СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ, РОСТОВОЙ ФАКТОР БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ И ИНГИБИТОР ПРОЛИФЕРАЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ Российский патент 2006 года по МПК A61K35/48 A61K35/54 A61K35/32 A61K38/02 

Изобретения относятся к области медицины и могут быть использованы в терапии различных заболеваний, сопровождающихся развитием фиброза внутренних органов, например фиброзные изменения костного мозга, цирроз печени, пневмофиброз, кардиосклероз, посттравматические рубцы и т.д.

На сегодняшний день во всем мире интенсивно проводятся исследования, связанные с получением средств, ингибирующих пролиферацию фибробластных клеток.

Известен способ получения ингибитора пролиферации опухолевых клеток (RU 2034564, А 61 К 38/00 10.05.1995). Способ предусматривает смешивание низкомолекулярного конденсационного полимера альфа-гидроксикислоты, олигопептида, содержащего, по меньшей мере, один остаток проглутаминовой кислоты, стабилизатора, включающего сахарид или сахароспирт и соли металла альфа-гидропропионовой кислоты, в качестве катализатора в определенном соотношении.

Известен ингибитор пролиферации злокачественных опухолевых клеток у человека, включающий 2-гидрокси-1(Р-гидроксифенил)-5-метилгексан-3-он (JP №2-247121 (заявка N 247121/1995 ), а также ингибитор, включающий моноглицерид (JP N 2-247125 (заявка № 247125/1995), и ингибитор пролиферации злокачественных опухолевых клеток у человека, включающий 2-гептадеканол, (JP №2-247120 (заявка № 247120/1995 ).

К недостаткам известных средств относится то, что они обладают побочными действиями, вызываемыми этими средствами, что в значительной степени снижает эффект ингибиции.

Известно также, что антифибротическим воздействием обладает селениум, а также ингибиторы диацетилазы гистонов клеток (фенилбутират, трихостатин А, вальпроевая кислота), редуктазы 3-гидро-3-метилглютарил коэнзима А (правастатин), рецептора ALK5 серин/тирозин киназы, простагландин Е2, интерферон-альфа. Влияние этих веществ является опосредованным и связано с ингибицией экспрессии ряда известных ростовых факторов, стимулирующих развитие фиброза. В первую очередь к ним относятся трансформирующий ростовой фактор и тумор-некротизирующий фактор-альфа.

Вещества, замедляющие образование фиброзной ткани, могут содержаться в экстрактах некоторых растений, а также в лишенных хлорофилла (зеленого пигмента) организмах (Boschniakia rossica), которые поселяются на корнях и питаются за счет растения (китайская медицина). (1. Yu Y., Ohmori К., Chen Y., Sato C. et al. Effects of pravastatin on progression of glucose intolerance and cardiovascular remodeling in a type II diabetes model. - J.Am Coil Cardiol. 2004 Aug 18; 44(4): 904-13, 2. Yih Lin Chung, Ae-June Wang, Lin-Fen Yao Antitumor histone deacetylase inhibitors suppress cutaneous radiation syndrome: implications for increasing therapeutic gain in cancer radiotherapy. Mol Cancer Ther, 2005; 3: 317-325, 3. Wu CS, Piao XX, Piao DM, Jin YR, Li CH. Treatment of pig serum-induced liver fibrosis with Boschniakia rossica. Oxymatrine and interferon-alpha. World J.Gastroenterol. 2005, Jan 7; 11(1): 122-6., 4. Hui AY, Dannenberg AJ, Sung JJ, Subbaramaiah K. et al. Prostaglandin E2 inhibits transforming growth factor beta 1-mediated induction of collagen alpha 1(1) in hepatic stellate cells. J.Hepatol. 2004, Aug; 41(2): 251-258, 5 He YT, Liu DW, Ding LY, Li Q, Xiao YH. Therapeutic effects and molecular mechanisms of anti-fibrosis herbs and selenium on rats with hepatic fibrosis. World J.Gastroenterol. 2004 Mar 1; 10(5): 703-706., 6. de Gouville AC, Boullay V, Krysa G, Pilot J. et al.Inhibition of TGF-beta signaling by an ALK5 inhibitor protector rats from dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis. Br.J.Pharmacol.2005 Feb 21.)

К недостаткам известных ингибиторов можно отнести то, что они не обладают прямым антифибротическим воздействием.

Задача изобретения заключается в создании нового способа получения ростового фактора белковой природы и применении его в качестве нового ингибитора пролиферации фибробластов, обладающего прямым антифибротическим воздействием на фибробласты и не оказывающего воздействия на пролиферацию нормальных клеток.

