СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЯЖЕСТИ АНТИ-NMDA-РЕЦЕПТОРНОГО ЭНЦЕФАЛИТА С ВЫРАЖЕННОЙ ПСИХОПАТОЛОГИЧЕСКОЙ СИМПТОМАТИКОЙ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 G01N33/564 

Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии и неврологии, и может быть использовано для оценки тяжести энцефалита, вызываемого антителами к N-метил-D-аспартатным рецепторам (анти-NMDA-рецепторный энцефалит). Диагностика и определение прогноза течения данного вида энцефалита представляют значительные трудности. Вследствие преобладания в клинической картине болезни психопатологических расстройств, многим пациентам ошибочно выставляется диагноз генуинного психического заболевания. Изменения, выявляемые с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), энцефалографии (ЭЭГ), позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или компьютерной томографии (КТ) головного мозга носят неспецифический характер.

Анти-NMDA-рецепторный энцефалит является наиболее распространенным видом аутоиммунного энцефалита, поражающим, в первую очередь молодых людей (средний возраст 21 год), причем у 25% пациентов развивается стойкий неврологический дефицит, 4-25% случаев заканчиваются летальным исходом, у 12-25% пациентов наблюдается рецидив [Huang Q, 2020; Nosadini et al., 2021; Nguyen et al., 2023].

Считается, что основным патофизиологическом механизмом анти-NMDA-рецепторного энцефалита является появление аутоантител, которые связываясь с NMDA-рецепторами мозга, приводят к их обратимой интернализации с соответствующим уменьшением плотности глутаматных рецепторов и структурных белков синапсов [Dalmau et al., 2019]. Снижение активности NMDA-рецепторов вызывает развитие психопатологической симптоматики (бреда, галлюцинаций, кататонических расстройств и др.), сходных с наблюдающимися при шизофрении, шизоаффективном расстройстве и других психических заболеваниях, что значительно осложняет диагностику анти-NMDA-рецепторного энцефалита.

Из уровня техники известно, что в качестве биомаркера для диагностики NMDA-рецепторного аутоиммунного энцефалита рядом отечественных компаний используются исключительно антитела к NMDA-рецепторам в сыворотке крови (Компании Helix, Инвитро, Лаборатория диагностики аутоиммунных заболеваний, Центр молекулярной медицины МЗ РФ, Санкт-Петербург). Единственным биомаркером, широко используемым за рубежом в клинической практике при анти-NMDAR-энцефалите, также является выявление антител IgG против субъединицы NR1 NMDA-рецепторов в сыворотке крови и спинномозговой жидкости (СМЖ), что является обязательным для установления диагноза [Dalmau et al, 2019; Balu et al., 2019]. Данный способ является наиболее близким к заявляемому и выбран в качестве прототипа. Недостатком данного способа является сложность дальнейшего прогноза течения заболевания и оценки терапевтической эффективности.

Важно отметить, что уровень серопозитивности антител против NMDA-рецепторов (всех классов Ig, нацеленных на NR1, включая IgG) у здоровых людей может быть достаточно высоким [Hammer et al., 2014; Beattie et al., 2022], что также свидетельствует о низкой валидности использования этого показателя в качестве единственного биомаркера тяжести заболевания.

Можно предположить, что наряду с выработкой антител определяющим фактором развития заболевания является нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера.

Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) является ключевым белком, экспрессирующимся в глиальных клетках - астроцитах. Он укрепляет структуру цитоскелета глиальных клеток и поддерживает целостность гематоэнцефалического барьера [Abdelhak et al., 2022]. Основным преимуществом GFAP как биомаркера является его специфичность, так как в норме он обнаружен только в ЦНС [Graham et al., 2016], а его появление в крови отражает, в первую очередь, нарушение проницаемости ГЭБ [Abdelhak et al., 2022].

