Средство, обладающее цитотоксической активностью в отношении культуры клеток глиомы U87MG Российский патент 2025 года по МПК C07D209/60 A61K31/404 A61P35/00 

Изобретение относится к фармакологии, а именно к биологически активным веществам, обладающим цитотоксической активностью по отношению к культуре клеток глиомы U87MG, и может быть использовано при производстве противоопухолевых лекарственных средств

Глиома - это общий термин, используемый для описания первичных опухолей головного мозга, который классифицируется в соответствии с предполагаемой клеткой их происхождения. К ним относятся астроцитарные опухоли (астроцитома, анапластическая астроцитома и глиобластома), олигодендроглиомы, эпендимомы и смешанные глиомы. Это наиболее часто встречающиеся опухоли центральной нервной системы (ЦНС), на которые приходится почти 80% всех злокачественных первичных опухолей головного мозга. Несмотря на разнообразие современных методов лечения ГБМ, это по-прежнему смертельное заболевание с крайне плохим прогнозом. [1]

Мультиформная глиобластома (МГБ) - наиболее злокачественная и часто встречающаяся разновидность глиальных опухолей. На долю приходится более 60% всех опухолей головного мозга у взрослых. [2].

Стандарт лечения впервые диагностированной МГБ включает хирургическую резекцию (если это возможно), одновременную лучевую терапию и химиотерапию, таргетную терапию при рецидиве МГБ. Несмотря на мультимодальное лечение, рецидивы встречаются практически повсеместно, медиана выживаемости составляет менее 2 лет. Продолжающиеся исследования, направленные на изменение этого мрачного прогноза, включают таргетную терапию, влияющую на различные механизмы передачи сигналов, иммунотерапию, онколитическую виротерапию, нанотерапия (нанометрические структуры, содержащие активные анти-GBM-агенты, в качестве иммунных клеток, химиотерапевтические/антиангиогенные препараты или сенсибилизаторы), а также методы лечения, основанные на использовании неионизирующих энергий (лазерная интерстициальная термотерапия, высокоинтенсивная фокусированная терапия, УЗИ и электропорация) [2].

Несмотря на агрессивный стандартный подход к лечению, включающий максимально безопасную хирургическую резекцию, лучевую терапию и химиотерапию темозоломидом (ТМЗ), среднее время выживаемости при глиобластоме невелико и составляет 14,6 месяцев [2,3]. Кроме того, существуют ограниченные варианты лечения, доступные при прогрессировании заболевания, когда возникает резистентность к стандартному лечению и развивается рецидив опухоли.

В связи со значительным ростом онкологических заболеваний актуальным является разработка и внедрение новых противоопухолевых средств, которые обладали бы высокой эффективностью на фоне низкого риска развития нежелательных реакций. Таким образом, учитывая крайнюю злокачественность и сложность существующей терапии глиом, разработка новых химиопрепаратов, способных подавлять клеточные линии глиом является актуальной задачей.

Известны применяемые при глиомах такие противоопухолевые препараты, как темозоломид (алкилирующий агент) [4], ломустин (алкилирующий агент) [5], винкристин (приводит к нарушению микротубулярного аппарата клеток) [6], бевацизумаб (ингибитор фактора роста эндотелия сосудов) [7], дабрафениб [8] и вемурафениб (ингибиторы BRAF-киназ с активирующими мутациями в кодоне V600E) [9].

Вышеперечисленные препараты рекомендованы для клинического применения [10], однако их активность остаётся недостаточно высокой (значение половинной ингибирующей концентрации IC₅₀ для них находится в пределах 17- 400 мкМ).

Одним из стандартных противоопухолевых препаратов, широко применяемых при глиомах является темозоломид. Значение IC₅₀ у него составляет 123,9 мкМ [11].

Техническим результатом является повышение цитотоксической активности (а именно, половинной ингибирующей концентрации IC₅₀) в отношении культуры клеток глиомы U87MG.

Технический результат достигается 2-(1,1-диметил-1H-бензо[e]индолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополоном формулы 1

Ранее было показано, что 2-(1,1-диметил-1H-бензо[e]индолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополон (1) обладает цитотоксической активностью по отношению к культуре клеток рака кожи А431 и рака легкого Н1299 [12].

