Способ получения щелочной фосфатазы Советский патент 1993 года по МПК C12N9/16 

Изобретение относится к получению очищенной щелочной фосфатазы животного происхождения, которая находит применение в генной инженерии, иммуногистохимических процедурах и иммуноферментном анализе, научно-исследовательской работе. Известна хроматографическая очистка щелочной фосфатазы на ионообменниках, несущих диэтиламиноэтильные и фосфатные группировки. Однако получаемый продукт piBnaflaeT низкой активностью, что сужает область его иёпользования. Более перспектйбным, методом очистки является аффинная хроматография. Одним из примеров аффинной хроматографии является иммуносорбция на иммобилизованных антителах против щелочной хроматографии на нерастворимых лектинах. Используя тот факт, что щелочная фосфатаза животного происхождения является гликопротеидом, для очистки щелочной фосфатазы был применен иммобилизованный конканавалин А. Хотя последние два способа имеют очевидные преимущества перед остальными, удельная активность целевого продукта недостаточно высока и не превь1шает 20003000 единиц на 1 мг балка. Разумным сочетанием известных приемов можно повысить эту величину. В качестве прототипа выбран способ получения щелочной фосфатазы, который позволяет получить наиболее высокую удельную активность целевого продукта. Данный способ включает следующие операции: печень быка отмьшали от крови 0,9%-ным раствором NaCI и гомогенизировали в 100 мРЛ трис-НС1, рН 7,6, содержащем 1мМ CaCIa, 1 MMMgCla, 0,02 мМ ZnS04 и 1 мМ MnCla. К гомoreнату добавляли равный объем охлажденного до -20°С н-бутанола при постоянном перемешивании. По прошествии 40 мин смесь центрифугировали, к водному раствору добавляли ацетон () до его конечной концентрации 30%. После центрифугирования осадок отбрасывали, а концентрацию ацетона в растворе повышали до 50%. Осадок растворяли в 100 мМ трис-НС1, рН 7,6, содержащем 1 мМ , 1мМ MgGl2, 0,02 мМ ZnSO/i и 1 мМ MnCl2 и наносили на колонку с сефадексом G-150. Белок, обладающий фосфатазной активностью, очищали затем на колонке с DE Нугелем. В дальнейшем щелочную фосфатазу смешивали с конканавалин А-сефарозой 4В, а фермент злюировали с помощью а-метил-О-манопиранозида. Дальнейшая очистка щелочной фосфатазы включала ионообменную хроматографию на моно О колонке (HR 5/5) и высокоэффективную обратнофазную хроматографию на дифенилкремнеземе (размер пор 50 нм). В результате получили препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью 7440 единиц на 1 мг белка; выхода 7-стадийной очистки составил 10%. Недостатком известного способа является невысокая удельная активность целевого продукта. Кроме того, существенным ограничением данного метода является его многостадийность и низкий выход. Целью предлагаемого изобретения является повышение удельной активности препарата щелочной фосфатазй, упрощение способа и увеличение выхода. Поставленная цель достигается тем, что ферглентный препарат получают гомогенизацией тонкого кишечника тюленя, после экстракции н-бутанолом осаждают этанолом при конечной концентрации 55-65 об.%, хроматографическое разделение осуществляют на иммобилизованных моноклональных антителах против щелочной фосфатазы тюленя, секретируемых гибридными клетками АРР.1, причем элюирование проводят растворами с рН 9,5-11,5. В предложенном способе активность целевого препарата щелочной фосфатазы увеличивается до 19000-20800 единиц на 1 мг белка при одновременном сокращении числа стадий до трех и повышении выхода до 90-94%. Верхняя граница конечной концентрации этанола при осаждении 65 об.% обусловлена тем, что при более высокой концентрации этанола, когда вся фосфатаза уже осаждена, происходит осаждение балластных белков, что приводит к уменьшению степени очистки. Нижняя граница конечной концентрации этанола при осаждении 55 об.% обусловлена тем, что при более низкой концентрации этанола значительная часть фосфатазы остается в растворе, что приводит к уменьшению выхода. Верхняя граница рН злюции обусловлена тем, что при рН 11,5 наблюдается количественная десорбция фермента с иммуносорбента, а дальнейшее повышение рН только приводит к денатурации как фермента, так и иммобилизованных антител. Нижняя граница рН элюции обусловлена тем, что при рН ниже 9,5 резко понижается степень десорбируемости фермента с иммуносорбента, что приводит соответственно к низкому выходу очистки целевого продукта. Предлагаемый способ заключается в следующем: 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюленя размельчают и гомргенизируют в 25 мл 0,0.5 М трис-НС1, рН