Нейронспецифическая енолаза (NSE) является гликолитическим ферментом, который в большом количестве экспрессируется в цитоплазме нейрональных клеток. В интактных нейронах NSE обычно не секретируется во внеклеточную жидкость. Таким образом, присутствие NSE в крови может отражать степень функционального повреждения нейронов [Chen et al., 2022; Gardner et al., 2023]. Определенным минусом и ограничением использования самого фермента в качестве биомаркера является отсутствие специфичности, так как фермент содержится в эритроцитах, что может давать ложноположительные результаты [Graham et al., 2016]. Авторы считают, что большей информативностью и специфичностью обладает не определение данного фермента, а уровня антител к нему.

Новым в предлагаемом способе является оценка тяжести заболевания с выраженной психопатологической симптоматикой на основании определения наряду с аутоантителами к NMDA-рецепторам антител к нейроспецифическому глиальному фибриллярному кислому белку (Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP) и нейронспецифической енолазе (Neuron-Specific Enolase, NSE) - маркерам повреждения глиальных клеток, нейронов головного мозга и нарушения функционального состояния гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) мозга. В изученной литературе аналогов предлагаемому изобретению не найдено.

Описан ряд случаев анти-NMDA-рецепторного энцефалита, когда повышение титра аутоантител к NMDA-рецепторам сопровождается повышением титра к GFAP [Zhang J. et al., 2022; Bai P. et al., 2022; Martinez-Hernandez E. et al., 2020; Flanagan EP. et al., 2017]. Однако, во всех этих наблюдениях выявленные нарушения рассматриваются как малоисследованное сочетание двух патологических состояний (анти-NMDA-рецепторного энцефалита и аутоиммунной астроцитопатии) без указаний на их взаимовлияние, в том числе в отношении тяжести клинических проявлений.

Также имеются публикации, указывающие на возможность сочетаний повышения титра антител к NMDA-рецепторам и концентрации NSE [Liu В. et al., 2018]. Однако в этих наблюдениях не рассматриваются клинические последствия такого сочетания, в том числе в отношении тяжести состояния пациентов.

Не найдено публикаций, в которых бы оценивался уровень антител одновременно к NMDA-рецепторам, GFAP и NSE, в том числе для оценки тяжести анти-NMDA-рецепторного энцефалита.

Раскрытие сущности изобретения

Проблема, на решение которой направлено заявленное изобретение, обусловлена недостатками существующего сегодня метода диагностики (прототипа), использующего в качестве инструмента только определение титра антител к NMDA-рецепторам. Считается, что в патогенезе заболевания основная роль принадлежит аутоантителам к NMDA-рецепторам [Zhang J, 2022; Bai Р, 2022]. При определении у пациентов с психопатологической симптоматикой титра антител к субъединице NR1 NMDA-рецептора 1:100 и выше диагностируют наличие аутоиммунного энцефалита. Однако в части случаев при относительно низких (но превышающих 1:100) титрах антител к NMDA-рецепторам тяжесть клинической симптоматики оказывается выше, чем при более высоких. Задачей изобретения является оценка тяжести анти-NMDA-рецепторного энцефалита. Поставленная задача решается путем выявления у пациентов комплекса антител к NMDA-рецепторам, GFAP и NSE в сыворотке крови. Эксперименты, проведенные авторами изобретения, показали, что увеличение уровня антител к GFAP и NSE у пациентов с подтвержденным анти-NMDA-рецепторным энцефалитом является биологическим маркером тяжести состояния. Таким образом, технический результат изобретения - повышение точности оценки тяжести заболевания. Изобретение может применяться при диагностическом обследовании пациентов с анти-NMDA-рецепторным энцефалитом и последующем мониторинге динамики состояния.

Сущность изобретения состоит в предлагаемом способе определения методом непрямого ИФА в сыворотке крови пациента наличия антител к субъединице NR1 NMDA-рецептора, GFAP и NSE, и при положительном тесте на антитела к NR1, титре антител к GFAP 1:100 и выше и титре антител к NSE 1:100 и выше состояние пациента оценивают как тяжелое.

Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть широко использован в медицине и здравоохранении для диагностики и оценки тяжести анти-NMDA-рецепторного энцефалита.

Осуществление изобретения

Анти-NMDA-рецепторный энцефалит - потенциально опасное для жизни аутоиммунное заболевание, наиболее частым и выраженным проявлением которого являются различные психические расстройства и расстройства поведения. Данный диагноз устанавливается в тех случаях, когда психопатологическая симптоматика сочетается с повышенными титрами антител к NR1 субъединице NMDA-рецепторов (1:100 и выше). Однако отсутствует выраженная корреляция между повышением титра антител к NMDA-рецепторам и тяжестью клинических проявлений данного заболевания. Для оценки тяжести клинического состояния пациентов с анти-NMDA-рецепторным энцефалитом, в клинической картине которого преобладает психопатологическая симптоматика, предлагается дополнительно определять титр антител к GFAP и NSE (как маркеров проницаемости гематоэнцефалического барьера). При одновременном наличии титра антител к NR1 субъединице NMDA-рецепторов 1:100 и выше, титре антител к GFAP 1:100 и выше и титре антител к NSE 1:100 и выше состояние оценивают, как тяжелое.

Для определения титра антител к субъединице NR1 NMDA-рецептора (Ed1, Ed2), GFAP и NSE применяется разработанный метод непрямого ИФА, где в качестве антигенов используются рекомбинантные белки (2 экстрацеллюлярных домена субъединицы NR1 NMDA-рецептора - Ed1 и Ed2), рекомбинантный белок GFAP, рекомбинантный белок NSE.

Метод ИФА для полуколичественного определения антител к NMDA-рецепторам в сыворотке крови подробно описан авторами [Павлова с соавт., 2022]. Также описано получение рекомбинантных белков GFAP [Chekhonin et al., 2007] и NSE [Pavlov et al., 2011].

У всех участников выполняется забор венозной крови с последующим выделением сыворотки крови. Все образцы должны храниться не более двух недель при температуре -40°С, с последующим хранением при температуре -80°С до проведения анализов.

На дно лунок 96-луночного планшета иммобилизуются рекомбинантные белки (2 экстрацеллюлярных домена субъединицы NR1 NMDA-рецептора - Ed1 и Ed2, GFAP, NSE) в течение 12 часов при +4С° (0,1 М NaHCO₃, рН 9.2). После чего их раствор удаляют, и планшет промывают промывочным буферным раствором (PBS, 0.05% Твин-20, рН 7.4). Здесь и далее промывку осуществляют на автоматическом вошере PW-40 (Bio-Rad). После промывки проводят блокирование неспецифического связывания инкубацией 3% БСА (бычий сывороточный альбумин) на PBS (1 час, КТ), промывают и вносят по 100 мкл образцов сывороток крови пациентов и здоровых индивидов без психических заболеваний (разведения 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:1600, 1:3200, PBS), инкубация продолжается 1 час при комнатной температуре (КТ) на шейкере-инкубаторе (500 об./мин). Затем планшет промывают промывочным буферным раствором и вносят вторичные антитела - антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с биотином (разведение 1:40000, согласно инструкции производителя - ThermoFisher) на 1 час при КТ (500 об./мин). После промывки вносят конъюгат стрептавидина с пероксидазой (разведение 1:10000, согласно инструкции производителя - ThermoFisher) на 30 мин при КТ (500 об./мин). Проявление ферментативной активности пероксидазы проводят с использованием раствора хромогенного субстрата ТМБ (Amresco) в течение 5-10 мин. Затем ферментативную реакцию останавливают внесением раствора 1М H₂SO₄. Считывание результатов проводят с помощью фотометра i-Mark (Bio-Rad Laboratories) при длине волны 450 нм.

