Штамм клеток почки крупного рогатого скота (Bos Taurus renibus) для репродукции вирусов Российский патент 2025 года по МПК C12N5/07 

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии, в частности получению нового штамма клеток почки крупного рогатого скота «ПБ-ВИЭВ», отвечающего требованиям биобезопасности и обеспечивающего репродукцию вирусов. Клеточный штамм ПБ-ВИЭВ предназначен для проведения вирусологических исследований, а также для изготовления биопрепаратов.

Изобретение может быть использовано специалистами научно-исследовательских учреждений, ветеринарных лабораторий, биофабрик, занимающихся изучением, диагностикой инфекционных болезней и их возбудителей, разработкой и изготовлением биопрепаратов.

Основной проблемой при использовании культивируемых in vitro клеток является их изменчивость при длительном культивировании вследствие накапливающихся наследственных изменений. Кроме того, возможна контаминация микоплазмами, вирусами, что создает угрозу получения ложных результатов исследований и изготовления неспецифических, непригодных к использованию биопрепаратов. Получение новых клеточных штаммов, свободных от контаминантов и чувствительных к возбудителям вирусных болезней является актуальным.

Уровень техники.

Известен штамм гетерологичных клеток почки эмбриона теленка ПТ-80 (1985), чувствительный к вирусам парагриппа 3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, парвовирусу крупного рогатого скота. В процессе длительного культивирования штамм клеток ПТ-80 контаминировался вирусом диареи-болезни слизистых оболочек и микоплазмой М. arginini. Штамм культивируется на среде ИГЛА MEM с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Кратность рассева- 1:2-1:3. [А.С. СССР №1212043 C12N 5/06 15.10.1985]

Известен также штамм культивируемых клеток почки двухмесячного теленка «RBT», который формирует монослой клетками эпителиоподобного типа на средах ИГЛА MEM или 0,25% гидролизате лактальбумина с 5% сыворотки крупного рогатого скота. Кратность рассева - 1:5-1:7. Клетки RBT чувствительны к альфагерпесвирусу, коронавирусу, пестивирусу, парамиксовирусу крупного рогатого скота [Патент Россия №2488631 C12N 5/07 27.07.2013]

Технической проблемой является необходимость создание штамма клеточной модели почки крупного рогатого скота, предназначенного для выделения вирусов и диагностики вирусных инфекций, репродукции вирусов, определения их инфекционной активности, изготовления вирусного сырья для производства диагностических и вакцинных препаратов.

Сущность изобретения.

Техническим результатом является создание штамма клеточной модели почки крупного рогатого скота, названного ПБ-ВИЭВ, для выделения вирусов и диагностики вирусных инфекций, репродукции вирусов, определения их инфекционной активности, изготовления вирусного сырья для производства диагностических и вакцинных препаратов.

Предложенный штамм клеток обладает следующими свойствами. Морфологические признаки. На 3-4 сутки культивирования монослой клеток ПБ-ВИЭВ состоит из плотно прилегающих друг к другу эпителиоподобных клеток полигональной формы с четко выраженными границами. Ядра клеток крупные округлой или овальной формы с 1-3 ядрышками. Цитоплазма гомогенная. Некоторые клетки содержат 2 ядра (1-2%). В отдельных клетках наблюдаются вакуоли, расположенные возле ядра.

Кариологическая характеристика. При кариологических исследованиях в популяции клеток ПБ-ВИЭВ модальный класс представлен 52 хромосомами, что составляет 35% от общего числа хромосом. Интервал изменчивости 46-56.

Культуральные свойства. Штамм ПБ-ВИЭВ выращивают на ростовой среде ГЛА и ИГЛА MEM (1:1) с 10% сыворотки крупного рогатого скота, при температуре 37-37,2°С. Клетки пересевают смесью 0,02% версена и 0,25% раствора трипсина (9:1). Кратность пересева - 1:3-1:4. Сроки формирования монослоя - 3-4 сутки. Посевная концентрация - 90-110 тыс. клеток /мл.

Молекулярно-генетические признаки. Исследования штамма ПБ-ВИЭВ с использованием 15 анализируемых STR-локусов подтвердили видовую принадлежность полученного штамма клеток к крупному рогатому скоту и отсутствие клеток другого происхождения.

Штамм является новым, свободным от контаминации Bovine alphaherpesvirus 1 (вирус ИРТ), Bovine viral diarrhea virus 1 (вирус диареи-болезни слизистых оболочек), Bovine-like parainfluenza virus 3, что подтверждалось ПЦР. Штамм свободен также от контаминации микоплазмами, бактериями, грибами. Он представляет собой биобезопасный субстрат для культивирования вирусов.

