Композиция для стимулирования регенерации соединительной ткани человека, способ ее получения и применения Российский патент 2025 года по МПК A61K35/16 A61K35/15 A61P17/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Группа изобретений относится к области биотехнологии и медицины и представляет собой композицию для стимулирования регенерации соединительной ткани, пораженной вследствие ожогов и/или травм, способу ее получения, а также способу лечения пораженной соединительной ткани с использованием указанной композиции. Группа изобретений может быть использована при лечении поражений мягкой соединительной ткани (механических и термических повреждениях), а также при лечении травм опорно-двигательного аппарата (переломы костей) и дегенеративно-дистрофических изменений опорно-двигательного аппарата и мягких тканей (межпозвоночные грыжи, артрозы суставов).

Уровень техники

Известна композиция для регенерации кожи и слизистых оболочек, включающая культуральную питательную среду, включающую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемую для культивирования in vitro эукариотических клеток, и кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами эукариотических клеток, выделяемыми ими в питательную среду в процессе их культивирования [Патент RU 2455354 C1, опубл. 10.07.2012].

Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения является композиция, предназначенная для стимуляции заживления ран и лечения ожогов, содержащая питательную среду, кондиционированную трехмерной клеточной культурой при культивировании in vitro в течение времени, достигающего 14 суток [Патент RU 2280459 C2, опубл. 20.01.2005). Культивированные в трех измерениях клеточные культуры включают в себя стромальные и/или паренхимные клетки, в том числе генетически сконструированные клетки. Композиция содержит названную кондиционированную культуральную среду, из которой отделены клетки, использованные для кондиционирования этой среды. В композиции кондиционированная клеточная среда культивирования может быть объединена с фармацевтически приемлемым носителем и другими соединениями. Недостатками данной известной композиции являются:

- отсутствие данных о составе групп ростовых факторов, цитокинов и стероидных гормонов, входящих в состав кондиционированной среды, что не позволяет определить возможности клинического применении композиции и проводить обоснованный выбор методики терапии;

- усложнение технологического процесса создания композиции вследствие необходимости многократной замены культуральной питательной среды;

- значительные объемы культуральной питательной среды, необходимой для проведения процессов культивирования клеток и кондиционирования культуральной питательной среды, что приводит к ее необоснованному расходу и, соответственно, к увеличению затрат на ее приобретение;

- большое время на получение кондиционированной среды, значение которого достигает 40 суток;

- недостаточно высокий уровень эффективности применения композиции при ведении лечебного процесса;

- невозможность получения кондиционированных сред и композиций с повышенными уровнями концентраций продуктов жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток и ростовых факторов.

Известна также композиция для стимуляции роста и регенерации клеток, которая содержит разрушенные клетки лейкоцитов периферической крови и стволовых и/или прогениторных клеток в кондиционированной среде их культивирования с тканеспецифическим антигеном, соответствующим поврежденному органу, регенерацию которого следует осуществить, и фармацевтически приемлемый носитель. Культуральная среда для культивирования клеток может быть любой средой для культивирования клеток, которая соответствует потребностям культивируемых клеток в питательных элементах, а длительность процесса культивирования может достигать 60 суток. Кондиционирование может быть осуществлено стромальными клетками, клетками костного мозга, паренхиматозными клетками, резервными клетками печени, стволовыми нервными клетками, стволовыми клетками поджелудочной железы и/или эмбриональными стволовыми клетками [Патент RU2341270 С2, опубл. 10.07.2008; МПК: A61K 35/12].

Таким образом, задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности процессов изготовления и практического применения в лечебном процессе композиции для стимулирования регенерации соединительной ткани.

К достигнутым техническим результатам предлагаемого изобретения относятся ускорение заживления раны, роста кожного покрова, роста сосудов и соединительной ткани, снижением отека, воспаления и болевого синдрома.