При оценке результатов ИФА предлагается считать титром антител последнее разведение, при котором разница в поглощении при длине волны 450 нм между исследуемой сывороткой и сывороткой индивида без психических заболеваний (отрицательный контрольный образец) превышает 1,2 раза. Такое значение было определено экспериментальным путем при постановке ИФА сывороток крови пациентов с подтвержденным анти-NMDA-рецепторным энцефалитом и людей без психических заболеваний [Павлова с соавт., 2022]. При этом референсными значениями для титров антител к GFAP и NSE предлагается считать 1:50, что также определено экспериментальным методом при проведении ИФА сывороток крови людей без психических заболеваний. Таким образом, начиная с титра 1:100 при положительном тесте на антитела к NR1, титре антител к GFAP 1:100 и выше и титре антител к NSE 1:100 и выше у пациентов с подтвержденным анти-NMDA-рецепторным энцефалитом их состояние оценивается как тяжелое.

В качестве иллюстрации приводим следующий клинический пример.

Пациентка П., 56 лет. Состояние изменилось остро за 2 дня перед госпитализацией в психиатрический стационар. У больной наблюдалась выраженная психопатологическая симптоматика: отмечался период растерянности с острым чувственным бредом, достигающим на высоте развития уровня фантастическо-бредовой дереализации. В дальнейшем возникло психомоторное возбуждение, сменившееся кататоническим ступором. Имела место мышечная ригидность, негативизм, застывала в одной позе. В неврологическом статусе - без менингеальных знаков и очаговой симптоматики. Отмечалось повышение температуры тела до субфебрильных цифр. Титр антител к NR1 субъединице NMDA-рецептора составил 1:800; титр антител к GFAP 1:200, титр антител к NSE 1:400. С учетом клинических и иммунологических данных, состояние пациентки было расценено как органическое кататоническое расстройство, обусловленное анти-NMDA-рецепторным энцефалитом (код по МКБ-10 раздела V «Психические расстройства и расстройства поведения» - F06.1). Тяжесть клинических проявлений определялась наличием отчетливо выраженной кататонической симптоматики с повышением температуры, что обуславливало опасность развития угрожающего жизни состояния в виде фебрильной кататонии. С целью иммунокоррекции проведен плазмаферез - в общей сложности 3 операции с удалением 900 мл плазмы крови. Положительный эффект удалось достичь после проведения 3-й операции плазмафереза. Наблюдалось стойкое купирования кататонических расстройств (снижение по шкале Буша-Френсиса с 24 до 4 баллов, отсутствие кататонии). Одновременно с этим произошло улучшение соматического состояния с нормализацией температуры тела, уменьшением тахикардии (со 105 до 80 уд/мин), а также положительная динамика лабораторных показателей в виде снижения СОЭ (с 18 до 10 мм/час), активности ACT (с 42,1 до 30,8 Ед/л) в биохимическом анализе крови. Параллельно с улучшением психического и соматического состояния произошло снижение титра антител к NR1 субъединице NMDA-рецептора до 1:200, титра антител к GFAP до 1:50 и титра антител к NSE до 1:50.

Пациентка была выписана из психиатрического стационара для продолжения наблюдения и лечения в амбулаторных условиях.

Таким образом, при поступлении в психиатрический стационар клиническое состояние пациентки определялось как тяжелое, что подтверждалось клинико-психопатологическими проявлениями и лабораторными показателями, а также с помощью психиатрической шкалы Буша-Френсиса. После проведенной терапии указанные клинические показатели нормализовались, что позволило выписать пациентку из психиатрической больницы. При этом, титр антител к NR1 субъединице NMDA-рецептора составлял 1:200, что было ниже исходного (1:800), но выше верхней границы референсных значений. Титр антител к GFAP составлял 1:50, титр антител к NSE - 1:50, то есть в пределах референсных значений, что соотносилось с отсутствием необходимости стационарного лечения пациентки.