Соединение относится к производным ряда 2-хинолин-1,3-трополонов. В ряду известны соединения, проявляющие активность против различных линий раковых клеток (H441, A549, OVCAR-3, OVCAR-8, HCT116 , Panc-1) и содержащие акцепторные группы (NO₂, Cl) на периферии трополонового кольца, в том числе 5,7-ди(трет-бутил)-2-(4,7-дихлор-8-метил-2-хинолил)-4-нитро-1,3-трополон [12], 5,7-ди(трет-бутил)-2-(4,7-дихлор-8-метил-5-нитро-2-хинолил)-4-нитро-1,3-трополон [12,13] и полихлорзамещённые производные - 2-(4,7-дихлор-8-метил-2-хинолил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополон и их смеси [12], а также 2-(6,8-диметил-5-нитро-4-хлорхинолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополон [14].

В ряду 2-хинолин-1,3-трополонов не известны соединения, проявляющие цитотоксическую активность в отношении культуры клеток глиомы U87MG.

Синтез соединения 1 описан [15] и заключается в реакции расширения о-хинонового цикла, протекающей между 1,1,2-триметил-1H-бензо[е]индолином 2 и 3,4,5,6-тетрахлор-1,2-бензохиноном 3 при кипячении в диоксане:

Механизм образования трополоновой системы 1 включает стадию альдольной конденсации с образованием интермедиата А, циклизацию А в норкарадиеновое производное B и перегруппировку B в дигидротрополон С. Окончательное формирование 1,3-трополонового фрагмента сопровождается дегидрохлорированием С, что ведет к основному продукту 1.

Строение соединения 1 установлено данными ЯМР ¹Н и ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии.

Ниже приведен пример синтеза 2-(1,1-диметил-1H-бензо[e]индолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона 1.

Пример. 2-(1,1-Диметил-1H-бензо[e]индолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополон (1). Раствор 1.05 г (5 ммоль) 1,1,2-триметил-1H-бензо[e]индолина (2), 1.23 г (5 ммоль) о-хлоранила (3) в 10 мл диоксана кипятили 1,5 часа с обратным холодильником. Отгоняли растворитель и остаток растворяли в хлористом метилене. Раствор пропускали через хроматографическую колонку с силикагелем (элюент - гексан - СН₂Cl₂, 1 : 2), собирали жёлто-оранжевую фракцию (1) с Rf=0.4. Перекристаллизовывали из н-гексана. Оранжевые кристаллы. Выход 30%. T.пл. 164-165 ºС (н-гексан).

Спектр ЯМР 1H (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 1.96 (с, 6H, Me(1,1)), 6.90 (с, 1H, H(4)), 7.42 (д, 1Н, Н_аром., J = 8.6), 7.49 (м, 1H, H_аром.), 7.61 (м, 1H, H_аром.), 7.87 (д, 1H, H_аром., J = 8.6), 7.93 (д, 1H, H_аром., J = 8.2), 8.06 (д, 1H, H_аром., J = 8.5), 15.14 (уш. с, 1Н, ОН). Спектр ЯМР 13С (CDCl₃, δ, м.д.): 23.4, 54.6, 77.0, 112.7, 122.5, 125.3, 127.6, 127.9, 130.1, 130.3, 132.6, 133.5, 135.0, 135.9, 180.7. ИК-спектр, ν/см^-1: 3040, 2975, 2934, 2867, 1736, 1638, 1536, 1520, 1494, 1466, 1442, 1399, 1372, 1364, 1323, 1261, 1215, 1207, 1174, 1082, 1057, 945, 907, 874, 856, 815, 788, 763, 748, 689. Масс-спектр (ЭУ, 70 эВ), m/z (I_отн (%)): 419 (44) [M⁺], 417 (44), 389 (66), 378 (27), 374 (82), 353 (17), 339 (60), 304 (18), 275 (24), 241 (35), 194 (72), 191 (26), 165 (60), 152 (100), 147 (26), 139 (30), 127 (35), 121 (35), 115 (21), 106 (16), 87 (12), 84 (21), 77 (15), 63 (23). Найдено (%): C, 60.12; Н, 3.20; N, 3.22. C₂₁H₁₄Cl₃NO₂. Вычислено (%): C, 60.24; Н, 3.37; N, 3.35.

