СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННО ОБУСЛОВЛЕННОЙ ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 G01N33/531 

Настоящее изобретение относится к диагностике артериальной гипертензии, в частности, к диагностике наследственно обусловленной эссенциальной гипертензии, в частности, к белку BASP1 как маркёру наследственно обусловленной эссенциальной гипертензии, в частности, с высокой прогностической ценностью положительного результата.

По оценке ВОЗ артериальной гипертензией (АГ) в мире страдает более 1 миллиарда человек (Вступительное слово Генерального директора ВОЗ на пресс брифинге по COVID-19 - 16 октября 2020 г. : [арх. 5 ноября 2020] = WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 : [пер. с англ.] // Всемирная организация здравоохранения. - 2020. - 16 октября). При этом диагноз вторичная (симптоматическая) гипертензия ставится лишь в 5-10% случаев, только если таковая обусловлена другим выявленным патологическим состоянием, беременностью или приёмом лекарственных препаратов. В остальных (90-95%) случаев ставится диагноз эссенциальная гипертензия (первичная гипертензия, гипертоническая болезнь), определяемая как высокое артериальное давление вследствие неспецифических факторов образа жизни и/или генетических факторов (Poulter NR, Prabhakaran D, Caulfield M Hypertension // Lancet. 386 (9995): 801-812.doi:10.1016/s0140-6736(14)61468-9). Из такого определения эссенциальной гипертензии следует неоднородность вызывающих её причин. Действительно, наследственная (генетическая) предрасположенность выявляется лишь приблизительно в 50% случаев (Rahmouni K., Correia M.L., Haynes W.G., Mark A.L. Obesity-associated hypertension: new insights into mechanisms (англ.) // Hypertension journal. - 2005, vol. 45, no. 1, p. 9-14. - doi: 10.1161/01.HYP.0000151325.83008.b4). Остальные случаи обусловлены неспецифическими факторами образа жизни: курением, избыточным весом, повышенным потреблением соли, пониженным потреблением кальция и др. в отдельности или в различных сочетаниях.

Специалистам известны молекулярные маркёры различных аспектов эссенциальной гипертензии. Среди них ангиотензин A (Jankowski V, Vanholder R, van der Giet M, et al. Mass-spectrometric identification of a novel angiotensin peptide in human plasma. Arterioscler Thromb Vase Biol 2007;27:297-302.), фактор ингибирования вазоконстрикции (Salem S, Jankowski V, Asare Y, et al. Identification of the Vasoconstriction-Inhibiting Factor (VIF), a Potent Endogenous Cofactor of Angiotensin II Acting on the Angiotensin II Type 2 Receptor. Circulation 2015;131:1426-34), эндотелиальные микрочастицы (Burger D, Schock S, Thompson CS, et al. Microparticles: biomarkers and beyond. Clin Sci (Lond) 2013;124:423-41), маркеры воспаления, такие как IL-6, ICAM1, Р-селектин, TNF-α (Savoia С, Schiffrin EL. Inflammation in hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens 2006;15:152-8, Huang Z, Chen C, Li S, et al. Serum Markers of Endothelial Dysfunction and Inflammation Increase in Hypertension with Prediabetes Mellitus. Genetic testing and molecular biomarkers 2016;20:322-7), и другие, среди которых в особенности отметим С-реактивный белок (см., напр., Sesso HD, Wang L, Buring JE, et al. Comparison of interleukin-6 and C-reactive protein for the risk of developing hypertension in women. Hypertension 2007;49:304-10). Ряд маркеров, таких как упомянутый С-реактивный белок, а также уровень мочевой кислоты (Mazzali М, Kanbay М, Segal MS, et al. Uric acid and hypertension: cause or effect? Curr Rheumatol Rep 2010;12:108-17) или гомоцистеина (Schalinske KL, Smazal AL. Homocysteine imbalance: a pathological metabolic marker. Adv Nutr 2012;3:755-62) могут служить для раннего предсказания развития АГ. АГ ведет к повреждению ряда органов; в этом смысле маркеры повреждения различных органов также могут рассматриваться в качестве маркеров течения АГ (для обзора: Amar Shere, Olanrewaju Eletta, Hemant Goyal. Circulating blood biomarkers in essential hypertension: a literature review // J. Lab. Precison Med. 2017; 2 (12): 99-110).