Поставленная задача решена следующим образом. Способ получения ростового фактора белковой природы включает получение кондиционированной среды, культивирование фрагментов и отличается тем, что для получения кондиционированной среды используют фрагменты эмбриональной костной ткани человека - эмбрионов человека 10-12 недель гестации, культивирование костных фрагментов проводят в среде RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки при температуре 37°С, 100% влажности воздуха и 5% содержании CO₂ в атмосфере в течение 8-10 недель, при этом еженедельно производят полную замену среды, затем выделяют белковую фракцию, обладающую фибробласт-, фиброз-ингибирующей активностью, при помощи методов очистки белка, в том числе, обменной хроматографии, гель-фильтрации, центрифугированием на мембране с диаметром пор 10-100 килодальтон и получают ростовой фактор белковой природы, представляющий собой очищенный белок, характеризующийся молекулярным весом около 100 KD, растворимый в воде, термически стабильный, имеющий фибробласт-ингибирующую активность, степень выраженности которой колеблется от 40% до 0%, и проявляющий ингибирующий эффект при росте линии в культуральной среде, содержащей 30% кондиционированной эмбриональной костной ткани.

Ростовой фактор белковой природы, представляет собой очищенный специфический белок, который получен или выделен в среде кондиционированной эмбриональной костной тканью, и характеризуется молекулярным весом около 100 KD, растворимый в воде, термически стабильный, имеет фибробласт-ингибирующую активность, степень выраженности которой колеблется от 40% до 0%, и проявляет ингибирующий эффект при росте линии в культуральной среде, содержащей 30% кондиционированной эмбриональной костной ткани.

Применение ростового фактора белковой природы, полученного по пункту 1, в качестве ингибитора пролиферации фибробластов.

Изобретение поясняется таблицами, приведенными на фиг.1 - 7.

Для получения кондиционированной среды (КС) были использованы фрагменты костной ткани эмбрионов человека 10-12 недель гестации. Культивирование костных фрагментов объемом 1-2 см² проводили в пластиковых флаконах в среде RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, при температуре 37°С, 100% влажности воздуха и 5% содержании CO₂ в атмосфере в течение 8-10 недель. Еженедельно производили полную замену среды. Выделение ингибирующего рост фибробластов фактора выполняли из полученной в результате культивирования среды (кондиционированной среды).

Для оценки ингибирующей активности применяли линию В270 эмбриональных фибробластов кожи, которую культивировали в течение 4-5 дней в присутствии различных концентраций кондиционированной среды. Пролиферативную способность клеток В270 линии фибробластов оценивали по включению Н³-тимидина, добавленного за 18 часов до окончания культивирования.

Дополнительным способом выявления ингибирующей активности фибробластов было определение количества колониеобразующих единиц фибробластов (КОЭ-Ф) линии фибробластов 3Т3, помещенных в культуральную среду альфа-МЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки и различные концентрации кондиционированной среды - 1%, 10% и 20%.

Выделение белковой фракции, содержащей ФИА, осуществлялось при помощи обменной хроматографии, гель-фильтрации, центрифугированием на мембране с диаметром пор 10-100 килодальтон.

Физико-химические свойства белковой фракции, содержащей ФИА, определяли путем экспозиции КС при температуре +4°С, +37°С, +56°С, +72°С, +95°С в течение 60 минут. Выявление изоэлектрической точки осуществляли с помощью DEAE Sepharose Fast Flow exchanger.

КС подвергалась исследованию для определения оптимального уровня рН. После соответствующего воздействия образцы КС были тестированы на наличие ФИА клеточной линии В270.

Длительное культивирование фрагментов эмбриональной костной ткани приводило к образованию монослоя из фибробластных клеток (ФК) на дне флакона. Эти клетки были трипсинизированы, ресуспензировались, помещены в 75 см² флаконы и инкубированы в течение 7-10 дней при температуре 37°С, 100% влажности воздуха и 5% содержании CO₂ в атмосфере. Далее образовавшийся монослой ФК трипсинизировали, ресуспензировали повторно и подвергали программному замораживанию с последующим хранением при температуре -180°С.

Фибробласты были оценены морфологически, гистохимически окрашены на присутствие щелочной фосфатазы и липидов. Для иммунофенотипирования использовали моноклональные антитела CD34 (FITC), CD34 (РЕ), CD11b (РЕ), CD14 (FITC), CD19 (FITC), CD38 (РЕ), CD33 (РЕ), CD31 (FITC), CD71 (FITC), HLA-DR (РЕ). Иммунофенотипирование выполняли методом иммунофлюорисценции с помощью FACS.

