СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПАЦИЕНТА ex vivo Российский патент 2009 года по МПК C12N5/08 G01N33/48 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии, фармакологии и медицины и может быть использовано как в научных целях, так и для целей практической медицины - для лечения больных широкого круга заболеваний, таких как гематологические расстройства, иммунодефицита, аутоиммунные заболевания, в регенеративной медицине, например, при лечении сердечно-сосудистых заболеваний (инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца).

Более конкретно, изобретение относится к способам выделения и культивирования высокопотентных недифференцированных стволовых клеток (СК) с использованием специально подобранной смеси на основе цитокинов, способной индуцировать очень быструю пролиферацию этих клеток, в то же время не вызывая их дифференцировку.

В основном, это клетки, имеющие маркеры CD34⁺CD133⁺Lin^- из костного мозга, из мобилизованной крови пациента, или крови пупочной вены, которые после культивирования в условиях ех vivo при введении больному способны к восстановлению дефицита поврежденных тканей и оказанию терапевтического воздействия на больной орган или ткань.

Необходимо отметить, что задача культивирования стволовых клеток самого пациента, а не фетальных клеток или стволовых клеток из костного мозга, пупочной вены, или мобилизованной крови донора является сверхактуальной, так трансплантация донорских (чужих) клеток сопровождается их быстрым отторжением и требует применения иммуносупрессивной терапии. Кроме того, в настоящее время к донорским препаратам крови и других тканей установлены очень высокие требования по безопасности их использования.

Известно, что содержание СК в мобилизованной крови и костном мозге человека не превышает 0,15-0,5% (1,5-5·10⁶ клеток /10⁹). Что касается пуповинной крови, ее объем невелик и количество выделяемых СК не превышает 0,5·10⁶ клеток. Ввиду сказанного, возможность умножить количество СК, выделяемых из небольшого количества биологического материала самого пациента, культивированием их в условиях ex vivo имеет большую практическую значимость.

Уровень техники

Основной проблемой культивирования высокопластичных недифференцированных стволовых клеток с маркерами CD34⁺CD133⁺Lin^- является их быстрый выход в дифференцировку, так как для решения описанных выше задач необходимо накопление, увеличение количества этих клеток без развития колоний дифференцированных клеток. При этом способность к последующей дифференцировке у таких культивируемых клеток должна быть сохранена, по возможности, в первоначальном виде.

Имеется ряд публикаций и патентов, в которых решается задача накопления недифференцированных стволовых клеток (см. на пример №РСТ 20060173370, 0036090, США 20050054103, 20050276793, 2006205071, 20070082397, 20030082397, 20070041948 и др.). Все указанные выше патенты описывают способы культивирования стволовых клеток с использованием смесей цитокинов, которые ускоряют процесс пролиферации клеток, но содержат ингибиторы, подавляющие их дифференцировку.

Так, в способе заявке WO 0036090 предлагается усиливать экспансию гемопоэтических СК CD34⁺CD38^-, кокультивируя эти клетки с эндотелиальными клетками человеческого мозга в присутствии хотя бы одного из цитокинов: IL-3, IL-6, GM-CSF, SCF, или комбинации этих цитокинов. В заявках США №20050276793 гемопоэтические СК стимулировали комбинациями нижеперечисленных цитокинов: Интерлейкины 1-12 (IL-1-IL-12), SCF, ЕРО, ТРО, G-CSF, GM-CSF, Flt3-L, LIF, IGF-1; В заявке №20050054103 авторы стимулируют пролиферацию гемопоэтических СК, используя Flt3-L, ТРО, IL-3, SCF, IL-6. Необходимо особо отметить то, что перечисленные в технических решениях цитокины упомянуты как равноценные стимуляторы роста клеток. Во всех этих способах дополнительно к перечисленным возможным комбинациям цитокинов добавляют активные компоненты, которые препятствуют дифференцировке культивируемых клеток, подавляя пути распространения сигналов дифференцировки. В обоих технических решениях использование ингибиторов дифференцировки может влиять на последующую способность клеток к дифференцировке и их жизнеспособность в условиях in vivo.

Любое из указанных технических решений может быть принято за прототип, так как все они основываются на одинаковом принципе подавления дифференцировки при культивировании стволовых клеток и используют смеси цитокинов как равнозначные агенты стимуляции роста клеток.

