КОМБИНАЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДИН МОДУЛЯТОР СПЛАЙСОСОМЫ И ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДИН ИНГИБИТОР, ВЫБРАННЫЙ ИЗ ИНГИБИТОРОВ BCL2, ИНГИБИТОРОВ BCL2/BCLXL И ИНГИБИТОРОВ BCLXL, А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК A61K45/00 A61K31/105 A61K31/11 A61K31/166 A61K31/343 A61K31/352 A61K31/426 A61P35/00 

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США 62/579,666, поданной 31 октября 2017 года, и предварительной заявке на патент США 62/580,364, поданной 1 ноября 2017 года, каждая из которых настоящим включена посредством отсылки во всей своей полноте.

[0002] Гены BCL2 семейства кодируют BH-домен-содержащие антиапоптотические белки/способствующие выживанию белки, играющие особо важную роль в регуляции апоптоза. Существует по меньшей мере пять белков BCL2, BCL2, BCL2L1, BCL2L2, BCL2A1 и MCL1, которые участвуют в обеспечении выживания опухолевых клеток различных форм рака (см., например, Delbridge ARD, et al., 2016, Nat. Rev. Cancer 16, 99-109; Czabotar PE, et al., 2014, Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 15, 49-63). Были разработаны несколько соединений для ингибирования белков семейства BCL2, включающие, например, ABT199 (венетоклакс), ABT263 (навитоклакс), A-1331852 и ABT737. Хотя ингибиторы BCL2 оказались многообещающими в качестве цитотоксических средств, эти соединения неспособны ингибировать антиапоптические эффекты MCL1. В частности, MCL1 локально амплифицируется во многих типах раковых опухолей (Zack Tl, et al., 2013, Nature Genet. 45, 1 134-1 140). Согласно некоторым сообщениям высокая экспрессия BCL2L1 (BCLxL) придает устойчивость к репрессии MCL1, при этом амплификация/оверэкспрессия MCL1 представляет собой главный механизм, придающий устойчивость к ингибиторам BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL (см., например, Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21 (4): 547-562; Lin X, et al., 2007, Oncogene 26(27): 3972-3979; Teh TC, et al, 2017, Leukemia, doi: 10.1038/leu.2017.243). Необходимы эффективные терапии для преодоления устойчивости к ингибиторам BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL.

[0003] Растущий объем данных указывает, что комбинированная терапия может помочь преодолеть неполный ответ и терапевтическую резистентность при противоопухолевой монотерапии (Sellers WR., 2011, Cell 147(1):26-31). Например, комбинацию ингибиторов пути MAPK, вемурафениба (ингибитора RAF) и кобиметиниба (ингибитора MEK), была одобрена FDA для лечения больных меланомой, несущей мутации B-RAF (Flaherty KT, et al., 2012, N Engl. J Med 367:1694-1703.) Однако разработка эффективной комбинированной терапии являлась сложной частично из-за отсутствия эффективных доклинических подходов, которые позволяют прогнозировать клиническую активность комбинации, особенно в случае экспериментального подтверждения эффективности комбинаций лекарственных средств. Основанные на механизмах действия стратегии комбинированного применения лекарственных средств применялись в доклинических и клинических условиях с опорой на результаты фундаментальных биологических исследований, связанных с мишенями и путями. Принимая во внимание сложность механизмов действия, существует множество препятствий при определении эффективных комбинаций цитотоксических средств.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее изобретение основано на наблюдении, что комбинация некоторых модуляторов сплайсосомы (например, соединений пладиенолида) и ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL, демонстрирует улучшенное (например, синергическое) противоопухолевое действие. Соединения пладиенолида, которые направленно воздействуют на сплайсосому и мутации в ней, являются особенно полезными. Таким образом, в настоящем документе предложена комбинированная терапия для лечения рака, включающая введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы (например, E7107 и/или H3B-8800) и терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL.

[0005] Также предложены способы, комбинированные терапии, фармацевтические композиции и наборы для лечения рака с применением комбинации терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы (например, E7107 и/или H3B-8800) и терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL.

[0006] Другие признаки настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания, чертежей и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0007] На ФИГ. 1 и 2 показана идентификация MCL1-оверэкспрессирующих и MCL1-зависимых линий клеток немелкоклеточной карциномы легкого (НМРЛ). На ФИГ. 1 показан Вестерн-блот MCL1L (полноразмерного MCL1) и GAPDH (контроль нанесения). Разбавление лизатов использовали в качестве стандартов полуколичественного определения. На ФИГ. 2 показано ингибирование роста линий клеток при нокдауне MCL1 под действием мшРНК. CNTRL: Контроль мшРНК; Dox: доксициклин.

[0008] На ФИГ. 3-5 показано, что E7107 вызывает модуляцию сплайсинга MCL1 в клетках NCIH1568. ФИГ. 3 является схематическим представлением сплайсинга гена MCL. На ФИГ. 4 показано обнаружение мРНК MCL1 с помощью количественной ОТ-ПЦР: MCL1L: длинная форма, содержащая экзоны 1, 2 и 3; MCL1S: короткая форма, которая содержит экзоны 1 и 3; пре-мРНК MCL1: мРНК с сохранением интрона 1. На ФИГ. 5 показан Вестерн-блот MCL1L (полноразмерного), усеченного MCL1, расщепленного PARP и тубулина (контроль нанесения) после обработки E7107 в течение 6 часов.

[0009] На ФИГ. 6-9 показано, что индуцированная E7107 цитотоксичность является MCL1- и BCLxL-зависимой. На ФИГ. 6 показана индуцируемая экспрессия кДНК MCL1L в клетках NCIH1568. Вестерн-блоттинг демонстрирует экспрессию MCL1L и GAPDH (контроль нанесения). CNTRL: контрольный вектор. На ФИГ. 7 показано ингибирование роста линий клеток NCIH1568 с пустым вектором (контроль) и оверэкспрессия кДНК MCL1L. На ФИГ. 8 показан индуцируемый опосредованный мшРНК нокдаун BCLxL (кодируемого геном BCL2L1) в клетках A549. Вестерн-блоттинг демонстрирует экспрессию BCLxL и GAPDH (контроль нанесения). На ФИГ. 9 показано ингибирование роста линий клеток A549 при Dox-индуцированном нокдауне BCLxL. Dox: доксициклин.

[0010] На ФИГ. 10 показан синергический эффект обработки E7107 и ABT263 в четырех линиях клеток НМРЛ. Это исследование проводили в контроле вектором или BCLxL мшРНК.

[0011] На ФИГ. 11 показан синергический эффект обработки E7107 и ABT199 в линии клеток A549. Это исследование проводили в контроле вектором или BCLxL мшРНК.

[0012] На ФИГ. 12 показан синергический эффект обработки H3B-8800 и ABT263 в двух линиях клеток множественной миеломы: U266B1 и RPMI8226.

[0013] На ФИГ. 13 показан синергический эффект обработки H3B-8800 и ABT199 в двух линиях клеток множественной миеломы: JJN3 и RPMI8226.

[0014] На ФИГ. 14 показан синергический эффект обработки H3B-8800 и A-1331852 в двух линиях клеток множественной миеломы: RPMI8226 и MM1S.

[0015] При использовании в настоящем документе должны применяться следующие определения, если не указано иное.

[0016] "Изомеры" относятся к соединениям, содержащим одинаковое число и тип атомов, и, следовательно, одинаковую молекулярную массу, но отличающимся расположением или конфигурацией атомов. "Стереоизомеры" относятся к соединениям, которые имеют одинаковые атомные связи, но отличаются расположением своих атомов в пространстве. "Диастереоизомеры" или "диастереомеры" относятся к стереоизомерам, которые не являются энантиомерами. "Энантиомеры" относятся к стереоизомерам, которые являются несовпадающими при наложении зеркальными отображениями друг друга. "Геометрические изомеры" относятся к цис-транс изомерам, имеющим разные расположения групп относительно двойной связи или кольца, или центрального атома.

[0017] Энантиомеры, описанные в настоящем документе, могут включать "энантиомерно чистые" изомеры, которые включают по существу единственный энантиомер, например, в количестве больше или равном 90%, 92%, 95%, 98% или 99%, или равном 100% одного энантиомера в конкретном центре или центрах асимметрии. "Центр асимметрии" или "хиральный центр" относится к тетраэдрическому атому углерода, который включает четыре разных заместителя.