Наличие в КС колониеингибирующей (колониестимулирующей) активности по отношению к клеткам - предшественницам гемопоэза определяли двумя способами:

- по росту колоний в краткосрочной полужидкой культуре - метилцелюлозе, содержащей рекомбининантные ростовые факторы - фактор стволовых клеток (strem cell factor-SCF), грануломоноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерлейкин-3 (IL-3), эритропоэтин (Еро) (КС добавляли в концентрации 2,5%, 5% и 10%;

- по оценке пролиферативной активности клеток линии TF-1, рост которой является зависимым от гемопоэтических ростовых (КС добавляли в концентрации - 1%, 3%, 10% и 30%).

В результате исследования были получены следующие данные:

- различные образцы КС имеют фибробласт-ингибирующую активность, степень выраженности которой колеблется от 40% до 0% при использовании вышеперечисленных тест-систем. КС вызывала подавление роста КОЕ-Ф при добавлении в концентрации 20% (фиг.1, 2).

- КС обладает стимулирующим пролиферацию клеток линии TF-1 воздействием при добавлении в концентрации от 5% до 20%, ингибирующий эффект проявляется при росте линии в культуральной среде, содержащей 30% КС (фиг.3).

- физико-химические характеристики: экспозиция КС в течение 60 минут в пределах от 4°С до 56°С не вызывала изменения ингибирующей активности в отношении роста фибробластов линий В270 и 3Т3, в то время как превышение температуры выше 72°С снижало способность к подавлению пролиферации на 70%, выше 95°С - 100%. (фиг.4).

- содержание фибробласт-ингибирующей активности после концентрации КС с применением различных пор выявило, что предполагаемый молекулярный вес вещества колеблется около 100 KD (фиг.5, 6).

Таким образом, установлено, что эмбриональная костная ткань способна к синтезу гуморального фактора, обладающего фибробласт-, фиброз-ингибирующей активностью.

ПРИМЕР 1

Фетальную костную ткань получали в стерильных условиях из эмбрионов человека 10-12 недель гестации. Фрагменты костной ткани размером 1-2 см³ помещали во флаконы 75 см² (фирма «Falcon»), в которые добавляли 10,0 мл культуральной среды RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (фирма «Gibco»), пенициллин 100,0 ЕД/мл (фирма «Gibco»), стрептомицин 0,1 мг/мл (фирма «Gibco»), 1% L-глютамин. Культивирование проводили в инкубаторе (фирма «Jouan») при температуре 37°С, 100% влажности воздуха и 5% содержании CO₂ в атмосфере. Еженедельно проводили полную замену культуральной среды, при этом из флаконов извлекали 10,0 мл культуральной среды, кондиционированной костной тканью, которую замораживали и хранили при -20°C до момента исследования. Общая длительность культивирования фрагментов эмбриональной костной ткани составила 8-10 недель.

Оценка фибробласт-ингибирующей активности.

Клетки линии В270 эмбриональных фибробластов кожи помещали в 96-луночные планшеты из расчета 250 или 500 клеток на одну лунку, В каждую лунку добавляли среду RPMI, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллин 100,0 ЕД/мл (фирма «Gibco»), стрептомицин 0,1 мг/мл (фирма «Gibco»), 1% L-глютамин и различные концентрации кондиционированной среды - 0%, 1%, 10% и 30%. Финальный объем культуральной среды был равен 200 мкл. Клеточную культуру помещали в инкубатор (фирма «Jouan») при температуре 37°С, 100% влажности воздуха и 5% содержании CO₂ в атмосфере. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку добавляли Н3-тимидин (0,25 микрокюри/лунку). На 4-5 дни производили оценку пролиферативной активности клеток по включению радиоактивной метки. Для этого монослой фибробластов подвергали трипсинизации, клетки собирали и помещали в счетчик. Данные оценивали в логарифмической зависимости по количеству сцинтилляций в минуту.

Идентификация молекулярного веса белка.

Ион-обменная хромотография. Кондиционированная среда пропущена через Mono Q колонки (10×1 см) или DEAE-Superose колонки (фирма «Pharmacia»). Очистку проводили при комнатной температуре (0,02 М HEPES буфер, рН 7,4+1 М NaCl, или PBS, рН 7,4+1 М NaCl соответственно) со скоростью 0,2 мл/мин. Фракции по 1-2 мл были собраны и исследованы для определения фибробласт-ингибирующей активности. Фракции, полученные на пике концентрации, центрифугировали и использовали для гель-фильтрации.