Однако подавление дифференцировки может влиять на приживляемость получаемых стволовых клеток после их введения пациенту в очаг поражения. Кроме всего прочего в известных технических решениях, как правило, не удается достигнуть больших скоростей роста клеток. Длительное же культивирование, кроме того, что на него иногда просто нет времени, может приводить к загрязнению препаратов, к различным «заболеваниям» стволовых клеток, прежде всего их злокачественному перерождению, инфицированию и т.д.

Раскрытие изобретения

Изобретательской задачей является расширение арсенала технических средств данного назначения за счет поиска новых композиций на основе цитокинов и устранение отмеченных недостатков, присущих известным техническим решениям.

Изобретательская задача решается тем, что предлагается способ увеличения количества гемопоэтических недифференцированных стволовых клеток (СК) пациента ex vivo путем их выделения из крови или костного мозга пациента и культивирования в ростовой среде, содержащей смесь цитокинов, состоящей из фактора роста стволовых клеток (SCF), лиганда тирозин киназы 3 из фетальной печени (Flt3L) и тромбопоэтина (ТРО), отличием которой является то, что указанная выше смесь цитокинов дополнительно содержит иономицин при следующем соотношении компонентов:

SCF (50-150)·10³ нг ТРО (50-150)·10³ нг Flt3L (10-50)·10³ нг Иономицин (10-100)·10³ нг

на 1 мл ростовой среды.

Изобретательская задача решается также тем, что предлагается использовать иономицин в качестве стимулирующего агента роста недифференцированных стволовых клеток в условиях ех vivo

Фактор роста СК (SCF) стимулирует пролиферацию СК, взаимодействуя со специфическим рецептором (протоонкогенный c-kit), обладающим тирозин-киназной активностью (Witte ON 1990), индуцирует активацию киназы и трансфосфорилирование цепей рецептора. Фосфотирозиновые остатки рецептора функционируют как места стыковки протеинов, связывающих c-kit с сигнальными путями, что индуцирует активацию пролиферации (Aronica SM еа, 1996).

Flt3-лиганд (Flt3L) стимулирует пролиферацию гемопоэтических СК в неменьшей степени, чем SCF. Flt3 представляет собой III класс рецептора тирозин киназы, экспрессированного на ранних предшественниках гемопоэтических СК. Взаимодействие Flt3 с лигандом (Flt3L) активирует сигнальные пути и последующую пролиферацию СК (Matthews Wea, 1991).

Тромбопоэтин (ТРО) - это гликопротеиновый гормон, который регулирует продукцию тромбоцитов стволовыми клетками костного мозга. ТРО был сначала охарактеризован как лиганд, который связывается с поверхностным рецептором с-Мр1. ТРО относится к классу I гемопоэтических цитокинов. В суспензионной культуре ТРО в комбинации с SCF стимулирует пролиферацию мультипотентных СК и повышает их количество (Ku et al., 1996).

Иономицин повышает концентрацию внутриклеточного Са²⁺, начиная с мобилизации внутриклеточных запасов, которые затем поддерживаются притоком экстраклеточного Са²⁺, индуцирует гидролиз фосфоинозитидов и стимулирует активацию протеинкиназы С (A J Morgan and R Jacob 1994). Иономицин повышает концентрацию внутриклеточного Са²⁺, начиная с мобилизации внутриклеточных запасов, которые затем поддерживаются притоком внеклеточного Са²⁴, индуцирует гидролиз фосфоинозитидов и стимулирует активацию протеинкиназы С, стимулируя вход катиона регулируемыми запасами кальция, но не прямым действием на плазматическую мембрану. (А J Morgan and R Jacob 1994, Biochem. J. 1994, 300 (665-672). Таким образом, иономицин является агентом первичной активации клеток (сферилизация клеток) (см., например, Пат РФ №2108579). Иономицин использовался как агент роста дифференцированных клеток, таких как гибридом и дендридных клеток (см., например, № патенты 20030213008; 20020194637; 9821313; 6458585)

Изобретательский уровень изобретения обеспечивается тем, что из равноценного перечня известных цитокинов была выявлена такая их смесь, которая в определенных подобранных концентрациях оказалась способной вместе с новым фактором стимуляции пролиферации для стволовых клеток - иономицином, индуцировать только клеточную пролиферацию и таким образом не потребовалось использовать дополнительные агенты для подавления дифференцировки клеток. Кроме того, неожиданным результатом для данного технического решения было достижение очень больших скоростей пролиферации клеток, что позволило сократить время культивирования клеток до 7-9 дней и избежать таким образом проблем длительного культивирования клеток.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 на типичных примерах одного донора представлены данные фенотипического анализа мононуклеарных клеток костного мозга (А), мобилизованной крови (Б) и пуповинной крови (В).

