СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ (АНТИМИКРОБНОЙ) АКТИВНОСТИ ДЕФЕНСИНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/04 C12N1/13 C12R1/19 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается применения штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») в качестве тест-штамма для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов и их производных).

Известно использование различных штаммов микроорганизмов для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов) (Lehrer R.I., Rosenman M., Harwig S.S., Jackson R., Eisenhauer P. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides. J Immunol Methods. 1991 Mar 21; 137 (2): 167-173). Недостатком данного метода является длительность исследования.

Известно использование люминесцирующих бактерий Pseudomonas aeruginosa H1001 (fliC:luxCDABE) для тестирования активности антимикробных катионных пептидов (Hilpert К, Hancock RE. Use of luminescent bacteria for rapid screening and characterization of short cationic antimicrobial peptides synthesized on cellulose using peptide array technology. Nat Protoc. 2007; 2 (7): 1652-1660).

Известно использование штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») для определения биотоксичности питьевых минеральных вод (заявка на изобретение RU 2007129999, опубликовано 27.02.2009), бактерицидной активности сыворотки крови (RU 2247987, 10.03.2005), токсичности воды («Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста «Эколюм». Методические рекомендации. МР 11-1/133-09. Утверждены Минздравом РФ 08.06.2000).

Новым в заявляемом изобретении является применение штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») в качестве тест-штамма для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов и их производных).

Техническим результатом изобретения является расширение спектра люминесцирующих тест-штаммов бактерий для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов и их производных).

Пример осуществления изобретения.

Для проведения исследования использовали тромбодефенсины, полученные известным способом (Dankert, J. (1988). Role of platelets in early pathogenesis of viridans group streptococcal endocarditis: a study on thrombodefensins. PhD thesis, University of Groningen, Groningen, The Netherlands). Реакционную систему формировали путем внесения 0,1 мл суспензии люминесцирующих бактерий в 0,9 мл раствора тромбодефенсинов; в качестве контроля использовали те же количества бактерий, вносимые в аналогичный объем растворителя. Полученные опытную и контрольную смеси инкубировали в течение 10 минут при 30°С в термостатируемой измерительной ячейке двухканального биохемилюминометра 8802М2К (СКТБ «Наука», Красноярск). Регистрацию интенсивности свечения осуществляли в непрерывном режиме, осуществляя расчет эффектов тромбодефенсинов на интенсивность бактериальной биолюминесценции по формуле: , где - сумма импульсов, испускаемых в контроле на n-й секунде эксперимента, - сумма импульсов, испускаемых в опыте на n-й секунде эксперимента.

Для оценки бактерицидного эффекта тромбодефенсинов в отношении используемых клеток-мишеней из опытных и контрольных проб по истечении 10 минут контакта отбирали аликвоты по 10 мкл, которые высевали на чашки с ВСР-агаром (Bio-Merieux, Франция) с добавлением ампициллина в конечной концентрации 200 мкг/мл (селективный маркер для использованного штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9»)). Учет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) проводили после дополнительной 18-24 часовой инкубации при 37°С. Расчет величин IC50 и LD50 осуществлен с использованием специализированной программы «LD50 (ver. 0.2)» (НПП «Наука Плюс»). Установлен дозозависимый отклик биолюминесценции рекомбинантного штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») на воздействие тромбодефенсинов (фиг.1).

Расчет величин IC50, соответствующих пятидесятипроцентной ингибиции интенсивности биолюминесценции от исходного уровня (фиг.2) позволил констатировать высокую чувствительность рекомбинантного штамма Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9») к воздействию тромбодефенсинов.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет расширить спектр штаммов микроорганизмов для определения биологической активности катионных антимикробных пептидов (дефенсинов и их производных).

Настоящее изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен способ определения антимикробной активности дефенсинов и их производных. В качестве тест штамма в данном способе используется штамм Escherichia coli К12 TG 1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10 («Эколюм-9»). Изобретение позволяет расширить спектр штаммов микроорганизмов для определения биологической (антимикробной) активности дефенсинов и их производных. 2 ил.

Способ определения биологической (антимикробной) активности дефенсинов и их производных, включающий внесение в реакционную смесь суспензии люминесцирующих бактерий и раствора дефенсинов, инкубацию полученной смеси и регистрацию интенсивности свечения реакционной смеси по сравнению с контрольной смесью, не содержащей дефенсинов, отличающийся тем, что в качестве тест штамма используют штамм Escherichia coli К 12 TG1 (lux+) с клонированными генами luxCDABE Photobacterium leiognathi 54D10.