Литература

1. Павлова О.В., Мурашко А.А., Морозова А.Ю., Павлов К.А., Турина О.И., Шмуклер А.Б. Метод иммуноферментного анализа для количественного определения аутоантител к NMDA-рецепторам в сыворотке крови. Социальная и клиническая психиатрия, т. 32 №4, 2022, Москва.

2. Abdelhak A., Foschi М., Abu-Rumeileh S., Yue J.K., D'Anna L., Huss A., et al. (2022). Blood GFAP as an emerging biomarker in brain and spinal cord disorders. Nat. Rev. Neurol. 2022, 18 (3):158-172. 10.1038/s41582-021-00616-3.

3. Bacchi S., Franke K., Wewegama D., Needham E., Patel S., Menon D. Magnetic resonance imaging and positron emission tomography in anti-NMDA receptor encephalitis: A systematic review. J. Clin. Neurosci. 2018, 52:54-59. doi: 10.1016/j.jocn.2018.03.026.

4. Bai P., Liu В., Li M., Chun M., Ma X., Zhen J. Anti-NMDAR encephalitis with GFAPα IgG: a case report. Case Reports BMC Neurol. 2022, 22(1):424. doi: 10.1186/sl2883-022-02961-2.

5. Balu R., Mccracken L., Lancaster E., Graus F., Dalmau J., Titulaer M.J. A score that predicts 1-year functional status in patients with anti-NMDA receptor encephalitis. Neurology. 2019, 92:E244-E252. doi: 10.1212/WNL.0000000000006783.

6. Beattie M, Goodfellow J, Oto M, Krishnadas R. Anti-NMDAR encephalitis for psychiatrists: the essentials. В J Psych Bulletin. 2022, 46(4):235-241. doi:10.1192/bjb.2021.35.

7. Dalmau J., Armangué Т., Planagumà J., Radosevic M., Mannara F., Leypoldt F., Geis C., Lancaster E., Titulaer M.J., Rosenfeld M.R., et al. An update on anti-NMDA receptor encephalitis for neurologists and psychiatrists: Mechanisms and models. Lancet Neurol. 2019, 18:1045-1057. doi: 10.1016/S1474-4422(19)30244-3.

8. Chekhonin V.P., Pavlov K.A., Shkoporov A.N., Yefimov B.A., Gurina O.I., Dmitrieva T.B. Cloning and expression of rat GFAP cDNA in Escherichia coli. Bull Exp Biol Med. 2007, 143(1):68-71. doi: 10.1007/s10517-007-0019-9.

9. Chen W., Wang G., Yao C., Zhu Z., Chen R., Su W. et al. (2022). The ratio of serum neuron-specific enolase level to admission Glasgow coma scale score is associated with diffuse axonal injury in patients with moderate to severe traumatic brain injury. Front. Neurol. 2022, 13:887818. doi: 10.3389/fneur.2022.887818.

10. Flanagan EP, Hinson SR, Lennon VA, et al. Glial fbrillary acidic protein immunoglobulin G as biomarker of autoimmune astrocytopathy: Analysis of 102 patients. Ann Neurol. 2017, 81(2):298-330. doi: 10.1002/ana.24881.

11. Gardner R.C., Puccio A.M., Korley F.K., Wang K.K.W., Diaz-Arrastia R., Okonkwo D.O., et al. Effects of age and time since injury on traumatic brain injury blood biomarkers: a TRACK-TBI study. Brain Commun. 2023, 5:fcac316. doi: 10.1093/braincomms/fcac316.

12. Graham E.M., Burd I., Everett A.D., Northington F.J. Blood biomarkers for evaluation of perinatal encephalopathy. Front. Pharmacol. 2016, 7:196.10.3389/fphar.2016.00196.

