Штамм культивируемых клеток почки мини-свиньи,используемый в качестве тест-системы для репродукции и изучения вируса гриппа Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 

00

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов. Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток лабораторной мини-свиньи, свободной от контаминантбв,обеспечивающей репродукцию вируса гриппа и служащей сингенной системой при экспериментальных исследованиях. Линия клеток ПСМ получена из почки двухнедельного мини-поросенка пассированием на среде Игла MEM, содержащей 10% сьшоротки крупного рогатого скота После 60-го пассажа карйотип стабилизируется, модельный класс составляют клетки с 60 хромосомами. Клетки линии ПСМ чувствительны к различным штаммам вируса гриппа. Штамм хранится в коллекции перевиваемых культур ВНИИ молекулярной экспериментальной ветеринарии под № 20. 1 табл. (О (Л

4

О СО

,-

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов.

Цель изобретения - получение оте чественной стабильной перевиваемой линии клеток лабораторной мини-свинь свободной от контаминантов, культивируемой на доступных питательных ере- дах, обеспечивакнцей репродукцию вируса гриппа и служащей сингенной системой при экспериментальных, исследованиях, проводимых с использованием мини-свиней.

Линия перевиваемых клеток почки мини-свиньи ПСМ депок.фована в Коллекции перевиваемых соматических клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Всесоюзь 1го НИИ экспериментальной ветеринарии ВАСХНИЛ, штамму присвоен коллекционный № 20.

Линию клеток ПСМ получают следующим образом.

.3 качестве исходной ткани используют почку двухнедельного мини-поросенка .Почку извлекают с соблюдением правил антисептики,помещают в стерилную чашку Петри с раствором Эрла, содержащим антибиотики - пенициллин (калиевая соль) и стрептомицин по 1000 мкг/мл, стараясь не повредить почечную артерию и вену. Изолированную почку переносят в чашку Петри, н повреждая капсулы отпрепарируют от жирового сальника. В артерш) через затупленную иглу нагнетают раствор Хенкса, содержащий 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина для промываний органа. Затем почку промьюают. 0,25%-ным раствором трипсина при 37 С в течение J30 мин до появления под капсулой сети трещин. Почк переносят в чистую чашку Петри, ос- вобождают от капсулы, отделяют корковый слой, механически измельчают и дезагрегируют в питательной среде на магнитной мешалке. Клеточную суспензию без предварительного центрифугирования фильтруют через 8-слойную марлевую салфетку, разбавляют до концентрации 400 тыс. кл. в 1,мл средой Игла MEM, содержащей 10% сьшоротки крупного рогатого скота предвари- тельно обработанной полиэтиленглико- лем (м.в. 6000) 0,6 г/л глютамина, 100 мкг/мл канамицина, высевают в чашки Карреля и помещают в термостат

5

|g15

20 25

30,, Q д, „,

50

при 32°С для предотвращения разрастания фибробластов. Каждые 3-4 сут. проводят частичное на 1/5-1/3 обновление среды. Первый пересев делают через 10, второй через 8, третий через 6 сут. Ввиду увеличения скорости роста к пятому пассажу клетки пересевают через 3-4 сут. Коэффициент рассева )/3. В дальнейшем клетки культивируют в монослое с применением среды Игла MEM, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота ,нативной или обработанной полиэтиленгликолем.Клетки снимают со стекла смесью 0,02%-но- го версена (1/2-2/3) и 0,25%-ного раствора трипсина (1/2-1/3) без центрифугирования, дважды обмыв моноО

слой прогретой до 36,5 С смесью и проинкубировав в течение 5-10 мин. Далее клетки ресуспендируют в свежей среде и рассевают в сосуды для культивирования с концентрацией 100 тыс. кл. в 1 мл. Пересевы осуществляют через 3-5 сут с кратностью рассева 1:4-1:5.

Полученная линия перевиваемых клеток ПСМ имеет следующие морфологические признаки.

Культура представлена эпителиопо- добными клетками с округлыми и овальными ядрами, имеющими от 1 до 4 ядрышек. Цитоплазма мелкозернистая, слабо вакуолизированная. Границы клеток в монослое четко различимы. По данным электронномикроскопическо- го анализа, изучение в люминесцентном микроскопе препаратов, окрашенных ДНК-флюорохромами, высева на селективных средах, гемадсорбцией с эритроцитами морской свинки, клетки свободны от вирусной, микоплазмен- ной, грибковой и бактериальной контаминации.

Модельный класс составляют клетки с 60 хромосомами. Анализ кариотипа с помощью G-метода дифференциального окрашивания показал, что кариотип клеток в линии является в основном три- сомным.. Произошло слияние 15 и 17 t (15 17) хромосом, 9 и 17 хромосом t (9:17), выявляется хромосома, являющаяся результатом слияния двух гомологов i 8 хромосомы 1(18),, Хромосома t (9j 17) может считаться маркерной для клеток линии ПСМ. При окрашивании азотнокислым серебром выявлено, что число хромосом, несущих ЯО районы, варьирует от 1 до 4.

Клетки линии ПСМ хранят в замороженном состоянии в жидком азоте при -19() с. Режим замораживания: снятые со стекла смесью версена и трип- сина и ресуспендированные в свежей среде клетки центрифугируют и ре- суспендируют в новой порции ростовой среды, содержащей 10% сьюоротки КРС до концентрации 3,3-6,5 млн.кл в 1 мл Затем медленно, при постоянном перемешивании добавляют глицерин до конечной концентрации 10% от общего объема. Суспензию клеток разливают по ампулам и замораживают в смеси спир- та и жидкого азота при понижении температуры на 1 С в I мин до -40 С с последующим погружением в хранилище биопродуктов.

Режим восстановления. Ампулы с клетками после извлечения из жидкого азота помещают в водяную баню с температурой 38 С. Суспензию размороженных клеток переносят в колбу и порциями, постоянно перемещивая, с ий- тервалом в 1-2 мин добавляют ростовую среду: 0,5; 0,5; 1; 2; 2 и 3 мл, затем суспензию центрифугируют и ре- суспендируют в свежей ростовой среде, подсчитьшают общее количество клеток и процент жизнеспособных и разводят ростовой средой до концентрации жизнеспособных клеток 100.тыс. кл/мл.

Клетки линии ПСМ чувствительны к различным штаммам вируса гриппа. Уровень накопления вирусов определяют на третьи сутки после заражения клеток линии ПСМ путем титрования на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) по ЭЙД50/мл.

В таблице даны результаты репродукции различных штаммов вируса гриппа на перевиваемых культурах клеток.

Из данных таблицы следует, что клетки линии ПСМ обладают примерно одинаковой чувствительностью к вирусу гриппа в сравнении с клетками линии СПЭВ и значительно превосходят линию кож- но-мьппечных клеток эмбриона человека

Линия перевиваемых клеток ПСМ может быть использована в вирусологических исследованиях для репродукции и изучения вируса гриппа, а также как сингенная система при экспе- рименталь ных исследованиях с лабораторными мини-свиньями.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток почки мини-свиньи ВСКК (СХЖ) № 20, используемый в качестве тест-системы для репродукции и изучения вируса гриппа