В приведенных примерах из уровня техники почти всегда осуществляется взятие образца ткани, в частности, крови пациента с последующим выявлением в образце искомого маркера.

В уровне техники не известно маркера наследственно обусловленной эссенциальной гипертензии. Настоящее изобретение касается именно такого маркера.

В качестве модели эссенциальной гипертензии широко используются крысы со спонтанной гипертензией (линия SHR). Во взрослом состоянии для таких крыс характерно систолическое артериальное давление (АД) около 180 мм рт.ст. (Pinto YM, Paul М, Ganten D (July 1998). "Lessons from rat models of hypertension: from Goldblatt to genetic engineering". Cardiovascular Research. 39 (1): 77-88. doi:10.1016/S0008-6363(98)00077-7). В частности, в организме крыс со спонтанною гипертензией наблюдаются наследственно обусловленные нарушения внутриклеточного обмена кальция (McCarron DA, Hatton D, Roullet JB, Roullet C. Dietary calcium, defective cellular Ca2+handling, and arterial pressure control. Can J Physiol Pharmacol. 1994;72(8):937-944).

Такие крысы были получены путем разведения крыс линии Вистар-Киото (WKY) с высоким АД (Okamoto K, Aoki K (March 1963). "Development of a strain of spontaneously hypertensive rats". Japanese Circulation Journal. 27 (3): 282-93. doi:10.1253/jcj.27.282). Как неоднократно продемонстрировано, у крыс нормотензивной линии WKY артериальная гипертензия может быть вызвана такими факторами, как повышенное потребление поваренной соли или недостаточное потребление кальция (см., напр.,: Альдекеева А.С., Плеханов А.Ю., Клюева Н.З. Уровни экспрессии мРНК NAP-22 и MARCKS в почках крыс со спонтанной гипертензией при потреблении воды с различным содержанием кальция). Такие факторы обычно относят к неспецифическим факторам образа жизни и, следовательно, возникающее при этом повышенное АД рассматривается как эссенциальная гипертензия. Однако в рассматриваемом случае эссенциальная гипертензия не является строго наследственно обусловленной, поскольку без воздействия вышеуказанных факторов крысы линии WKY имеют нормальное давление.

Одним из PIP-модулинов - мажорных регуляторных клеточных белков кальциевого каскада со сходной структурой - является BASP1 (САР-23, NAP-22). В частности, этот белок-субстрат кальций-зависимой протеинкиназы С регулирует высвобождение полифосфоинозитидов из клеточной мембраны в цитоплазму, концентрацию кальмодулина, а также модификации актиновогого цитоскелета (Laux Т, Fukami K, Thelen М, Golub Т, Frey D, Caroni P. GAP43, MARCKS, and CAP23 modulate PI(4,5) P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 2000;149(7):1455-1472.doi:10.1083/jcb.l49.7.1455). Белок BASP1 гетерогенен: он представлен мономерной формой, а также неполнодлинными изоформами и олигомерными агрегатами (Mosevitsky MI, Capony JP, Skladchikova GYu, Novitskaya VA, Plekhanov AYu, Zakharov VV. The BASP1 family of myristoylated proteins abundant in axonal termini. Primary structure analysis and physico-chemical properties. // Biochimie, 1997, 79 (6): 373-84. doi:10.1016/S0300-9084(97)80032-6).

Такие факторы, способствующие повышению АД, как солевая нагрузка (Альдекеева А.С, Корнева Н.А., Руденко Е.Д., Клюева Н.З. Экспрессия мРНК NAP-22 в почках крыс со спонтанной гипертензией (линия SHR) и нормотензивных крыс (линия WKY) в раннем постнатальном онтогенезе в условиях нормального поступления экзогенного кальция и его дефицита. Артериальная гипертензия. 2014;20(5):401-405. doi: 10.18705/1607-419Х-2014-20-5-401-405) и недостаточное потребление кальция (Альдекеева А.С., Плеханов А.Ю., Клюева Н.З. Уровни экспрессии мРНК NAP-22 и MARCKS в почках крыс со спонтанной гипертензией при потреблении воды с различным содержанием кальция), влияют на экспрессию BASP1, в частности, в почках, причём, с различиями в зависимости от исследуемой почечной структуры.