Культура клеток ПБ-ВИЭВ предназначена для выделения и накопления вирусов, индикации противовирусных антител в реакции нейтрализации, определения инфекционной активности.

Штамм ПБ-ВИЭВ апробирован с положительными результатами и отделе клеточной биотехнологии и лаборатории вирусологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН в 2023 г. и депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером 105.

Предложенный штамм клеток почки крупного рогатого скота найдет применение в научно-исследовательских учреждениях, диагностических лабораториях, биологической промышленности.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Характеристики штамма

Род Bos

Вид Bos Taurus

Видовое название штамма. Штамм перевиваемой линии клеток почки крупного рогатого скота (Bos Taurus renibus).

Родословная штамма. Получен от индивидуального организма. Бык. Возраст 1 год. Почка.

Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования. Штамм клеток на 70 пассаже.

Причины депонирования. Штамм клеток депонируется как перспективная модель для биотехнологии и лабораторных исследований.

Условия выращивания. Штамм клеток культивируют при температуре 37°С в стационарных условиях в сосудах различной емкости; ростовой средой является среда Игла MEM и ГЛА (1:1) с 10% сыворотки крупного рогатого скота.

Культуральные свойства. Клетки ПБ-ВИЭВ выращивают в условиях стационарного культивирования. Для снятия клеток с поверхности культурального флакона при пересевах используют смесь 0,02% версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 9:1. посевная концентрация 90-100 тыс.клеток/мл. Периодичность культивирования - не менее 3-5 суток. Монослой при температуре 37°С сохраняется не менее трех недель. Пассируется с коэффициентом пересева 1:3 -1:4.

Описание визуальных и цитологических наблюдений при стандартных условиях выращивания. При посеве клетки равномерно распределяются по поверхности. Клетки однородные, эпителиоподобного типа, полигональной формы. Ядра крупные, овальной или округлой формы.

Кариологическая характеристика. Модальный класс 52 хромосомы. Интервал изменчивости 46-56.

Данные о видовой идентичности. Видовая идентичность подтверждена молекулярно-генетическими методами.

Данные о контаминации. Контаминация грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами не выявлена.

Способ криоконсервирования. Среда для замораживания: 50% ростовой питательной среды, 40% сыворотки крупного рогатого скота, 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в пластиковых криопробирках 2-3 х 10⁶ клеток/мл. Жизнеспособность клеток после размораживания 80-85%. Чувствительность к вирусам. Чувствителен к Bovine alphaherpesvirus 1 -Orthoherpesviridae; Alphaherpesvirinae; Varicellovirus (вирус инфекционного ринотрахеита), Bovine viral diarrhea virus 1 - Amarillovirales; Flaviviridae: Pestivirus (вирус диареи-болезни слизистых оболочек), Bovine-like parainfluenza virus 3 - Paramyxoviridae; Orthoparamyxovirinae; Respirovirus (вирус парагриппа-3), Lumpy skin disease virus - Poxviridae; Chordopoxvirinac: Capripoxvirus (вирус нодулярного дерматита), Orf virus - Poxviridae; Chordopoxvirinae; Parapoxvirus (вирус контагиозного пустулезного стоматита коз и овец).

Штамм клеток почки крупного рогатого скота ПБ-ВИЭВ, представленный эпитеолиподобными клетками с модальным классом 52 (46-56), свободный от контаминации клетками другого видового происхождения, вирусами, микоплазмами, бактериями, грибами, способный к продолжительному культивированию, чувствительный к Bovine alphaherpesvirus 1, Bovine viral diarrhea virus 1, Bovine-like parainfluenza virus 3, Lumpy skin disease virus, Orf virus, предназначенный для вирусологических исследований и производства биологических препаратов.

Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером 105.

Пример 2. Предложенный штамм ПБ-ВИЭВ получали следующим образом. Почки быка в возрасте 1 года подвергали трипсинизации с использованием 0,25% раствора трипсина в пяти циклах. Диспергированные клетки объединяли, центрифугировали при 1000 об/мин. 10 мин., ресуспендировали в ростовой среде (ГЛА+ИГЛА MEM 1:1 с 10% сыворотки крупного рогатого скота), определяли жизнеспособность и засевали в культуральные флаконы. Смену среды проводили через 48 часов. Конфлюэнтный монослой формировался на 11-12 сутки культивирования. При последующих пересевах в 1-3 пассажах монослой формировался на 5-6 сутки. Субкультивирование до 15 пассажа проводили с кратностью рассева 1:1,5-1:2; монослой формировался на 6-7 сутки. Клетки более высокого пассажного уровня формировали конфлюэнтный монослой на 4-5 сутки при посевной концентрации 100-120 тыс.клеток /мл. До 20-го пассажа популяция клеток была смешанного типа - фибробласто- и эпителиоподобного. К 30-му пассажу культура была представлена эпителиоподобными клетками. Монослой формировался на 3-4 сутки при пересеве 1:3. В дальнейшем, до 70-го пассажа (период наблюдения) сроки образования монослоя стабилизировались и составляли 3-4 суток при коэффициенте пересева 1:3-1:4. Штамм ПБ-ВИЭВ был представлен клетками эпителиоподобного типа полигональной формы, плотно прилегающими друг к другу с четкими границами. Ядра клеток округлой или овальной формы, содержащие 1 -3 ядрышка. В отдельных клетках встречались вакуоли. Для культивирования клеток применяли смесь сред 0,5% гидролизата лактальбумина и ИГЛА MEM (1:1) с 10% сыворотки крупного рогатого скота в пластиковых или стеклянных флаконах емкостью 50-1500 мл. Пересевали с использованием 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 9:1.

