Способ обнаружения неклассического вируса Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 G01N33/48 

Изобретение относится к -wpvcoio- гии и может быть использовано для обнаружения неклассических вирусов в анализируемых образцах.

Целью изобретения является похищение точности.

Для этого вируссолержатий материал освобождают от классических возбудителей инфекционных заболеваний обработкой при 10()°С в течение 15 мин, вводят в культуру астроцитов морских свинок и сразу же в нее вносят Кон-А (в дозе 20-25 мкг/мл), через 2 дня дополнительно вводят Н-тнмидин, на 3 сут о наличии возбудителя судят ло потере астроцитами способности отвечать пролиферацией на м тоген.

Сущность способа заключается в следующей последовательности операций.

Предварительные этагш. Прежде, чем наследовать инфекционный материал, sapai: f готовят ростовые среды, культуру асттоцитов и определяют оптимальную концентрацию митогена (Кон-А).

Приготовление культур астроцитов. Источником получения культур служат новорожденные морские свинки. Под пфнрным наркозом вскрывают черепную коробку, извлекают большие полушария голов:юге мозга и немедленно помещают во флаконы со стандартным раствором Хенкса, содержанием пенициллин (100 ед/мп) и гентамицин ( У мкг/мл). Удаляют пинцетом мягкую мозговую оболочку и крупные сгустки крови. Ножницами с узкими браншами разрс зают большие полушария на две части, из области височной части коры вырезают кусоОЭСП

-U со со

СО

чек ткани объемом 10-15 мм3 и переносят его в чашку Петри с ростовой средой (сыворотка плодов коров 30%, 5%-ный гемогидролизат 70% с добавлением 0,2 М раствора L-глутамина из расчета 1 мл на 100 мл среды и гента- мицина 25 мкг/мл), где измельчают до кусочков объемом 0,5-1 мм3. После этого, совместно с ростовой средой собирают кусочки пастеровской- пипеткой и пропускают через нейлоновое . сито первоначально с размером пор 150 мкм, а затем 75 мкм.

Получают первичный моноолой, сое- тоящий на 85-90% из астроцитов. Для этого приготовленную клеточную взвесь (10 мл) переносят в культуральные флаконы с площадью дна 22 см2, помещают в термостат и инкубируют при 37°С с 5% содержанием СО в течение 1 недели.

После образования сплошного монослоя культуральную среду удаляют, вносят 2,5 мл смеси (+37°С), состоящей из 0,1% трипсина и 0,02% версена в соотношении 1:5, выжидают 1-2 мин (контроль под микроскопом, до набухания клеток). Сливают смесь и пастеклетки, соблюдая следующий режим, град/мин: ст -10 до -20° 1; от -20 до -40°1,5; от -40 до -70° 3. После чего погружают в сосуд с жидким азотом и хранят при -196°С.

Жизнеспособность клеток сохраняется более двух лет.

Восстановление культур астроцитов после хранения в жидком азоте и подготовка их для вирусологических исследований .

Ампулы с суспензией астроцитов извлекают из азота и немедленно помещают в водяную баню на -2 мин при +ЗУ°С. Затем вскрывают, содержимое переносят в культуральные флаконы объемом 50 мл и помещают в С02 инкубатор при +37°с. Через 24 ч меняют ростовую среду на RPMI-1640 с 10% сывороткой плодов коров и культивируют в течение 5-6 дней до образования сплошного монослоя. Монослой снимают раствором трипсина и версена, как описано выше. В камере Горяева подсчитывают количество клеток в полученной суспензии, затем разводят ростезой средой RPMI-1640 до концентрации 7 10 кл ./мл . Приготовленную

Изобретение относится к вирусологии и полет быть использовано для обнаружения некляссических вирусов з анализируемых образцах. Целью изобретения явпяется повышение точности. 71лч того отбирают пробу вируссодер- .кап ого материала, освобождают ее от классических вирусов, вносят в культуру ГГ-1.НИ астроцитов морской свинки, и RuTopvw вносят конканавалин А в концентрации 20-25 мкг и Н-тимидин, и оценивают уровень включения Н-тнми- л,ича в клеточную ДНК и при отсутствии пролифе-рации судят о наличии вируса. 1 таил. с $ (Л

ровской пипеткой вносят ростовую ере-з0 купьтуру астроцитов в суспензии, вноду в объеме 5 мл, пипетируя струей для снятия клеточного пласта (5-10 манипуляций). Используя камеру Горяева, подсчитывают количество клеток в 1 мл,

ся в ячейки 96-луночных пластиковых панелей, используют для обнаружения возбудителя.