Раскрытие сущности изобретения

Теоретической предпосылкой изобретения была идея создания локального депо аутологичных живых, активированных клеток во внутрикожном слое дермы. Эффект клеточной терапии опосредован как наличием во вводимом во внутрикожном слое дермы клеточном препарате синтезированных за время инкубации in vitro цитокинов и других биологически активных веществ, так и продолжающимся после введения синтезом их in vivo активированными клетками. Активированная клетка крови, введенная локально в патологический очаг, выполняя свою функцию, купирует патологическое воспаление, запускает или усиливает естественный каскад реакций по заживлению. Особая эффективность наблюдается при хронических, длительно текущих повреждениях, когда естественные каскады реакций по восстановлению и регенерации либо слабые, либо блокируются хроническим воспалением. Для активации клеток крови используются различные медиаторы в зависимости от цели терапии. Так, например, при лечении посттравматических поражений суставов и околосуставных мягких тканей используются анти-апоптотичные медиаторы (ИЛ6, ИЛ8, ФНОа), которые стимулируют клеточную пролиферацию и миграцию (TGF-b, PDGF, VEGF), а также дополнительно усиливают синтез внеклеточного матрикса (коллаген, эластин и других компонентов соединительной ткани)- структурных компонентов связок, суставов, сухожилий, что приводит к быстрой регенерации и восстановлению функции органа. Восстановление уровня коллагена и эластина также широко используется с целью омоложения в косметологии, а также в программах «anti-age».

Основной объект воздействия предлагаемой композиции - это Толл-рецепторы. Известно несколько типов лигандов к этому рецептору. Одним из них является полиинозиновая-полицистидиновая кислота и ее соли. Однако этот синтетический аналог вирусной РНК плохо применим в клинической практике, так как обладает рядом побочных эффектов и высокой токсичностью.

При активации Толл-рецептора происходит образование нескольких транскприпционных факторов NF-kB и IRF3, которые, в свою очередь, активируют транскрипцию целого ряда активных молекул. Основными действующими веществами выступают провоспалительные цитокины ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО, которые кроме их основного провоспалительного эффекта, как оказалось, обладают антиапоптотичным эффектом, сохраняя жизнеспособными пролиферирующие клетки. Так же эти факторы стимулируют миграцию пролиферацию клеток в месте введения и привлекают в зону неспецифического воспаления макрофаги. Моноциты под действием факторов (за счет увеличения экспресии HIF-1 и VEGF) в ткани трансформируются в макрофагальные клетки и участвуют в регенеративных процессах. В небольших количествах, как следствие факта неспецифического воспаления, так и под действием активации Толл-рецепторов, продуцируются ростовые факторы, которые стимулируют ангиогенез, пролиферацию клеток и синтез экстраклеточного матрикса. Композиция обладает выраженным эффектом стимуляции синтеза интерферонов, они, в свою очередь, оказывают противовирусный эффект.

HIF факторы играют ключевую роль в адаптации клеток на недостаток кислорода. Описываемая технология является мощным стимулятором экспрессии HIF, что приводит к активации генов, связанных с адаптивной реакцией. Например, HIF способствует выработке эритропоэтина (EPO), миоглобина, вегетативных нейромедиаторов и других метаболических и гормональных факторов. Также описываемые процессы стимулируют аутофагические резервы клеток, что ускоряет восстановление и ремоделирование тканей, а также способствует регуляции механизмов роста и выживания клеток (Фиг. 1).

На рисунке представлена схема последовательных процессов в ткани после применения описываемой технологии. Процесс регенерации ткани происходит за счет включения нескольких механизмов, включая антиапоптотическое действие ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО, факторов роста, стимулирующих клеточную миграцию и пролиферацию, а также антибактериальный и противовирусный эффекты.

Предлагаемая композиция, предназначенная для стимулирования регенерации соединительной ткани человека, содержит взвесь человеческих лейкоцитов в сыворотке человеческой крови в концентрации 1100-1800×10³ клеток/мл, предварительно активированных липополисахаридом (ЛПС) в течение 8-24 часов в культуре in vitro тромбоцитарных гранул, цитокинов, интерлейкинов, факторов роста b-FGF, TGF-b2, VEGF, TDGF и липополисахарида. Под липополисахаридом в настоящем изобретении понимается основной компонент внешней мембраны грамотрицательных бактерий, предпочтительно, выделенный из бактерий Salmonella typhi, например, препарат «Пирогенал». Указанную композицию получают путем забора крови у пациента в вакуумную пробирку с цитратом натрия и в пробирку с натриевой солью гепарина, центрифугированием пробирки с кровью и цитратом натрия при 100 g в течение 15 минут, с последующим отбором из нее плазмы богатой тромбоцитами которую переносят в чистую вакуумную пробирку без добавок. К отобранной плазме добавляют 10% водный раствор кальция хлорида из расчета 50 мкл раствора на 1 мл плазмы. Перемешивают содержимое и инкубируют в течение 1 часа при температуре от +18 до +41°С. В процессе инкубирования в пробирке образуется сгусток фибрина.

