АНТИТЕЛО К CLDN-18.2 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 C12N15/63 A61K39/395 A61P35/00 

Область техники

В настоящем изобретении представлены антитело, специфично связывающее CLDN-18.2, или его антигенсвязывающий фрагмент и содержащая их композиция. Также представлены молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, вектор экспрессии и клетка-хозяин для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, и способ терапии или диагностики, и применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.

Уровень техники

Рак желудка является одним из наиболее распространенных видов рака во всем мире. Согласно статистике Проекта по контролю рака Всемирной организации здравоохранения не менее 7 миллионов пациентов во всем мире ежегодно умирают от рака, из которых 700000 пациентов умирают от рака желудка. По сравнению с общепринятыми схемами лечения рака желудка схемы лечения с применением антител имеют большие перспективы применения ввиду их высокой специфичности и низкой частоты побочных эффектов.

Клаудины, также известные под названием CLDN, представляют собой семейство поверхностных белков клетки, которые образуют межклеточные барьеры и контролируют поток молекул между клетками. На сегодняшний день обнаружено как минимум 26 представителей клаудинов. Представители семейства белков клаудинов являются важными структурными компонентами плотных контактов, которые играют важную роль в поддержании полярности эпителиальных клеток, контроле трансклеточной диффузии и регуляции роста и дифференцировки клеток. Молекулы клаудина пересекают клеточную мембрану четыре раза, при этом как N-конец, так и С-конец располагаются в цитоплазме. Разные представители семейства клаудинов экспрессируются в разных тканях, и изменения их функции связаны с образованием рака. Изменения уровней экспрессии клаудина 1, клаудина 18 и клаудина 10 связаны, соответственно, с раком кишечника, раком желудка и гепатоцеллюлярной карциномой.

У клаудина 18 (CLDN18) существует два альтернативных сплайсированных варианта, а именно CLDN-18.1 и CLDN-18.2. Клаудин 18.1 (CLDN-18.1) избирательно экспрессируется в нормальном эпителии легких и желудка. Клаудин 18.2 (CLDN-18.2) демонстрирует следовую экспрессию в нормальных короткоживущих клетках эпителия желудка, но в опухолевых клетках клаудин 18.2 проявляет сильную экспрессию при различных типах рака, например, высокую экспрессию клаудина 18.2 выявляют у 75% пациентов с раком желудка, у 50% пациентов с раком поджелудочной железы и у 30% пациентов с раком пищевода, а также раком легкого и т.д.

Хотя клаудиксимаб (IMAB362), разработанный компанией Ganymed, проходит в настоящее время фазу II клинических испытаний в лечении гастроэзофагеального рака на поздней стадии (WO 2007059997), по-прежнему, существует потребность в новом антителе к CLDN18.2 с улучшенной аффинностью и специфичностью по сравнению с известными антителами.

Суть изобретения

В настоящем изобретении представлены антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые обладают такими преимуществами, как высокая аффинность и высокая специфичность в отношении CLDN-18.2 человека. Антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в настоящем изобретении, можно применять в режиме монотерапии или в комбинации с другими видами терапии и/или другими противораковыми средствами для лечения, например, рака.

В одном аспекте настоящего изобретения представлены антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где

последовательность HCDR1 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, 10, 16, 22, 28, 34 и 37;

последовательность HCDR2 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:62, 63, 17, 23, 29, 35, 38, 72 и 74; при этом в HCDR2, представленной под SEQ ID NO:62, Х₁ представляет собой С или S, и Х₂ представляет собой Т или S, и в HCDR2, представленной под SEQ ID NO:63, Х₃ представляет собой D или G, и Х₄ представляет собой K или Т; и

последовательность HCDR3 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:3, 12, 18, 24, 30, 36, 39, 73 и 7 5; и

вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где

последовательность LCDR1 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:4, 7, 13, 19, 25 и 31;

последовательность LCDR2 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:5, 8, 14, 20, 26 и 32; и

последовательность LCDR3 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:6, 9, 15, 21, 27 и 33.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи настоящего изобретения содержит:

(I) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3; или

(II) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12; или

(III) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:18; или

(IV) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:24; или

(V) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:30; или

(VI) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 и SEQ ID NO:36; или

(VII) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38 и SEQ ID NO:39; или

(VIII) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:40 и SEQ ID NO:12; или

(IX) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:3; или

(X) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:73; или

(XI) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:3; или

(XII) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:74 и SEQ ID NO:75; или

(XIII) HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:74 и SEQ ID NO:30; и

вариабельная область легкой цепи содержит:

(I) LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6; или

(II) LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9; или

(III) LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15; или

(IV) LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21; или

(V) LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27; или

(VI) LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:33.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит:

(I) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6; или

(II) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9; или

(III) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15; или

(IV) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:18; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21; или

(V) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:24; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27; или

(VI) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:30; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:33; или

(VII) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 и SEQ ID NO:36; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27; или

(VIII) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38 и SEQ ID NO:39; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:33; или

(IX) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21; или

(X) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:30; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15; или

(XI) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:24; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15; или

(XII) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:40 и SEQ ID NO:12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15; или

(XIII) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9; или

(XIV) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:73; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9; или

(XV) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9; или

(XVI) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:74 и SEQ ID NO:30; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15; или

(XVII) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:74 и SEQ ID NO:75; и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями, соответственно, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи по настоящему изобретению предусматривает последовательность, выбранную из последовательностей под SEQ ID NO:42, 45, 47, 49, 51, 53, 54, 76, 78, 82 и 83, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с любой из последовательностей, представленных под SEQ ID NO:42, 45, 47, 49, 51, 53, 54, 76, 78, 82 и 83; и

аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:43, 44, 46, 48, 50 и 52, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с любой из последовательностей, представленных под SEQ ID NO:43, 44, 46, 48, 50 и 52.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит:

(I) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:42, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:43; или

(II) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:42, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:44; или

(III) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:45, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46; или

(IV) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:47, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:48; или

(V) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4 9, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:50; или

(VI) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:52; или

(VII) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:53, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:50; или

(III) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:54, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:52; или

(IX) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:45, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:48; или

(X) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46; или

(XI) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:55, 57, 58, 59, 60, 76, 78, 79, 82 и 83, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с любой из последовательностей, представленных под SEQ ID NO:55, 57, 58, 59, 60, 76, 78, 79, 82 и 83; и

аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:56, 61, 77, 80 и 81, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с последовательностями, представленными под SEQ ID NO:56, 61, 77, 80 и 81.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под любой из SEQ ID NO:55, 57, 60, 76, 78, 79, 82 или 83; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под любой из SEQ ID NO:56, 61, 77, 80 или 81.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:55, 57, 82 или 83; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:56.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:60, 76 или 78; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:61.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где

вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:55; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:56; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:57; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:56; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:58; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:56; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:59; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:56; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:60; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:61; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:76; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:77; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:79; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:80; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:55; и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:81. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит: тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:64 или ее вариант или под SEQ ID NO:68 или ее вариант, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:65 или ее вариант или под SEQ ID NO:69 или ее вариант, где вариант содержит 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен в вариабельной области;

предпочтительно вариант SEQ ID NO:64 содержит аминокислотную замену в положении 50 или 63 или их комбинацию; и/или вариант SEQ ID NO:68 содержит аминокислотную замену в положении 63 или 65 или их комбинацию;

предпочтительно вариант SEQ ID NO:64 содержит S50C или S63T или их комбинацию; и/или вариант SEQ ID NO:68 содержит G63D или Т65K или их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит тяжелую и легкую цепи, где

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:64, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:64; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:65, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:65; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:68, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:68; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:69, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:69; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:84, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:84; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:85, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:85; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:86, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:86; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:87, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:87; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:88, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:88; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:89, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:89; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:90, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:90; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:91, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:91; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:92, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:92; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:93, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:93; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:94, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:94; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:95, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:95; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:96, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:96; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:97, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:97; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:98, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:98; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:99, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:99; или

тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:100, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:100; и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:101, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:101.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит:

(I) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:64, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:65; или

(II) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:68, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:69.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению представляет собой Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, scFv, или sdAb, или диантитело.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой IgG любого подтипа, такого как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4; при этом предпочтительно антитело является гипофукозилированным или афукозилированным.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению является гипофукозилированным.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению является афукозилированным.

В другом аспекте настоящего изобретения представлены антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, характеризующиеся одним или несколькими из следующих свойств:

(1) связываются с одним и тем же или полностью или частично перекрывающимся эпитопом человеческого белка CLDN-18.2, что и антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе;

(2) конкурируют с антителом к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагментом, описанными в данном документе, за связывание с эпитопом человеческого белка CLDN-18.2;

(3) связываются с человеческим белком CLDN-18.2, но не связываются с человеческим белком CLDN-18.1;

(4) индуцируют механизм ADCC в отношении клеток, экспрессирующих человеческий белок CLDN-18.2; и

(5) индуцируют механизм CDC в отношении клеток, экспрессирующих человеческий белок CLDN-18.2.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен полинуклеотид, кодирующий антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен вектор экспрессии, содержащий описанный в данном документе полинуклеотид, при этом предпочтительно вектор представляет собой эукариотический вектор экспрессии.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлена клетка-хозяин, содержащая описанный в данном документе полинуклеотид или описанный в данном документе вектор экспрессии или экспрессирующая описанные в данном документе антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, при этом предпочтительно клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, более предпочтительно клетку млекопитающего.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен способ получения описанных в данном документе антитела к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом способ предусматривает культивирование описанной в данном документе клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение экспрессированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая описанные в данном документе антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе полинуклеотид, описанный в данном документе вектор экспрессии или описанную в данном документе клетку-хозяина и фармацевтически приемлемые носитель или вспомогательное вещество.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлено применение описанных в данном документе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе полинуклеотида, описанного в данном документе вектора экспрессии, описанной в данном документе клетки-хозяина или описанной в данном документе фармацевтической композиции в получении лекарственного препарата для лечения и/или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованного CLDN-18.2; при этом предпочтительно заболевание или патологическое состояние представляет собой рак.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлены описанные в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе полинуклеотид, описанный в данном документе вектор экспрессии, описанная в данном документе клетка-хозяин или описанная в данном документе фармацевтическая композиция для лечения и/или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованного CLDN-18.2; при этом предпочтительно заболевание или патологическое состояние представляет собой рак.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен способ лечения и/или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованных CLDN-18.2, предусматривающий введение нуждающемуся в этом субъекту описанных в данном документе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе полинуклеотида, описанного в данном документе вектора экспрессии, описанной в данном документе клетки-хозяина или описанной в данном документе фармацевтической композиции; при этом предпочтительно заболевание или патологическое состояние представляет собой рак.