Приготовление сред для культнвиропри необходимости доводят их концент- ,, вания астроцитов. Для приготовления рацию ростовой средой до кл./мп. первичной монослойной культуры астКлеточную взвесь можно сразу переносить для культивирования в лунки пластиковой панели и использовать для,

роцитов используют ростовую среду на основе 5% гемогидролизата.

Для постановки опыта в пластиковых

обнаружения вируса или хранить в жид- до панелях применяют среду RPMI-1640. ком азоте, восстанавливая по мере не- В среду добавляют следующие необ- обходимости.

Хранение культур астроцитов.

Клетки переносят пипеткой в пробирходимые ингредиенты. 1-глутамин 2мМ, антибиотики 100 мкг/мл хлоркальциево- го комплекса стрептомицина и

ки, центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин, надосадок удаляют, а оставшиеся клетки разводят криозащит ной средой.(5% гемогидролиэат, рН - 7,2-7,4 70%, сыворотка плодов коров ,20%, глицерин 10%) до концентрации 2-10 кл./мл.

Приготовленную суспензию астроцитов разливают по 3 мл в стерильные ампулы и герметично закрывают. Ампулы с астроцитами поэтапно охлаждают выдерживанием при +4°С 2 ч, затем помещают в ванночку с 96%-ным этиловым спиртом, охлажденным до -10 С. Используя жидкий азот, замораживают

купьтуру астроцитов в суспензии, внося в ячейки 96-луночных пластиковых панелей, используют для обнаружения возбудителя.

Приготовление сред для культнвиророцитов используют ростовую среду на основе 5% гемогидролизата.

Для постановки опыта в пластиковых

панелях применяют среду RPMI-1640. В среду добавляют следующие необ-

ходимые ингредиенты. 1-глутамин 2мМ, антибиотики 100 мкг/мл хлоркальциево- го комплекса стрептомицина и

10i) ед./мл пенициллина, 10% сыворотки плодов коров, инактивированной при 56°С в течение 30 мин. Для стабилизации рН среды (7,4) добавляют раствор HEPES (М-2-гидроксиэтилпиперазин-М-2- этансульфановая кислота) в окончательной концентрации 10 мМ.

Приготовление раствора митогена. В качестве митогена используют Конка- навалин A (Concanavalin A, Serva). Готовят матричный концентрированный раствор на среде RPflI-1640, содержащий Кон-А, в дозе 100 мкг/мл, который разбавляют перед использованием до нужной концентрации. Исходя из того.

что в лунки пластиковой панели приготовленную суспензию астроцитов и раствор митогена добавляют в равных количествах (т.е. происходит разбавление митогена в два рача), растворы митогенов готовят в концентрациях, в два раза превышающих необходимую (20, 30, 40 мкг/мл и т.д.).

Определение оптимальной концентрации митогена Кон-А для стимуляции пролиферативной активности астроцито

Определение дозоэависимого стимулирующего эффекта митогена осуществляют внесением Кон-А в конечных концентрациях 10,20,25,40 и 50 мкг/мл в незараженные культуры астроцитов морских свинок, находящихся в лунках пластиковых панелей (/0000 кл./мл ротовой среды). Для этого в каждую из 15 лунок с астроцитами в первом варианте опыта вносят Кон-А в О,1 мл ростовой среды RPMI-1640 (концентрация Ю мкг/мл).

Во втором варианте опыта в 15 лунок с культурой астроцитов вносят Кон-А в 0,1 мл ростовой среды RPMI- 1640 (концентрация 20 мкг/мл).

В третьем варианте опыта в каждую

с

из 15 лунок с астроцитами вносят Кон-А 30 в термостатах при +3/ С с 5% содер- в 0,1 мл ростовой среды RPMI-1640 жанием C(V . (концентрация 25 мкг/мл и т.д.).

Контролем служат 15 лунок с культивируемыми астроцитами без митогена.

Через ч в первые 15 лунок вносят по 0,05 мл обработанного вируссодер- жащего материала и сразу же в них Пластиковые панели помещают в тер- ,, добавляют по 0,1 мл Кон-А в дозе

20-25 мкг/мл. Во вторые 15 лунок

мостат и культивируют при С с 5% содержанием COj.