[0018] "Стереомерно чистый" при использовании в настоящем документе означает соединение или его композицию, которые включают один стереоизомер соединения и по существу не содержат других стереоизомеров данного соединения. Например, стереомерно чистая композиция соединения, имеющего один хиральный центр, по существу не будет содержать противоположного энантиомера соединения. Стереомерно чистая композиция соединения, имеющего два хиральных центра, по существу не будет содержать диастереомеров, и по существу не будет содержать противоположный энантиомер соединения. Типичное стереомерно чистое соединение содержит больше чем приблизительно 80% по весу одного стереоизомера соединения и меньше чем приблизительно 20% по весу других стереоизомеров соединения, более предпочтительно больше чем приблизительно 90% по весу одного стереоизомера соединения и меньше чем приблизительно 10% по весу других стереоизомеров соединения, еще более предпочтительно больше чем приблизительно 95% по весу одного стереоизомера соединения и меньше чем приблизительно 5% по весу других стереоизомеров соединения, и наиболее предпочтительно больше чем приблизительно 97% по весу одного стереоизомера соединения и меньше чем приблизительно 3% по весу других стереоизомеров соединения. См., например, патент США 7,189,715.

[0019] "R" и "S" в качестве терминов, описывающих изомеры, являются идентификаторами стереохимической конфигурации на асимметрично замещенном атоме углерода. Обозначение асимметрично замещенного атома углерода как "R" или "S" выполняется путем применения правил приоритета Кана-Ингольда-Прелога, которые хорошо известны специалистам в данной области и описаны в Правилах номенклатуры органической химии Международного союза теоретической и прикладной химии (ИЮПАК), Разделе E, Стереохимия.

[0020] "Лечение", "лечить" или "лечение" рака относятся к изменению (например, преодолению блокирования дифференцировки клеток), облегчению (например, облегчению одного или более симптомов, таких как усталость при анемии, пониженное содержание форменных элементов крови и т.д.) и/или задержке прогрессирования (например, задержке прогрессирования состояния, такого как перерождение в ОМЛ) рака, как описано в настоящем документе.

[0021] "Субъект" при использовании в настоящем документе означает подопытное животное, предпочтительно субъекта-млекопитающего и, в частности, человека.

[0022] "Фармацевтически приемлемый носитель" при использовании в настоящем документе относится к нетоксичному носителю, вспомогательному веществу или растворителю, который не устраняет фармакологическую активность соединения, с которым его включают в композицию. Фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или растворители, которые могут применяться в композициях согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения перечисленными, ионообменные смолы, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протамина сульфат, динатрия гидрофосфат, калия гидрофосфат, натрия хлорид, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, циклодекстрины, натрий карбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блоксополимеры полиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и жиропот.

[0023] "Фармацевтически приемлемая соль" является солью, которая сохраняет требуемую биологическую активность исходного соединения и не оказывает нежелательного токсического действия. Примерами таких солей являются: (а) соли присоединения кислоты, образованные с неорганическими кислотами, например, соляной кислотой, бромоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и т.п.; и соли, образованные с органическими кислотами, например, уксусной кислотой, щавелевой кислотой, винной кислотой, янтарной кислотой, малеиновой кислотой, фумаровой кислотой, глюконовой кислотой, лимонной кислотой, яблочной кислотой, аскорбиновой кислотой, бензойной кислотой, дубильной кислотой, пальмитиновой кислотой, альгиновой кислотой, полиглутаминовой кислотой, нафталинсульфоновой кислотой, метансульфоновой кислотой, п-толуолсульфоновой кислотой, нафталиндисульфоновой кислотой, полигалактуроновой кислотой и т.п.; и (b) соли, образованные из элементарных анионов, таких как хлор, бром и иод. См., например, публикации Haynes et al., "Commentary: Occurrence of Pharmaceutically Acceptable Anions and Cations in the Cambridge Structural Database," J. Pharmaceutical Sciences, vol. 94, no. 10 (2005), и Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharmaceutical Sciences, vol. 66, no. 1 (1977), которые включены в настоящий документ посредством отсылки.

[0024] Если не указано иное, соединения, представленные в настоящем документе, могут включать смеси соединения, представленного в настоящем документе, и любых энантиомерные, диастереомерные и/или геометрические (или конформационные) формы структуры; например, R и S конфигурации для каждого асимметричного центра, (Z) и (E) изомеры с двойной связью и (Z) и (E) конформационные изомеры. Если не указано иное, соединения, представленные в настоящем документе, существующие совместно с таутомерными формами, входят в объем изобретения. Кроме того, если не указано иное, структуры, представленные в настоящем документе, также подразумевают включение соединений, которые отличаются только присутствием одного или более изотопно обогащенных атомов. Например, соединения, имеющие настоящие структуры, за исключением замены водорода дейтерием или тритием или замены углерода 13C- или 14C-обогащенным углеродом, входят в объем настоящего изобретения. Такие соединения могут применяться, например, в качестве аналитических средств или зондов в биологических анализах.

[0025] Различные соединения пладиенолида были разработаны как модуляторы сплайсинга для лечения рака, включая соединения, раскрытые в следующих заявках на патент: WO 2002/060890; WO 2004/01 1459; WO 2004/01 1661; WO 2004/050890; WO 2005/052152; WO 2006/009276; WO 2008/126918; и WO 2015/175594, каждая из которых включена в настоящий документ посредством отсылки. Например, соединение пладиенолида (8E,12E,14E)-7-((4-Циклогептилпиперазин-1-ил)карбонил)окси-3,6,16,21-тетрагидрокси-6,10,12,16,20-пентаметил-18,19-эпокситрикоза-8,12,14-триен-11-олид, также известное как E7107, является полусинтетическим производным природного продукта пладиенолида D, и сообщали о результатах его исследования Фазы I:

.

[0026] В качестве другого примера, соединение пладиенолид пиридина (2S,3S,6S,7R,10R, E)-7,10-дигидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((R,2E,4E)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксацикло-додец-4-ен-6-ил-4-метилпиперазин-1-карбоксилат (также называемый "(2S,3S,4E,6S,7R,10R)-7,10-дигидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((2E,4E,6R)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-ил-4-метилпиперазин-1-карбоксилат"), также известное как H3B-8800, получило назначение лекарственного средства от редких заболеваний для лечения некоторых гемобластозов и имеет следующую структуру:

.

[0027] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы для применения в комбинированной терапии выбран из соединения формулы 1 ('E7107"):

и его фармацевтически приемлемых солей.

[0028] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы для применения в комбинированной терапии выбран из соединения формулы 2 ("H3B-8800"):

и его фармацевтически приемлемых солей.

[0029] При использовании в настоящем документе по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, включает, без ограничения перечисленными, HA14-1, BH3I-1, антимицин A, хелеритрин, госсипол (NSC19048), апогоссипол (NSC736630), TW-37, 4-(3-метокси-фенилсульфонил)-7-нитро-бензофуран-3-оксид (MNB), ТМ 12-06, обатоклакс (GX15-070), венетоклакс (ABT199), навитоклакс (ABT263), A-1331852 и ABT737.

[0030] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, выбран из венетоклакса (ABT199), навитоклакса (ABT263), A-1331852, ABT737 и его фармацевтически приемлемых солей.

[0031] Способы, раскрытые в настоящем документе, могут применяться для лечения различных типов онкологических заболеваний, включая гемобластозы и солидные опухоли.

[0032] Гемобластозы могут включать онкологические заболевания крови (например, лейкоз) или онкологические заболевания лимфатических узлов (например, лимфомы) или другие подобные онкологические заболевания. Лейкозы могут включать острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ), острый моноцитарный лейкоз (ОМоЛ), и т.д. Лимфомы могут включать лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому. Другие гемобластозы могут включать миелодиспластический синдром (МДС) и множественную миелому (ММ).

[0033] Солидные опухоли могут включать карциномы, такие как аденокарциному, например, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак толстой кишки или рак толстой и прямой кишки, рак легкого (включая немелкоклеточную карциному легкого (НМРЛ) и мелкоклеточную карциному легкого (МРЛ)), рак желудка, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичника, холангиокарциному, глиому, меланому и т.п.