На Фиг.2 представлены данные фенотипического анализа выделенных в магнитном поле клеток CD133⁺ и CD34⁺ из МНК костного мозга (А), мобилизованной крови (Б) и пуповинной крови (В).

На Фиг.3 дана пропорция клеток CD34⁺, выделенных из костного мозга донора до (А) и после (Б) 7 дней культивирования.

На Фиг.4 дана пропорция клеток CD 133⁺ выделенных из костного мозга донора до (А) и после (Б) культивирования.

На Фиг.5 показана пропорция клеток CD34⁺, выделенных из мобилизованной крови донора до (А) и после (Б) культивирования.

На Фиг.6 показана пропорция клеток CD133⁺, выделенных из мобилизованной крови донора, до (А) и после культивирования (Б).

На Фиг.7 представлена пропорция клеток CD34⁺, выделенных из пуповинной крови до (А) и после (Б) культивирования.

На Фиг.8 представлена пропорция клеток CD34⁺, выделенных из пуповинной крови до (А) и после (Б) культивирования.

Осуществление изобретения

Способ выделения и культивирования CD34⁺CD133⁺

Все процедуры проводятся в ламинарных шкафах класса II, расположенных в стерильном блоке с подачей воздуха по регламенту GMP, с использованием стерильной одноразовой пластиковой посуды и стерильных реагентов:

1. Транспортировка мешков с клетками костного мозга, мобилизованной крови, или пуповинной крови осуществляется в термоконтейнерах ТермоКонт при комнатной температуре (18-25°С).

2. Забор клеток из мешка с мобилизованной кровью производится в ламинарном шкафу класса II, расположенном в стерильном блоке;

2.1. клеточную взвесь забирают шприцем, прокалывая мембрану соединительной трубочки на мешке.

3. Получение фракции мононуклеарных клеток (МНК): клеточную взвесь, взятую шприцем, разводят в соотношении 1:4 фосфатным буферным раствором (PBS) без ионов кальция и магния (PBS Ca²⁺Mg²⁺ free) и затем наслаивают на раствор фикола (d=1,077 г/мл, MP Biomedicals) в 50 мл пробирках;

3.1. пробирки центрифугируют при 400g в течение 30 мин при 20°С;

3.2. в результате центрифугирования в градиенте фикола, эритроциты и гранулоциты опускаются на дно пробирки, а фракция мононуклеаров в виде плотного кольца концентрируется между двумя слоями, на поверхности градиента;

3.3. фракцию МНК отбирают пипеткой, разводят в свежем PBS и три раза отмывают центрифугированием в течение 10 мин при 300g и температуре 10°С.

4. Подсчет клеток и фенотипический анализ мононуклеарной фракции:

4.1. для определения количества живых МНК к 20 мкл клеточной суспензии добавляют 20 мкл трипанового синего (Gibco). Подсчет клеток производят в гемоцитометре, пропорция живых клеток не должна быть ниже 95%;

4.2. для оценки количества клеток CD34⁺ и CD133⁺ мононуклеарной фракции 0,1 мл клеточной суспензии окрашивают соотвествующими антителами и определяют пропорцию гемопоэтических СК в исходной клеточной взвеси на приборе FACSCalibur (Beckton Dickinson).

Ниже представлены данные фенотипического анализа мононуклеарных клеток в одном показательном эксперименте, проведенном на клетках донорского костного мозга (А), мобилизованной крови (Б) и пуповинной крови (В) (Фиг.1). Как показано на фигуре, пропорция клеток 0034⁺ донора составляла 0,9% в костном мозге (А), 0,4% в мобилизованной периферической крови (Б) и 0,7% в пуповинной крови (В).

Ко-экспрессия маркеров CD133 и CD34 наблюдается в 0,7% общей взвеси МНК костного мозга в 0,3% МНК периферической мобилизованной крови и в 0,3% МНК пуповинной крови.