Белок BASP1 является продуктом экспрессии гена BASP1, расположенного, в частности, на 5-й хромосоме человека (GRCh38: Ensembl release 89: ENSG00000176788 - Ensembl, May 2017) и на 15-й хромосоме мыши (GRCh38: Ensembl release 89: ENSMUSG00000045763 - Ensembl, May 2017). Другим продуктом гена BASP1 является матричная РНК (мРНК), на матрице которой синтезируется белок BASP1.

Цитированные выше данные об изменении экспрессии гена BASP1 в связи с различными вариантами эссенциальной артериальной гипертензии получены путём выявления обоих продуктов экспрессии этого гена. Так, мРНК выявляли путём полимеразной цепной реакции (ПЦР), а белок выявляли иммунохимически при помощи антител, специфичных к этому белку.

Вместе с тем, получение образцов тканей внутренних органов, таких как почка, является травматичной процедурой и мало подходит для широкого применения в диагностике. Как известно специалистам, значительно удобнее проводить диагностические процедуры с использованием образцов крови, однако сведения о содержании BASP1 в крови при артериальной гипертензии из уровня техники не известны.

Настоящее изобретение касается способа дифференциальной диагностики наследственно обусловленной эссенциальной гипертензии, включающего в себя взятие образца крови пациента, необязательную подготовку образца и последующее выявление белка BASP1. При превышении уровня белка BASP1 в испытуемом образце по сравнению с образцом крови пациента с нормальным артериальным давлением, известным специалистам, диагностируется наследственно обусловленная эссенциальная гипертензия.

Под пациентом понимается животное, в частности, млекопитающее, в частности, эуархонтоглир (Euarchontoglires). Под эуархонтоглирами понимается клада млекопитающих, в частности, зверей, в частности, плацентарных, включающая в себя эуархонтов (Euarchontes), в частности, человека разумного Homo sapiens, а также грызунообразных (Glires), в частности, крыс Rattus norvegicus.

Подготовка образца крови может включать такие процедуры, не ограничиваясь ими, как экстракция белка BASP1, в частности, поверхностно-активными веществами, например, тритоном Х-100, например, в концентрации от 0,1 % до 1 %, в частности, с последующим добавлением кислоты, например, добавлением трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации от 0,5% до 2%, предпочтительно 1% с последующим центрифугированием; осаждение BASP1 из растворенного состояния, например, добавлением трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации от 3% до 20% или ацетона до конечной концентрации свыше 85% с последующим центрифугированием. Предпочтительно подготовка образца крови осуществляется при температуре от 0°С до +5°С в присутствии ингибиторов протеаз, известных специалистам. Подготовка также может включать в себя электрофорез, например, в полиакриламидном геле, с последующим иммуноблоттингом.

Под выявлением белка BASP1 понимается определение факта присутствия такового в образце, позволяющее судить о его количестве. Специалистам известны многочисленные способы выявления белков, в частности, окрашивание, в том числе после электрофоретического разделения; масс-спектрометрия, а также выявление с помощью антител или аптамеров, в частности, твердофазный иммуноферментный анализ, в частности, иммуноблоттинг. Предпочтительно проводится выявление белка BASP1 путем иммуноферментного анализа, предпочтительно путем иммуноблоттинга.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано не исчерпывающим сущности изобретения примером осуществления.

ПРИМЕР.

В опыте использовались взрослые крысы-самцы линий SHR и WKY возрастом 60 дней. Крысы содержались группами в клетках со свободным доступом к сбалансированному корму (комбикорм ЛБК-120 для лабораторных животных ЗАО «Тосненский комбикормовый завод», содержание кальция 0,48-0,76%) и воде в условиях 12-часового светового дня.

6 крыс линии SHR от рождения получали питьевую воду с содержанием Са⁺⁺ 8 мг/мл и были рождены от матерей, получавших от рождения такую же воду.

2 из них продолжали получать такую же питьевую воду в ходе всего опыта.

4 из них в течение 20 дней непосредственно перед забоем получали 1% раствор NaCl на такой же воде.

8 крыс линии SHR от рождения получали питьевую воду с содержанием Са++ 80 мг/мл и были рождены от матерей, получавших от рождения такую же воду.

4 из них продолжали получать такую же питьевую воду в ходе всего опыта.

4 из них в течение 20 дней непосредственно перед забоем получали 1% раствор NaCl на такой же воде. 6 крыс линии WKY от рождения получали питьевую воду с содержанием Са++ 8 мг/мл и были рождены от матерей, получавших от рождения такую же воду.

2 из них продолжали получать такую же питьевую воду в ходе всего опыта.

