Способ определения генотоксичности химических веществ Российский патент 2017 года по МПК C12Q1/66 C12N1/21 C12N15/52 

Изобретение относится к определению генотоксичности химических веществ, то есть к определению повреждения генетической информации химическими веществами, в результате которого микрофлора в организме пациента может в результате действия подпороговых концентраций генотоксических препаратов приобрести ряд мутаций, повышающих ее патогенность либо увеличивающих резистентность. Изобретение может быть использовано для оценки побочных эффектов лекарственных препаратов и других химических веществ.

Известны способы определения генотоксичности химических веществ на основе биосенсоров (культур клеток бактерий, в которых присутствуют гены, обеспечивающие свечение бактериальной клетки), свечение которых усиливается или подавляется под действием определенных химических веществ (патент RU №2179581, МПК C12Q 1/02, C12Q 1/66, 2002 г.; патент RU №2297450, МПК C12N 1/21, 2007 г.; патент RU №2355760, МПК C12N 1/21, 2009 г.; патент RU №2179581, МПК C12Q 1/02, 2002 г.).

Наиболее близким по выполнению является способ определения генотоксичности химических веществ, включающий инкубацию тестируемого химического вещества с рекомбинантным штаммом Е. coli, несущим плазмиду, в которой lux оперон находится под контролем SOS-lux-промотора, измерение интенсивности биолюминесценции контрольных культур и содержащих тестируемое химическое вещество и определение генотоксичности по фактору индукции I=Lc/Lk, где I - фактор индукции; Lc - интенсивность свечения суспензии SOS-lux штамма, содержащего тестируемое химическое вещество; Lк - интенсивность свечения контрольной суспензии SOS-lux штамма (Анализ SOS-ответа клеток E. coli с помощью бактериальной люминесценции. Всесоюз. конф. "Генетические исследования действия биологических, химических и физических факторов окружающей среды", по проблеме "Человек и Биосфера ", Киев, 1988, с. 95).

Недостатком данного способа является недостаточно высокий фактор индукции (усиление биолюминесценции анализируемой пробы по сравнению с биолюминесценцией контрольной пробы).

Техническим результатом изобретения является увеличение фактора индукции.

Технический результат достигается тем, что способ определения генотоксичности химических веществ, характеризуется тем, что в культуру Escherichia coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi, Vibriofischeri или Photorabdusluminescens поставлен под контроль промотора pColD, добавляют рибофлавин до конечной концентрации 1⋅10^-7 мг/мл - 1⋅10^-5 мг/мл, добавляют тестируемое вещество в концентрации, не подавляющей жизнедеятельность Escherichia coli (определяемую экспериментально) и определяют интенсивность люминесценции полученной суспензии и контроля, а о повреждающем действии тестируемого вещества судят по отклонению интенсивности люминесценции суспензии от контроля (повреждающее действие отсутствует, если нет отклонения от контроля).

Культуру предварительно выращивают предпочтительно на жидкой питательной полноценной среде Луриа-Бертани.

Культуру после выращивания доводят предпочтительно до плотности 0,01-0,1 единица Мак-Фарланда и концентрации 3⋅10⁷-3⋅10⁶ клеток/мл.

Контроль содержит в качестве вещества сравнения (контрольного вещества) предпочтительно деионизированную воду в эквивалентном объеме.

Отличием предлагаемого способа является добавление в культуру клеток Е. coli, несущей плазмиду pColD-lux, в которой lux оперон поставлен под контроль промотора pColD, рибофлавина в концентрации 1⋅10^-7 мг/мл - 1⋅10^-5 мг/мл.

Рибофлавин известен в качестве кофактора фермента люциферазы, моноонсигеназы КФ 144413 (J.W. Hastings. 1983. "Biological diversity, chemical mechanisms, and the evolutionary origins of bioluminescent systems." Journal of Molecular Evolution, v. 19: p.309-321). Однако не известен характер влияния рибофлавина (усиление или ослабление люминесценции) и не известны пределы концентраций, способствующие увеличению фактора индукции в отношении бактерий Escherichia coli К12 MG1655, содержащей плазмиду pColD-lux, с опероном Photobacterium leiognathi, Vibriofischeri или Photorabdusluminescens.

Ниже приведены примеры осуществления способа.

Пример 1. Определение генотоксичности диоксидина по способу прототипа.

В качестве тестируемого вещества взято генотоксическое вещество диоксидин в концентрации 2,25⋅10^-5 М (Фонштейн Л.М., Ревазова Ю.А., Золотарева Г.Н. и др. Изучение мутагенной активности диоксидина // Генетика. 1985. Т. 21. №5. С. 11-19).

Культуру Е. coli выращивают на среде LBP (пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлористый натрий - 10 г на 1 л раствора; pH 7.0) в присутствии 50 мкг/мл ампициллина. В 50 мл среды вносят 0,1 мл ночной культуры Е. coli С 600 и инкубируют в термостате в течение одного часа при t=37°C. Затем добавляют среду LBP до достижения оптической плотности культуры 0,1 (550 нм). Аликвоты этой культуры по 1 мл переносят в стерильные пробирки и добавляют в них по 10 мкл тестируемого химического вещества. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Пробирки помещают на 1 час в термостат при t=37°C. В процессе инкубации пробирки несколько раз встряхивают.