5. Сепарация клеток CD133⁺ или CD34⁺ на колонках в магнитном поле по методике MACS (Myltenyi Biotec, Germany):

5.1. 0,5×l0⁹ МНК суспендируют в объеме 2,5 мл буфера, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 5% раствора антикоагулянтного цитрата декстрозы в растворе PBS (ACD-A буфер);

5.2. в суспензию клеток добавляют 500 мкл реагента, блокирующего Fc рецептор, и инкубируют в течение 5 мин при 4°С;

5.3. затем в суспензию добавляют 500 мкл коллоидальных суперпарамагнитных микрошариков, коньюгированных с моноклональным мышиным античеловеческим антителом АС133.1 или анти-CD34⁺, и инкубируют в течение 25 мин при 4°С;

5.4. после инкубации в клетки добавляют 10 мл ACD-A буфера и центрифугируют при 400 g в течение 10 мин при температуре 4°С;

5.5. надосадочную жидкость удаляют и осадок ресуспензируют в 5 мл ACD-A буфера и наносят на охлажденную колонку для позитивной селекции, которая находится в магнитном поле;

5.6. колонку 4 раза промывают 2 мл охлажденного буфера ACD-A, удаляют из магнитного поля и поршнем выдавливают клетки CD133⁺ или CD34⁺ в стерильную пробирку;

5.7. селекцию на колонке повторяют и подсчитывают количество клеток. Часть клеток (0,1 мл) отбирают для фенотипирования.

6. Оценка чистоты клеточной суспензии после выделения СК из трех источников: костного мозга, мобилизованной периферической крови и пуповинной крови показала, что в среднем степень очистки клеток CD133⁺ костного мозга в магнитном поле составляла 88,1±0,9% (n12), в мобилизованной крови равнялась 87,2±4,0% (n18) и в пуповинной крови оценивалась как 76,1±2,8% (n22). Соответственно, процентное содержание клеток CD34⁺ после сепарации клеток костного мозга в магнитном поле составило 98,9±1,1%, клеток мобилизованной крови - 96,1±2,8%, клеток пуповинной крови - 97,1±1,2%.

Данные одного показательного эксперимента, где был проведен фенотипический анализ выделенных в магнитном поле клеток CD133⁺ и CD34⁺ из МНК костного мозга (А), мобилизованной крови (Б) и пуповинной крови (В) представлены на Фиг.2. Как показано на фигуре, общее количество CD34⁺ клеток после магнитной селекции, выделенных из костного мозга, составило 95,3%, из периферической крови 98,4% и из пуповинной крови 98,3%. Пропорция клеток CD34⁺, которые ко-экспрессируют CD133⁺, в клетках костного мозга (А) составила 92,1%, в клетках мобилизованной периферической крови (Б) - 87,2%, а в клетках пуповинной крови (В) 72,8%.

7. Фенотипические характеристики клеток. Клетки CD133⁺ ко-экспрессируют поверхностные маркеры стволовых клеток: CD34⁺ (98,6%±0,9%), CD38⁺ (85,1±4,8%). Клетки CD34⁺ ко-экспрессируют CD⁺ (86,8±0,1%), CD38⁺ (90,8±5,2%), CD117⁺ (33,6%±0,3). Данные сведены в ТАБЛИЦУ 1.

ТАБЛИЦА 1
Изменения клеточных маркеров клеток CD34⁺ через 7 дней культивирования   Периферческая мобилизованная кровь Костный мозг Пуповинная кровь   До культивирования После культивирования До культивирования После культивирования До культивирования После культивирования СD34⁺ 96,1±2,8 88,3±7,4 98,9±1,1 90,9±4,1 97,1±1,2 87,7±10,2 CD133⁺ 87,2±4,0 45,7±6,4 88,1±0,9 57,1±7,0 76,1±2,8 51,4±5,8 CD34⁺CD133⁺ 86,8±2,4 42,9±2,7 84,6±2,2 47,2±5,3 74,0±2,4 46,0±2,9 CD38⁺ 89,6±1,8 97,8±0,9 92,4±5,1 98,1±1,1 88,6±2,0 98,1±0,7 CD34⁺CD38^- 9,2±2,0 0,1±0,1 7,1±1,8 0,2±0,1 9,6±1,9 0,2±0,2 CD1a⁺ 0,2±0,1 1,2±0,2 0,2±0,2 0,8±0,2 0,1±0,1 0,9±0,3 CD14⁺ 0,4±0,1 5,0±1,1 0,3±0,1 2,7±0,5 0,1±0,1 2,6±0,5 CD19⁺ 0,6±0,2 0,8±0,1 0,5±0,2 0,6±0,1 0,3±0,1 0,3±0,2 CD45⁺ 84,2±9,1 12,8±2,6 93,9±4,7 15,6±3,1 81,7±5,7 13,3±2,1 CD34⁺CD45^- 15,5±3,1 44,4±8,9 17,6±3,5 38,4±7,7 12,4±2,3 32,0±5,8 CD117⁺ 35,8±0,2 2,7±1,5 42,4±0,5 2,1±0,8 29,5±0,2 1,5±1,2 CD34⁺CD117⁺ 33,6±0,3 1,8±0,5 2,4±0,5 1,3±0,4 1,6±0,2 4,8±0,9