[0034] Способы, раскрытые в настоящем документе, также могут применяться для лечения онкологических заболеваний, которые могут отвечать на терапию средствами, которые направленно воздействуют на ген или белок сплайсосомы, например, SF3B1. Примеры таких онкологических заболеваний включают, без ограничения перечисленными, миелодиспластический синдром, множественную миелому, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак эндометрия, рак яичника, рак молочной железы, увеальную меланому, рак желудка, холангиокарциному или рак легкого (включая немелкоклеточную карциному легкого (НМРЛ) и мелкоклеточную карциному легкого (МРЛ)). Примеры генов или белков сплайсосомы включают, без ограничения перечисленными, субъединицу 1 фактора сплайсинга 3B (SF3B1), U2 малой ядерной РНК вспомогательный фактор 1 (U2AF1), серин/аргинин-богатый фактора сплайсинга 2 (SRSF2), цинкпальцевый (CCCH типа) РНК-связывающий мотив и серин/аргинин-богатый 2 (ZRSR2), фактор процессинга-сплайсинга пре-мРНК 8 (PRPF8), U2 малой ядерной РНК вспомогательный фактор 2 (U2AF2), фактор сплайсинга 1 (SF1), субъединицу 1 фактора 3a сплайсинга (SF3A1), PRP40 фактор процессинга пре-мРНК 40 гомолог B (PRPF40B), содержащий РНК-связывающий мотив белок 10 (RBM 10), поли(rC)-связывающий белок 1 (PCBP1), фактор сплайсинга пре-мРНК crooked neck 1 (CRNKL1), DEAH (Asp-Glu-Ala-His) бокс геликазу 9 (DHX9), пептидил-пролил цис-транс изомераза-подобный 2 (PPIL2), содержащий РНК-связывающий мотив белок 22 (RBM22), малый ядерный рибонуклеопротеин Sm D3 (SNRPD3), вероятную АТФ-зависимую РНК-геликазу DDX5 (DDX5), фактор сплайсинга пре-мРНК АТФ-зависимую РНК-геликазу DHX15 (DHX15) и полиаденилат-связывающий белок 1 (PABPC1).

[0035] Способы, раскрытые в настоящем документе, также могут применяться для лечения MCL1-зависимых онкологических заболеваний. Примеры MCL1-зависимых онкологических заболеваний могут включать, без ограничения перечисленными, множественную миелому, лейкозы, лимфомы и солидные опухоли. MCL1-зависимые лейкозы могут включать, без ограничения перечисленными, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический лимфолейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз и острый моноцитарный лейкоз. MCL1-зависимые лимфомы могут включать, без ограничения перечисленными, лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому. MCL1-зависимые солидные опухоли могут включать, без ограничения перечисленными, рак легкого (например, немелкоклеточную карциному легкого и мелкоклеточную карциному легкого), рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак толстой кишки или рак толстой и прямой кишки, рак желудка, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичника, холангиокарциному, глиому и меланому.

[0036] Было показано, что злокачественные опухоли с высокой экспрессией MCL1 чувствительны к ингибированию MCL1 либо путем прямого ингибирования мишени, либо путем изменения уровня гена, например, ингибирования транскрипции или сплайсинга (Gao Y, Koide K., 2013, ACS Chem Biol. 8(5):895-900; Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4):547-562). Также было показано, что высокая экспрессия BCL-xL придает устойчивость к репрессии MCL1, а амплификация/оверэкспрессия MCL1 является основным механизмом, придающим устойчивость к ингибиторам BCL2/xL (см., например, Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4):547-562; Lin X, et al., 2007, Oncogene 26(27):3972-3979; Teh TC, et al, 2017, Leukemia, doi:10.1038/leu.2017.243). Без ограничения какой-либо конкретной теорией, как описано в настоящем документе, производные пладиенолида E7107 и H3B-8800 могут индуцировать мощную модуляцию сплайсинга гена MCL1, что приводит к снижению экспрессии функционального полноразмерного белка. Снижение белка MCL1 может вызывать гибель клеток в линиях раковых клеток. Комбинация по меньшей мере одного производного пладиенолида (например, E7107 и/или H3B-8800) и по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, может вызвать синергическое ингибирование роста раковых клеток. Таким образом, комбинация по меньшей мере одного низкомолекулярного модулятора сплайсинга и по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, может применяться для лечения таких форм рака, как злокачественные опухоли, которые зависят от антиапоптотических генов.

[0037] Также в настоящем документе раскрыты фармацевтические композиции, включающие по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. По меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель может быть выбран в соответствии с предполагаемым путем введения.

[0038] Фармацевтические композиции, раскрытые в настоящем документе, могут быть изготовлены для парентерального, перорального, ингаляционного аэрозольного, наружного, ректального, назального, буккального, вагинального введения или введения имплантируемого резервуара и т.д. Термин "парентеральный" при использовании в настоящем документе включает методы подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, интрасиновиальной, интрастернальной, интратекальной, внутрипеченочной, внутриочаговой и внутричерепной инъекции или инфузии. В конкретных вариантах осуществления соединения при комбинированной терапии вводят путем внутривенного, перорального, подкожного или внутримышечного введения. Стерильные инъекционные формы композиций согласно настоящему изобретению могут быть водной или масляной суспензией. Эти суспензии могут быть изготовлены в соответствии с методиками, известными в уровне техники, при использовании подходящих диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ. Стерильный препарат для инъекций также может быть стерильным раствором или суспензией для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Подходящие носители и растворители, которые могут использоваться, включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды.

[0039] Для этой цели можно использовать любое нелетучее масло без вкуса и запаха, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, пригодны для изготовления инъекционных препаратов, как и природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных вариантах. Эти масляные растворы или суспензии также могут содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или дисперсант, такой как карбоксиметилцеллюлозу или подобные диспергирующие вещества, которые обычно используются в производстве фармацевтически приемлемых лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. Другие обычно используемые поверхностно-активные вещества, такие как Tween, Span и другие эмульгаторы или усилители биодоступности, которые обычно используются в производстве фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм, также могут использоваться в целях производства лекарственной формы.

[0040] Для перорального применения по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосом и/или по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, могут быть предоставлены в приемлемой лекарственной форме для приема внутрь, в том числе, без ограничения перечисленным, капсулах, таблетках, водных суспензиях или растворах. В случае таблеток для перорального применения носители могут быть выбраны, например, из лактозы и кукурузного крахмала. Также могут быть добавлены смазывающие вещества, такие как стеарат магния. Для перорального применения в форме капсул полезные разбавители включают лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Если для перорального применения требуются водные суспензии, активный ингредиент объединяют с эмульгирующим и/или суспендирующим веществом. При необходимости также могут быть добавлены некоторые подсластители, ароматизаторы или красители.

[0041] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, раскрытых в настоящем документе, вводят субъекту в единичной лекарственной форме или путем раздельного или последовательного введения каждого действующего вещества.

[0042] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, включают в состав таблеток, пилюль, капсул или растворов. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и/или по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, включают в состав раствора для парентерального введения. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, включают в состав раздельных областей или разные каплеты, помещенные в капсулу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, включают в состав изолированных слоев в таблетке.

[0043] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает: терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы, терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

[0044] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает: терапевтически эффективное количество E7107, терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

[0045] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает: терапевтически эффективное количество H3B-8800, терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

[0046] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, могут вводить в отдельных композициях и необязально в разных формах, например, в виде отдельных таблеток или растворов. Кроме того, в качестве неограничивающего примера, по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, могут вводить отдельно, в виде таблеток для приема внутрь.

[0047] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, надлежит вводить в отдельных композициях:

фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель; и

фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

[0048] В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предложен набор, включающий первую фармацевтическую композицию, включающую терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы, вторую фармацевтическую композицию, включающую терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, и инструкции по применению набора при лечении рака.

[0049] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, вводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, вводят последовательно. В некоторых варианты осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, вводят периодически. Интервал между введениями по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы и по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, может быть подобран так, чтобы обеспечить требуемый терапевтический эффект. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, вводят с интервалом только в несколько минут. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, вводят через несколько часов (например, приблизительно 2, 4, 6, 10, 12, 24 или 36 ч). В некоторых вариантах осуществления может быть предпочтительным вводить больше одной дозы одного из по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы и по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, между введениями оставшегося терапевтического средства. Например, одно терапевтическое средство могут вводить через 1 час, а затем повторно через 11 часов после введения другого терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления терапевтические эффекты каждого пладиенолида-модулятора сплайсосомы и ингибитора BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL должны перекрываться, по меньшей мере, в течение части периода действия, чтобы общий терапевтический эффект комбинированной терапии мог быть частично связан с объединенным или синергическим действием комбинированной терапии.

[0050] По меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор, выбранный из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, раскрытых в настоящем документе, могут вводить субъекту в эффективном для лечения или терапевтически эффективном количестве. Количество каждого по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы и по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL, которые могут быть объединены в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, с получением единой лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от субъекта, подвергаемого лечению, и предполагаемого пути введения.