В некоторых вариантах осуществления рак выбран из рака желудка, рака пищевода, гастроэзофагеального рака, рака поджелудочной железы, холангиокарциномы, рака легкого, рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря, рака кишечника и рака мочевого пузыря.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая комбинация, содержащая описанные в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе полинуклеотид, описанный в данном документе вектор экспрессии, описанную в данном документе клетку-хозяина или описанную в данном документе фармацевтическую композицию и одно или несколько дополнительных терапевтических средств.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен набор, содержащий описанные в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе полинуклеотид, описанный в данном документе вектор экспрессии, описанную в данном документе клетку-хозяина или описанную в данном документе фармацевтическую композицию; при этом предпочтительно набор дополнительно содержит устройство для введения.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен способ обнаружения присутствия CLDN-18.2 в образце с применением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: аффинность химерного антитела к CLDN-18.2 на клеточном уровне, определенная посредством проточной цитометрии.

Фиг. 2а и 2b: ADCC-активность, опосредованная химерным антителом к CLDN-18.2, которая определена посредством методики с использованием репортерного гена.

Фиг. 3: CDC-активность, опосредованная химерным антителом к CLDN-18.2, которая определена посредством проточной цитометрии.

Фиг. 4а, 4b и 4с: аффинность гуманизированного антитела к CLDN-18.2 на клеточном уровне, определенная посредством проточной цитометрии.

Фиг. 5а, 5b и 5с: ADCC-активность, опосредованная гуманизированным антителом к CLDN-18.2, которая определена посредством методики с использованием репортерного гена.

Фиг. 6а, 6b и 6с: CDC-активность, опосредованная гуманизированным антителом к CLDN-18.2, которая определена посредством проточной цитометрии.

Фиг. 7: ингибирующий эффект гуманизированного антитела к CLDN-18.2 антитела в отношении опухолевого роста клеток рака желудка человека MKN45 hClaudinl8.2 Mixeno, трансплантированных мышам M-NSG.

Фиг. 8: ингибирующий эффект гуманизированного антитела к CLDN-18.2 в отношении опухолевого роста клеток рака поджелудочной железы человека hCLDN18.2 MIA РаСа-2, трансплантированных мышам СВ-17 SCID.

Подробное описание вариантов осуществления

Определения

При реализации на практике настоящего изобретения можно использовать, если не указано иное, стандартные методики молекулярной биологии (включая рекомбинантные методики), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах знаний специалиста в данной области техники.

Для более легкого понимания настоящего изобретения некоторые технические термины конкретизируются следующим образом. Если иное явно не определено где-либо в данном документе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значения, обычно понятные обычным специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Для определений и терминов в данной области техники специалисты могут обратиться к Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel). Аббревиатуры для аминокислотных остатков представляют собой стандартные 3-буквенные и/или 1-буквенные коды, используемые в данной области техники для обозначения одной из 20 обычно используемых L-аминокислот. Используемые в данном документе (включая формулу изобретения) формы единственного числа включают соответствующие им формы множественного числа, если контекстом явно не требуется иного.

Выражение "приблизительно", если его используют в связи с числовым значением, предназначено для охвата числовых значений в пределах диапазона, имеющего нижний предел, который на 5% меньше, чем указанное числовое значение, и верхний предел, который на 5% больше, чем указанное числовое значение.

Выражение "и/или" следует понимать как означающее любой из необязательных элементов или комбинацию из любых двух или более необязательных элементов.

Термин "CLDN-18.2" или "клаудин 18.2" представляет собой один из двух сплайсированных вариантов клаудина 18. Термин относится к любому нативному CLDN-18.2 любого позвоночного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Термин охватывает "полноразмерный" непроцессированный CLDN-18.2, а также любую форму CLDN-18.2 или любой его фрагмент, полученный в результате внутриклеточного процессинга. Термин также включает встречающиеся в природе варианты CLDN-18.2, например, сплайсированные варианты или аллельные варианты. В предпочтительном варианте осуществления CLDN-18.2 относится к полноразмерному CLDN-18.2 человека и яванской обезьяны или его фрагменту (такому как его зрелый фрагмент без сигнального пептида).

Термин "процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" или просто "идентичность" определяется как процентная доля аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в референтной аминокислотной последовательности после выравнивания аминокислотных последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, а также без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание последовательностей с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто с использованием различных методик из данной области техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или MEGALIGN (DNASTAR). Специалист в данной области техники может определить соответствующие параметры для оценки выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.

Термин "иммунный ответ" относится к активности, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых указанными выше клетками или печенью (включая антитела, цитокины и компоненты системы комплемента), причем данная активность приводит к избирательному повреждению, разрушению или элиминации из организма человека инвазирующих патогенов, инфицированных патогенами клеток или тканей, раковых клеток, или нормальных клеток, или тканей человека в случае аутоиммунного или патологического воспаления.

Термин "путь передачи сигнала" или "активность передачи сигнала" относится к биохимической причинно-следственной связи, обычно инициируемой белок-белковыми взаимодействиями, такими как связывание фактора роста с рецептором; при этом указанная связь приводит к передаче сигнала от одной части клетки к другой части. Как правило, передача включает специфическое фосфорилирование одного или нескольких остатков тирозина, серина или треонина на одном или нескольких белках в каскаде реакций, ведущих к передаче сигнала. Предпоследний процесс часто включает события в ядре, приводящие к изменениям в экспрессии генов.

Термины "активность" или "биологическая активность" или термины "биологическое свойство" или "биологические характеристики" используются в данном документе взаимозаменяемо, включая без ограничения аффинность и специфичность эпитопа/антигена, способность к нейтрализации или антагонизму активности CLDN-18.2 in vivo или in vitro, IC50, стабильность антитела in vivo и иммуногенное свойство антитела. Другие идентифицируемые биологические свойства или характеристики антител, известные в данной области техники, включают, например, перекрестную реактивность (т.е. перекрестно-реагирующие обычно с отличным от человеческого гомологом пептида-мишени или с другими белками или тканями) и способность поддерживать высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих. Вышеупомянутые свойства или характеристики наблюдают, измеряют или оценивают с использованием методик, известных в данной области техники, включая без ограничения ELISA, FACS или анализ BIACORE на основе поверхностного плазмонного резонанса, неограниченные анализы нейтрализации in vitro или in vivo, связывание рецепторов, продуцирование цитокинов или факторов роста и/или секрецию, трансдукцию сигнала и

иммуногистохимический анализ срезов тканей различного происхождения, включая человека, приматов или любого другого происхождения.

Термин "антитело" относится к любой форме антитела, обладающей требуемой биологической активностью. Соответственно, его используют в наиболее широком смысле и он конкретно включает без ограничения моноклональное антитело (включая полноразмерное моноклональное антитело), поликлональное антитело, мультиспецифическое антитело (такое как биспецифическое антитело), гуманизированное антитело, полностью человеческое антитело, химерное антитело и верблюжье однодоменное антитело.

Термин "выделенное антитело" относится к очищенному состоянию связывающего соединения, и в данном контексте он означает, что молекула по сути свободна от других биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, сахара или другие вещества, такие как клеточный дебрис и среда для выращивания. Термин "изолят (выделенный)" не подразумевает полное отсутствие таких веществ или отсутствие воды, буферов или солей, за исключением случаев, когда они присутствуют в количестве, которое существенно препятствует экспериментальному или терапевтическому применению связывающего соединения, описанного в данном документе.

Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из по сути однородной популяции антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного эпитопа. Для сравнения препараты на основе обычных (поликлональных) антител, как правило, включают большое количество антител к (или специфичных для) различным эпитопам. Определение "моноклональное" указывает на характеристику антитела, полученного из по сути однородной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом.

Термин "полноразмерное антитело" относится к молекуле иммуноглобулина, состоящей из четырех пептидных цепей, встречающихся в природе: двух тяжелых (Н) цепей (приблизительно 50-70 кДа при полной длине) и двух легких (L) цепей (приблизительно 25 кДа при полной длине), соединенных друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (обозначаемой в данном документе как VH) и константной области тяжелой цепи (обозначаемой в данном документе как СН). Константная область тяжелой цепи состоит из 3 доменов (CHI, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (обозначаемой в данном документе как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на высоковариабельные области, определяющие комплементарность (CDR), и более консервативные области, называемые каркасными областями (FR), разделенными CDR. Каждая область VH или VL состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных в направлении от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающие домены, которые взаимодействуют с антигенами. Константная область антитела может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканью или фактором хозяина (включая различные клетки (например, эффекторные клетки) иммунной системы и первый компонент классического пути активации системы комплемента (Clq)).

Термин "Fc-область" используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Термин включает Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. В одном варианте осуществления Fc-область тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Рго230 тяжелой цепи до карбокси-конца. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. Если здесь не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации ЕС, также известной как индекс ЕС, как описано в Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th edition, Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

Термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела ("исходное антитело") включает фрагмент или производное антитела, обычно содержащие по меньшей мере фрагмент антигенсвязывающей области или вариабельной области (например, одну или несколько CDR) исходного антитела, и фрагмент или производное антитела сохраняет по меньшей мере некоторую специфичность связывания исходного антитела. Примеры антигенсвязывающего фрагмента включают без ограничения фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диантитела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител, такие как sc-Fv; наноантитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Если антигенсвязывающую активность антитела выражают на основе молярной концентрации, связывающий фрагмент или производное обычно сохраняет по меньшей мере 10% своей антигенсвязывающей активности. Предпочтительно связывающий фрагмент или производное сохраняет по меньшей мере 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% или больше антигенсвязывающей аффинности исходного антитела. Также предполагается, что антигенсвязывающий фрагмент антитела может включать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, которые по сути не изменяют его биологическую активность (называемые "консервативными вариантами" или "функционально консервативными вариантами" антитела). Термин "связывающее соединение" относится как к антителу, так и к его связывающему фрагменту.

Термин "одноцепочечное антитело Fv" или "scFv" относится к фрагменту антитела, содержащему домен VH и домен VL антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Обычно Fv-полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между доменом VH и доменом VL, который позволяет scFv образовывать требуемую структуру для связывания антигена.

Термин "домен антитела" представляет собой иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В некоторых случаях две или более областей VH ковалентно связаны с пептидным линкером с образованием двухвалентного доменного антитела. Две области VH двухвалентного доменного антитела могут быть нацелены на один и тот же или разные антигены.

Термин "двухвалентное антитело" включает два сайта связывания антигена. В некоторых случаях два сайта связывания обладают одинаковой антигенной специфичностью. Однако бивалентное антитело может быть биспецифическим.

Термин "диантитело" относится к небольшому фрагменту антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, при этом фрагмент содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL или VL-VH). При использовании линкера, который слишком короткий, чтобы позволить спаривание между двумя доменами в одной цепи, домен должен спариваться с комплементарным доменом другой цепи с образованием двух сайтов связывания антигена.

Термин "химерное антитело" представляет собой антитело, имеющее вариабельный домен первого антитела и константный домен второго антитела, при этом первое антитело и второе антитело получены от разных видов. Как правило, вариабельный домен получают из антитела грызуна и т.д. ("исходное антитело"), тогда как последовательность константного домена получают из человеческого антитела, так что по сравнению с исходным антителом грызуна полученное химерное антитело в меньшей степени может вызвать неблагоприятный иммунный ответ у субъектов-людей.