8. Культивирование

Культуральная среда

Пример 1-3

Жидкая культуральная система состоит из среды Искова в модификации Дульбекко (Iscove's modified Dulbecco's Medium IMDM, Gibco, UK) с добавлением 0,5 г/л бычьего сывороточного альбумина (Sigma Aldrich), 0,39 мкг/мл человеческого инсулина и 60 мкг/мл трансферрина (Gibco). В культуральную среду добавляют фактор роста стволовых клеток SCF, другое название c-Kit-ligand (c-KitL, R&D Systems), в концентрации 100 нг/мл, а также Flt3-ligand (Flt3L) в концентрации 20 нг/мл, (R&D Systems), и иономицин (Sigma Aldrich), в концентрации 0.1 мкМ/мл

Способ культивирования.

Пример 4-5

Клетки культивируют при 37°С во влажной атмосфере с притоком 5% CO₂. Свежую среду и цитокины добавляют каждый третий день. Время культивирования составляет 5-7 дней. Использованные нами факторы роста способствуют пролиферации стволовых клеток, при этом не нужно добавлять агенты, подавляющие дифференцировку. Получаемые суспензии стволовых клеток любого индивидуума могут быть сохранены в замороженном виде либо могут быть введены больным непосредственно после культивирования.

Лекарственные препараты на основе клеток CD34⁺ и СР133⁺, выделенные из костного мозга, пупочной вены и мобилизованной крови.

Пример 6

Фигура 3 представляет пример культивирования клеток CD34⁺, выделенных из костного мозга здорового донора. До культивирования в очищенной суспензии клеток определялось 99,8% клеток с маркерами CD34⁺, а через 7 дней культивирования - 84,0%. Общее количество клеток выросло в 24 раза, при этом количество CD34⁺ увеличилось в 15 раз.

Фигура 4 показывает пример культивирования клеток CD133⁺, выделенных из костного мозга. До культивирования выявлялось 88,6% клеток с маркером СD133⁺. Через 7 дней культивирования количество CD 133⁺ составило 62,6% и, следовательно, увеличилось в 11 раз.

Пример 7

Фигура 5 показывает пропорцию клеток CD34⁺, выделенных из мобилизованной крови до (А) и после (Б) культивирования. В выделенных клетках процент CD34⁺ клеток составлял 99,1%, а через 7 дней культивирования 87,1%. В результате культивирования в течение 7 дней общее количество клеток увеличилось 17 раз, а количество CD34⁺ клеток - в 11 раз.

Фигура 6 представляет данные по культивированию клеток CD133⁺, выделенных из мобилизованной крови: до (А) и после (Б) культивирования. До культивирования количество CD133⁺ клеток составляло 91,4%, после культивирования - 66,7%, при этом количество CD133⁺ клеток увеличилось в 7 раз.

Пример 8

Фигура 7 показывает пропорцию клеток CD34⁺, выделенных из пуповинной крови до (А) и после (Б) культивирования. До культивирования количество CD34⁺ клеток составляло 98,9%, после культивирования - 92,1%. Общее количество клеток в результате культивирования увеличилось в 19 раз, а количество CD34⁺ клеток - в 12 раз.

Фигура 8 представляет пропорцию клеток CD133⁺, выделенных из пуповинной крови до (А) и после (Б) культивирования. До культивирования количество CD133⁺ клеток составляло 93,2%, после культивирования - 56,9%. Количество CD133⁺ клеток после культивирования увеличилось в 6 раз.

Пример 9. Стимулирующий эффект иономицина, оптимальные концентрации последнего в смеси ростовых факторов.

Раститровка оптимальной концентрации иономицина от 0,1 до 1 мкМ показала, что оптимальная концентрация, которая вызывает наибольший рост клеток и наиболее высокое содержание клеток CD34⁺, составляет 0,5 мкМ (Таблица 2). Исследование влияния различных концентраций иономицина на экспансию CD34⁺ и CD133⁺ клеток, выделенных из периферической мобилизованной крови донора, показало, что технический результат достигается при концентрации иономицина от 0,1 мкМ до 1 мкМ.