На вторые сутки культивирования в каждую лунку опыта и контроля вносят 5 мкКм Н-тимидина в 0,05 мл среды RPMI-1640.

На третьи сутки из лунок пипеткой удаляют культуральную среду и добавляют 0,2 мл физраствора, клетки суспензируют и переносят на целлюлозные фильтры с диаметром пор 0,85 мкм. Затем их последовательно обрабатывают 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, 96%-ным этиловым спиртом и переносят во флаконы с 6 мл толуолового сцинтиллятора. Пролиферативную активность астроцитов определяют на жидкостном сцинтилляционном спектрометре, учитывая уровень синтеза клеточной ДНК по включению в нее Н-тимидина.

Установлено, что индекс стимуляции пролиферации (отношение количества импульсов в 1 мин в культурах астроцитов с Кон-А к количеству импульсов

(контроль митогена) вносят по 0,05 мл среды культивирования и 0,1 мл Кон-А в дозе 20-25 мкг/мл. В оставшиеся

до 15 лунок (контроль опыта) вносят

только по 0,05 мл среды культивирования без митогена.

Культуры помещают в термостат и инкубируют при +37°С с 5% содержани45 ем С(2На вторые сутки в каждую лунку опыта и контроля вносят 5 мкКи Н-тимидина в 0,05 мл среды культивирования.

50 Обнаружение возбудителя проводят на третьи сутки, испотьзуя жидкостный сцинтилляционный спектрометр, определяют пролифератнвную активность астроцитов по включению Ч-тнмидина

55 в клеточную ДНК, учитывают количество импульсов в 1 мин в опытных и контрольных культурах. Присутствие возбудителя устанавливают по потере инфицированными астроцитами способв 1 мин в культурах без Кон-А) наиболее высокий при внесении Кон-А в концентрации 20-25 мкг/мл. Малые концентрации Кон-А (Ю мкг/мл) на третьи сутки вызывают более низкую стимуляцию пролнферативной активности, а более высокая концентрация (50 мкг/мл) вообще не вызывает пролиферации клеток.

Таким образом, наиболее оптимальной концентрацией митогена Кон-А для стимуляции пролиферативной активности астроцитов морских свинок является доза 20-25 мкг/мл.

5 Влияние различных концентраций Кон-А на пролиферативнуто активность астроцитов морской свинки показано в таблице.

Инфекционный материал (нервная

0 ткань людей, животных, культура клеток и т.п.) гомогенизируют, добавляют физраствор, центрифугируют при 6000 об/мин 15 мин и удаляют осадок. Надосадок обрабатывают в водяной

5 бане при ЮО°С в течение 15 мин.

В 45 плоскодонных лунок пластиковой панели вносят взвесь астроцитов в объеме 0,1 мл ростовой среды, содержащей Л 10 клеток, и инкубируют

с

0 в термостатах при +3/ С с 5% содер- жанием C(V .

(контроль митогена) вносят по 0,05 мл среды культивирования и 0,1 мл Кон-А в дозе 20-25 мкг/мл. В оставшиеся

15 лунок (контроль опыта) вносят

только по 0,05 мл среды культивирования без митогена.

Культуры помещают в термостат и инкубируют при +37°С с 5% содержанием С(2На вторые сутки в каждую лунку опыта и контроля вносят 5 мкКи Н-тимидина в 0,05 мл среды культивирования.

Обнаружение возбудителя проводят на третьи сутки, испотьзуя жидкостный сцинтилляционный спектрометр, определяют пролифератнвную активность астроцитов по включению Ч-тнмидина

в клеточную ДНК, учитывают количество импульсов в 1 мин в опытных и контрольных культурах. Присутствие возбудителя устанавливают по потере инфицированными астроцитами способности отвечать пролиферацией на дей-| ствие мнтогена.

Пример 1. Обнаружение возбудителя амиотрофического лейкоспонгио- за (АЛ) в ткани ЦНС больного Д.

Из мозга (кора больших полушарий) через 3 ч после смерти выделяют кусочек ткани (0,3 г), помещают в ступку, гомогенизируют, добавляют 2,7 мл физраствора, переносят суспензию в пробирку и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин. Собирают надосадок и прогревают при 100°С 15 мин в водяной бане.