Далее к крови в пробирке с натриевой солью гепарина добавляют 100-1000 мкл раствора липополисахарида «Пирогенал» в концентрации 50 мкг/мл, перемешивают содержимое и инкубируют от 8 до 24 часов при температуре от +18 до +41°С. После окончания инкубирования пробирку с кровью центрифугируют при 100-200 g в течение 10 минут, после отбирают плазму с суспензией лейкоцитов и смешивают с сывороткой, полученной после активации тромбоцитов. Повышение температуры в данном интервале и увеличение времени инкубирования пробирки с добавленным ЛПС увеличивает выработку цитокинов и факторов роста и других биологически активных компонентов. После смешивания двух компонентов пробирка может храниться в холодильнике при температуре +2-+8 в течение 4 часов.

Композиция может быть использована, в том числе, для стимулирования регенерации соединительной ткани человека при повреждениях, которые представляют собой травмы мягких тканей, кожных покровов; резанные, минно-взрывные, пулевые, осколочные или рваные раны; переломы, ожоги.

Способ применения композиции по настоящему изобретению зависит от типа повреждения соединительной ткани человека:

- при травмах мягких тканей производится обработка раны и ее краев антисептическими растворами. Далее полученную композицию вводят шприцем в края раны в общем объеме 1-8 мл в зависимости от размера раны. После чего на рану накладывается марлевая повязка и бинтуется или стерильный пластырь для защиты раны от попадания инфекции.

- при ожогах производится обработка раневого ложа и окружающих кожных покровов антисептическими растворами. Далее композиция вводится в края пораженного участка в объеме 1-8 мл в зависимости от размера раны. Допустимо дополнительное орошение поврежденных тканей композицией. После орошения нужно выждать 5-10 минут для того, чтобы композиция распределилась по поверхности раны и не впиталась в повязку сразу после ее наложения.

- при переломах костей композиция водится непосредственно рядом с областью перелома в объеме 1-4 мл перед инъекцией место введения необходимо обработать антисептическим раствором.

Для всех вышеописанных способов применения частота введения одной дозы композиции (объемом 1-8 мл) составляет 6-10 раз с интервалом 2-3 дня между введениями, что является одним курсом применения. Число курсов от 1 до 4 с промежутком между курсами от 2 до 4 недель.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 Предполагаемый механизм регенерации соединительной ткани человека при использовании изобретения;

Фиг. 2. Изображение травмы мягких тканей пациента 1 до применения композиции по примеру 1 на основе аутологичной сыворотки и суспензии аутологичных лейкоцитов;

Фиг. 3. Изображение травмы мягких тканей пациента 1 спустя месяц после начала применения композиции на основе аутологичной сыворотки и суспензии аутологичных лейкоцитов по примеру 1 согласно способу по примеру 2;

Фиг. 4. Рана, обработанная известной композицией на основе кондиционированной среды согласно RU 2280459 C2 на 3-е сутки;

Фиг. 5. Рана, обработанная композицией по п.1 на 3-е сутки;

Осуществление изобретения

Возможность осуществления заявленного изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение композиции для стимулирования регенерации соединительной ткани человека

Способ получения композиции представляет собой последовательность следующих стадий:

1) забор крови у пациента в вакуумную пробирку, содержащую 3,2% водный раствор цитрата натрия в объемном соотношении 9:1 к крови и в другую пробирку с гепарином натрия с расчетом 17МЕ на 1 мл крови.