Гель-фильтрацию выполняли с использованием HiLoad G75 - Superdex колонка (фирма «Pharmacia», 330 мл, 26×62 см) для выделения белков с мол. весом 3-70 килодальтон.

Blue Sepharose Fast-Flow (6ff) (фирма «Pharmacia», 5х46 см) применяли для элиминации альбумина из кондиционированной среды.

Определение физиологических характеристик белка.

Температурная чувствительность. Образцы кондиционированной среды экпозировали при температуре +4°С, +37°С, +56°С, +72°С и +95°С в течение 60 мин с последующей оценкой фибробласт-ингибуруюшей активности в культуральной тест-системе.

Определение изоэлектрической точки. Для этого использовали DEAE Sepharose Fast Flow обменную колонку, которую 3-кратно эквилибрировали 0,2 М HEPES буффером (рН 5,0-9,0) и 2-кратно 0,02 М HEPES буффером (рН 5,0-9,0). Образцы кондиционированной среды добавляли в каждую трубку и содержали при температуре +37°С в течение 30 мин. После этого образцы центрифугировали и диализировали при рН 7,4 против РВС при температуре +4°С в течение 24 часов.

Влияние кондиционированной среды на клетки-предшественники гемопоэза.

Колониеобразование. Кондиционированную фетальной костной тканью среду добавляли в концентрации 2,5%, 5% и 10% в краткосрочную полужидкую среду - метилцеллюлозу, содержащую ростовые факторы - фактор стволовых клеток, интерлейкин-3, эритропоэтин, ± грануло-моноцитарный колониестимулирующий фактор. Клеточную культуру помещали в инкубатор (фирма «Jouan») при температуре 37°С, 100% влажности воздуха и 5% содержании CO₂ в атмосфере. Подсчет колоний осуществляли под микроскопом на 14 день культивирования.

Оценка пролиферативной активности зависящей от ростовых факторов клеточной линии TF-1. Клетки линии TF-1 культивировали в присутствии 1%, 3%, 10% и 30% содержания кондиционированной фетальной костной тканью среды. Клеточную культуру помещали в инкубатор (фирма «Jouan») при температуре 37°С, 100% влажности воздуха и 5% содержании CO₂ в атмосфере. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку добавляли Н3-тимидин (0,25 микрокюри/лунку). На 4-5 дни производили оценку пролиферативной активности клеток по включению радиоактивной метки. Для этого клетки собирали и помещали в счетчик. Данные оценивали в логарифмической зависимости по количеству сцинтилляций в минуту.

ПРИМЕР 2

Фетальную костную ткань получали в стерильных условиях из эмбрионов человека 10-12 недель гестации. Фрагменты костной ткани размером 1-2 см³ помещали во флаконы 75 см² (фирма «Falcon»), в которые добавляли 10,0 мл культуральной среды RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (фирма «Gibco»), пенициллин 100,0 ЕД/мл (фирма «Gibco»), стрептомицин 0,1 мг/мл (фирма «Gibco»), 1% L-глютамин. Культивирование проводили в инкубаторе (фирма «Jouan») при температуре 37°С, 100% влажности воздуха и 5% содержании CO₂ в атмосфере. Еженедельно проводили полную замену культуральной среды, при этом из флаконов извлекали 10,0 мл культуральной среды, кондиционированной костной тканью, которую замораживали и хранили при -20°C до момента исследования. Общая длительность культивирования фрагментов эмбриональной костной ткани составила 8-10 недель.

Оценка фибробласт-ингибирующей активности.

Клетки линии фибробластов 3Т3 культивировали в 96-луночных планшетах из расчета 300 клеток на одну лунку. В каждую лунку помещали 0,5 мл культуральной среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллин 100,0 ЕД/мл (фирма «Gibco»), стрептомицин 0,1 мг/мл (фирма «Gibco»), 1% L-глютамин и различные концентрации кондиционированной среды - 0%, 10%, 20%. Клеточную культуру помещали в инкубатор (фирма «Jouan») при температуре 37°С, 100% влажности воздуха и 5% содержании CO₂ в атмосфере. На 3 день культивирования под микроскопом (увеличение × 20) выполняли подсчет колониеобразующих колоний фибробластов.

Идентификация молекулярного веса белка.

Ион-обменная хромотография. Кондиционированная среда пропущена через Mono Q колонки (10×1 см) или DEAE-Superose колонки (фирма «Pharmacia»). Очистку проводили при комнатной температуре (0,02 М HEPES буфер, рН 7,4+1 М NaCl, или PBS, рН 7,4+1 М NaCl соответственно) со скоростью 0,2 мл/мин. Фракции по 1-2 мл были собраны и исследованы для определения фибробласт-ингибирующей активности. Фракции, полученные на пике концентрации, центрифугировали и использовали для гель-фильтрации.

