Способ определения коагуляционного потенциала лиофилизированной плазмы Российский патент 2025 года по МПК G01N33/86 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, в частности, к трансфузиологии и может быть использовано для определения коагуляционных свойств лиофилизированной плазмы (ЛП).

Свежезамороженная плазма (СЗП) является одним из самых часто используемых компонентов крови в клинической практике. Показанием для ее применения является коррекция коагуляционных нарушений при кровотечениях, ДВС-синдроме, передозировке антикоагулянтов, терапевтическом плазмаферезе, врожденных или приобретенных дефицитах факторов свертывания. Коагуляционный потенциал СЗП изучен достаточно хорошо и характеризуется балансом прокоагулянтов и антикоагулянтов. Для хранения и транспортировки СЗП требуется наличие морозильных камер, что может ограничивать её клиническое применение. ЛП лишена таких недостатков, может храниться при комнатной температуре и использоваться при оказании первичной медицинской помощи.

Оценка коагуляционного потенциала компонентов крови – корректоров гемостаза, таких как СЗП и ЛП осуществляется с помощью определения активности ф.VIII, которая должна быть не менее 70% в СЗП и 50% в ЛП, что регламентировано постановлением правительства Российской Федерации от 22 июня 2019 г. N 797 «Об утверждении правил заготовки, хранения, транспортировки и клинического использования донорской крови и ее компонентов и о признании утратившими силу некоторых актов правительства Российской Федерации».

Изготовление ЛП подразумевает сублимационное высушивание СЗП, что значительно меняет физико-химические свойства продукта, а также способно влиять на коагуляционные показатели и содержание факторов свёртывания. А.Л. Берковский и соавт. показали, что после сублимационной сушки концентрации FV, FVIII и фибриногена снижались в среднем на 38, 24 и 12% соответственно, а значения АЧТВ и ПВ после лиофилизации удлинялись на 16 и 11%. При этом значение рН плазмы увеличивалось от 7,35 до 8,2 [Берковский А.Л., Сергеева Е.В., Суворов А.В., Гурвиц И.Д., Анисимова Е.В., Савченко В.Г. Получение лиофилизированной плазмы с сохраненной активностью факторов свертывания. Гематология и трансфузиология. 2016; 61(4): 204-208. DOI:10.18821/0234-5730-2016-61-4-204-208]. Изменение качеств ЛП возможно и при восстановлении её жидкого состояния. Воздействие этих неблагоприятных факторов может способствовать изменению характеристик ЛП, что требует контроля её коагуляционных свойств.

Наиболее распространенными тестами для определения коагуляционного потенциала крови и её компонентов является определение активированного частичного тромбинового времени (АЧТВ) и международного нормализованного отношения (MHO). Главным недостатком этих способов является оценка только начальной стадии процессов свёртывания крови (не более 5% продолжительности всего процесса коагуляции). Кроме того, изолированная оценка функциональной активности внешнего и внутреннего путей коагуляции посредством MHO и АЧТВ не соответствует современным представлениям о гемостазе, где оба механизма рассматриваются как единый процесс. Возможно исследование расширенной коагулограммы с определением параметров как свертывающей, так и противосвертывающей систем, однако это является весьма трудоемким и затратным процессом. Существует способ оценки показателей коагуляции плазмы крови по определению активности тромбина, времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину (RU2786591C2).

Важными недостатками вышеперечисленных методов является отсутствие возможности оценить скорость образования сгустка крови, его физические характеристики, способность к достижению устойчивого гемостаза [Синьков С.В., Заболотских И.Б. Диагностика и коррекция расстройств системы гемостаза. - М.: Практическая медицина, 2017, 336 с. ISBN 978-5-98811-457-4]. Кроме того, они не позволяют оценить сбалансированность системы гемостаза и ее функциональные возможности.

Интегральные тесты оценки гемостаза позволяют одномоментно оценить все звенья свертывающей системы крови. Данные методы отражают конечный этап каскада коагуляции - процесс превращения фибриногена в фибрин и образование фибринового сгустка, а не отдельные звенья свертывающей системы [Долгушина Н.В., Шпилюк М.А., Иванец Т.Ю., Безнощенко О.С., Пырегов А.В., Городнова Е.А., Кречетова Л.В. Роль и место интегральных методов в диагностике нарушений системы гемостаза у больных COVID-19. Лабораторная служба. 2022; 11(4): 7-15].