2) пробирку с кровью и цитратом натрия центрифугируют при 100-300 g в течение 15 минут. После центрифугирования из пробирки отбирают плазму богатую тромбоцитами и переносят в чистую вакуумную пробирку без добавок. К отобранной плазме добавляют 10 % водный раствор кальций хлорида из расчета 50 мкл раствора на 1 мл плазмы. Перемешивают содержимое и инкубируют в течение 1 часа при температуре от +18 до +41°С. В процессе инкубирования в пробирке образуется сгусток фибрина. Далее пробирку центрифугируют 10 минут при 1500 g. В результате сгусток фибрина оседает вниз, а сверху остается сыворотка, которую отбирают.

3) в кровь в пробирке с натриевой солью гепарина добавляют 100-1000 мкл раствора ЛПС «Пирогенал» в концентрации 50 мкг/мл на 1 мл крови, перемешивают содержимое и инкубируют от 8 до 24 часов при температуре от +18 до +41°С. После окончания инкубирования пробирку с кровью центрифугируют при 100-200 g в течение 10 минут, после отбирают плазму с суспензией лейкоцитов и смешивают с сывороткой, полученной после активации тромбоцитов, в равных пропорциях. Готовую композицию можно хранить в холодильнике при температуре от +2 до +8 в течение 4 часов.

Концентрация факторов роста b-FGF, TGF-b2, VEGF, TDGF в композиции определялась методом ИФА, используя специфические наборы ELISA для каждого типа факторов роста. Сравнение концентраций факторов роста в композиции проводилось с плазмой полученной путем забора крови в и пробирку с гепарин натрия с расчетом 17МЕ на 1 мл крови, центрифугированием 10 минут при 100-200 g и отбором плазмы с суспензией лейкоцитов в 5 образцах от разных пациентов показало достоверное увеличение количества факторов роста b-FGF, TGF-b2, VEGF в композиции по сравнению с контрольной плазме. Концентрация VEGF в контрольной плазме составила 196±9,5пг/мл, а в композиции 324,3±916,8 пг/мл, TGF-b2 - 1,5±0,4 нг/мл и 14,2±2,6 нг/мл, b-FGF - 3,2±0,2 пг/мл и 18,4±4 пг/мл соответственно.

Пример 2. Клиническое применение композиции

Пациент 1. Осколочное ранение бедра с массивным поражением мягких тканей и переломом бедренной кости. При поступлении в стационар была произведена первичная хирургическая обработка ран и установлен аппарат Илизарова для фиксации обломков бедренной кости. Пациент находился в стационаре около месяца после поступления, проводились регулярные обработки ран. За это время динамика восстановления поврежденных мягких тканей было слабо выражена, толщина и глубина раневых каналов сохранялись, слабо выраженная динамика образования костной мозоли в месте перелома. Спустя месяц его нахождения в стационаре была начата терапия с использованием композиции на основе суспензии лейкоцитов в сыворотке крови, полученной по Примеру 1 из аутологичной крови пациента 1. Инъекции композиции производились в суммарном объеме 6 мл, при каждом проколе вводилось примерно 0,5 мл в края раневых каналов и в область перелома. Процедура проводилась 2 раза в неделю с интервалом 2-3 дня в течение 4 недель. Итоговое количество введений составило 8 раз. Уже через неделю терапии просвет раневого канала начал уменьшаться, края раны стягиваться и началась эпителизация раневого ложа. Клинические результаты до и после применения композиции на основе аутологичной сыворотки и суспензии аутологичных лейкоцитов представлены на Фиг.2 и Фиг. 3. При сравнении результатов до терапии и после 1 курса терапии представленных на Фиг. 2 и Фиг. 3 соответственно, видно что после применения терапии наблюдается значительное закрытие раневого канала и сближение краев раневого поля, что свидетельствует об росте количества новой соединительной ткани, изменился цвет раны, стал более розовый, что свидетельствует о росте сосудистой сети в месте повреждения и улучшения кровоснабжения. При пальпации краев раны до применения терапии отмечалось повышенная плотность мягких тканей, после применения терапии при пальпации края раны стали более мягкие и упругие, что свидетельствует о снижении отека тканей.