Термин "гуманизированное антитело" относится к форме антитела, которая содержит последовательности как человеческого, так и нечеловеческого (например, мышиного и крысиного) антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит по меньшей мере один, обычно два вариабельных домена, где все или по сути все гипервариабельные петли соответствуют петлям отличного от человеческого иммуноглобулина, а все или по сути все каркасные (FR) области соответствуют таким из последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области человеческого иммуноглобулина (Fc).

Термин "полностью человеческое антитело" относится к антителу, которое содержит только белковые последовательности человеческого иммуноглобулина. Если полностью человеческое антитело получают с использованием мышей, мышиных клеток или гибридом, полученных из мышиных клеток, то полностью человеческое антитело может содержать мышиные сахарные цепи. Аналогично "мышиное антитело" относится к антителу, содержащему только последовательности мышиного иммуноглобулина. Альтернативно, если полностью человеческое антитело продуцируется у крыс, в клетках крыс или гибридомах, полученных из крысиных клеток, полностью человеческое антитело может содержать крысиные сахарные цепи. Аналогично "крысиное антитело" относится к антителу, которое содержит только последовательности крысиного иммуноглобулина.

"Изотип" антитела относится к классу антител (например, IgM, IgE и IgG, таким как IgG1, IgG2 или IgG4) на основе генов константной области тяжелой цепи. Изотип также включает модифицированные формы одного из этих классов, в которых были выполнены модификации для изменения функции Fc, например, для усиления или ослабления эффекторной функции или связывания с рецепторами Fc.

Термин "эпитоп" относится к области антигена, с которой связывается антитело. Эпитоп может быть образован из смежных аминокислот или несмежных аминокислот, сопоставленных третичной укладкой белка.

"Аффинность" или "аффинность связывания" относится к истинной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие между партнерами связывающей пары. Аффинность молекулы X к ее партнеру Y обычно может быть представлена равновесной константой диссоциации (K_D), которая представляет собой соотношение константы скорости диссоциации (k_dis) и константы скорости ассоциации (k_on). Аффинность можно измерить обычными способами, известными в данной области техники. Одной из конкретных методик измерения аффинности является описанный в данном документе кинетический анализ связывания ForteBio.

Термин "не связывается" с белком или клеткой означает не связывается с белком или клеткой или не связывается с белком или клеткой с высокой аффинностью, т.е. KD связывания с белком или клеткой составляет 1,0×10^-6 М или больше, более предпочтительно 1,0×10^-5 М или больше, более предпочтительно 1,0×10^-4 М или больше, 1,0×10^-3 М или больше и более предпочтительно 1,0×10^-2 М или больше.

Термин "высокая аффинность" к антителу IgG означает K_D антигена, составляющую 1,0×10^-6 М или меньше, предпочтительно 5,0×10^-8 М или меньше, более предпочтительно 1,0×10^-8 М или меньше, 5,0×10^-9 М или меньше и более предпочтительно 1,0×10-9 М или меньше. Связывание с "высокой аффинностью" может варьироваться для антител других подтипов. Например, "высокоаффинное" связывание подтипа IgM означает K_D, составляющую 10^-6 М или меньше, предпочтительно 10^-7 М или меньше и более предпочтительно 10^-8 М или меньше.

Термины "антителозависимая клеточная цитотоксичность", "антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" или "ADCC" относятся к клеточно-опосредованной иммунной защите, при которой эффекторные клетки иммунной системы активно лизируют клетки-мишени, такие как раковые клетки, у которых поверхностные антигены клеточной мембраны связаны антителами, такими как антитело к клаудину 18.2.

Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность" или "CDC" относится к эффекторным функциям антител классов IgG и IgM, которые при связывании с поверхностными антигенами инициируют классический путь активации комплемента, включая образование мембраноатакующего комплекса и лизис клеток-мишеней. Антитело по настоящему изобретению при связывании с клаудином 18.2 индуцирует CDC в отношении раковых клеток.

Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" относится к дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) или рибонуклеиновой кислоте (РНК) и их полимерам в одно- или двухнитевой форме. Если специально не ограничено, этот термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие аналоги известных природных нуклеотидов и обладающие свойствами связывания, аналогичными референтной нуклеиновой кислоте, и метаболизируемые способом, сходным с встречающимися в природе нуклеотидами (см. патент США №827 8036 Kariko et al., в котором раскрываются молекула мРНК, в которой уридин заменен псевдоуридином, способ синтеза молекулы мРНК и способ доставки терапевтических белков in vivo). Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также косвенно охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также явно указанные последовательности. В частности, замена вырожденных кодонов может быть осуществлена путем получения последовательностей, в которых третьи положения одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов заменены смешанными основаниями и/или остатками дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 2 60:2 605-2 608 (1985) и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

"Конструкция" означает любую рекомбинантную полинуклеотидную молекулу (такую как плазмида, космида, вирус, автономно реплицирующаяся полинуклеотидная молекула, бактериофаг или линейная или кольцевая полинуклеотидная молекула одно- или двухнитевой ДНК или РНК), которая получена из любого источника, способного к интеграции с геномом или автономной репликации, образует полинуклеотидную молекулу, в которой одна или несколько полинуклеотидных молекул были функционально сцеплены (т.е. функционально связаны). Рекомбинантная конструкция обычно содержит полинуклеотид по настоящему изобретению, функционально связанный с регуляторной последовательностью инициации транскрипции, которая управляет транскрипцией полинуклеотида в клетке-хозяине. Как гетерологичные, так и негетерологичные (т.е. эндогенные) промоторы могут быть использованы для управления экспрессией нуклеиновых кислот по настоящему изобретению.

"Вектор" относится к любой рекомбинантной полинуклеотидной конструкции, которую можно использовать для целей трансформации (т.е. введения гетерологичной ДНК в клетку-хозяина). Один тип вектора представляет собой "плазмиду", которая относится к кольцевой двухнитевой петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, и в вирусный геном могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). После введения в клетку-хозяина другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом клетки-хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны к управлению экспрессии функционально связанных генов. Такой вектор упоминается в данном документе как "вектор экспрессии".

Термин "вектор экспрессии", используемый в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к репликации и экспрессии представляющего интерес гена при трансформации, трансфекции или трансдукции в клетку-хозяина. Вектор экспрессии содержит один или более фенотипических селектируемых маркеров и точку начала репликации для обеспечения поддержания вектора и обеспечения размножения в хозяине, если это необходимо.

"Активация", "стимуляция" и "лечение" в отношении клетки или рецептора могут иметь одно и то же значение, например, клетку или рецептор активируют, стимулируют или обрабатывают лигандом, если контекстом явно не подразумевается иное. "Лиганд" включает природные и синтетические лиганды, такие как цитокины, варианты цитокинов, аналоги, мутеины и связывающие соединения, полученные из антител. "Лиганд" также включает малые молекулы, такие как пептидомиметики цитокинов и пептидомиметики антител. "Активация" может относиться к клеточной активации, регулируемой внутренними механизмами, а также внешними факторами или факторами окружающей среды. "Ответ/реакция", такие как ответ клетки, ткани, органа или организма, включает изменения в биохимических или физиологических характеристиках (например, концентрации, плотности, адгезии или миграции, скорости экспрессии генов или статусе дифференцировки в биологическом компартменте), если изменения связаны с активацией, стимуляцией или лечением или с внутренними механизмами, такими как генетическое программирование.

Используемый в данном документе термин "лечить" или "лечение" любого заболевания или патологического состояния относится в одном варианте осуществления к уменьшению тяжести заболевания или патологического состояния (т.е. к замедлению, или остановке, или уменьшению прогрессирования заболевания или по меньшей мере одного клинического симптома заболевания). В другом варианте "лечить" или "лечение" относится к облегчению или улучшению по меньшей мере одного физического параметра, включая те физические параметры, которые пациент может не различать. В другом варианте осуществления термин "лечить" или "лечение" относится к модулированию заболевания или патологического состояния физически (например, стабилизации различимых симптомов), физиологически (например, стабилизации физических параметров) или как к первому, так и ко второму. Если в данном документе не описано иное, способы оценки лечения и/или предупреждения заболевания в целом известны в данной области техники.

"Субъект" включает любого из человека или животного, отличного от человека. Термин "животное, отличное от человека" включает всех позвоночных, например, млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.п. Используемый в данном документе термин "макак-крабоед" или "яванский макак" относится к подвидам яванских макаков.

Введение "в комбинации с" одним или несколькими другими терапевтическими средствами включает как одновременное (совместное) введение, так и последовательное введение в любом порядке.

"Терапевтически эффективное количество", "терапевтически эффективная доза" и "эффективное количество" относятся к количеству антител к CLDN-18.2 или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, которое может эффективно предупреждать или смягчать симптом одного или нескольких заболеваний или патологических состояний или развитие таких заболеваний или патологических состояний при введении в клетки, ткани или субъектов по отдельности или в комбинации с другими терапевтическими средствами. Терапевтически эффективная доза также относится к количеству антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, достаточному для обеспечения уменьшения тяжести симптомов, например, к количеству, которое обеспечивает лечение, излечение, предупреждение или уменьшение тяжести связанного медицинского состояния или обеспечивает ускорение лечения, излечения, предупреждения или уменьшения тяжести такого состояния. Если субъекту вводят только активный ингредиент, терапевтически эффективная доза относится только к указанному ингредиенту. При введении в комбинации терапевтически эффективная доза относится к совокупному количеству активных ингредиентов, которое дает терапевтический эффект, будь то в комбинации, последовательно или одновременно. Эффективное количество терапевтического средства приведет к улучшению диагностических критериев или параметров на по меньшей мере 10%; обычно по меньшей мере 20%; предпочтительно по меньшей мере приблизительно 30%; более предпочтительно по меньшей мере 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%.

"Рак" и "злокачественный" относятся или описывают физиологический недуг у млекопитающих, который часто характеризуется неконтролируемым ростом клеток. В это определение включены доброкачественные и злокачественные опухоли, а также дремлющие опухоли или микрометастазы. Примеры видов рака включают без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), перитонеальную карциному, гепатоцеллюлярную карциному, рак желудка или гастральный рак (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак эндометрия или рак матки, рак слюнных желез, почечный рак или рак почки, печеночный рак, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак печени и различные типы рака головы и шеи и В-клеточную лимфому (включая низкодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому Кинга (NHL), мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL, промежуточной степени злокачественности/фолликулярную NHL, диффузную NHL промежуточной степени злокачественности, иммунобластную NHL высокой степени злокачественности, лимфобластную NHL высокой степени злокачественности, мелкоклеточную NHL высокой степени злокачественности с нерассеченными ядрами, NHL с генерализованной лимфаденопатией, лимфому из клеток мантийной зоны, СПИД-ассоциированную лимфому и макроглобулинемию Вальденстрема), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD), а также аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами, отеки (например, связанные с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса.