Наиболее подходящим для оценки коагуляционного потенциала плазмы является тест тромбодинамика (ТД). В основе метода ТД лежит принцип разделения в пространстве процесса активации и роста фибринового сгустка. Активация свертывания запускается от поверхности с иммобилизованным рекомбинантным тканевым фактором (ТФ), которая имитирует место повреждения стенки кровеносного сосуда [Fadeeva O.A., Panteleev M.A., Karamzin S.S., Balandina A.N., Smirnov I.V., Ataullakhanov F.I. Thromboplastin immobilized on polystyrene surface exhibits kinetic characteristics close to those for the native protein and activates in vitro blood coagulation similarly to thromboplastin on fibroblasts. Biochemistry (Mosc) 2010; 75: 734-43]. Далее сгусток распространяется в плазме уже без контакта с активирующей поверхностью.

Известно, что ТД успешно применяли для определения различий коагуляционного потенциала СЗП в зависимости от способа патогенинактивации [Рафиев, И. А. Оценка коагуляционного потенциала патогенинактивированной донорской плазмы методом тромбодинамики / И. А. Рафиев, А. А. Купряшов, Н. Н. Самсонова // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Сердечно-сосудистые заболевания. - 2015. - Т. 16, № S6. - С. 206]. Показано, что ЛП значимо отличается от СЗП по методу получения, физико-химическим показателям и условиям хранения. Несмотря на значимые преимущества ТД при оценке коагуляционного потенциала плазмы, метод не применялся для оценки характеристик ЛП.

Заявляемое изобретение разработано отделом организации и сопровождения научных исследований совместно с лабораторией препаратов крови ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Техническим результатом изобретения является определение коагуляционного потенциала лиофилизированной плазмы in vitro.

Технический результат достигается тем, что после восстановления жидкого состояния плазмы in vitro определяют показатели теста тромбодинамика, а именно, время задержки начала образования сгустка, среднюю скорость роста сгустка, размер фибринового сгустка, плотность сгустка и время появления спонтанных сгустков, при нахождении которых в пределах референсных значений коагуляционный потенциал лиофилизированной плазмы считается не нарушенным.

Способ осуществляется следующим образом.

Регидратацию ЛП производят посредством введения в контейнер 250 мл стерильного растворителя (кристаллоидного раствора), покачивая контейнер с гемокомпонентом до его полного растворения (в течение 2-3 минут). Для оценки коагуляционного потенциала ЛП используется лабораторная диагностическая система «Регистратор тромбодинамики» (ТУ 9443-001-66307734-2011), регистрационное удостоверение на медицинское изделие от 25.02.2020 № ФСР 2012/13248. Образец регидратированной ЛП помещают в канал измерительной кюветы прибора, затем в кювету вводится активатор, содержащий тканевой фактор (ТФ). Свертывание ЛП начинается сразу после её контакта с ТФ. Возникновение и рост фибринового сгустка регистрируется посредством последовательной фотосъемки в тёмном поле в течение 30 мин. В процессе тестирования оцениваются следующие показатели: Tlag (лаг-тайм) - время задержки начала образования сгустка после контакта плазмы с активатором (норма 0,6-1,5 мин), V (скорость роста сгустка) - средняя скорость роста сгустка, рассчитанная на интервале 15-25 мин после начала роста (норма 20-29 мкм/мин), СS (размер фибринового сгустка) - размер сгустка через 30 мин после контакта ЛП с активатором (норма 800-1200 мкм), D (плотность сгустка) - оптический показатель плотности сгустка (норма 15000-32000 усл.ед.), показатель Тsр (время появления спонтанных сгустков) - время появления спонтанных сгустков не контактирующих с активатором (в норме не образуются). Коагуляционный потенциал ЛП считается не нарушенным, если показатели теста ТД находятся в пределах референсных диапазонов.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии, и может быть использовано для определения коагуляционного потенциала лиофилизированной плазмы. После восстановления жидкого состояния плазмы in vitro проводят тест тромбодинамики. Определяют показатели теста, а именно: время задержки начала образования сгустка, среднюю скорость роста сгустка, размер фибринового сгустка, плотность сгустка и время появления спонтанных сгустков, при нахождении которых в пределах референсных значений, определяют не нарушенный коагуляционный потенциал лиофилизированной плазмы. Способ обеспечивает возможность информативного определения коагуляционного потенциала лиофилизированной плазмы in vitro за счет определения после восстановления жидкого состояния плазмы in vitro показателей теста тромбодинамика: времени задержки начала образования сгустка, средней скорости роста сгустка, размера фибринового сгустка, плотности сгустка и времени появления спонтанных сгустков, что может быть использовано в отделениях трансфузиологии и банках крови.

Способ определения коагуляционного потенциала лиофилизированной плазмы, отличающийся тем, что после восстановления жидкого состояния плазмы in vitro проводят тест тромбодинамики, определяют показатели теста, а именно: время задержки начала образования сгустка, среднюю скорость роста сгустка, размер фибринового сгустка, плотность сгустка и время появления спонтанных сгустков, при нахождении которых в пределах референсных значений определяют не нарушенный коагуляционный потенциал лиофилизированной плазмы.