[0051] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции имеют такой состав, чтобы субъекту была введена доза от 0,01 до 100 мг/кг массы тела/день каждого из по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы и по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят дозу в пределах от 1 до 100 мг/кг массы тела/день каждого из по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы и по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят дозу в пределах от 0,01 мг до 50 мг каждого из по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы и по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL. В некоторых вариантах осуществления предложена доза в пределах от 1 мг до 50 мг, от 0,1 мг до 25 мг или от 5 мг до 40 мг каждого из по меньшей мере одного пладиенолида-модулятора сплайсосомы и по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL и BCLxL.

[0052] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид-модулятор сплайсосомы вводят в диапазоне дозы от 1 мг/кг до 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид сплайсосомы вводят в дозе 1 мг/кг, 1,25 мг/кг, 2 мг/кг, 2,5 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг или 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид сплайсосомы вводят в дозе 5 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один пладиенолид сплайсосомы вводят в дозе 8 мг/кг.

[0053] В некоторых вариантах осуществления E7107 вводят внутривенно в дозе 5 мг/кг в течение пяти дней подряд. В некоторых вариантах осуществления H3B-8800 вводят перорально в дозе 8 мг/кг в течение пяти дней подряд с последующимх девятидневным перерывом.

[0054] Среднему специалисту в данной области будет очевидно, что определенная дозировка и схема лечения для какого-либо конкретного пациента будут зависеть от множества факторов, включающих активность конкретного применяемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, скорость экскреции, комбинацию лекарственных средств, решение лечащего врача и тяжесть конкретного заболевания, подвергаемого лечению. Количество каждого действующего вещества в комбинированной терапии будет также зависеть от конкретного соединения/соли в композиции.

[0055] Следующие примеры изложены так, чтобы варианты осуществления, описанные в настоящем документе, и их применение, могли быть поняты в более полной мере. Следует понимать, что эти примеры предназначены лишь для иллюстративных целей и не должны рассматриваться в качестве какого-либо ограничения.

ПРИМЕРЫ

A. Материалы и методы

1. Линии клеток и протокол культивирования клеток

[0056] Линии клеток A549, NCI-H23, NCI-H 1568, NCI-H1650, NCI-H1975 и NCI-H2110 немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) получали в Американской коллекции типовых культур (ATCC) и культивировали согласно инструкции производителя. Индуцируемые линии мшРНК и кДНК, полученные путем лентивирусной трансдукции, культивировали согласно инструкциям производителя при использовании FBS, одобренной для применения с Tet-системой (Clontech), а не стандартной сыворотки. Для создания вирусов для оверэкспрессии мшРНК и кДНК для инфекции использовали LentiX-293T (Clontech) и производили культивирование согласно инструкции производителя. Линии клеток исследовали на контаминацию микоплазмой и аутентичность для подтверждения идентичности клеток. Пуромицин (0,25-1,25 мкг/мл, Thermo Fisher Scientific) использовали для отбора экспрессирующих мшРНК клеток; G418 (0,5-2 мг/мл, Thermo Fisher Scientific) использовали для отбора индуцируемых клеток, экспрессирующих кДНК. Доксициклина гиклат (Sigma) (Dox) использовали для индукции мшРНК и кДНК.

[0057] Клетки NKM 1 и KO52 получали из Японской коллекции Банка клеток исследовательских биоресурсов. Клетки HNT34, MONOMAC6 и MUTZ3 получали из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур. Клетки HNT34 и NKM 1 поддерживали в RPMI (ATCC) с 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки KO52 поддерживали в Альфа-MEM (ATCC) с 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки MONOMAC6 поддерживали в RPMI (ATCC) с 20% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки MUTZ3 поддерживали в альфа-MEM (ATCC) с 20% эмбриональной бычьей сыворотки и 20% кондиционированной среды 5637. Линии клеток инкубировали в инкубаторе с увлажненной атмосферой при 37°C с 5% CO2.

2. Методика Вестерн-блоттинга MCL1 и BCLxL

[0058] Линии клеток лизировали в буфере RIPA (Boston BioProducts) со смесью ингибиторов протеаз (Mini-complete, без ЭДТА, Roche) и ингибитором фосфатазы PhosSTOP (Roche). Лизаты разбавляли буфером RIPA с 4× LDS буфером для образцов (Nupage, Thermo Fisher Scientific) и 10× Восстанавливающим реагентом (Nupage, Thermo Fisher Scientific) и кипятили в течение 5 минут. Двадцать пять микрограммов белка вносили в ячейку в 4-12% бис-Трис SDS ПААГ гелях (Novex, Thermo Fisher Scientific). Гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны с использованием системы iBIot (Thermo Fisher Scientific). Мембраны блокировали в блокирующем буфере (1× Трис-буферизованном растворе хлорида натрия+0,1% Tween-20 (Boston Bioproducts) + 5% обезжиренного сухого молока (Bio-Rad)) в течение 1 часа и затем разрезали. Каждую секцию отдельно метили антителами к каждому из следующих белков в блокирующем буфере: MCL1 (Cell Signaling Technologies 5453) (D35A5), кроличье моноклональное, разведение 1:500, BCL-xL (Cell Signaling Technologies 2764) (54H6), кроличье моноклональное, разведение 1:500, расщепленный Parp (Cell Signaling Technologies 5625) (D64P10), кроличье моноклональное, разведение 1:500, и GAPDH (Sigma G8795), мышиное моноклональное в концентрации 100 нг/мл. Блоты инкубировали с разведениями первичных антител при 4°C в течение ночи при встряхивании. Затем Вестерн-блоты метили вторичными Odyssey Licor или HRP антителами. Затем блоты четыре раза промывали с использованием промывочного буфера (1× Трис-буферизованного раствора хлорида натрия+0,1% Tween-20). Блоты, проявленные с использованием Licor, метили при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 часа с Licor ИК-меченными вторичными антителами, IRDye® 800CW козьим против IgG кролика (Odyssey 925-3221 1) и IRDye® 680LT козьим против IgG мыши (Odyssey 925-68020) в разведении 1:10000 в блокирующем буфере. Затем блоты промывали три раза промывочным буфером. Детектирование ИК-красителя проводили с использованием системы визуализации Licor (Odyssey) в соответствии с инструкцией производителя. Блоты, визуализированные с использованием HRP, метили при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 часа с HRP-конъюгированным антителом против IgG мыши (Cell Signaling Technologies 7076) и HRP-конъюгированным антителом против IgG кролика (Cell Signaling Technologies 7074) в разведении 1:5000 в блокирующем буфере. Затем блоты три раза промывали промывочным буфером. Детектирование HRP проводили при использовании субстрата SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific) и визуализировали с использованием системы биомолекулярной визуализации ImageQuant™ LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences) в соответствии с инструкцией производителя.

3. Методика количественной ПЦР MCL1 в реальном времени

[0059] Лизаты РНК выделяли из клеток, обработанных соединениями в 96-луночных планшетах, и подвергали обратной транскрипции с использованием набора TaqMan Gene Expression Cells-to-CT (Thermo Fisher Scientific) согласно инструкции производителя. Количественную ПЦР проводили с использованием мастер-микса TaqMan Gene Expression (Thermo Fisher Scientific) с зондами к транскрипту MCL1 (Integrated DNA technologies FAM-ZEN/IBFQ), спаренными с 18S рРНК VIC-МН (Thermo Fisher Scientific, тест Hs99999901_s1), и количество определяли с помощью метода AACt.