Антитело к CLDN-18.2

В одном аспекте настоящего изобретения представлены антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент. Термины "антитело к CLDN-18.2", "антитело, связывающее CLDN-18.2", "CLDN-18.2 антитело" или "антитело, которое связывается с CLDN-18.2" означает, что оно может связываться с белком CLDN-18.2 или его фрагментом с достаточной аффинностью, так что антитело можно использовать в качестве диагностического и/или терапевтического средства, направленного на CLDN-18.2.

Антитело по настоящему изобретению может быть получено с использованием любого подходящего способа получения антител. Любая подходящая форма CLDN-18.2 может быть использована в качестве иммуногена (антигена) для получения антител. В качестве примера, а не ограничения, любой вариант CLDN-18.2 или его фрагмент можно использовать в качестве иммуногена. В некоторых вариантах осуществления гибридомные клетки, продуцирующие мышиное моноклональное антитело к CLDN-18.2 человека, могут быть получены способами, известными в данной области техники. Антитело, полученное от грызунов (например, мышей), может вызывать нежелательную иммуногенность антител при использовании in vivo в качестве терапевтического средства, а повторное применение приводит к иммунному ответу организма человека на терапевтические антитела, и такой иммунный ответ приводит как минимум к потере терапевтической эффективности, а в тяжелых случаях приводит к потенциально смертельным аллергическим реакциям. Один из подходов к снижению иммуногенности антител грызунов включает получение химерных антител, в которых мышиные вариабельные области слиты с человеческими константными областями (Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43). Однако удерживание интактных вариабельных областей грызунов в химерных антителах может по-прежнему приводить к неблагоприятной иммуногенности у пациентов. Пересадку петель определяющей комплементарность области (CDR) вариабельных доменов грызунов на человеческие каркасы (т.е. гуманизацию) использовали для дальнейшей минимизации последовательностей грызунов (Jones et al. (1986) Nature 321:522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534).

В некоторых вариантах осуществления химерное или гуманизированное антитело по настоящему изобретению может быть получено на основе последовательности полученного мышиного моноклонального гибридомного антитела. ДНК, кодирующая тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина, может быть получена из представляющих интерес мышиных гибридом и сконструирована так, чтобы она содержала немышиные (например, человеческие) последовательности иммуноглобулинов, используя стандартные методики молекулярной биологии.

В некоторых вариантах осуществления химерное антитело к CLDN-18.2 по настоящему изобретению может быть получено путем эффективного связывания вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепей иммуноглобулина из гибридомы с константной областью IgG человека (см., например, патент США №4816567, выданный Cabilly et al.) посредством способов, известных в данной области техники, для получения химерной тяжелой цепи и химерной легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления константная область, содержащаяся в химерном антителе по настоящему изобретению, может быть выбрана из любого подтипа человеческого IgG, такого как IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, но предпочтительно из IgG4.

В некоторых вариантах осуществления химерное антитело к CLDN-18.2 по настоящему изобретению может быть получено путем трансфекции экспрессионных клеток экспрессионной плазмидой, кодирующей химерную легкую цепь и химерную тяжелую цепь, посредством способа "самосборки", при этом вышеуказанный анализ связывания и другие общепринятые анализы связывания (например, ELISA) можно использовать для определения связывания CLDN-18.2 таким антителом, полученным посредством "самосборки".

Точные границы аминокислотной последовательности CDR вариабельной области антитела по настоящему изобретению могут быть определены с использованием любой из ряда хорошо известных схем, включая схему по Чотиа, основанную на трехмерной структуре антитела и топологии петли CDR (Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)), по Кабату на основе вариабельности последовательностей антител (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4^th ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)), AbM (Университет Вата), Contact (Университетский колледж Лондона), международную базу данных ImMunoGeneTics (IMGT) (1999 Nucleic Acids Research, 27, 209-212) и определение CDR по Норту, основанное на алгоритме кластеризации распространения аффинности с использованием большого количества кристаллических структур. Граница CDR антитела по настоящему изобретению может быть определена специалистом в данной области техники с использованием любой схемы, известной в данной области техники (например, различные системы присвоения или комбинации).

Следует отметить, что границы CDR вариабельных областей одного и того же антитела, полученные на основе разных систем присвоения, могут отличаться. То есть последовательности CDR вариабельных областей одного и того же антитела, определенные в разных системах присвоения, отличаются. Таким образом, если речь идет об определении антитела с конкретными последовательностями CDR, определенными в настоящем изобретении, объемом антитела также охватывается такое антитело, чьи последовательности вариабельной области содержат конкретные последовательности CDR, но чьи заявленные границы CDR отличаются от границ конкретных CDR, определенным настоящим изобретением за счет применения другой схемы (например, других систем присвоения или комбинаций).

Антитела с разными специфичностями (т.е. с разными сайтами связывания для разных антигенов) имеют разные CDR. Однако, хотя CDR различаются от антитела к антителу, только ограниченное число положений аминокислот в CDR непосредственно задействовано в связывании антигена. Используя по меньшей мере две методики из нумерации по Кабату, по Чотиа, AbM, Contact и определения по Норту, можно определить минимальную перекрывающуюся область, с обеспечением тем самым "минимальной связывающей единицы" для связывания антигена. Минимальная связывающая единица может быть подчастью CDR. Как будет очевидно специалистам в данной области техники, остатки остальных последовательностей CDR можно определить по структуре и укладке белка антитела. Соответственно, в настоящем изобретении также предусмотрены варианты любой из CDR, представленных в данном документе. Например, в варианте CDR аминокислотные остатки минимальной связывающей единицы могут оставаться неизменными, в то время как остальные остатки CDR, определенные по Кабату или Чотиа, могут быть заменены консервативными аминокислотными остатками.

В случае гуманизированного антитела по настоящему изобретению области CDR мышей могут быть встроены в каркасные области иммуноглобулина зародышевой линии человека с использованием способов, известных в данной области техники. См. патент США №5225539, выданный Winter et al., и патенты США №5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены включают в себя делеции, вставки или замены аминокислот. В некоторых вариантах осуществления антитела к CLDN-18.2 или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению включают те антитела, чьи аминокислотные последовательности были мутированы посредством делеции, вставки или замены аминокислот, но по-прежнему характеризуются по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью с вышеуказанными антителами (особенно в областях CDR, изображенных в приведенных выше последовательностях). В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению имеет не более 1, 2, 3, 4 или 5 мутаций аминокислот в области CDR путем делеции, вставки или замены аминокислоты по сравнению с областью CDR, показанной в специфичной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий антитело по настоящему изобретению, включает полинуклеотид, который был подвергнут мутации путем делеции, вставки или замены нуклеотида, но по-прежнему характеризуется по меньшей мере приблизительно 60, 70, 80, 90, 95 или 100% идентичностью кодирующей области, соответствующей CDR, показанной в последовательности, описанной выше.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько модификаций аминокислот могут быть введены в Fc-область антитела, представленного в данном документе, с получением варианта Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательности Fc-области человека (например, Fc-области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащие модификации аминокислот (например, замены) в одном или нескольких положениях аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления может быть необходимым получение рекомбинантного антитела, модифицированного цистеином, такого как "thioMAb", в котором один или несколько аминокислотных остатков антитела заменены остатками цистеина.

В некоторых вариантах осуществления антитело можно изменить, чтобы повысить или понизить степень его гликозилирования и/или изменить его паттерн гликозилирования. Добавление или удаление сайтов гликозилирования в антителе удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности с образованием или удалением одного или нескольких сайтов гликозилирования. Например, одна или несколько аминокислотных замен могут быть выполнены для удаления одного или нескольких сайтов гликозилирования с устранением тем самым гликозилирования в этом сайте. Антитело может быть получено с измененными типами гликозилирования, например, гипофукозилированное антитело с уменьшенным количеством фукозильных остатков, или афукозилированное антитело, или антитело с увеличенным числом структур, представляющих собой олигосахарид с двумя симметричными ветвями и остатком N-ацетилглюкозамина посередине (GlcNac). Было показано, что такие измененные паттерны гликозилирования повышают способность антитела к индуцированию ADCC.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения представлено антитело, гипофукозилированное или афукозилированное так, что аффинность связывания антитела с рецепторами, экспрессируемыми на эффекторных клетках, может быть значительно увеличена, в результате чего антитело характеризуется повышенной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичной (ADCC) активностью. Среднее значение содержания фукозы в сахарной цепи при Asn 2 97 можно рассчитать относительно суммарного количества всех сахарных структур (таких как сложные гибридные структуры и структуры с высоким содержанием маннозы), связанных с Asn 297, посредством MALDI-TOF-масс-спектрометрии с определением тем самым количества фукозы, как, например, описано в W0 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагиновой кислоты, расположенному примерно в положении 2 97 (нумерация ЕС остатков Fc-области) в Fc-области; однако из-за незначительных вариаций последовательности в антителе Asn2 97 также может быть расположен на примерно ±3 положения аминокислот выше или ниже относительно положения 297, т.е. между положением 294 и положением 300. См., например, US 2003/0157108; US 2004/0093621. Такие варианты антител могут быть получены в клеточных линиях, способных к продуцированию дефукозилированных или гипофукозилированных антител. Примеры таких клеток включают клетки Lecl3 СНО с дефицитом фукозилирования белка (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986): 533-545; US 2 003/0157108). В некоторых вариантах осуществления остатки фукозы в антителе расщепляют с помощью фукозидазы. В некоторых вариантах осуществления модуляторы гликоформы используются для манипуляции фукозными остатками в антителе. Модуляторы гликоформы могут представлять собой CDFS01, который коммерчески доступен от Shanghai ОРМ Biosciences Co., Ltd. Дефукозилирование можно осуществлять традиционными способами, известными в данной области техники.

Уровень фукозилирования антитела можно определить структурно. Используемый в данном документе термин "нефукозилированное" или "афукозилированное" означает, что в антителе содержание фукозы составляет менее 5%, например, приблизительно 0%, менее 1%, менее 2%, менее 3% и менее 4%. Термин "гипофукозилирование" означает, что в антителе содержание фукозы приблизительно более или равно 5% и менее 30%; например, содержание фукозы в антителе составляет приблизительно 5% - 10%, 10% - 15%, 15% - 20%, 20% - 25%, 25% - 30%, 10% - 20%, 20% - 30% и 10% - 30%. Термин "гипофукозилирование или афукозилирование" означает, что содержание фукозы в антителе составляет менее 30%.

В некоторых вариантах осуществления антитело,

представленное в данном документе, может быть дополнительно модифицировано так, чтобы оно содержало другие небелковые фрагменты, легкодоступные и известные в данной области техники. Фрагменты, подходящие для дериватизации антител, включают без ограничения водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают без ограчения полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимер этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоту (гомополимер или статистический сополимер) и декстран или поли(н-винилпирролидон), полиэтиленгликоль, гомополимер пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (такие как глицерин), поливиниловый спирт и их смеси.