Пример 3. Сравнительное исследование композиции на животной модели

Проведен сравнительный эксперимент на животной модели композиции, представленной в RU 2280459 C2 и композиции, представленной в данном изобретении. В качестве животной модели выступали 6 особей кроликов разного веса, разного возраста, разного пола, три самца, три самки. У кроликов был произведен забор участка кожи и получена культура фибробластов согласно методике, описанной в изобретении-прототипе. Фибробласты культивировались в закрытой системе культивирования с использованием среды культивирования DMEM с высоким содержанием глюкозы (10% BCS с добавлением 2 мМ L-глутамина и 50 мг/мл аскорбиновой кислоты) при 37°С в 5% СО₂-атмосфере с повышенной влажностью. Через 10 дней клеточную культуру удаляли и добавляли свежую среду. Клетки культивировали еще 4 дня. Затем полученную кондиционированную среду, экспонированную клеточной и тканевой культурой в течение четырех дней (дни 10-14), отбирали и концентрировали в 10 раз на концентрирующем аппарате с избыточным давлением. Итого было получено 10 мл 10-х концентрированной кондиционированной среды. Конечную 1-х концентрацию кондиционированной среды получают, исходя из 10-х кондиционированной среды, добавленной к основной среде в виде 10% (об/об) раствора.

Композиция для ускорения регенерации представленная в данном изобретении по п.1 получена способом по п.2 была изготовлена непосредственно перед началом эксперимента из аутологичной крови кроликов. 6 кроликам были нанесены хирургические разрезы длиной не более 2 см на спине вдоль позвоночника, 3 справа и 3 слева. После нанесения разреза был наложено 2 шва не растворяющимися нитками, чтобы свести края раны. Операция проводилась под наркозом. Раны, с одной стороны, обрабатывались композицией на основе кондиционированной среды, полученной путем, описанным выше, ведением 2 мл в края каждой раны папулами по 0,5 мл. Раны со второй стороны обрабатывались однократно композицией по примеру 1 полученной по примеру 2 введением 2 мл в края каждой раны папулами по 0,5 мл. Визуальная оценка ран производилась на 3, 7 и 14 сутки после операции, а также были извлечены участки раны для гистологического исследования. Результаты визуальной оценки на 3 сутки представлены на Фиг. 4,5.

По результатам визуальной оценки видно, что на 3-е сутки, раны, обработанные композицией по п.1 имеют меньший отек краев, менее гиперемированы, более сближены чем группа ран, обработанных композицией на основе кондиционированной среды. Это свидетельствует о том, что в них менее выражены признаки воспаления и процессы регенерации проходят быстрее (Фиг. 4 и Фиг.5).

На 7 сутки у кролика номер 4 раны, обработанные композицией на основе кондиционированной среды, заживают плохо. Об этом свидетельствуют отек вокруг области раны, увеличенный струп над раной, что свидетельствует о ярко выраженных воспалительных процессах и торможении заживления. При этом группа ран, обработанные композицией по п.1, выглядит спокойно, без явных признаков воспалительного процесса. Отека нет, края сближены. Струп слабо выражен. У кролика номер 3 на 7 сутки при сравнении групп ран наблюдается более выраженный процесс заживления в группе ран, обработанных композицией по п.1, более сближенные края ран, слабо выраженный отек краев ран.

На 14 сутки в обеих группах ран прошли признаки воспаления (отек, гиперемия) что свидетельствует о ходе процессов заживления. При сравнении степени заживления ран, видно, что в группе ран обработанной композицией по п.1 края ран частично срослись. Чего нет во второй группе ран. Это подтверждает, что в группе ран обработанной композицией по п.1 процессы заживления происходили быстрее, чем в группе сравнения.

Результаты гистологического исследования.

На 3 сутки в группе ран, обработанных композицией на основе кондиционированной среды, наблюдались признаки воспаления. Присутствовали очаги лимфоидной инфильтрации. Было заметно начало роста многослойного эпителия. В области повреждения мышечного слоя наблюдается большая полость с признаками тканевого распада и геморрагии. На 7 сутки сохранялись признаки воспаления, наблюдался вырост многослойного эпителия в виде узких тяжей, в области повреждения мышечного слоя сохранялась полость с незначительным количеством лимфоидных клеток. На 14 сутки рана в значительной степени, но не полностью закрыта многослойным эпителием, формирования волосяных сумок не выявлено, полость в области повреждения мышечных волокон сохранялась, наблюдалась начальная стадия роста миотуб.