Набор зондов MCL1L

праймер ATATGCCAAACCAGCTCCTAC

праймер AAGGACAAAACGGGACTGG

тестовый AGAACTCCACAAACCCATCCCAGC

зонд MCL1S

праймер AAAGCCAATGGGCAGGT

праймер CCACCTTCTAGGTCCTCTACAT

зонд TCCACAAACCCATCTTGGAAGGCC

Набор зондов к пре-мРНК MCL1 с интроном1-экзоном2

праймер GACAAAGGAGGCCGTGAGGA

праймер GTTTGTTACGCCGTCGCTGAAA

зонд TCAGGCATGCTTCGGAAACTGGA

4. Методика индуцируемой мшРНК и кДНК

[0060] BCL-xL мшРНК 1 (GCTCACTCTTCAGTCGGAAAT) (Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4):547-562) клонировали по AgeI и EcoRI в Tet-индуцируемый лентивирусный вектор pLKO-iKD-H1 puro (Wiederschain D, et al., 2009, Cell Cycle 8(3):498-504). MCL1 мшРНК 48 (GCATCGAACCATTAGCAGAAA) (Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4):547-56) клонировали по AgeI и EcoRI в Tet-индуцируемый лентивирусный вектор pLKO-iKD-U6 puro. MCL1-L pENTR-D-TOPO клонировали с использованием технологии Gateway (LR клоназа, Thermo Fisher Scientific) в pINDUCER20 (Meerbrey KL, et al., 2011, Proc Natl Acad Sci U S A. 108(9):3665-3670). Лентивирусы получали в клетках LentiX-293T. Клетки 2.5M в 10 см чашках Biocoat Collagen II (Corning) трансфицировали 2,4 мкг мишени pLKO-мшРНК или плазмиды pINDUCER20 с 2,4 мкг ρΔ8.91 (упаковывающий) и 0,6 мкг VSVG (оболочка) с использованием реагента TransIT (Mirus). pINDUCER20+MCL1-L, вектор pINDUCER20, pLKO-iKD-U6 puro+MCL1 мшРНК 48 и pLKO-iKD-U6 puro вектор вирусы использовали для инфицирования A549, NCI-H23, NCI-H1568, NCI-H1650, NCI-H1975 и NCI-H2110. Вирусы pLKO-iKD-H1 puro+BCL-xL мшРНК 1 и pLKO-iKD-H1 puro использовали для инфицирования A549, NCI-H23, NCI-H1568 и NCI-H2110. Клетки инфицировали с или без центрифугирования с использованием Полибрена (Millipore). Через один - три дня после инфицирования клетки культивировали в генетицине (pINDUCER20) или пуромицине (pLKO мшРНК). Отобранные клетки культивировали в присутствии или отсутствие Dox (300 нг/мл). Клетки собирали для выделения белка и РНК через три - пять дней после индукции. РНК выделяли как в разделе ПЦР MCL1 в реальном времени. Белковые экстракты получали как в разделе методики Вестерн-блоттинга MCL1 и BCL-xL выше.

5. Жизнеспособность клеток и методика MCL1-спасения

[0061] Для экспериментов с индуцируемой мшРНК клетки культивировали в 96-луночном формате с или без 300 нг/мл Dox в течение 72 часов и затем лизировали с использованием CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) согласно инструкции производителя и исследовали с использованием Perkin-Elmer Envision. Обработанные Dox лунки нормализовали по лункам без обработки для каждой линии клеток.

[0062] Для экспериментов по исследованию зависимости эффекта от дозы клетки сеяли в 96- или 384-луночные планшеты по 1000 клеток в 50 мкл на лунку. Соединения добавляли из серии 11-точечного серийного разведения в 90% ДМСО к клеткам в среде путем акустического переноса. Конечная концентрация ДМСО составляла 0,1%. Планшеты накрывали крышками и позволяли клеткам расти при 37°C и 5% СО2. В t=0 необработанные клетки лизировали с использованием CellTiter-Glo и измеряли на анализаторе планшетов Envision. В t=72 (через 72 часа после добавления соединения) клетки, обработанные соединением, лизировали с использованием CellTiter-Glo и анализировали на Envision. Показатель люминесценции для каждого обработанного образца нормализовали по среднему значению соответствующего контроля ДМСО.

[0063] Для экспериментов по MCL1-спасению клеточные линии культивировали в течение 72 часов с 300 нг/мл dox, затем субкультивировали и сеяли в 96- или 384-луночные планшеты с 300 нг/мл dox.

6. Исследования комбинированного применения

[0064] Серийные разведения соединений приготавливали для модулятора сплайсинга (например, E7107 или H3B-8800) и ингибитора BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL (например, ABT263, ABT199 или A-1331852), и обрабатывали клетки, как описано в Жизнеспособности клеток и методике MCL1-спасения. Для нокдауна BCL-xL клетки обрабатывали 300 нг/мл dox в соответствии с Жизнеспособностью клеток и методикой MCL1-спасения перед посевом в 384-луночные планшеты. Конечная концентрация ДМСО составляла 0,2%. CellTiter-Glo проводили в соответствии с Жизнеспособностью клеток и методикой MCL1-спасения. Данные анализировали при использовании программы Chalice Bioinformatics (Horizon Discovery, Cambridge, UK). Для оценки синергии соединений для модулятора сплайсинга (например, E7107 или H3B-8800) и ингибитора BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL (например, ABT263, ABT199 или A-1331852), использовали модель аддитивности Леве от Horizon Discovery, и Избыток Леве вычисляли путем вычитания модели Леве (чистой аддитивности на основе комбинирования соединения с самим с собой) из матрицы зависимости доза-эффект.

7. Исследования на животных

[0065] Для определения переносимых доз для применения в группе комбинированной терапии исследования эффективности мышам вводили модулятор сплайсосомы (например, E7107 или H3B-8800) внутривенно, один раз в день, в течение 5 последовательных дней (QD×5) при хорошо переносимых уровнях дозы (например, 1, 25, 2,5 и 5 мг/кг для E7107) или ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL перорально, один раз в день (QD), в переносимых дозах (100, 50 и 25 мг/кг), отдельно или в комбинации. После введения доз животных мониторировали до развития нарушений (например, паралича или чрезмерной потери массы тела). Максимальная переносимая доза комбинации и соответствующие однократные дозы каждого соединения использовались в исследовании эффективности на животных с опухолями.

[0066] Противоопухолевую активность комбинации E7107 и ингибитора BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL оценивали in vivo в подкожной модели A549 и NCIH1568. Клетки (5×106 клеток H1568 и 10×106 клеток A549) подкожно имплантировали в бок голым мышам. Животным вводили модулятор сплайсосомы и ингибитор BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL на основе доз, определенных в предыдущем исследовании.

B. Результаты

1. Идентификация MCL1-оверэкспрессирующих и MCL1-зависимых линий клеток НМРЛ

[0067] Для идентификации моделей линий клеток для оценки комбинаторной активности пладиенолидных модуляторов сплайсосомы и ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL отобрали шесть линий клеток немелкоклеточной карциномы легкого (НМРЛ) с или без амплификации MCL1 на основе предыдущего сообщения (Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4):547-562). Вестерн-блоттинг проводили для анализа экспрессии белка MCL1 в этих линиях клеток. Как показано на ФИГ. 1, NCIH1568, NCIH23 и NCIH2110 с амплификацией гена MCL1 экспрессируют более высокие уровни белка MCL1 по сравнению с линиями клеток NCIH1650, NCIH1975 и A549 без амплификации. Затем зависимость от MCL1 исследовали в этих линиях клеток с использованием индуцируемой мшРНК, которая вызывает специфичную даунрегуляцию MCL1, демонстрируя селективную MCL-зависимость в MCL-амплифицированных линиях клеток, но не в клетках без амплификации (ФИГ. 2). Модели линий MCL1-оверэкспрессированных и MCL1-зависимых клеток НМРЛ идентифицировали для применения в последующих функциональных исследованиях.

2. E7107 вызывает модуляцию сплайсинга MCL1

[0068] Изучали модуляцию сплайсинга гена MCL1 под действием производного пладиенолида, E7107. Ген MCL1 содержит три экзона и два интрона, которые могут подвергаться альтернативному сплайсингу с получением двух основных транскриптов: MCL1L, который кодирует функциональный полноразмерный белок, и MCL1S, который кодирует предполагаемый белок с потерей функции (ФИГ. 3). В качестве части исследования измеряли сохранение интронов MCL1, так как E7107 нарушает функцию аппарата сплайсинга. Шестичасовая обработка клеток NCIH1568 E7107 эффективно вызывала снижение мРНК MCL1L, транзиентную экспрессию мРНК MCL1S и непрерывную индукцию пре-мРНК MCL1 с сохранением интрона (ФИГ. 4).

[0069] Экспрессию белка MCL1 также исследовали в клетках NCIH1568. В соответствии с данными мРНК, E7107 вызывал дозозависимую даунрегуляцию полноразмернго белка MCL1, тогда как усеченная короткая форма белкового продукта повышалась дозозависимым образом. Изменение уровней белка MCL было связано с индукцией расщепленного белка PARP, который является индикатором апоптоза, что дает основания предполагать, что модуляция сплайсинга MCL1, вызванная E7107, может привести к гибели клеток NCIH1568 (ФИГ. 5).