Экспрессия антител

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен полинуклеотид, кодирующий антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе. Полинуклеотид может предусматривать полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи антитела, или предусматривать полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен вектор экспрессии, содержащий описанный в данном документе полинуклеотид, при этом предпочтительно вектор представляет собой эукариотический вектор экспрессии. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе полинуклеотид содержится в одном или нескольких векторах экспрессии.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлена клетка-хозяин, содержащая описанный в данном документе полинуклеотид или описанный в данном документе вектор экспрессии, при этом клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, более предпочтительно клетку млекопитающего.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен способ получения описанных в данном документе антитела к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом способ предусматривает обеспечение экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в описанной в данном документе клетки-хозяине в условиях, подходящих для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение экспрессированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина.

В настоящем изобретении представлены клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантного антитела по настоящему изобретению, включая многие иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Среди прочего к ним относятся клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки NSO, SP2/0, клетки HeLa, клетки почек детенышей хомяков (ВНК), клетки почек обезьян (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека, клетки А549, клетки 293Т и многие другие клеточные линии. Клетки-хозяева млекопитающих включают клетки человека, мыши, крысы, собаки, обезьяны, свиньи, козы, быка, лошади и хомяка. Особенно предпочтительные клеточные линии выбирают путем определения того, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлен способ получения антитела к CLDN-18.2, где способ предусматривает введение вектора экспрессии в клетку-хозяин млекопитающего и культивирование клетки-хозяина в течение периода времени, достаточного для обеспечения экспрессии антитела в клетке-хозяине или более предпочтительно обеспечения секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетку-хозяина, с получением тем самым антитела. Антитело может быть выделено из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка.

Вполне вероятно, что антитела, экспрессируемые разными клеточными линиями или экспрессируемые у трансгенных животных, характеризуются разным гликозилированием. Однако все антитела, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот, представленными в данном документе, или содержащие аминокислотные последовательности, представленные в данном документе, являются частью настоящего изобретения независимо от гликозилирования антител. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления нефукозилированные антитела обладают преимуществом, поскольку они обычно характеризуются более высокой эффективностью in vitro и in vivo, чем их фукозилированные аналоги и менее вероятно, что они будут иммуногенными, поскольку их сахарная структура является обычным компонентом природного сывороточного IgG человека.

Фармацевтическая композиция и фармацевтический препарат

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая описанные в данном документе антитело к CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе полинуклеотид, описанный в данном документе вектор экспрессии, описанную в данном документе клетку-хозяина и фармацевтически приемлемые носитель или вспомогательное вещество.

Следует понимать, что антитело к CLDN-18.2 или фармацевтическая композиция на его основе, представленные в настоящем изобретении, могут быть введены в комбинации с соответствующими носителями, вспомогательными веществами и другими средствами в препарате с тем, чтобы обеспечить улучшенные перенос, доставку, переносимость и им подобные.

Термин "фармацевтическая композиция" относится к препарату, который обеспечивает присутствие содержащихся в нем активных ингредиентов в биологически эффективной форме и не содержит дополнительных ингредиентов, которые были бы неприемлемо токсичными для субъекта, которому вводят данный препарат.

Антитело к CLDN-18.2 по настоящему изобретению, характеризующееся требуемой степенью чистоты, может быть смешано с одним или несколькими необязательными фармацевтическими вспомогательными веществами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th edition, Osol, A. ed. (1980)) для получения фармацевтического препарата, содержащего описанное в данном документе антитело к CLDN-18.2, предпочтительно в форме водного раствора или лиофилизированного препарата.

Фармацевтическая композиция или препарат по настоящему изобретению может также содержать один или несколько других активных ингредиентов, необходимых для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно такие активные ингредиенты с взаимодополняющей активностью, которые не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. В некоторых вариантах осуществления другими активными ингредиентами являются химиотерапевтические средства, ингибиторы контрольных точек иммунного ответа, ингибиторы роста, антибиотики или различные известные противоопухолевые или противораковые средства, причем активные ингредиенты присутствуют в подходящей комбинации в количестве, эффективном для целевого назначения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно предусматривает композицию на основе полинуклеотида, кодирующего антитело к CLDN-18.2.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая комбинация, содержащая описанные в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе полинуклеотид, описанный в данном документе вектор экспрессии, описанную в данном документе клетку-хозяина или описанную в данном документе фармацевтическую композицию и одно или несколько дополнительных терапевтических средств.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен набор, содержащий описанные в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе полинуклеотид, описанный в данном документе вектор экспрессии, описанную в данном документе клетку-хозяина или описанную в данном документе фармацевтическую композицию; при этом предпочтительно набор дополнительно содержит устройство для введения.

Медицинское применение

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлено применение описанных в данном документе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе полинуклеотида, описанного в данном документе вектора экспрессии, описанной в данном документе клетки-хозяина или описанной в данном документе фармацевтической композиции в получении лекарственного препарата для лечения и/или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованного CLDN-18.2; при этом предпочтительно заболевание или патологическое состояние представляет собой рак.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлены описанные в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе полинуклеотид, описанный в данном документе вектор экспрессии, описанная в данном документе клетка-хозяин или описанная в данном документе фармацевтическая композиция для лечения и/или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованного CLDN-18.2; при этом предпочтительно заболевание или патологическое состояние представляет собой рак.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен способ лечения и/или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованных CLDN-18.2, предусматривающий введение нуждающемуся в этом субъекту описанных в данном документе антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе полинуклеотида, описанного в данном документе вектора экспрессии, описанной в данном документе клетки-хозяина или описанной в данном документе фармацевтической композиции; при этом предпочтительно заболевание или патологическое состояние представляет собой рак.

В некоторых вариантах осуществления рак выбран из рака желудка, рака пищевода, гастроэзофагеального рака, рака поджелудочной железы, холангиокарциномы, рака легкого, рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря, рака кишечника и рака мочевого пузыря.

В некоторых вариантах осуществления способы введения по настоящему изобретению включают без ограничения пероральный, внутривенный, подкожный, внутримышечный, внутриартериальный, внутрисуставной (например, в пораженные артритом суставы), ингаляционный, введение посредством аэрозольной доставки или внутриопухолевое введение и им подобные.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено назначение субъекту в комбинации с терапевтически эффективным количеством одного или нескольких видов терапии (например, методов лечения и/или других терапевтических средств). В некоторых вариантах осуществления лечение включает хирургическое вмешательство и/или лучевую терапию.

В некоторых вариантах осуществления способ или применение, представленные в настоящем изобретении, дополнительно предусматривают назначение индивидууму одного или нескольких видов терапии (например, методов лечения и/или других терапевтических средств). Антитело по настоящему изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами в терапии. Например, его можно вводить совместно с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим средством. Например, антитело к PD-1, антитело к PD-L1, антитело к LAG-3 и/или антитело к CTLA-4.

В одном варианте осуществления способ лечения онкологических заболеваний по настоящему изобретению дополнительно предусматривает введение средства для стабилизации или повышения экспрессии CLDN-18.2. Экспрессия CLDN-18.2 предпочтительно происходит на клеточной поверхности раковых клеток. Средство для стабилизации или повышения экспрессии CLDN-18.2 может представлять собой оксалиплатин и/или 5-FU.

Способы диагностики и обнаружения

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен способ обнаружения присутствия CLDN-18.2 в образце с применением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе. Используемый в данном документе термин "обнаружение" включает количественное или качественное обнаружение. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой биологический образец. В определенных вариантах осуществления биологический образец представляет собой образец крови, сыворотки крови или другой жидкости биологического происхождения. В определенных вариантах осуществления биологический образец предусматривает клетки или ткани.

В настоящее изобретение включены все комбинации описанных конкретных вариантов осуществления. Дополнительные варианты осуществления и полный объем применимости настоящего изобретения станут очевидными из подробного описания, приведенного ниже. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, указывающие на предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку специалистам в данной области техники из этого подробного описания станут очевидными различные изменения и модификации в пределах сущности и объема изобретения. Все публикации, патенты и заявки на патенты, цитируемые в данном документе, включая цитаты, полностью включены в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Примеры

Следующие примеры представлены для демонстрации и дальнейшего пояснения некоторых предпочтительных вариантов осуществления и аспектов настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие его объем.

Пример 1. Получение рекомбинантного человеческого белка CLDN-18.2 (hCLDN-18.2) для получения антитела к CLDN-18.2

Плазмиду HG20047-U, содержащую последовательность кДНК гена CLDN-18 человека, приобрели у Sino Biological, Inc., и частичный фрагмент гена CLDN-18 человека был амплифицирован посредством ПЦР с использованием прямого праймера и обратного праймера

Амплифицированный фрагмент расщепляли с использованием NheI и SbfI, а затем клонировали в эукариотическую экспрессионную плазмидную систему (НХР) с получением конструкции HXP-CLDN18P. Полученную конструкцию направили в Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd. для синтеза частичной последовательности гена hCLDN-18.2, и последовательность гена клонировали в НХР-CLDN18P путем ферментативного расщепления с использованием BSPQI с получением в конечном итоге конструкции HXP-hCLDN-18.2.

Пример 2. Получение мышиных гибридомных клеток

2.1. Иммунизация животных

Конструкцию HXP-hCLDN-18.2, полученную в примере 1, смешивали с равным количеством иммунного адъюванта (адъюванта Фрейнда) и внутримышечно вводили пяти 8-недельным самкам мышей BALB/c для иммунизации. Для первичной иммунизации использовали 100 мкг плазмидной ДНК на мышь. После этого бустерную иммунизацию выполняли каждые 2 или 3 недели, всего 5 раз, используя каждый раз 50 мкг плазмидной ДНК на мышь. При последней бустерной иммунизации стабильные клетки СНО, сверхэкспрессирующие CLDN-18.2, использовали совмещенно, и каждой мыши клетки инъецировали внутрибрюшинно в количестве 1е+7.

2.2. Слияние клеток

Через четыре дня после последней дозы бустерной иммунизации у мышей отбирали паховый лимфатический узел, подколенный лимфатический узел и селезенку, а после измельчения в среде DMEM отбирали суспензию, богатую лимфоцитами, и лимфоциты сливали с мышиными миеломными клетками Sp2/0 (АТСС) в соответствии с традиционной методикой слияния под действием электрического поля. Продукт слияния культивировали в полной среде DMEM, содержащей 1: 50 HAT (гипоксантин, аметоптерин и тимидин) в течение 5 дней для скрининга успешно слитых клеток (т.е/ гибридомных клеток). Затем полную среду DMEM заменяли на полную среду DMEM, содержащую 1: 50 НТ (гипоксантин и тимидин) до конца скрининга.

Соотношение составов в полной среде DMEM: 15% FBS (эмбриональная бычья сыворотка) + 1: 50 L-глутамина+100 ЕД/мл пенициллина+1: 100 OPI (оксалоацетат, пируват и инсулин), условия в термостате: 8% CO₂, 37°С.