7.4.содержащем 2.5 мМ MgSO-i. К гомогенату добавляют 80 мл н-бутанола л проводят экстракцию при 37С в течение 1.5 ч. Буганольную фазу отбрасывают, а 45 мл водного раствора диализуют против 1 л 0.05 М триоHCI. рН 7.4. содержащего 2.5 мМ MgS04. в течение 20 ч при 4°С. Буфер заменяют свежим через 10 ч. К полученному диализату при перемешивании добавляют этанол (4°С)

до конечной концентрации 55-65 об.%, выдерживают 30 мин при 4°С и осадок центрифугируют. Полученный осадок растворяют в 20 мл 0.02 М трис-НС1,, рН 7.4. содержащем 10 мМ MgCl2 и 0.5 М NaCI, Раствор наносят на колонку ( мл) с иммобилизованными моноклональными антителами, секретируемыми гибриднымиклетками АРР.1 (коллекция клеточных культур Института цитологии АН СССР. Ленинград, номер 377Д), предварительно уравновешенными тем же буфером. После нанесения фермента гель отмывают 0,02 М трис-НС1. рН 7.4. содержащим 10 мМ MgCl2 и 0.5 М NaCI. до А280, равной 0.03-0,05. Фермент элюируют растворами с рН 9,5-11,5. Активные фракции объединяли и определяли ферментативную активность. Данный способ позволяет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 19000-20800 ед/мг белка; выход по активности равен 9094%. .

П р и М е р 1. 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюленя размельчали и гомогенизировали в 25 мл 0.05 М трис-НС1, рН 7.4, содержащем 2.5 мМ MgSO. К гомогенату добавляли ВО мл н-бутанола и проводили экстракцию при 37°С. в течение 1.5 ч. Бутанольную фазу отбрасывали, а 45 мл водного раствора диализовали против 1 л 0.05 М трис-НС1, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ MgS04, в течение 20 ч при 4°С. Буфер заменяли свежим через 10 ч. К полученному диализату при перемешивании добавляли этанол (4°С) до конечной концентрации 55 об.%, выдерживали 30 мин при 4С и осадок центрифугировали. Полученный осадок растворяли в 20 мл 0,02 М трис-НС1, рН 7.4, содержащем 10 мМ MgCl2 и 0.5 М MaCI. Раствор наносили на колонку ( мл) с иммобилизованными моноклональными антителами, секретируемыми гибридными клетками АРР.1 (коллекция клеточных культур Института цитологии АН СССР, Ленинград, номер 377 Д). предварительно уравновешенными тем же буфером. После нанесения фермента гель отмывали 0,02 М трис-НС1, рН 7,4, содержащим 10 мМ MgCl2 и 0.5 М NaCI, до А280. равной 0.03-0.05. Фермент элюировали 0,05 М триэтиламином, рН

9.5.Активные фракции объединяли и определяли ферментативную активность по отношению к п-нитрофенилфосфату и концентрацию белка по Лоури. Данный способ позволяет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 19000 ед/мг белка, выход по активности равен 90%.

П р и М е р 2. 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюленя размельчали и гомогенизировали в 25 мл 0.05 М трис-НС1, рН 7.4, содержащем 2,5 мМ MgSO. К гомогенату добавляли 80 мл н-бутанола и проводили экстракцию при 37°С в течение 1,5 ч. Бутанольную фазу отбрасывали, а 45 мл водного раствора диализовали против 1 л 0,05 М трис-НСГ. рН 7,4, содержащего 2,5 мМ MgSO-q, в течение 20 ч при 4°С. Буфер заменяли свежим через 10 ч. К полученному диализату при перемешивании добавляли этанол (4°С) до конечной концентрации 65 об. %, выдерживали 30 мин при 4°С и осадок центрифугировали. Полученный осадок растворяли в 20 мл 0,02 М трис-HCI. рН 7,4. содержащем 10 мМ MgClz и 0,5 М NaCI. Раствор наносили на колонку (v 10 мл) с иммобилизованными моноклональными антителами, секретируемыми гибридными клетками АРР.1 (коллекция клеточных культур Института цитологии АН СССР, Ленинград, номер 377Д), предварительно уравновешенны.ми тем же буфером. После нанесения фермента гель отмывали 0,02 М трис-НС1. рН 7,4, содержащим 10 мМ MgCl2 и 0,5 М NaCI, до А280, равной 0,03-0,05. Фермент элюировали 0,5 М триэтиламином, рН 11.5. Активные фракции объединяли и определяли ферментативную активность по отношению к п-нитрофенилфосфату vi концентрацию белка по Лоури. Данный способ позволяет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 19460 ед/мг белка; выход по активности.равен 91%.