3. E7107-индуцированная гибель клеток является BCLxL- и MCLI-зависимой

[0070] Чтобы подтвердить, что вызванная E7107 даунрегуляция MCL1 является причиной гибели клеток, кДНК MCL1L оверэкспрессировали в клетках NCIH1568, как показано с помощью Вестерн-блоттинга (ФИГ. 6). Оверэкспрессия кДНК MCL1L предотвращала гибель клеток, вызванную E7107 в MCL1-зависимой линии клеток (ФИГ. 7). Также исследовали роль BCLxL (кодируемого BCL2L1) в E7107-обработанных MCL1-независимых клетках A549. Хотя E7107 вызывал только цитостатическое ингибирование, как и ожидали, индуцируемый нокдаун BCLxL (ФИГ. 8) приводил к явной гибели клеток при обработке E7107 (ФИГ. 9). Таким образом, эти данные подтверждают, что ингибирование как MCL1, так и BCLxL приводит к синергической активности, приводящей к цитотоксичности как в MCL1-зависимых, так и MCL1-независимых раковых клетках.

4. Комбинация E7107 с ингибиторами BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL демонстрирует синергический эффект

[0071] Так как E7107 может модулировать MCL1, а другие белки BCL2 могут препятствовать цитотоксичности, вызванной ингибированием MCL1, комбинация E7107 с ингибиторами BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL может обеспечивать усиленную гибель клеток посредством широкого адресного воздействия на все антиапоптические белки BCL2.

[0072] ABT263 (Навитоклакс), панингибитор BCL2/BCLxL/BCLw, тестировали в комбинации с E7107 в режиме матрицы доз 8×8 (ФИГ. 10). Фактически, комбинация этих двух ингибиторов показала сильный синергический эффект с большим избытком по сравнению с моделью аддитивности Леве (ФИГ. 10, панели слева) в четырех разных моделях линии клеток, экспрессирующих пустые векторы, включая MCL1-зависимые клетки NCIH23 (оценка синергии=50,8), NCIH2110 (оценка синергии=50,2), NCIH1568 (оценка синергии=35,2) и MCL1-независимые клетки A549 (оценка синергии=85,4). Кроме того, истощение мшРНК BCLxL в основном уменьшало эту синергию между E7107 и ABT263 (ФИГ. 10, панели справа), подтверждая, что генетическая манипуляция мшРНК и фармакологический ингибитор (ABT263) действовали на один и тот же узел BCLxL, достигая синергического эффекта. В частности, оценка синергии значительно снижена в NCIH23 (7,42), NCIH2110 (7,03), NCIH1568 (12,7) и A549 (28,3).

[0073] ABT199 (венетоклакс) также тестировали в комбинации с E7107. ABT199 является более BCL2-селективным ингибитором, который активен в отношении BCLxL. Комбинация E7107 и ABT199 в MCL1-независимых клетках A549 продемонстрировала синергическую активность (оценка=32,6), тогда как нокдаун BCLxL значительно уменьшал синергизм (оценка=16,4) (ФИГ. 11).

5. Комбинация H3B-8800 с ингибиторами BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL демонстрирует синергический эффект

[0074] H3B-8800, другой SF3b-направленный модулятор сплайсинга, также оценивали на потенциальную синергическую активность с ингибиторами BCL2/BCLxL, которые могут обеспечивать усиленную гибель клеток посредством широкого направленного воздействия на все антиапоптические белки BCL2.

[0075] ABT263 (Навитоклакс), панингибитор BCL2/BCLxL/BCLw, тестировали в комбинации с H3B-8800 в режиме матрицы доз 12×12. Комбинация этих двух ингибиторов показала сильный синергический эффект с большим избытком по модели аддитивности Леве (ФИГ. 12) в двух разных моделях линии клеток множественной миеломы, включающих U266B1 (оценка синергии=41,3) и RPMI8226 (оценка синергии=40,1).

[0076] ABT199 (венетоклакс) также тестировали в комбинации с H3B-8800. ABT199 является более BCL2-селективным ингибитором, который активен в отношении BCLxL. Комбинация H3B-8800 и ABT199 также продемонстрировала синергическую активность в двух протестированных моделях линии клеток множественной миеломы JJN3 (оценка синергии=26,1) и RPMI8226 (оценка синергии=19) (ФИГ. 13).

[0077] Кроме того, A-1331852 также тестировали в комбинации с H3B-8800. А-1331852 является более BCLxL-селективным ингибитором. Комбинация H3B-880 и A-1331852 продемонстрировала существенную синергическую активность в двух протестированных моделях линии клеток множественной миеломы RPMI8226 (оценка синергии=68,3) и MM1S (оценка синергии=56,8) (ФИГ. 14).

[0078] В совокупности эти данные указывают, что комбинация пладиенолид-производных модуляторов сплайсинга (например, E7107 или H3B-8800) с ингибиторами BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL (например, ABT263, ABT199 или A-1331852) вызывает синергическую цитотоксичность в различных раковых клетках. Таким образом, эти данные подтверждают применение комбинации пладиенолидных модуляторов сплайсинга и ингибиторов BCL2, BCL2/BCLxL или BCLxL при лечении рака.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD.

<120> КОМБИНАЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДИН МОДУЛЯТОР СПЛАЙСОСОМЫ И

ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДИН ИНГИБИТОР, ВЫБРАННЫЙ ИЗ ИНГИБИТОРОВ BCL2,

ИНГИБИТОРОВ BCL2/BCLXL И ИНГИБИТОРОВ BCLXL, А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 08061.0033-00304

<140> PCT/US2018/058277

<141> 2018-10-30

<150> 62/580,364

<151> 2017-11-01

<150> 62/579,666

<151> 2017-10-31

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестный

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестного:

пептид DEAH-бокс геликазы 9 (DHX9)"

<400> 1

Asp Glu Ala His

1

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер"

<400> 2

atatgccaaa ccagctccta c 21

<210> 3

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер"

<400> 3

aaggacaaaa cgggactgg 19

<210> 4

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

зонд"

<400> 4

agaactccac aaacccatcc cagc 24

<210> 5

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер"

<400> 5

aaagccaatg ggcaggt 17

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер"

<400> 6

ccaccttcta ggtcctctac at 22

<210> 7

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

зонд"

<400> 7

tccacaaacc catcttggaa ggcc 24

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер"

<400> 8

gacaaaggag gccgtgagga 20

<210> 9

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

праймер"

<400> 9

gtttgttacg ccgtcgctga aa 22

<210> 10

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

зонд"

<400> 10

tcaggcatgc ttcggaaact gga 23

<210> 11

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 11

gctcactctt cagtcggaaa t 21

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид"

<400> 12

gcatcgaacc attagcagaa a 21

<---

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к фармацевтической композиции, включающей: (i) терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного модулятора сплайсосомы, выбранного из E7107, H3B-8800 и их фармацевтически приемлемых солей, и (ii) терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из венетоклакса (ABT199), навитоклакса (ABT263), A-1331852 и их фармацевтически приемлемых солей, также относится к комбинации для лечения злокачественной опухоли, выбранной из гемобластозов и солидных опухолей, включающей: (i) по меньшей мере один модулятор сплайсосомы, выбранный из E7107, H3B-8800 и их фармацевтически приемлемых солей, и (ii) по меньшей мере один ингибитор, выбранный из венетоклакса (ABT199), навитоклакса (ABT263), A-1331852 и их фармацевтически приемлемых солей, при этом по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят одновременно, отдельно или последовательно по меньшей мере с одним ингибитором, также относится к применению комбинации, включающей: (i) по меньшей мере один модулятор сплайсосомы, выбранный из E7107, H3B-8800 и их фармацевтически приемлемых солей, и (ii) по меньшей мере один ингибитор, выбранный из венетоклакса (ABT199), навитоклакса (ABT263), A-1331852 и их фармацевтически приемлемых солей, для лечения злокачественной опухоли, выбранной из гемобластозов и солидных опухолей, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят одновременно, отдельно или последовательно по меньшей мере с одним ингибитором, и также относится к способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту: (i) терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного модулятора сплайсосомы, выбранного из E7107, H3B-8800 и их фармацевтически приемлемых солей, и (ii) терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из венетоклакса (ABT199), навитоклакса (ABT263), A-1331852 и их фармацевтически приемлемых солей, где злокачественная опухоль выбрана из гемобластозов и солидных опухолей, и при этом по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят одновременно, отдельно или последовательно по меньшей мере с одним ингибитором. Группа изобретений обеспечивает синергическое противоопухолевое действие комбинаций модуляторов и ингибиторов сплайсосомы. 4 н. и 80 з.п. ф-лы, 14 ил.

1. Фармацевтическая композиция, включающая: (i) терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного модулятора сплайсосомы, выбранного из E7107, H3B-8800 и их фармацевтически приемлемых солей, и (ii) терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из венетоклакса (ABT199), навитоклакса (ABT263), A-1331852 и их фармацевтически приемлемых солей.

2. Композиция по п.1, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы выбран из E7107 и его фармацевтически приемлемых солей.