По окончании инкубации культуры охлаждают до комнатной температуры. На люминометре LM-01T (Immunotech, Чехия) измеряют интенсивности биолюминесценции контрольных культур и содержащих анализируемое химическое вещество. Получают следующие данные. Интенсивность люминесценции для диоксидина составляет 118158,6 у.е., для контроля 311,6 у.е.. То есть, фактор индукции равен 379,2.

Пример 2.

В качестве тестируемого вещества взято генотоксическое вещество диоксидин (Фонштейн Л.М., Ревазова Ю.А., Золотарева Г.Н. и др. Изучение мутагенной активности диоксидина // Генетика. 1985. Т. 21. №5. С. 11-19).

Культуру клеток Е. coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон (оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi) поставлен под контроль промотора pColD, растят на жидкой питательной полноценной среде Луриа-Бертани (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. // М., Мир, 1984, 480 с.) при постоянной аэрации на круговой качалке при 37°C. В среду добавляют антибиотик ампициллин (100 мкг/мл). Ночную культуру разбавляют свежей средой до плотности 0,01 - единица Мак-Фарланда (концентрация 3⋅10⁷ клеток/мл), и добавляют рибофлавин до конечной концентрации 1⋅10^-6 мг/мл. Аликвоты этой культуры (по 90 мкл) переносят в ячейки (стрипы) планшета и добавляют в них по 10 мкл диоксидина концентрацией 2,25⋅10^-5 М (указанная концентрация меньше, чем терапевтическая [Приказ Минздрава СССР от 29.06.1976 № 647 О разрешении к медицинскому применению новых лекарственных средств]). В контрольные ячейки добавляют 10 мкл деионизированной воды.

После обработки планшет с пробами помещают в люминометр, инкубируют при 30°C и измеряют интенсивность биолюминесценции (Люминесценцию измеряли на люминометре LM-01T (Immunotech, Чехия). Интенсивность люминесценции для пробы с диоксидином составляет 191895,3 у.е., а для контроля 328,0 у.е.. То есть, фактор индукции как их соотношение равен 585,0. Интенсивность люминесценции пробы с диоксидином без добавления рибофлавина (положительный контроль) составляет 135284,1 у.е. То есть, фактор индукции равен 412,5.

Аналогично ночную культуру разбавляют свежей средой до плотности 0,1 единица Мак-Фарланда (концентрация 3⋅10⁶ клеток/мл).

Аналогично в качестве lux оперона используют оперон биолюминесценции морских фотобактерий Vibriofischeri и Photorabdusluminescens.

Результаты по показателям интенсивности свечения аналогичны. На рис. 1 приведены значения фактора индукции анализируемого вещества - диоксидина - в концентрации 2,25⋅10^-5 М при различных концентрациях рибофлавина и без добавления рибофлавина к культуре. Как видно из рис. 1, при заявляемых концентрациях (1⋅10^-7-1⋅10^-5 мг/мл) фактор индукции превышает таковой без добавления рибофлавина. То есть, добавление рибофлавина в концентрациях 1⋅10^-7-1⋅10^-5 мг/мл позволяет увеличить интенсивность свечения тестируемой пробы.

Таким образом, способ позволяет увеличить фактор индукции по сравнению со способом прототипа (для которого фактор индукции в соответствии с примером 1 составляет 379,2) и может быть использован для определения генотоксичности химических веществ (в частности, диоксидина).

Изобретение относится к способу определения генотоксичности химических веществ. Способ предусматривает добавление рибофлавина до конечной концентрации 1⋅10^-7 мг/мл - 1⋅10^-5 мг/мл в культуру Escherichia coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri или Photorabdus luminescens поставлен под контроль промотора pColD. Осуществляют добавление тестируемого вещества и определение интенсивности люминесценции полученной суспензии и контроля. О повреждающем действии тестируемого вещества судят по отклонению интенсивности люминесценции суспензии от контроля. Изобретение обеспечивает увеличение фактора индукции. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Способ определения генотоксичности химических веществ, характеризующийся тем, что в культуру Escherichia coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri или Photorabdus luminescens поставлен под контроль промотора pColD, добавляют рибофлавин до конечной концентрации 1⋅10^-7-1⋅10^-5 мг/мл, добавляют тестируемое вещество и определяют интенсивность люминесценции полученной суспензии и контроля, а о повреждающем действии тестируемого вещества судят по отклонению интенсивности люминесценции суспензии от контроля.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культуру предварительно выращивают на жидкой питательной полноценной среде Луриа-Бертани.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культуру после предварительного выращивания доводят до плотности 0,01-0,1 единица Мак-Фарланда и концентрации 3⋅10⁷-3⋅10⁶ клеток/мл.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что контроль в качестве вещества сравнения содержит деионизированную воду в эквивалентном объеме.