Пример 3. Скрининг мышиных гибридомных клеток и тестирование эффективности полученного мышиного антитела к CLDN-18.2

Из 3840 разных поликлональных гибридомных клеточных линий согласно реакции связывания на клеточном уровне отсеяли гибридомные клеточные линии, экспрессирующие антитело, которое может связываться с белком CLDN-18.2 человека и не связываться с белком CLDN18.1 человека. После того, как путем субклонирования получили моноклональные гибридомные клеточные линии, выполняли функциональный скрининг в соответствии с ADCC и CDC in vitro и в результате получили 7 моноклональных гибридомных клеточных линий, соответствующих экспрессированным антителам 1Н17, 2 В19, 4G3, 9J24, 9024, 10L8 и 10N10, которые специфически связываются с рекомбинантным белком CLDN-18.2 человека и не связываются с рекомбинантным белком CLDN-18.1 человека и обладают высокими ADCC- и CDC-активностями.

Пример 4. Определение последовательности вариабельной области мышиного антитела к CLDN-18.2 (представлено согласно Кабату или IMGT)

Кодирующую последовательность ДНК, соответствующую вариабельной области мышиного антитела к CLDN-18.2, определяли способом, основанным на ПЦР с вырожденными праймерами. Кандидатные гибридомные клетки культивировали, центрифугировали при 1000 об/мин и собирали, а общую РНК экстрагировали тризолом. Используя общую РНК в качестве матрицы, синтезировали кДНК первой нити, а затем кодирующую последовательность ДНК, соответствующую вариабельной области, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием кДНК первой нити в качестве последующей матрицы. Последовательности праймеров, использованные в реакции амплификации, были комплементарны первой каркасной области вариабельной области и константной области антитела (Larrick, J.W. et al., 1990, Scand. J. Immunol., 32, 121-128 и Coloma, J.J. et al., (1991) BioTechniques, 11, 152-156). В реакционную смесь объемом 50 мкл добавляли 1 мкл кДНК, 5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, по 1 мкл каждого прямого и обратного праймеров (25 пмоль), 1 мкл dNTP, 1 мкл 25 ммоль PL MgCl₂ и 39 мкл H₂O и предварительно денатурировали при 95°С в течение 10 мин, затем добавляли 1 мкл фермента Taq и подвергали воздействию температурного цикла для ПЦР-амплификации. Условия реакции были следующими: 32 цикла денатурации при 94°С в течение 1 мин, отжига при 58°С в течение 1 мин и элонгации при 72°С в течение 15 сек. с последующим выдерживанием при 72°С в течение 10 мин. Выделяли и очищали продукт ПЦР. Амплифицированный продукт секвенировали с получением аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи мышиного антитела к CLDN-18.2.

В базах данных последовательностей зародышевого типа и Ig с перегруппировкой вариабельных областей выполняли поиск консенсусных последовательностей с использованием NCBI Ig-Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/). На основании системы по Кабату (Wu, Т. Т/ and Kabat, Е.А. 1970 J. Exp. Med., 132:211-250) и системы IMGT (Lefranc M.-P. et al., 1999 Nucleic Acids Research, 27, 209-212) посредством аннотации последовательности и анализа последовательности в Интернете (http://www.Imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html и http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) определяли аминокислотные последовательности областей, определяющих комплементарность (CDR).

Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи и CDR мышиного антитела к CLDN-18.2 показаны в таблице ниже:

Пример 5. Конструирование химерного антитела к CLDN-18.2

Учитывая уровень экспрессии, активность, тип и другие характеристики антитела, экспрессируемого гибридомными клетками, мышиные антитела к CLDN-18.2 (1Н17, 1Н17-2, 2В19, 4G3, 9J24 и 9024) выбрали для продолжения эксперимента.

Кодирующие последовательности константной области Fc-фрагмента тяжелой цепи и константной области легкой к-цепи клонировали из клеток крови человека (из Beijing Institute of Blood) и вводили в плазмиду pCDNA3.1. Кодирующие последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи вышеупомянутого мышиного антитела к CLDN-18.2 синтезировали в компании Genscript. Кодирующие последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и кодирующие последовательности вариабельных областей легкой цепи разных мышиных антител к CLDN-18.2 расщепляли с использованием Bspq I, а затем вводили с использованием различных комбинаций, показанных в таблице 2, в плазмиду pCDNA3.1, в которую были введены кодирующие последовательности константных областей, и правильные клоны были подтверждены посредством секвенирования. Различные химерные плазмиды для экспрессии тяжелых и легких цепей смешивали и объединяли в пары для трансфекции экспрессионных клеток и получали 5 химерных антител к CLDN-18.2 с нумерацией и соответствующими аминокислотными последовательностями вариабельных областей, показанными в таблице 2. Затем материалы для эксперимента извлекали из клеток, трансфицированных этой серией плазмид.

Пример 6. Идентификация химерного антитела

6.1 Аффинность связывания антител

Клеточные линии рака желудка NUGC4-CLDN-18.2, сверхэкспрессирующие человеческий CLDN-18.2, инкубировали с вышеупомянутыми химерными антителами к CLDN-18.2 (Chi-JS012-2, Chi-JS012-9, Chi-JS012-10, Chi-JS012-21 и Chi-JS012-27) в серии градиентных разведений при 4°С в течение 30 мин соответственно, затем промывали и инкубировали с флуоресцентно меченым вторичным антителом. По завершении определяли интенсивность флуоресценции посредством проточного цитометра BD Canto II. Чем сильнее флуоресцентный сигнал, тем выше аффинность антитела к мишени. Кривую зависимости доза антитела-связывание строили с использованием GraphPad (фиг. 1) и рассчитывали ЕС₅₀ (таблица 3). В качестве положительных и отрицательных контролей использовали антитело IMAB362 и человеческое антитело IgGl к KLH соответственно.

Как показано на фиг. 1 и в таблице 3, все Chi-JS012-2, Chi-JS012-9, Chi-JS012-10, Chi-JS012-21 и Chi-JS012-27 могут связываться с человеческим CLDN-18.2, который высоко экспрессируется на данной поверхности клеток линии рака желудка NUGC4-CLDN-18.2.

Таблица 3. Аффинность химерного антитела к CLDN-18.2 на клеточном уровне (ЕС₅₀)

6.2 Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC)

Вышеупомянутые химерные антитела к CLDN-18.2 (Chi-JS012-2, Chi-JS012-9, Chi-JS012-10, Chi-JS012-21 и Chi-JS012-27) в серии градиентных разведений инкубировали с клеткой-мишенью CHO-CLDN-18.2, сверхэкспрессирующей CLDN-18.2 человека (50000 клеток), и эффекторной клеткой Jurkat ADCC, экспрессирующей NFAT-Luc и FcyRIHaR (100000 клеток), при 37°С в течение 6 ч, затем добавляли субстрат ONE-Glo и определяли сигнал люциферазы посредством устройства для считывания микропланшетов. Более высокие показатели флуоресценции указывали на более сильные эффекты ADCC. Кривые зависимости доза антитела-эффект ADCC аппроксимировали с использованием GraphPad (фиг. 2а и 2b), а в качестве положительного и отрицательного контролей использовали антитело IMAB362 и человеческое антитело IgGl к KLH соответственно.

Как показано на фиг. 2а и 2b, значения ЕС₅₀ в отношении эффектов ADCC, опосредованных Chi-JS012-2, Chi-JS012-9, Chi-JS012-10, Chi-JS012-21 и Chi-JS012-27, составляли 56,08 нг/мл, 43,6 нг/мл, 49,51 нг/мл, 63,09 нг/мл и 43,21 нг/мл соответственно, что сопоставимо с положительным контролем IMAB362 (фиг. 2а: 35,98; фиг. 2b: 34,41 нг/мл).

6.3 Комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC)

Клетки-мишени CHO-CLDN-18.2, сверхэкспрессирующие CLDN-18.2 человека (100000 клеток), смешивали с вышеупомянутыми химерными антителами к CLDN-18.2 (Chi-JS012-2, Chi-JS012-9, Chi-JS012-10 и Chi-JS012- 27) в серии градиентных разведений, добавляли десятикратно разбавленный сывороточный комплемент (Quidel, кат. №А113) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. По завершении клетки ресуспендировали в PBS и добавляли краситель PI, и после инкубации при 4°С в течение 5 мин интенсивность флуоресценции определяли посредством проточного цитометра BD Canto II. Кривую зависимости доза антитела-комплементзависимая цитотоксичность строили с использованием GraphPad (фиг. 3). В качестве положительных и отрицательных контролей использовали антитело IMAB362 и человеческое антитело IgG1 к KLH соответственно.

Как показано на фиг. 3, значения ЕС₅₀ в отношении эффектов CDC, опосредованных Chi-JS012-2, Chi-JS012-9, Chi-JS012-10 и Chi-JS012-27, составляли 461,2 нг/мл, 316 нг/мл, 358,3 нг/мл и 264,5 нг/мл соответственно, что сопоставимо с положительным контролем IMAB362 (353,6 нг/мл).

Пример 7. Гуманизация вариабельных областей антител

Для таких целей, как снижение иммуногенности антитела, вариабельные области антитела гуманизировали и оптимизировали. Результаты оптимизации следующие:

Таким образом, получили серию гуманизированных антител к CLDN-18.2.

Гуманизированные антитела к CLDN-18.2 (JS012-Chi9-hu7, JS012-Chi9-hu7-v2, JS012-Chi27-hu3-v2, JS012-Chi27-hu6-v3-2 и JS012-Chi2-hu2-v3-2) использовали в последующем эксперименте. Последовательности CDR/вариабельной области вышеуказанных антител показаны в таблицах 4-1 и 4-2, а аминокислотные последовательности и нуклеотидные кодирующие последовательности тяжелых/легких цепей показаны в таблице 5.

Кодирующие последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей гуманизированных антител к CLDN-18.2 синтезировали в компании Genscript.

Кодирующие последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и кодирующие последовательности вариабельных областей легкой цепи разных синтезированных гуманизированных антител к CLDN-18.2 расщепляли с использованием Bspq I, а затем вводили в плазмиду pCDNA3.1, которая содержала кодирующие последовательности константных областей, и правильность клонов подтверждали секвенированием. Различные плазмиды для экспрессии гуманизированных тяжелых и легких цепей смешивали и объединяли в пары для трансфекции экспрессирующих клеток (CHOK1 18, Suzhou Junmeng Biosciences Co., Ltd.), а экспрессированные антитела выделяли центрифугированием и очищали в соответствии со стандартными способами получения гуманизированных антител к CLDN-18.2 в таблицах 4-1 и 4-2.

Из них гуманизированное антитело JS012-Chi2-hu2-v3-2 оптимизировали путем добавления модулятора гликоформы (CDFS01, Shanghai ОРМ Biosciences Co., Ltd.) в ходе культивирования клеток с получением дефукозилированного антитела JS012-Chi2-hu2-v3-2a. Антитело JS012-Chi2-hu2-v3-2a представляет собой гуманизированное антитело к CLDN-18.2 с фукозилированием менее 30%.