В группе ран, обработанных композицией по п.1, уже на 3 сутки отмечался значительный рост многослойного эпителия, повышалась пролиферация клеток в базальном слое эпидермиса и в клетках сосочкового слоя. Признаков воспаления под эпидермисом не отмечалось. На 7 сутки в эпидермисе формировались выросты волосяных фолликулов, просвет раны был закрыт в значительной степени, наблюдался частичный рост новых мышечных волокон, наблюдались единичные лимфоидные клетки и макрофаги. На 14 сутки просвет раны был закрыт многослойным эпителием и рыхлой соединительной тканью под слоем эпидермиса, разрез мышечных волокон по большей части был заполнен новыми мышечными волокнами.

По результатам гистологического исследования можно сделать выводы, что для ран, которые обрабатывались композицией по п.1 на протяжении всего наблюдения 3-14 сутки, были значительно меньше выражены признаки воспаления, более выраженный рост эпителия и рыхлой соединительной ткани, полноценный рост новых мышечных волокон по сравнению с группой ран, обработанных композицией на основе кондиционированной среды.

Из представленных данных визуального контроля заживления хирургической раны и гистологического исследования можно сделать вывод, что представленная композиция по п.1 и полученная по п.2 обладает более выраженным противовоспалительным действием и ускоряющим регенерацию эффектом.

Группа изобретений относится к медицине, клеточным технологиям и регенеративной медицине и включает композицию для стимулирования регенерации соединительной ткани человека, содержащую взвесь человеческих лейкоцитов в сыворотке человеческой крови в концентрации 1100-1800×10³ клеток/мл, предварительно активированных липополисахаридом в течение 8-24 часов в культуре in vitro тромбоцитарных гранул, цитокинов, интерлейкинов, факторов роста b-FGF, TGF-b2, VEGF, TDGF и липополисахарида, способ ее получения и применение для стимуляции регенерации повреждений соединительной ткани человека. Использование композиции обеспечивает ускорение заживления раны, роста кожного покрова, роста сосудов и соединительной ткани; снижении отека, воспаления и болевого синдрома. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

1. Композиция для стимулирования регенерации соединительной ткани человека, содержащая взвесь человеческих лейкоцитов в сыворотке человеческой крови в концентрации 1100-1800×10³ клеток/мл, предварительно активированных липополисахаридом в течение 8-24 часов в культуре in vitro тромбоцитарных гранул, цитокинов, интерлейкинов, факторов роста b-FGF, TGF-b2, VEGF, TDGF и липополисахарида.

2. Способ получения композиции по п. 1, содержащей взвесь человеческих лейкоцитов в сыворотке человеческой крови в концентрации 1100-1800×10³ клеток/мл, характеризующийся тем, что смешивают в равных пропорциях аутологичную плазму пациента, полученную после забора в пробирку с содержанием гепарина натрия 17 ME на 1 мл крови, добавления к пробе крови пациента 100-1000 мкл раствора липополисахарида в концентрации 50 мкг/мл на 1 мл крови с последующим инкубированием в течение 8-24 часов при температуре от +18 до +41°С для активирования лейкоцитов в культуре in vitro тромбоцитарных гранул, цитокинов, интерлейкинов, факторов роста b-FGF, TGF-b2, VEGF, TDGF и липополисахарида, и центрифугированием при 100-200 g, и аутологичную сыворотку пациента, полученную путем забора в пробирку с 3,2% водным раствором цитрата натрия в объемном соотношении 9:1 к крови, центрифугирования при ускорении 100-300 g, отбора плазмы, богатой тромбоцитами, добавления к плазме 10% водного раствора кальция хлорида из расчета 50 мкл раствора на 1 мл плазмы, с последующим инкубированием полученной смеси в течение 1 часа при температуре от +18 до +41°С, центрифугированием 10 минут при 1500 g и отбором сыворотки.

3. Применение композиции по п. 1 для стимулирования регенерации соединительной ткани человека при повреждениях, включая травмы мягких тканей, кожных покровов; резанные, минно-взрывные, пулевые, осколочные или рваные раны; переломы, ожоги.