В первые 15 лунок пластиковой панели, содержащей культуру астроцитов, вносят 0,05 мл обработанного, как указано выше, надосадка суспензии мозга больного Л. и сразу же в эти лунки добавляют 0,1 мл Кон-А (в дозе 25 мкг/мл).

Во вторые 15 лунок пластиковой панели с культурой астроцитов вносят 0,05 мл среды RPMI-1640 и добавляют 0,1 мл Кон-А (в дозе 25 мкг/мл).

В контрольные 15 лунок пластиковой панели с культурой астроцитов вносят только 0,05 мл среды RPMI-1640 без митогена.

Пластиковые панели помещают в термостат и инкубируют при +3 С с 5% содержанием COg.

На вторые сутки во все лунки с аст роцитами в опыте и контроле вносят 5 мкКи Н-тимидина в -,М5 мл среды RPMI-1640.

На третьи сутки пипеткой удаляют культуральную жидкость, добавляют в каждую лунку 0,2 мл физраствора, клет ки суспензируют и переносят на целлюлозные фильтры с диаметром пор 0,85 мкм. Обрабатывают фильтры 5%-ным раствором треххлоруксусной кислоты, промывают 96%-ным этиловым спиртом, высушивают и помещают во флаконы с толуоловым сцинтиллятором. Пролифера- тивную активность оценивают по включению Н-тимидина в клеточную ДНК. Уровень включения Н-тимидина в пер- вых (опытных) 15 лунках с внесенным вируссодержащим материалом и митоге- ном - 5380+240 имп/мин, во вторых (контроль митогена) 15 лунках, содержащих астроциты и митоген без вируса, 13088t982 имп/мин и в последних (конт роль опыта) 15 лунках, содержащих только культивируемые клетки, 5260i i590 имп/мин. Разница между средним

числом импульсов с учетом средней ошибки в опыте (первые 15 лунок) и контроле опыта статистически незначима, а разница между средним числом импульсов в стимулированных митогеном астроцитах (контроль митогена - вторые 15 лунок) и контролем опыта статистически значима, т.е. зараженные астроциты не отвечают пролиферацией на внесенный митоген.

Таким образом в ткани ЦНС больного Д. содержится возбудитель АЛ. Посмертная верификация заболевания - амнотрофической лейкоспонгиоз.

Пример 2. Обнаружение возбудителя АЛ в ткани ЦНС больного Л.

Проведено взятие ткани объемом 0,5 см3 из области центральной извилины коры больших полушарий головного мозга. Обработку вируссодержащего материала, последующее заражение клеток, внесение митогена Кон-А, (концентрация 20 мкг/мл) и подсчет проли- феративной активности проводят, как описано в примере 1. В зараженных культурах стимулирующего действия Кон-А на астроциты не отмечено. Уровень включения Н-тимидина в клеточную ДНК, имп/мин: 61501955 (опыт); 128501354 (контроль митогена); 589О±340 (контроль опыта).

Таким образом; внесение суспензии ткани мозга больного Л. в культуру привело к потере астроцитами способности отвечать пролиферацией на митоген. В ЦНС больного Л. находится возбудитель АЛ.

П р и м е р 3. Определение возбудителя АЛ в ткани ЦНС морской свинки с экспериментально воспроизведенным заболеванием.

Морской свинке инокулируют интра- церебрально 0,1 мл 10%-ной суспензии мозга больного Д., умершего от АЛ. Через 1,5 мес после заражения у него появляются клинические признаки заболевания, проявляющиеся в выпадении шерсти, атрофии мышц, развитии парезов и параличей конечностей и туловища . В терминальной стадии заболевания у животного под эфирным наркозом берут мозг для вирусологических исследований. Обработку и внесение вируссодержащего материала в культуру астроцитов морской свинки проводят как описано в примере 1 . Через 3 дня определяют пролиферативную активность астроцитов по уровню включения 3Н-тимидина в ДНК. В зараженных культурах стимулирующего действия митогена на астроциты не отмечено. Уровень включения Н-тимидина в клеточную ДНК, имп/мин: 4980+350 (опыт), 120501:900 (контроль митогена); 5420+570 (контроль опыта).

Таким образом, ь ткани ЦНС исследованной морской свинки находится возбудитель АЛ.