Пример 8. Идентификация гуманизированных антител к CLDN-18. 2

Связывающую активность 5 гуманизированных антител к CLDN-18.2 (JS012-Chi9-hu7, JS012-Chi9-hu7-v2, JS012-СЫ27-hu3-v2, JS012-Chi27-hu6-v3-2 и JS012-Chi2-hu2-v3-2) выявляли с использованием FACS путем определения связывающей активности антител к CLDN-18.2, экспрессированных на клеточной поверхности. Клетки NUGC4-CLDN-18.2 инкубировали с серийно разбавленными разными концентрациями вышеупомянутых гуманизированных антител к CLDN-18.2, затем промывали и инкубировали с флуоресцентно меченым вторичным антителом. Флуоресцентный сигнал выявляли с помощью FACS: чем сильнее выявленный флуоресцентный сигнал, тем выше аффинность антитела, то есть выше активность связывания с мишенью. Кривые связывания антител аппроксимировали с использованием GraphPad (фиг. 4а, 4b и 4с), а в качестве положительного и отрицательного контролей использовали антитело IMAB362 и человеческое антитело IgG1 к KLH соответственно.

Как показано на фиг. 4а, 4b и 4с, JS012-Chi9-hu7-v2, JS012-Chi9-hu7, JS012-Chi27-hu3-v2, JS012-Chi2-hu2-v3-2 и JS012-Chi27-hu6-v3-2 может связываться с человеческим CLDN-18.2, высоко экспрессируемым на поверхности клеток линии рака желудка NUGC4, при этом значения ЕС₅₀ для JS012-Chi9-hu7-v2, JS012-Chi9-hu7, JS012-Chi27-hu3-v2 и JS012-Chi2-hu2-v3-2 были сопоставимы с положительным контролем.

Пример 9. ADCC, опосредованная гуманизированными антителами к CLDN-18.2

Гуманизированные антитела к CLDN-18.2 относились к подтипу IgGl человека и могут опосредовать эффект ADCC. Fc-конец антител связывается с рецептором FcγIIIaR на поверхности NK-клеток и активирует NK-клетки для уничтожения клеток-мишеней. Используя систему экспрессии люциферазы под контролем NFAT, экспрессирующую FcγIIIaR, эффект ADCC in vivo моделировали с использованием системы репортерных генов. Гуманизированные антитела к CLDN-18.2 совместно инкубировали с клетками-мишенями CH0-CLDN-18.2 и эффекторными клетками Jurkat ADCC, и сигнал регистрировали с использованием устройства для считывания микропланшетов после добавления субстрата ONE-Glo. Данные анализировали с использованием GraphPad для сравнения дозозависимых ADCC-эффектов антител (фиг. 5а, 5b и 5 с). В качестве положительных и отрицательных контролей использовали антитело IMAB362 и человеческое антитело IgGl к KLH соответственно.

Как показано на фиг. 5а, 5b и 5с, значения ЕС₅₀ для эффектов ADCC, опосредованных JS012-Chi9-hu7-v2, JS012-Chi9-hu7, JS012-Chi27-hu3-v2, JS012-Chi2-hu2-v3-2 и JS012-Chi27-hu6-v3-2, соответственно составляли 22,5 нг/мл, 23,63 нг/мл, 35,75 нг/мл, 14,18 нг/мл и 74,24 нг/мл, причем все приведенные значения были значительно лучше, чем у положительного контроля IMAB362.

Пример 10. CDC, опосредованная гуманизированными антителами к CLDN-18.2

Гуманизированные антитела к CLDN-18.2 также могут опосредовать эффект CDC и уничтожать клетки-мишени путем образования мембраноатакующих комплексов. Сывороточный комплемент (разведение 1: 10) инкубировали с гуманизированными антителами к CLDN-18.2 и клетками-мишенями CHO-CLDN-18.2 (100000 клеток) в термостате при 37°С в течение 1 часа, а выживание и уничтожение клеток-мишеней определяли путем окрашивания иодидом пропидия (PI) для расчета относительного показателя цитолиза. Дозозависимый эффект CDC, опосредованный гуманизированными антителами к CLDN-18.2, выражался относительным показателем цитолиза (фиг. 6а, 6b и 6с). В качестве положительных и отрицательных контролей использовали антитело IMAB362 и человеческое антитело IgG1 к KLH соответственно.

Как показано на фиг. 6а, 6b и 6с, значения ЕС₅₀ для эффектов CDC, опосредованных JS012-Chi9-hu7-v2, JS012-Chi9-hu7, JS012-Chi27-hu3-v2, JS012-Chi2-hu2-v3-2 и JS 012-Chi27-hu6-v3-2, соответственно составляли 134,2 нг/мл, 86,04 нг/мл, 168,9 нг/мл, 166,5 нг/мл и 714,9 нг/мл, при этом JS012-Chi9-hu7-v2, JS012-Chi9-hu7, JS012-Chi27-hu3-v2 и JS012-Chi2-hu2-v3-2 значительно превосходили положительный контроль IMAB362.

Пример 11. Ингибирующий эффект гуманизированных антител к CLDN-18.2 в отношении опухолевого роста клеток рака желудка человека MKN45 hClaudinl8.2 Mixeno, трансплантированных мышам М-NSG

1. Цель тестирования

Оценка противоопухолевого эффекта у JS012-Chi2-hu2 v3-2a по настоящему изобретению в модели подкожной трансплантации клеток рака желудка человека MKN45 hClaudinl8.2 Mixeno.

2. Процесс тестирования

5×10⁶ опухолевых клеток MKN45 hClaudinl8.2 (Shanghai Novobiosci Co., Ltd) смешивали с 5×10⁶ клеток РВМС (Shanghai OriBiotech Co., Ltd), мышам M-NSG (Shanghai Model Organisms Center, Inc) подкожно на правой стороне спины инокулировали смесь из расчета 0,2 мл/мышь (культуральная среда RPMI1640 (Gibco), содержащая клетки и 50% Matrigel) и в зависимости от массы тела отбирали 50 мышей и рандомно разделяли на следующие 5 групп (10 мышей/группа).

Группа отрицательного контроля: человеческое антитело IgG1 к KLH, 10 мг/кг;

группа обработки посредством JS012-Chi2-hu2 v3-2a, 1 мг/кг;

группа обработки посредством JS012-Chi2-hu2 v3-2a, 3 мг/кг;

группа обработки посредством JS012-Chi2-hu2 v3-2a, 10 мг/кг;

и группа положительного контроля IMAB362, 10 мг/кг.

В день распределения в группы введение осуществляли через 4 часа после инокуляции опухолевых клеток. Путь введения для всех групп - внутрибрюшинная инъекция. Введение осуществляли два раза в неделю в течение 9 последовательных введений. Эксперимент завершали через 3 дня после последнего введения. Дважды в неделю измеряли объем опухоли и массу тела и регистрировали массу тела и объем опухоли у мышей. В конце эксперимента мышей подвергали эвтаназии и рассчитывали показатель ингибирования опухоли TGI% (TGI%=[1-Т/С]×100%). (Т: средний объем опухоли в группе обработки или группе положительного контроля в конце эксперимента, С: средний объем опухоли в группе отрицательного контроля в конце эксперимента).

Как показано на фиг. 7, в конце эксперимента средний объем опухоли в группе отрицательного контроля (человеческое антитело IgG1 к KLH) составлял 1276±228 мм³. Средние объемы опухолей в группе введения JS012-Chi2-hu2a v3-2 в дозах 1, 3 и 10 мг/кг составили 235±25 мм³, 243±33 мм³ и 343±63 мм³ соответственно, a TGI составил 81,6%, 81,0% и 73,1% соответственно, демонстрируя значительный эффект ингибирования опухоли. Средний объем опухоли в группе введения IMAB362 в дозе 10 мг/кг составил 361±73 мм³, a TGI составил 71,7%. При условии введения той же дозы (10 мг/кг) эффект ингибирования опухоли антителом JS012-Chi2-hu2 v3-2a был несколько лучше, чем у IMAB3 62.

Пример 12. Ингибирующий эффект гуманизированных антител к CLDN-18.2 в отношении опухолевого роста клеток рака поджелудочной железы человека hCLDNl 8.2 MIA РаСа-2, трансплантированных мышам СВ-17 SCID

1. Цель тестирования

Оценка противоопухолевой эффективности у JS012-Chi2-hu2 v3-2а по настоящему изобретению в модели подкожной трансплантации клеток рака поджелудочной железы человека hCLDN18.2 MIA РаСа-2.

2. Процесс тестирования

5×10⁶ клеток hCLDN18.2 MIA РаСа-2 (Accurusbio-C3002) инокулировали мышам SCID СВ-17 (Shanghai JiHui Experimental Animal Co., Ltd.) подкожно на правой стороне спины в дозе 0,2 мл/мышь (культуральная среда DMEM (Gibco), содержащая клетки и 50% матригеля), и когда средний объем опухоли составлял приблизительно 8 9 мм³, в зависимости от объема опухоли отбирали 40 мышей и рандомно разделяли на следующие 5 групп (8 мышей/группе):

Группа отрицательного контроля: человеческое антитело IgGl к KLH, 3 мг/кг;

группа положительного контроля IMAB362, 3 мг/кг;

группа обработки посредством JS012-Chi2-hu2 v3-2a, 0,3 мг/кг;

группа обработки посредством JS012-Chi2-hu2 v3-2a, 1 мг/кг;

и группа обработки посредством JS012-Chi2-hu2 v3-2a, 3 мг/кг;

Введение осуществляли в день распределения в группы. Путь введения для всех групп - внутрибрюшинная инъекция. Введение осуществляли два раза в неделю в течение 6 последовательных введений. Эксперимент завершали через 4 дня после последнего введения. Объем опухоли и массу тела измеряли 3 раза в неделю и регистрировали массу тела и объем опухоли у мышей. В конце эксперимента мышей подвергали эвтаназии и рассчитывали показатель ингибирования опухоли TGI% (TGI%=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100%). (Ti: средний объем опухоли в группе обработки или в группе положительного контроля в день i после введения, Т0: средний объем опухоли в группе обработки или в группе положительного контроля в день 0 после введения; Vi: средний объем опухоли в группе отрицательного контроля в день i после введения и V0: средний объем опухоли в группе отрицательного контроля в день 0 после введения).

Как показано на фиг. 8, в конце эксперимента средний объем опухоли в группе введения человеческого антитела IgG1 к KLH составлял 2235±145 мм³. Средний объем опухоли в группе введения IMAB362 в дозе 3 мг/кг составлял 465±74 мм³, a TGI составлял 82,5%. Средние объемы опухолей в группе введения JS012-Chi2-hu2 v3-2a в дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг составляли 1455±142 мм³, 673±153 мм³ и 74±19 мм³ соответственно, a TGI составлял 36,3%, 72,8% и 100,6% соответственно, демонстрируя значительный эффект ингибирования опухоли. При условии введения той же дозы (3 мг/кг) эффект ингибирования опухоли антителом JS012-Chi2-hu2 v3-2a был значительно лучше, чем у IMAB362.