Таблица 2   SCF+Flt3L+ТРО+0.1 мкМ иономицина SCF+Flt3L+ТРО+0.5 мкМ иономицина SCF+Flt3L+ТРО+1 мкМ иономицина Экспансия общая 20,0 24,0 10,9 Экспансия CD34⁺ 11,3 15,0 6,7 % CD34⁺ 85,7% 87,1% 84,1% % CD133⁺ 66,7% 62,6% 41,9%

Пример 10. Сравнение различных комбинаций факторов роста клеток, синергический эффект.

Сравнение различных комбинаций факторов роста клеток CD34⁺ показало, что SCF, Flt3L и ТРО гораздо менее эффективны, чем коктейль цитокинов, который содержит SCF, Flt3L, ТРО и иономицин. В таблице представлены результаты экспериментов, которые демонстрируют эффект для смеси цитокинов, содержащих иономицин.

Таблица 3   SCF+Flt3+TPO SCF+Flt3+TPO 0.5 мкМ иономицина Экспансия общая 15,1 24,0 Экспансия CD34⁺ 12,9 15,0 % CD34⁺ 62,4% 87,1% % CD133⁺ 28,7% 62,6%

Как видно из Таблицы, иономицин в комбинации с ростовыми факторами SCF, Flt3L и TPO усиливает экспансию стволовых клеток CD34⁺ и CD133⁺.

Пример 11. Сравнение результатов культивирования клеток CD34⁺ в коктейле цитокинов, содержащих Flt3L, SCF и TPO в присутствии G-CSF или иономицина.

Сравнение набора ростовых факторов, включающего иономицин с таким же набором факторов, содержащих G-CSF (гранулоцитарный колонии-стимулирующий фактор), показало, что в присутствии G-CSF значительно повышается общая экспансия кроветворных клеток предшественников, тогда как пропорция собственно стволовых клеток в 20 раз ниже. Данные сведены в Таблицу 4.

Таблица 4   SCF+Flt3+TPO+0.5 мкМ иономицина
7 дней культивирования SCF+Flt3+TPO+G-CSF (А.С.Lam et al., 2001)
12 дней культивирования Экспансия общая 24,0 279 Экспансия CD34⁺ 15,0 13,0 % CD34⁺ М7,1% 3,9%

Эффективность предложенного изобретения, позволяющего культивировать СК с цитокинами, которые способствуют пролиферации, но не дифференцировке СК, открывает перспективы для применения собственных стволовых клеток больного для лечения таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, ожоги, долго незаживающие раны и травмы конечностей, травмы спинного и головного мозга. Аутологичные СК могут быть выделены и храниться в замороженном виде, чтобы быть использованы в случае острой необходимости. При этом способность к последующей дифференцировке у таких культивируемых клеток сохранена на уровне первоначально выделяемых стволовых клеток.

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии. Гемопоэтические стволовые клетки человека выделяют из костного мозга или мобилизованной периферической крови, или крови, выделенной из пуповинной вены. Методом фракционирования в градиенте фикола из общей массы клеток получают суспензию мононуклеарных клеток, из которых выделяют обогащенную суспензию клеток CD133⁺ и CD34⁺. Полученную суспензию культивируют в среде Dulbecco M (IMDM) с добавлением инсулина и трансферрина, а также фактора роста стволовых клеток (SCF), лиганда тирозин киназы 3 из фетальной печени (Flt3L), тромбопоэтина (ТРО) и иономицина (Са²⁺ ionophore). Через 7-10 дней культивирования в выращенной клеточной суспензии содержится 80-92% клеток CD34⁺. Изобретение позволяет за короткий период времени вырастить 10-15-кратно увеличенное количество низкодифференцированных гемопоэтических стволовых клеток, которые могут быть использованы в терапевтических целях. 8 ил., 4 табл.

Способ увеличения количества гемопоэтических недифференцированных стволовых клеток (СК) пациента ex vivo путем их выделения из крови или костного мозга пациента и культивирования в ростовой среде, содержащей смесь цитокинов, состоящей из фактора роста стволовых клеток (SCF), лиганда тирозин киназы 3 из фетальной печени (Flt3L) и тромбопоэтина (ТРО), отличающийся тем, что указанная выше смесь цитокинов дополнительно содержит иономицин при следующем соотношении компонентов:
SCF (50-150)·10³ нг ТРО (50-150)·10³ нг Flt3L (10-50)·10³ нг Иономицин (10-100)·10³ нг