13. Hammer С., Stepniak В., Schneider A., Papiol S., Tantra M., Begemann M. et al. Neuropsychiatric disease relevance of circulating anti-NMDA receptor autoantibodies depends on blood-brain barrier integrity. Mol Psychiatry 2014,19:1143-9. doi: 10.1038/mp.2013.110.

14. Huang Q., Xie Y., Hu Z., Tang X. Anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis: A review of pathogenic mechanisms, treatment, prognosis. Brain Res. 2020, 1727:146549. doi: 10.1016/j.brainres.2019.146549.

15. Liu В., Xie Z., Liu G., Gu Y., Pan S., Wang H. Elevated neuron-specific enolase and S100 calcium-binding protein В concentrations in cerebrospinal fluid of patients with anti-N-methyl-d-aspartate receptor encephalitis. Clin Chim Acta. 2018, 480:79-83. doi: 10.1016/j.cca.2018.01.016.

16. Martinez-Hernandez E., Guasp M., Garcia-Serra A., et al. Clinical significance of anti-NMDAR concurrent with glial or neuronal surface antibodies. Neurology. 2020, 94(22):e2302-2310. doi: 10.1212/WNL.0000000000009239.

17. Nguyen L., Wang C. Anti-NMDA Receptor Autoimmune Encephalitis: Diagnosis and Management Strategies. Int J Gen Med. 2023, 16:7-21. doi: 10.2147/IJGM.S397429.

18. Nosadini M., Eyre M., Molteni E., Thomas Т., Irani S.R., Dalmau J., Dale R.C., Lim M., Anlar В., Armangue Т., et al. Use and Safety of Immunotherapeutic Management of N-Methyl-d-Aspartate Receptor Antibody Encephalitis: A Meta-analysis. JAMA Neurol. 2021, 1-12. doi: 10.1001/jamaneurol.2021.3188.

19. Pavlov K.A., Gurina O.I., Antonova O.M., Semenova A.V., Chekhonin V.P. Cloning and expression of human neuron-specific enolase cDNA in Escherichia coli. Bull Exp Biol Med. 2011, 152(2):206-9. doi: 10.1007/s10517-011-1489-3.

20. Zhang J., Gan J., Wang J. A case of GFAP-IgG positivity followed by anti-NMDAR encephalitis. BMC Pediatrics. 2022, 22:600 doi: 10.1186/sl2887-022-03650-2.

Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии и неврологии, и может быть использовано для оценки тяжести анти-N-метил-D-аспартат (NMDA) рецепторного энцефалита с выраженной психопатологической симптоматикой. У пациента выполняют забор крови, в сыворотке которой определяют аутоантитела к субъединице NR1 NMDA рецептора. В сыворотке крови пациента определяют антитела к нейроспецифическому глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) и нейронспецифической енолазе (NSE). При положительном тесте на антитела к NR1, титре антител к GFAP 1:100 и выше и титре антител к NSE 1:100 и выше состояние пациента оценивают как тяжелое. Способ обеспечивает возможность повышения точности оценки тяжести анти-NMDA-рецепторного энцефалита у пациентов с преобладанием психопатологической симптоматики за счет выявления у пациентов комплекса антител к NMDA-рецепторам, GFAP и NSE в сыворотке крови, где в качестве антигенов используют рекомбинантные белки: 2 экстрацеллюлярных домена субъединицы NR1 NMDA-рецептора - Ed1 и Ed2, GFAP и NSE. 1 пр.

Способ оценки тяжести анти-N-метил-D-аспартат (NMDA) рецепторного энцефалита с выраженной психопатологической симптоматикой, включающий выполнение у пациента забора крови, в сыворотке которой определяют аутоантитела к субъединице NR1 NMDA рецептора, отличающийся тем, что в сыворотке крови пациента определяют антитела к нейроспецифическому глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) и нейронспецифической енолазе (NSE) и при положительном тесте на антитела к NR1, титре антител к GFAP 1:100 и выше и титре антител к NSE 1:100 и выше состояние пациента оценивают как тяжелое.