культуры инкубирую при 34 С. Сбор вируса проводят на 4день после заражения и определяют его титр по методу образования бляше Титр составляет 7,8 Ig БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян получают титр 7,5 Ig БОЕ/мл. Пример2. Культивирование ви руса полиомиелита, штамм Сэбина 2 типа. Клетки линии 455 на уровне 33 пас сажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1.Титр вируса составляет 7,7 Ig БОЕ/мл. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек -обезьян получают титр 7,5 Ig БОЕ/мл. Пример 3. Культивирование вируса полиомиелита, штамм Сэбина 3 типа. Клетки линии 455 на уровне 33 пассажа получают и заражают вирусом ПС способу, описанному в примере 1. Титр вируса составляет 7,7 Ig БОЕ/МЛ.. При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян получа1бт титр 7,6 Ig БОЕ/мл. П р и и е р 4. Культивирование вируса ЕСНО-11. Клетки линии 455 на уровне 32 пассажа получают по способу, описанному в примере 1, только клетки по 210 эксплантируют в пробирки. При заражении вирусом среду из пробирок сливают и вносят 1,8 мл сре ды Игла MEM без сыворотки, затем вводят 0,1 мл вируссодержащей суспензии в разведении Ю . Заражают по 4 пробирки на разведение.Кул туру инкубируют при 37С в течение 1 недели до развития четкого цитопатического эффекта. Параллельно аналогичным способом заражают первичную культуру клеток почек обезьен. Титр вируса в культуре 455 был равен ТЦД,/мл, в первичных . Пример 5. культивирование риновируса. Клетки линии 455 на уровне 32 пасЬажа получают по способу, описанному в примере 4. Титр вируса в культуре 455 был равен TlЩJj/мл. Аналогичные результаты были получены в первичной культуре клеток почек обезьян. Предлагаемое изобретение способствует расширению клеточных субстратов, используемых для культивирования вирусов. Применение линии клеток 455 приводит к уменьшению экономических затрат для культивирования вирусов. Применение линии клеток 455 приводит к уменьшению экономических затрат для культивирования вирусов в связи с тем, что, во-первых, она может заменить дЪрогостоящие первичные культуры клеток почек обезьян (40-10 клеток почек обезьян стоят 28 рублей, а линии 455 2 руб,) во-вторых, получение линии клеток из селезенок позволяет повысить степень утилизации органов дорогостоящих обезьян (стоимость одной обезьяны 150 руб.). Кроме того, клетки линии 455 обладают высокой пролиферативной активностью, легко культивируются на отечественных средах и сыворотках и могут быть использованы для оценки их качеств.. , Клетки линии 455 не теряют своих СВОЙСТВ при хранении в жидком азоте в течение 3 лет (время наблюдения) и создан значительный их запас на разных уровнях пассажей (10- 10 клеток). Вышеуказанные свойства клеток линии 455 позволяют значительно упростить и удетиевить способ культивирования вирус.ов, а также расширяют возможности успешиой диагностики вирусных инфекций.

Линия перевиваемых,клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455, 45 (Коллекция штаьимов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского), используемая для культивирования вирусов.