П р и М е р 3. 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюленя размельчали и гомогенизировали в 25 мл 0,05 М трис-HCI, рН 7.4. содержащем 2,5 мМ MgS04. К гомогенату добавляли 80 мл н-бутанола и проводили экстракцию при 37°С в течение 1,5 ч. Бутанольную фазу отбрасывали, а 45 мл водного раствора диализовали против 1 л 0.05 М трис-HCI. рН 7.4, содержащего 2,5 мМ MgS04. в течение 20 ч при . Буфер заменяли свежим через 10 ч. К полученному диализату при перемешивании добавляли этанол (4°С) до конечной концентрации 60 об.% выдерживали 30 мин при 4°С и осадок центрифугировали. Полученный осадок растворялй в 20 мл 0,02 М трис-НС1, рН 7,4, содержащем 10 мМ MgCIa и 0,5 М NaCI. Раствор наносили на колонку (v 10 мл) с иммобилизованными моноклональными антителами, секретируемыми гибридными клетками АРР.1 (коллекция клеточных культур Института цитологии АН СССР, Ленинград, номер, 377 Д), предварительно уравновешенными тем же буфером. После нанесения фермента иммуносорбент отмывали 0,02 М трис-НС1, рН 7,4, содержащим 10 мМ MgCl2 и 0,5 М NaCi, до А280, равной 0.03-0,05. Фермент элюировали 0,05 М триэтйламином рН 10.3. Активные фракции объединяли и определяли ферментативную активность по отношению к п-нитрофенилфосфату и концентрацию белка по Лоури. Данный способ позволяет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной акФормула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ. предусматривающий гомогенизацию сырья животного происхождения, экстракцию н-бутанолом, осаждение органическим растворителем и аффинную хроматографию, отличающийся тем, что. с целью повышения удельной активности фермента, упрощения способа и увеличе510 15 20

ния выхода, в качестве сырья используют п(. тонкий кишечник тюленя, осаждение ведут этанолом при конечной концентрации 55 65 об.%, аффинную хроматографию осуществляют на иммобилизованных моноклональных антителах. продуцируемых 30 штаммом гибридных культивируемых клеtoK АРР.1 ВКК (П) Д 377, а элюирование проводят раствором с рН 9.5 -11,5. тивностью, равной 20800 ед/мг белка: выход по активности равен 94%. Таким образом, технико-экономический зффект предлагаемого способа заключается в увеличении активности целевого продукта щелочной фосфатазы. резком сокращении стадий очистки и повышении выхода. Это позволяет создать простой и легко масштабируемый процесс выделения и очистки щелочной фосфатазы тюленя при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырья. (56) Авторское свидетельство СССР № 1426089, кл. С 12 N9/16. 1986. Авторское свидетельство СССР № 1554377, кл. С 12 N 9/16. 1988. Ниа J.-C.,Garattlnl Е.. Pan Y.-С.Е. etal. Arch. Blochem. Blophyis., 1985. v. 241. p. 380-385 - прототип.

Изобретение относится к биотехнологии. Цель - повышение удельной активности фермента, упрощение способа и увеличение выхода. Ферментный препарат щелочной фосфатазы получают гомогенизацией тонкого кищечнмка тюленя экстракцией н-бутанолом, осаждением этанолом при конечной концентрации 55 - 65 об.% и хроматографичей<им разделением на иммобилизованных моноклональ- ных антителах против щелочной фосфатазы тюленя, продуцируемых ияаммом гибридных культивируемых клеток АРР.1.ВКК(П) 377. причем элюирова- ние проводят растворами с рН 9,5 - 11.5. Удельная активность щелочной фосфатазы равна 19000 - 20800 ед/мг белка Выход по активноаи равен 90 -94%.