Исследование фармакологической активности

Материалы и методы

Исследование проводили на клеточной линии глиомы U87MG. Определение цитотоксичности вещества проводили с помощью стандартного МТТ-теста. Подсчёт живых клеток осуществляли непрямым способом путём измерения уровня восстановления под действием клеточных НАДФ-H-зависимых оксидоредуктазных ферментов желтого тетразолиевого красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида в пурпурно-фиолетовый формазан с максимумом поглощения света в диапазоне 540-560 нм. Оптическая плотность раствора в данном диапазоне волн является косвенным показателем количества живых клеток в культуре. Жизнеспособность рассчитывают, как отношение оптической плотности в опытных лунках к лункам без воздействия, выраженную в процентах. Для характеристики жизнеспособности использовалось значение половинной ингибирующей концентрации IC₅₀ (количество вещества, при котором происходит снижение количества продуктов жизнедеятельности клеток на 50%).

Для определения IC₅₀ строили график, выражающий зависимость величины оптической плотности от концентрации препарата.

Ход эксперимента.

Клетки культуры U87MG высаживали в 96-луночный планшет в количестве 5 тыс. на лунку в полной питательной среде (ППС) DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и культивировали в стандартных условиях при 37°C и 5,0% CO₂. На следующие сутки среду культивирования заменяли на ППС, содержащую тестируемое вещество в серии двукратных разведений от 24 мкМ до 0,023 мкМ. В контрольных лунках производили замену ППС без тестируемого вещества. Клетки инкубировали в стандартных условиях при 37°C и 5,0% CO₂ в течение 24, 48 или 72 ч, после чего проводили МТТ тест по стандартной методике. Среду культивирования заменяли на ППС с 10% содержанием МТТ, после чего инкубировали ещё 2 часа в стандартных условиях в СО₂-инкубаторе. По окончании культивирования из лунок полностью удаляли ППС с МТТ, и растворяли в ДМСО образовавшиеся кристаллы формазана. Далее измеряли оптическую плотность полученного раствора при 540нм и вычисляли среднее значение жизнеспособности клеток культуры U87MG для каждого варианта опыта.

Определение значения IC₅₀ проводили в среде разработки RStudio с использованием пакета drc [16].

Результаты исследований.

Половинная ингибирующая концентрация IC₅₀ 2-(1,1-диметил-1H-бензо[e]индолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона в отношении культуры клеток глиомы U87MG, составила 8,43±0,5 мкМ при 24 ч культивирования, 2,14±0,17 мкМ при 48ч культивирования и 2,01±0,08 мкМ при 72ч культивирования.

Для сравнения, ингибирующая концентрация IC₅₀ темозоломида (стандартного противоопухолевого препарата, применяемого при глиомах) по данным литературы для культуры U87MG через 24, 48 и 72 часа составляет 123,9 мкМ, 223,1 мкМ и 230,0 мкМ, соответственно [11], что существенно выше значений, полученных для 2-(1,1-диметил-1H-бензо[e]индолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона.

Таким образом, предлагаемое соединение обладает более высокой цитотоксической активностью в отношении культуры клеток глиомы U87MG по отношению к одному из стандартных противоопухолевых препаратов, широко применяемых при глиомах, и может быть использовано как действующее начало в фармацевтических композициях, обладающих соответствующей активностью.

Литература

1. Hanif F., Muzaffar K., Perveen K., Malhi S.M., Simjee S.U. Glioblastoma multiforme: a review of its epidemiology and pathogenesis through clinical presentation and treatment // Asian pacific journal of cancer prevention. - Vol. 18. - Issue 1. - P. 3. DOI:10.22034/APJCP.2017.18.1.3.

2. Poon M.T.C., Sudlow C.L.M., Figueroa J.D., Brennan P.M. Longer-term (≥2 years) survival in patients with glioblastoma in population-based studies pre- and post-2005: a systematic review and meta-analysis // Scientific Reports. - 2020. - Vol. 10. - Article № 11622. DOI: 10.1038/s41598-020-68011-4.

3. Stupp R., Mason W.P., Bent M.J., Weller M., Fisher B., Taphoorn M.J.B., Belanger K., Brandes A.A., Marosi C., Bogdahn U., Curschmann J., Janzer R.C., Ludwin S.K., Gorlia T., Allgeier A., Lacombe D., Cairncross J.G., Eisenhauer E., Mirimanoff R.O. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma // The new England journal of medicine. - 2005. - Vol. 352. - P. 987. DOI: 10.1056/NEJMoa043330.