Клетки ПБ-ВИЭВ оставались жизнеспособными при хранении в жидком азоте. Для замораживания использовали криозащитную среду, состоящую из 10% ДМСО, 40% сыворотки крупного рогатого скота, 50% питательной среды. Концентрация клеток для замораживания составляла 2-3 млн клеток / мл. Жизнеспособность после восстановления - 80-85%.

Высевы на бактериологические селективные среды, на этапах формирования клеточной культуры, показали отсутствие контаминации ее бактериями, дрожжами, грибами.

Пример 3. Чувствительность к Bovine alphaherpesvirus 1 (вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота). При заражении культуры клеток ПБ-ВИЭВ BoHV 1 в дозе 0.1 ТЦД₅₀/клетку ЦПД визуализировалось через сутки, полное поражение монослоя - через 48 часов после заражения. ЦПД характеризовалось округлением клеток и, в отличие от других чувствительных культур, без выраженного гроздеобразования. Урожай вируса составлял в среднем 10⁶ТЦД₅₀/мл. ПЦР была положительной и подтверждала репродукцию вируса. Указанные показатели не имели существенных отличий в 5-ти последовательных пассажах.

Пример 4. Чувствительность к Bovine-like parainfluenza virus 3 (вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота). Вирус ПГ-3 индуцировал появление ЦПД через сутки, полную деструкцию монослоя - через 72 часа после заражения. Округление одних и удлинение других клеток, образование пустот в монослое были доминирующими признаками, образование симпластов было менее выраженным. Урожай вируса, в среднем, составлял 10⁵ - 10^5.5 ТЦД₅₀/мл по ЦПД или 10⁶ по гемадсорбции. ПЦР была положительной и подтверждала репродукцию вируса. Указанные характеристики не имели существенных отличий в 5-ти последовательных пассажах.

Пример 5. Чувствительность к Lumpy skin disease virus (вирус нодулярного дерматита). Инфицирование вирусом нодулярного дерматита приводило к появлению ЦПД через 48 ч и характеризовалось гипертрофией, округлением или удлинением отдельных клеток. В цитоплазме появлялись вакуоли. По мере культивирования количество пораженных клеток увеличивалось, и через 72 ч имелись многочисленные очаги крупных округлых клеток, небольшое количество симпластов, двуядерных клеток и бесклеточных пространств. Деструкция монослоя наблюдалась через 96 ч после заражения. Средний титр вируса составлял 10⁵ТЦД₅₀/см³. ПЦР была положительной подтверждала репродукцию вируса. Указанные характеристики не имели существенных отличий в 5-ти последовательных пассажах.

Пример 6. Чувствительность к Orf virus (вирус контагиозного пустулезного стоматита овец и коз). Вирус контагиозного пустулезного стоматита овец и коз размножался с характерным ЦПД в виде гипертрофии и округления клеток по всему клеточному газону, появлявшимся через 2Л ч после заражения. В дальнейшем количество таких клеток нарастало, появлялись небольшие симпласты. В цитоплазме появлялись вакуоли. Нарушалась целостность монослоя. ЦПД прогрессировало до полной деструкции монослоя через 72 ч после заражения. Средний титр вируса составлял 10^5.5 ТЦД₅₀/см³. В процессе повышения пассажного уровня характер и динамика ЦПД, уровень репродукции вируса существенно не изменялись.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штамму клеток почки крупного рогатого скота Bos Taurus для репродукции вирусов. Указанный штам депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером 105. Настоящее изобретение обеспечивает штамм клеточной модели почки крупного рогатого скота для выделения вирусов и диагностики вирусных инфекций, репродукции вирусов, определения их инфекционной активности, изготовления вирусного сырья для производства диагностических и вакцинных препаратов. 6 пр.

Штамм клеток почки крупного рогатого скота Bos Taurus для репродукции вирусов, депонированный в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером 105.