Гель-фильтрацию выполняли с использованием HiLoad G75 - Superdex колонка (фирма «Pharmacia», 330 мл, 26×62 см) для выделения белков с мол. весом 3-70 килодальтон.

Blue Sepharose Fast-Flow (6ff) (фирма «Pharmacia», 5×46 см) применяли для элиминации альбумина из кондиционированной среды.

Концентрацию белков с различным мол.весом проводиди на мембранах с диаметром пор 10-100 килодальтон путем центрифугирования в течение 30 минут при 1800 оборотах/мин (центрифуга фирмы «Beckman»).

Фракции, полученные в результате разделения на мембранах с различным диаметром пор, тестировали для определения фибробласт-ингибирующей активности в тест-системе с использованием клеток линии В270 эмбриональных фибробластов кожи.

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована в терапии различных заболеваний, сопровождающихся развитием фиброза внутренних органов. Способ получения ростового фактора белковой природы включает получение кондиционированной среды, культивирование фрагментов, при этом для получения кондиционированной среды используют фрагменты эмбриональной костной ткани человека, культивирование костных фрагментов проводят в течение 8-10 недель, при этом еженедельно производят полную замену среды, затем выделяют белковую фракцию, обладающей фибробласт-, фиброз-ингибирующей активностью, с помощью обменной хроматографии, гель-фильтрации, центрифугирования на мембране с диаметром пор 10-100 килодальтон и получают ростовой фактор белковой природы, представляющий собой очищенный белок, характеризующийся молекулярным весом около 100 KD, растворимый в воде, термически стабильный, имеющий фибробласт-ингибирующую активность, степень выраженности которой колеблется от 40% до 0%, и проявляющий ингибирующий эффект при росте линии в культуральной среде, содержащей 30% кондиционированной эмбриональной костной ткани. Ростовой фактор белковой природы представляет собой очищенный специфический белок, полученный или выделенный в среде, кондиционированной эмбриональной костной тканью, характеризующийся молекулярным весом около 100 KD, растворимый в воде, термически стабильный, имеющий фибробласт-ингибирующую активность, степень выраженности которой колеблется от 40% до 0%, и проявляющий ингибирующий эффект при росте линии в культуральной среде, содержащей 30% кондиционированной эмбриональной костной ткани. Ростовой фактор белковой природы, полученный по вышеуказанному способу используется в качестве ингибитора пролиферации фибробластов. Группа изобретений обеспечивает создание нового способа получения ростового фактора белковой природы и применение его в качестве нового ингибитора пролиферации фибробластов, обладающего прямым антифибротическим воздействием на фибробласты и не оказывающего воздействия на пролиферацию нормальных клеток. 3 н.з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Способ получения ростового фактора белковой природы, включающий получение кондиционированной среды, культивирование фрагментов, отличающийся тем, что для получения кондиционированной среды используют фрагменты эмбриональной костной ткани человека - эмбрионов человека 10-12 недель гестации, культивирование костных фрагментов проводят в среде RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки при температуре 37°С, 100%-ной влажности воздуха и 5%-ном содержании СО₂ в атмосфере в течение 8-10 недель, при этом еженедельно производят полную замену среды, затем выделяют белковую фракцию, обладающую фибробласт-, фиброзингибирующей активностью, посредством методов очистки белка, в том числе обменной хроматографии, гель-фильтрации, центрифугирования на мембране с диаметром пор 10-100 килодальтон и получают ростовой фактор белковой природы, представляющий собой очищенный белок, характеризующийся молекулярным весом около 100 KD, растворимый в воде, термически стабильный, имеющий фибробластингибирующую активность, степень выраженности которой колеблется от 40 до 0%, и проявляющий ингибирующий эффект при росте линии в культуральной среде, содержащей 30% кондиционированной эмбриональной костной ткани.2. Ростовой фактор белковой природы, представляющий собой очищенный белок, полученный или выделенный в среде кондиционированной эмбриональной костной тканью, характеризующийся молекулярным весом около 100 KD, растворимый в воде, термически стабильный, имеющий фибробластингибирующую активность, степень выраженности которой колеблется от 40 до 0%, и проявляющий ингибирующий эффект при росте линии в культуральной среде, содержащей 30% кондиционированной эмбриональной костной ткани.3. Применение ростового фактора белковой природы, полученного по п.1, в качестве ингибитора пролиферации фибробластов.