4. Grossman R, Rudek MA, Brastianos H, Zadnik P, Brem H, Tyler B, Blakeley JO. The impact of bevacizumab on temozolomide concentrations in intracranial U87 gliomas. Cancer Chemother Pharmacol. 2012 Jul;70(1):129-39.

5. Yamamuro S, Takahashi M, Satomi K, Sasaki N, Kobayashi T, Uchida E, Kawauchi D, Nakano T, Fujii T, Narita Y, Kondo A, Wada K, Yoshino A, Ichimura K, Tomiyama A. Lomustine and nimustine exert efficient antitumor effects against glioblastoma models with acquired temozolomide resistance. Cancer Sci. 2021 Nov;112(11):4736-4747.

6. Zhai M, Wang Y, Zhang L, Liang M, Fu S, Cui L, Yang M, Gong W, Li Z, Yu L, Xie X, Yang C, Yang Y, Gao C. Glioma targeting peptide modified apoferritin nanocage. Drug Deliv. 2018 Nov;25(1):1013-1024.

7. Lallemand C, Ferrando-Miguel R, Auer M, Iglseder S, Czech T, Gaber-Wagener A, Di Pauli F, Deisenhammer F, Tovey MG. Quantification of Bevacizumab Activity Following Treatment of Patients With Ovarian Cancer or Glioblastoma. Front Immunol. 2020 Oct 15;11:515556.

8. Merisaari J, Denisova OV, Doroszko M, Le Joncour V, Johansson P, Leenders WPJ, Kastrinsky DB, Zaware N, Narla G, Laakkonen P, Nelander S, Ohlmeyer M, Westermarck J. Monotherapy efficacy of blood-brain barrier permeable small molecule reactivators of protein phosphatase 2A in glioblastoma. Brain Commun. 2020 Jan 11;2(1):fcaa002.

9. El-Gamal MI, Zaraei SO, Madkour MM, Anbar HS. Evaluation of Substituted Pyrazole-Based Kinase Inhibitors in One Decade (2011-2020): Current Status and Future Prospects. Molecules. 2022 Jan 5;27(1):330.).

10. Клинические рекомендации / Ассоциация онкологов России, Ассоциация нейрохирургов России, Рос. общ-во клинической онкологии. 2020. URL: https://oncology-association.ru/wp-content/uploads/2020/09/pervichnye_opuholi_cns.pdf).

11. Ritz C., Baty F., Streibig J.C., Gerhard D. Dose-Response Analysis Using R // PLoS ONE - 2015. - Vol. 10. - Issue 12. - Article № e0146021. DOI: 10.1371/journal.pone.0146021.

12. Gusakov E.A., Topchu I.A., Mazitova A.M., Dorogan I.V., Bulatov E.R., Serebriiskii I.G., Abramova Z.I., Tupaeva I.O., Demidov O.P., Duong N.T., Tran D.L., Duong N.B., Boumber Y.A., Sayapin Yu.A., Minkin V.I. Design, synthesis and biological evaluation of 2-quinolyl-1,3-tropolone derivatives as new anti-cancer agents // RSC Advances. - 2021. - Vol. 11. - Issue 8. - P. 4555. DOI: 10.1039/d0ra10610k.

13. Патент на изобретение РФ № 2702648, МПК C07D215/18, 2019 г.

14. Патент на изобретение РФ № 2741311, МПК C07D215/18, 2020 г.

15. Патент на изобретение РФ № 2810581, МПК С07D487/04, 2023 г.

16. Poon M.T.C., Bruce M., Simpson J.E., Hannan C.J., Brennan P.M. Temozolomide sensitivity of malignant glioma cell lines - a systematic review assessing consistencies between in vitro studies // BMC Cancer. - 2021. - Vol. 21. - Article № 1240. DOI: 10.1186/s12885-021-08972-5.

Изобретение относится к применению 2-(1,1-диметил-1H-бензо[e]индолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона формулы (1) в качестве средства, обладающего цитотоксической активностью в отношении культуры клеток глиомы U87MG. Технический результат – повышение цитотоксической активности в отношении культуры клеток глиомы U87MG. 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Применение 2-(1,1-Диметил-1H-бензо[e]индолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона, формулы (1)

в качестве средства, обладающего цитотоксической активностью в отношении культуры клеток глиомы U87MG.

2. Применение 2-(1,1-Диметил-1H-бензо[e]индолин-2-ил)-5,6,7-трихлор-1,3-трополона по п.1 для изготовления фармацевтической композиции.