3. Композиция по п.1, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы выбран из H3B-8800 и его фармацевтически приемлемых солей.

4. Композиция по любому из пп.1-3, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы является стереоизомерно чистым.

5. Композиция по любому из пп.1-4, где по меньшей мере один ингибитор выбран из венетоклакса (ABT199) и его фармацевтически приемлемых солей.

6. Композиция по любому из пп.1-4, где по меньшей мере один ингибитор выбран из навитоклакса (ABT263) и его фармацевтически приемлемых солей.

7. Композиция по любому из пп.1-4, где по меньшей мере один ингибитор выбран из A-1331852 и его фармацевтически приемлемых солей.

8. Композиция по любому из пп.1-7, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы включен в состав для внутривенного, перорального, подкожного или внутримышечного введения.

9. Композиция по любому из пп.1-8, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы включен в состав для перорального введения.

10. Композиция по любому из пп.1-9, где по меньшей мере один ингибитор включен в состав для внутривенного, перорального, подкожного или внутримышечного введения.

11. Композиция по любому из пп.1-10, где по меньшей мере один ингибитор включен в состав для перорального введения.

12. Комбинация для лечения злокачественной опухоли, выбранной из гемобластозов и солидных опухолей, включающая: (i) по меньшей мере один модулятор сплайсосомы, выбранный из E7107, H3B-8800 и их фармацевтически приемлемых солей, и (ii) по меньшей мере один ингибитор, выбранный из венетоклакса (ABT199), навитоклакса (ABT263), A-1331852 и их фармацевтически приемлемых солей, при этом по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят одновременно, отдельно или последовательно по меньшей мере с одним ингибитором.

13. Комбинация по п.12, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы выбран из E7107 и его фармацевтически приемлемых солей.

14. Комбинация по п.12, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы выбран из H3B-8800 и его фармацевтически приемлемых солей.

15. Комбинация по любому из пп.12-14, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы является стереоизомерно чистым.

16. Комбинация по любому из пп.12-15, где по меньшей мере один ингибитор выбран из венетоклакса (ABT199) и его фармацевтически приемлемых солей.

17. Комбинация по любому из пп.12-15, где по меньшей мере один ингибитор выбран из навитоклакса (ABT263) и его фармацевтически приемлемых солей.

18. Комбинация по любому из пп.12-15, где по меньшей мере один ингибитор выбран из A-1331852 и его фармацевтически приемлемых солей.

19. Комбинация по любому из пп.12-18, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы включен в состав для внутривенного, перорального, подкожного или внутримышечного введения.

20. Комбинация по любому из пп.12-19, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы включен в состав для перорального введения.

21. Комбинация по любому из пп.12-20, где по меньшей мере один ингибитор включен в состав для внутривенного, перорального, подкожного или внутримышечного введения.

22. Комбинация по любому из пп.12-21, где по меньшей мере один ингибитор включен в состав для перорального введения.

23. Комбинация по любому из пп.12-22, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят одновременно по меньшей мере с одним ингибитором.

24. Комбинация по любому из пп.12-22, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят последовательно по меньшей мере с одним ингибитором.

25. Комбинация по любому из пп.12-22, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят отдельно по меньшей мере с одним ингибитором.

26. Комбинация по любому из пп.12-25, где указанная злокачественная опухоль выбрана из миелодиспластического синдрома, множественной миеломы, хронического лимфоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического миеломоноцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака эндометрия, рака яичника, рака молочной железы, увеальной меланомы, рака желудка, холангиокарциномы или рака легкого.

27. Комбинация по п.26, где указанная злокачественная опухоль представляет собой рак легкого.

28. Комбинация по п.27, где указанный рак легкого выбран из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого.

29. Комбинация по п.12, где указанный гемобластоз выбран из острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического миеломоноцитарного лейкоза, острого моноцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, миелодиспластического синдрома и множественной миеломы.

30. Комбинация по п.12, где указанная солидная опухоль выбрана из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака толстой кишки или рака толстой и прямой кишки, рака легкого, рака желудка, рака шейки матки, рака эндометрия, рака яичника, холангиокарциномы, глиомы и меланомы.

31. Комбинация по любому из пп.12-25, где указанная злокачественная опухоль выбрана из форм MCL1-зависимой злокачественной опухоли.

32. Комбинация по п.31, где указанная MCL1-зависимая злокачественная опухоль выбрана из острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического миеломоноцитарного лейкоза, острого моноцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, миелодиспластического синдрома, множественной миеломы, рака легкого, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака толстой кишки или рака толстой и прямой кишки, рака желудка, рака шейки матки, рака эндометрия, рака яичника, холангиокарциномы, глиомы и меланомы.

33. Комбинация по любому из пп.12-25, где указанная злокачественная опухоль является положительной по одной или более мутаций в гене или белке сплайсосомы.

34. Комбинация по п.33, где указанный ген или белок сплайсосомы выбран из субъединицы 1 фактора сплайсинга 3B (SF3B1), U2 малой ядерной РНК вспомогательного фактора 1 (U2AF1), серин/аргинин-богатого фактора сплайсинга 2 (SRSF2), цинкпальцевого (CCCH типа) РНК-связывающего мотива и серин/аргинин-богатого 2 (ZRSR2), фактора процессинга-сплайсинга пре-мРНК 8 (PRPF8), U2 малой ядерной РНК вспомогательного фактора 2 (U2AF2), фактора сплайсинга 1 (SF1), субъединицы 1 фактора 3a сплайсинга (SF3A1), PRP40 фактора процессинга пре-мРНК 40 гомолога B (PRPF40B), содержащего РНК-связывающий мотив белка 10 (RBM10), поли(rC)-связывающего белка 1 (PCBP1), фактора сплайсинга пре-мРНК crooked neck 1 (CRNKL1), DEAH (Asp-Glu-Ala-His) бокс геликазы 9 (DHX9), пептидил-пролил цис-транс изомераза-подобного 2 (PPIL2), содержащего РНК-связывающий мотив белка 22 (RBM22), малого ядерного рибонуклеопротеина Sm D3 (SNRPD3), вероятной АТФ-зависимой РНК-геликазы DDX5 (DDX5), фактора сплайсинга пре-мРНК АТФ-зависимой РНК-геликазы DHX15 (DHX15) и полиаденилат-связывающего белка 1 (PABPC1).

35. Комбинация по п.34, где указанный ген или белок сплайсосомы является субъединицей 1 фактора сплайсинга 3B (SF3B1).

36. Применение комбинации, включающей: (i) по меньшей мере один модулятор сплайсосомы, выбранный из E7107, H3B-8800 и их фармацевтически приемлемых солей, и (ii) по меньшей мере один ингибитор, выбранный из венетоклакса (ABT199), навитоклакса (ABT263), A-1331852 и их фармацевтически приемлемых солей, для лечения злокачественной опухоли, выбранной из гемобластозов и солидных опухолей, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят одновременно, отдельно или последовательно по меньшей мере с одним ингибитором.

37. Применение по п.36, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы выбран из E7107 и его фармацевтически приемлемых солей.

38. Применение по п.36, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы выбран из H3B-8800 и его фармацевтически приемлемых солей.

39. Применение по п.36, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы является стереоизомерно чистым.

40. Применение по любому из пп.36-39, где по меньшей мере один ингибитор выбран из венетоклакса (ABT199) и его фармацевтически приемлемых солей.

41. Применение по любому из пп.36-39, где по меньшей мере один ингибитор выбран из навитоклакса (ABT263) и его фармацевтически приемлемых солей.

42. Применение по любому из пп.36-39, где по меньшей мере один ингибитор выбран из A-1331852 и его фармацевтически приемлемых солей.

43. Применение по любому из пп.36-42, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы предназначен для внутривенного, перорального, подкожного или внутримышечного введения.

44. Применение по любому из пп.36-43, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы предназначен для перорального введения.

45. Применение по любому из пп.36-44, где по меньшей мере один ингибитор предназначен для внутривенного, перорального, подкожного или внутримышечного введения.

46. Применение по любому из пп.36-45, где по меньшей мере один ингибитор предназначен для перорального введения.

47. Применение по любому из пп.36-46, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят одновременно по меньшей мере с одним ингибитором.

48. Применение по любому из пп.36-47, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят последовательно по меньшей мере с одним ингибитором.

49. Применение по любому из пп.36-47, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят отдельно по меньшей мере с одним ингибитором.