П р и м е р 4. Определение перси- стенции возбудителя АЛ в монослой- ных культурах клеток, полученных из мозга больного Д., умершего от АЛ.

Сливают культуральную жидкость, механически отделяют клетки (около 1000 клеток), добавляют 5 мл физраствора и переносят в пробирку. Дают клеткам 15-20 мин отстояться, сливают физраствор, 3-кратно замораживают и размораживают, гомогенизируют и обрабатывают, как описано в примере 1 . После этого вируссодержащий материал вносят в культуру астроцитов морской свинки. Через 3 дня исследуют уровень включения 3Н-тимидина в клеточную ДНК. В заряженных культурах стимулирующего действия Кон-А в дозе 25 мкг/мл на астроциты не. отмечено. Уровень включения н-тимидчна в клеточную ДНК составляют, имп/мин: 4778 ±294 (опыт); 14001±200 (контроль митогена); 4960+310 имп/мин (контроль

опыта).

Таким образом, в монослойной культуре клеток, полученной от больного Д., персистирует возбудитель АЛ.

П р и м е р 5. Определение влияния очищенных препаратов возбудителя АЛ на астроциты.

Культуральную жидкость, полученную из монослойной культуры больного Д., (титр возбудителя АЛ в культуральной жидкости 5, 1 1р, ИД 50/мл), обрабатывают как в примере 1, затем концентрируют 8 раз сухим полиэтилен- гликолем и вносят по 0,1 мл в лунки пластиковой панели с культурой астро- цитов, учитывают так, как описано ранее. В зараженных клетках стимуляции пролиферации Кон-А в дозе 25 мкг/мл не отмечено. Уровень включения Н-тимидина в клеточную ДНК, имп/мин: 6200+356 (опыт); 13240+450 (контроль митогена); (контроль опыта).

Таким образом, внесение очищенных препаратов возбудителя АЛ в культуру

,

Q

5

0 5 0

5

о

$ „, 5

привело к потере астроцитами способности отвечать пролиферацией на мито- ген.

11 р и м е р 6. Вольной П. Патолого- анатомический диагноз - болезнь 1 1иль- дера.

Вирусологическое исследование ткани ЦНС проводят, как описано в примере 1 .

Как в первых 15 лунках с внесенной мозговой суспензией больного ПВ, так и во вторых 15 лунках, не содержащих какого-либо дополнительного материала под действием Кон-А в дозе 25 мкг/мл, отмечается увеличение пролиферативной активности астроцитов. Уровень включения Н-тимидина в клеточную ДНК, имп/мин: 12384+405 (опыт);13233±370 (контроль митогена); 5ЮО±ЗЮ (контроль опыта).

Таким образом в ЦНС больного ПВ возбудитель АЛ отсутствует.

Пример. Больной П. Патоло- гоанатомический диагноз - амиотрофи- ческий боковой склероз .

Вирусологическое исследование ткани проводят, как описано в примере 1.

Как в первых 15 лунках с внесенной мозговой суспензией, так и во вторых 15 лунках, не содержащих какого-либо дополнительного материала под дейст- зием Кон-А в дозе 25 мкг/мл, отмечено увеличение пролиферативной активности астроцитов. Уровень включения

Н-тимидина в клеточную ДНК имп/мин: 12820±290 (опыт); 13115+570 (контроль митогена); 5490+520 (контроль опыта).

Таким образом в ЦНС больного П. неклассический вирус АЛ отсутствует.

Формула изобретения

Способ обнаружения неклассического вируса, включающий отбор пробы вируссодержащего материала, освобождение его от классических вирусов, внесение его в культуру клеток с последующей оценкой наличия вируса, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, в качестве культуры используют астроциты морской свинки, в которую вносят кокко- навалин А в концентрации 20-25 мкг/мл и 3Н-тимидин, а оценку проводят по включению 3Н-тимидина в клеточную ДНК и при отсутствии пролиферации судят о наличии вируса.

Астроциты, обработанные Кон-А, имп/мин Астроциты без Кон-А, имп/мин Индекс стимуляции пролиферации t, P

10440 880 13088+982 8050+105

1,5

,29

,,)1

2,0

t-5,5

РСО,001

5284+310 2,5

t-7,58 ,001

1,5 ,45

Р),001

0,9

,79

РХ),05

0

1,5 ,45

Р),001

0,9

,79

РХ),05