Перечень последовательностей

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SHANGHAI JUNSHI BIOSCIENCES CO., LTD.

SUZHOU JUNMENG BIOSCIENCES CO., LTD.

<120> АНТИТЕЛО К CLDN-18.2 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<140> PCT/CN2021/106125

<141> 2021-07-13

<150> CN2020106714138

<151> 2020-07-13

<160> 101

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

Asn Phe Gly Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

Cys Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 3

Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Phe Ser Phe

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

Ser Ala Ser Ser Ile Phe Ser Tyr Ile Phe

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

Leu Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

His Gln Trp Lys Ile Thr His Thr

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 7

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 8

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 8

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 9

Gln Asn Val Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 10

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 11

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 12

Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 13

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 14

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 14

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 15

Gln Asn Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 16

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 16

Ser Phe Gly Val Ser

1 5

<210> 17

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 17

Ala Ile Trp Ala Gly Gly Asn Arg Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser

1 5 10 15

<210> 18

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 18

Gly Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Ala Asn

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 19

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 20

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 20

Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 21

Gln Asn Ala Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 22

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 22

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 23

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 23

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 24

Ser Tyr Asn Gly Asn Ser Leu Pro Tyr

1 5

<210> 25

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 25

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 26

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 26

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 27

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 28

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 28

Ser Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 29

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 29

Thr Ile Ser Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 30

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 30

Ser Tyr Asn Gly Asn Ser Leu Pro Tyr

1 5

<210> 31

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 31

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 32

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 32

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 33

Gln Asn Thr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 34

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 34

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 35

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 35

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 2

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 36

Gly Tyr

1

<210> 37

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 37

Asn Tyr Leu Ile Glu

1 5

<210> 38

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 38

Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 39

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 39

Pro His Asp Gly Tyr Tyr Phe Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 40

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 40

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Phe Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 41

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 41

Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 42

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 42

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Cys Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Phe Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 105

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 43

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ile Phe Ser Tyr Ile

20 25 30

Phe Trp Ser Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Lys Ile Thr His Thr Phe

85 90 95

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 44

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 44

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Val Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 45

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 45

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Ser Glu Thr Ser Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 46

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe Leu Thr Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Val

100 105 110

Lys

<210> 47

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 47

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Phe

20 25 30

Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Ala Ile Trp Ala Gly Gly Asn Arg Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Thr Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Ser Tyr Gly Ser Ser Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 48

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Thr Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Phe Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 49

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 49

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Ser Glu Thr Ser Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Gly Met Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Asn Gly Asn Ser Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 50

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 51

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 51

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Cys Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Asn Gly Asn Ser Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 52

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 52

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ile Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Thr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Asp Leu

100 105 110

Lys

<210> 53

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 53

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 54

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 54

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Pro His Asp Gly Tyr Tyr Phe Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 55

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 55

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Ser Asp Thr Ser Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 56

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 57

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Asn Gly Asn Ser Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 59

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ser Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Asn Gly Asn Ser Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 60

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 60

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Phe Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 61

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 61

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Val Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 62

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> X представляет собой замену, показанную в описании

<400> 62

Xaa Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Xaa Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 63

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> X представляет собой замену, показанную в описании

<400> 63

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Xaa Phe Xaa

1 5 10 15

Gly

<210> 64

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 64

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Phe Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 65

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 65

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Val Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 66

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 66

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgagactg 60

agctgcgccg ccagcggctt caccctgaac aacttcggca tgcactgggt gagacaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtgagctcc atcagcagcg gcagcggcac catctactac 180

gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca accccaagaa cagcctgtac 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagcctac 300

tacggcaacg gcttcagctt ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgctagc 360

accaagggcc catccgtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga cgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

tccctctccc tgtctccggg taaatga 1347

<210> 67

<211> 663

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 67

gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60

atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120

tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc cagcaccaga 180

gagagcggcg tgcccgacag attcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240

atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacgt gtacagctac 300

cccctgacct tcggccaggg caccaagctg gagatcaagc gaactgtggc tgcaccatct 360

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660

tag 663

<210> 68

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 68

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Ser Asp Thr Ser Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 69

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 69

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 70

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 70

cagatccagc tggtgcagag cggcagcgag ctgaagaagc ccggcgagag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gagacaggcc 120

cccggccagg gcctggagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gagcacctac 180

gccgacggct tcaccggcag attcgtgttc agcagcgaca ccagcgccag aaccgcctac 240

ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt acttctgcgc caccctgggc 300

tacggcaaca gcctggccta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgctagc 360

accaagggcc catccgtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga cgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

tccctctccc tgtctccggg taaatga 1347

<210> 71

<211> 663

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 71

gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60

atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagagaaa ctacctgacc 120

tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc cagcaccaga 180

gagagcggcg tgcccgacag attcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240

atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacaa ctacttctac 300

cccttcacct tcggccaggg caccaagctg gagatcaagc gaactgtggc tgcaccatct 360

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660

tag 663

<210> 72

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 72

Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 73

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 73

Ala Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Ser Phe

1 5

<210> 74

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 74

Thr Ile Ser Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 75

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 75

Ser Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Pro Tyr

1 5

<210> 76

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 77

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 77

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Val Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 78

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Phe Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 79

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 79

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Ser Asp Thr Ser Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 80

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 80

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 81

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 81

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile

100 105 110

Lys

<210> 82

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 83

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Asn Gly Asn Ser Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 84

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 84

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 85

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 85

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Val Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 86

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 86

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Ala Phe Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 87

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 87

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Val Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 88

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 88

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Phe Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 89

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 89

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Val Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 90

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 90

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Ser Asp Thr Ser Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 91

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 91

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 92

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 92

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 93

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 93

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 94

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 94

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Ser Asp Thr Ser Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 95

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 95

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Ala Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 96

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 96

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 97

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 97

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 98

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 98

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 99

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 99

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 100

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 100

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Gly Gly Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Asn Gly Asn Ser Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 101

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 101

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asn Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу против CLDN-18.2 или его антигенсвязывающему фрагменту. Раскрыты полинуклеотид, кодирующий указанное антитело; вектор экспрессии; клетка-хозяин; фармацевтическая композиция или комбинация. Также раскрыт способ получения антитела против CLDN-18.2; применение указанного антитела для лечения или профилактики заболевания или патологического состояния, опосредованных CLDN-18.2. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевание, ассоциированное с CLDN-18.2. 9 н. и 11 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 табл., 12 пр.

1. Антитело против CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:

(I) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, соответственно; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, соответственно; или

(II) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, соответственно; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9, соответственно; или

(III) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 соответственно; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15, соответственно; или

(IV) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:18, соответственно; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21, соответственно; или

(V) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:24, соответственно; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27, соответственно; или

(VI) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:30, соответственно; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:33, соответственно; или

(VII) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 и SEQ ID NO:36, соответственно; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27, соответственно; или

(VIII) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38 и SEQ ID NO:39, соответственно; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:33, соответственно.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где

(1) вариабельная области тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:42, 45, 47, 49, 51, 53, 54, 76, 78, 82 и 83, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:42, 45, 47, 49, 51, 53, 54, 76, 78, 82 и 83; и

вариабельная области легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:43, 44, 46, 48, 50 и 52, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:43, 44, 46, 48, 50 и 52; или

(2) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:42, и

вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:43; или

вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:42, и

вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:44; или

вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной

последовательностью SEQ ID NO:45, и

вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46; или

вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:47, и

вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:48; или

вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:49, и

вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:50; или

вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:51, и

вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:52; или

вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:53, и

вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:50; или

вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:54, и

вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:52.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где

(1) вариабельная области тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:55, 57, 76, 78, 79, 82 и 83, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:55, 57, 76, 78, 79, 82 и 83; и

вариабельная области легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:56, 61, 77, 80 и 81, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:56, 61, 77, 80 и 81; или

(2) вариабельная область тяжелой цепи содержит любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:55, 57, 76, 78, 79, 82 или 83; и

вариабельная область легкой цепи содержит любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:56, 61, 77, 80 или 81; или

(3) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:55, 57, 82 или 83; и

вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:56; или

(4) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76 или 78; и

вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:61; или

(5) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:55; и

вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:56; или

(6) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:57; и

вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:56; или

(7) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:76; и

вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:77; или

(8) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:79; и

вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:80; или

(9) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:55; и

вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:81.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где

(1) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:84, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:84; и

легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:85, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:85; или

(2) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:86, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:86; и

легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:87, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:87; или

(3) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:88, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:88; и

легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:89, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:89; или

(4) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:90, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:90; и

легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:91, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:91; или

(5) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность

SEQ ID NO:92, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:92; и

легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:93, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:93; или

(6) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:94, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:94; и

легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:95, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:95;

(7) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:98, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:98; и

легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:99, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:99; или

(8) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:100, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:100; и

легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:101, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:101.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело; антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, sdAb или диантитело.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело представляет собой IgG любого подтипа, такого как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело является гипофукозилированным или афукозилированным.

8. Выделенное антитело против CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, имеющее одно или несколько из следующих свойств:

(1) связывание с белком CLDN-18.2 человека, но не связывание с CLDN-18.1 человека;

(4) индуцирование механизма ADCC в отношении клеток, экспрессирующих белок CLDN-18.2 человека; и

(5) индуцирование механизма CDC в отношении клеток, экспрессирующих белок CLDN-18.2 человека.

9. Полинуклеотид, кодирующий антитело против CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8.

10. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.9.

11. Вектор по п.10, где вектор представляет собой эукариотический вектор экспрессии.

12. Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело против CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где клетка содержит полинуклеотид по п.9 или вектор экспрессии по п.10 или 11.

13. Клетка по п.12, где клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.

14. Клетка по п.13, где клетка представляет собой клетку млекопитающего.

15. Способ получения антитела против CLDN-18.2 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8, включающий

культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 12-14 в условиях, подходящих для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение экспрессированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина.

16. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или состояния, опосредованного CLDN-18.2, содержащая антитело против CLDN-18.2 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, полинуклеотид по п.9, вектор экспрессии по п.10 или 11, клетку-хозяина по любому из пп.12-14 и фармацевтически приемлемые носитель или вспомогательное вещество.

17. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8, полинуклеотида по п.9, вектора экспрессии по п.10 или 11, клетки-хозяина по любому из пп.12-14 или фармацевтической композиции по п.16 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики заболевания или патологического состояния, опосредованных CLDN-18.2.

18. Применение по п.17, где заболевание или патологическое состояние представляет собой рак.

19. Применение по п.18, где рак выбран из рака желудка, рака пищевода, гастроэзофагеального рака, рака поджелудочной железы, холангиокарциномы, рака легкого, рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря, рака кишечника и рака мочевого пузыря.

20. Фармацевтическая комбинация для лечения заболевания или состояния, опосредованного CLDN-18.2, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, полинуклеотид по п.9, вектор экспрессии по п.10 или 11, клетку-хозяина по любому из пп.12-14 или фармацевтическую композицию по п.16 и одно или несколько дополнительных терапевтических средств.