50. Применение по любому из пп.36-49, где указанная злокачественная опухоль выбрана из миелодиспластического синдрома, множественной миеломы, хронического лимфоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического миеломоноцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака эндометрия, рака яичника, рака молочной железы, увеальной меланомы, рака желудка, холангиокарциномы и рака легкого.

51. Применение по п.50, где указанная злокачественная опухоль представляет собой рак легкого.

52. Применение по п.51, где указанный рак легкого выбран из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого.

53. Применение по п.36, где указанный гемобластоз выбран из острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического миеломоноцитарного лейкоза, острого моноцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, миелодиспластического синдрома и множественной миеломы.

54. Применение по п.36, где указанная солидная опухоль выбрана из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака толстой кишки или рака толстой и прямой кишки, рака легкого, рака желудка, рака шейки матки, рака эндометрия, рака яичника, холангиокарциномы, глиомы и меланомы.

55. Применение по любому из пп.36-49, где указанная злокачественная опухоль выбрана из форм MCL1-зависимой злокачественной опухоли.

56. Применение по п.55, где указанный MCL1-зависимая злокачественная опухоль выбрана из острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического миеломоноцитарного лейкоза, острого моноцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, миелодиспластического синдрома, множественной миеломы, рака легкого, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака толстой кишки или рака толстой и прямой кишки, рака желудка, рака шейки матки, рака эндометрия, рака яичника, холангиокарциномы, глиомы и меланомы.

57. Применение по любому из пп.36-49, где указанная злокачественная опухоль является положительной по одной или более мутаций в гене или белке сплайсосомы.

58. Применение по п.57, где указанный ген или белок сплайсосомы выбран из субъединицы 1 фактора сплайсинга 3B (SF3B1), U2 малой ядерной РНК вспомогательного фактора 1 (U2AF1), серин/аргинин-богатого фактора сплайсинга 2 (SRSF2), цинкпальцевого (CCCH типа) РНК-связывающего мотива и серин/аргинин-богатого 2 (ZRSR2), фактора процессинга-сплайсинга пре-мРНК 8 (PRPF8), U2 малой ядерной РНК вспомогательного фактора 2 (U2AF2), фактора сплайсинга 1 (SF1), субъединицы 1 фактора 3a сплайсинга (SF3A1), PRP40 фактора процессинга пре-мРНК 40 гомолога B (PRPF40B), содержащего РНК-связывающий мотив белка 10 (RBM10), поли(rC)-связывающего белка 1 (PCBP1), фактора сплайсинга пре-мРНК crooked neck 1 (CRNKL1), DEAH (Asp-Glu-Ala-His) бокс геликазы 9 (DHX9), пептидил-пролил цис-транс изомераза-подобного 2 (PPIL2), содержащего РНК-связывающий мотив белка 22 (RBM22), малого ядерного рибонуклеопротеина Sm D3 (SNRPD3), вероятной АТФ-зависимой РНК-геликазы DDX5 (DDX5), фактора сплайсинга пре-мРНК АТФ-зависимой РНК-геликазы DHX15 (DHX15) и полиаденилат-связывающего белка 1 (PABPC1).

59. Применение по п.58, где указанный ген или белок сплайсосомы является субъединицей 1 фактора сплайсинга 3B (SF3B1).

60. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту: (i) терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного модулятора сплайсосомы, выбранного из E7107, H3B-8800 и их фармацевтически приемлемых солей, и (ii) терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из венетоклакса (ABT199), навитоклакса (ABT263), A-1331852 и их фармацевтически приемлемых солей, где злокачественная опухоль выбрана из гемобластозов и солидных опухолей, и при этом по меньшей мере один модулятор сплайсосомы вводят одновременно, отдельно или последовательно по меньшей мере с одним ингибитором.

61. Способ по п.60, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы выбран из E7107 и его фармацевтически приемлемых солей.

62. Способ по п.60, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы выбран из H3B-8800 и его фармацевтически приемлемых солей.

63. Способ по любому из пп.60-62, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы является стереоизомерно чистым.

64. Способ по любому из пп.60-63, где по меньшей мере один ингибитор представляет собой венетоклакс (ABT199) или его фармацевтически приемлемую соль.

65. Способ по любому из пп.60-63, где по меньшей мере один ингибитор выбран из навитоклакса (ABT263) и его фармацевтически приемлемых солей.

66. Способ по любому из пп.60-63, где по меньшей мере один ингибитор выбран из A-1331852 и его фармацевтически приемлемых солей.

67. Способ по любому из пп.60-66, где модулятор сплайсосомы предназначен для внутривенного, перорального, подкожного или внутримышечного введения.

68. Способ по любому из пп.60-67, где модулятор сплайсосомы предназначен для перорального введения.

69. Способ по любому из пп.60-68, где по меньшей мере один ингибитор предназначен для внутривенного, перорального, подкожного или внутримышечного введения.

70. Способ по любому из пп.60-69, где по меньшей мере один ингибитор предназначен для перорального введения.

71. Способ по любому из пп.60-70, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор вводят последовательно.

72. Способ по любому из пп.60-70, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор вводят отдельно.

73. Способ по любому из пп.60-70, где по меньшей мере один модулятор сплайсосомы и по меньшей мере один ингибитор вводят одновременно.

74. Способ по любому из пп.60-73, где указанная злокачественная опухоль выбрана из миелодиспластического синдрома, множественной миеломы, хронического лимфоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического миеломоноцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака эндометрия, рака яичника, рака молочной железы, увеальной меланомы, рака желудка, холангиокарциномы и рака легкого.

75. Способ по любому из пп.60-74, где указанная злокачественная опухоль представляет собой рак легкого.

76. Способ по любому из пп.60-75, где указанная злокачественная опухоль выбрана из немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого.

77. Способ по п.76, где указанный гемобластоз выбран из лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, миелодиспластического синдрома, множественной миеломы, хронического лимфоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического миеломоноцитарного лейкоза и острого миелоидного лейкоза.

78. Способ по п.60, где указанная солидная опухоль выбрана из рака толстой кишки или рака толстой и прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака эндометрия, рака яичника, рака молочной железы, меланомы, рака желудка, холангиокарциномы, рака предстательной железы, рака шейки матки, глиомы и рака легкого.

79. Способ по п.78, где указанная меланома является увеальной меланомой.

80. Способ по любому из пп.60-73, где указанная злокачественная опухоль является MCL1-зависимой злокачественной опухолью.

81. Способ по п.80, где указанная MCL1-зависимая злокачественная опухоль выбрана из острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, хронического миеломоноцитарного лейкоза, острого моноцитарного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, миелодиспластического синдрома, множественной миеломы, рака легкого, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака толстой кишки или рака толстой и прямой кишки, рака желудка, рака шейки матки, рака эндометрия, рака яичника, холангиокарциномы, глиомы и меланомы.

82. Способ по любому из пп.60-73, где указанная злокачественная опухоль является положительной по одной или более мутаций в гене или белке сплайсосомы.

83. Способ по п.82, где указанный ген или белок сплайсосомы выбран из субъединицы 1 фактора сплайсинга 3B (SF3B1), U2 малой ядерной РНК вспомогательного фактора 1 (U2AF1), серин/аргинин-богатого фактора сплайсинга 2 (SRSF2), цинкпальцевого (CCCH типа) РНК-связывающего мотива и серин/аргинин-богатого 2 (ZRSR2), фактора процессинга-сплайсинга пре-мРНК 8 (PRPF8), U2 малой ядерной РНК вспомогательного фактора 2 (U2AF2), фактора сплайсинга 1 (SF1), субъединицы 1 фактора 3a сплайсинга (SF3A1), PRP40 фактора процессинга пре-мРНК 40 гомолога B (PRPF40B), содержащего РНК-связывающий мотив белка 10 (RBM10), поли(rC)-связывающего белка 1 (PCBP1), фактора сплайсинга пре-мРНК crooked neck 1 (CRNKL1), DEAH (Asp-Glu-Ala-His) бокс геликазы 9 (DHX9), пептидил-пролил цис-транс изомераза-подобного 2 (PPIL2), содержащего РНК-связывающий мотив белка 22 (RBM22), малого ядерного рибонуклеопротеина Sm D3 (SNRPD3), вероятной АТФ-зависимой РНК-геликазы DDX5 (DDX5), фактора сплайсинга пре-мРНК АТФ-зависимой РНК-геликазы DHX15 (DHX15) и полиаденилат-связывающего белка 1 (PABPC1).

84. Способ по п.83, где указанный ген или белок сплайсосомы является субъединицей 1 фактора сплайсинга 3B (SF3B1).