4 из них в течение 20 дней непосредственно перед забоем получали 1% раствор NaCl на такой же воде. 8 крыс линии WKY от рождения получали питьевую воду с содержанием Са++ 80 мг/мл и были рождены от матерей, получавших от рождения такую же воду.

4 из них продолжали получать такую же питьевую воду в ходе всего опыта.

4 из них в течение 20 дней непосредственно перед забоем получали 1% раствор NaCl на такой же воде.

Далее все крысы в опыте были забиты путем декапитации под легким эфирным наркозом. По 200 мкл крови от каждой крысы было отобрано в 1,5-миллилитровые пробирки типа «Эппендорф», сразу заморожено и хранилось при -20°С в течение недели.

Далее под растворами понимаются водные растворы, если не указано иначе.

Дифференциальную экстракцию белка BASP 1 проводили, основываясь на его растворимости в слабых растворах трихлоруксусной кислоты (в отличие от большинства других белков), а также на свойстве тритона Х-100 облегчать экстракцию этого белка (Mosevitsky MI, Capony JP, Skladchikova GYu, Novitskaya VA, Plekhanov AYu, Zakharov VV. The BASP1 family of myristoylated proteins abundant in axonal termini. Primary structure analysis and physico-chemical properties. // Biochimie, 1997, 79 (6): 373-84. doi:10.1016/S0300-9084(97)80032-6). На льду без предварительного размораживания к каждому образцу добавляли по 200 ил раствора, содержащего 1% тритона Х-100, 2 мМ трилона Б, 2 мМ дитиотреитола и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (последний был внесен непосредственно перед опытом, исходя из 100^х-ного маточного раствора на этаноле). Добавляемый раствор изначально имел температуру тающего льда. Образцы гомогенизировали стеклянной палочкой с последующим добавлением того же раствора до 1 мл, перемешиванием и выдерживанием на льду в течение 5 минут для экстракции белков. Далее к образцам добавляли 10%-ную трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 1%, после чего экстракцию продолжали в тех же условиях еще 10 минут.Затем полученные белковые экстракты отделяли от осадка центрифугированием.

Из каждого образца отбирали аликвоты по 30 ил и утяжеляли каждую добавлением 10 μл 7,5М мочевины, подкрашенной метиловым зеленым. Подготовленные таким образом акликвоты полностью наносили на старт гель-электрофореза в 11%-ном полиакриламидном геле (соотношение акриламид: N,N'-метиленбисакриламид 29:1) с уксусной кислотой и мочевиной (Panyim S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones. // Arch. Biochem. Biophys. 1969, v. 130, N.1, p.337-346) и проводили электрофоретическое разделение белков при напряженности электрического поля около 25 В/см в течение 20 мин.

По завершении электрофореза гель выдерживали в дистиллированной воде (5 мин.), затем в 1% уксусной кислоте (5 мин.) Далее гель накладывали на пропитанную 1% уксусной кислотой поливинилидендифторидную мембрану. Мембрану с наложенным на нее гелем помещали между слоями фильтровальной бумаги (по 8 слоев с каждой стороны), пропитанной 1% уксусной кислотой, и проводили электрофоретический перенос белков из геля на мембрану (электроблоттинг) при напряженности электрического поля около 10 В/см.

По окончании электроблоттинга мембрану с сорбированными на ней белками промывали водой и дважды по 5 минут в фосфатно-буферном физиологическом растворе (ФБР). Избыточные участки сорбции белков на мембране исчерпывали вымачиванием последней в питьевом ультрапастеризованном молоке с жирностью 1,5% (1 час, 37°С). Далее осуществляли иммунохимическое выявление BASP1. Для этого мембрану выдерживали в растворе поликлональных кроличьих антител, полученных нами против электрофоретически очищенного BASP1 крысы (1:1000 на ультрапастеризованном молоке при комнатной температуре в течение ночи) с последующим ополаскиванием водой и промывкой ФБР (5 мин.) После этого мембрану выдерживали в растворе меченых пероксидазой хрена козьих антител против иммуноглобулинов G кролика (Sjgma) (1:1000 на молоке, 1 час, 37°С) с последующим ополаскиванием водой, промывкой ФБР (3×5 мин.) и водой (5 мин.)

Пероксидазную метку, связанную с белком BASP1, выявляли методом усиленной хемилюминесценции (http://molbiol.ru/protocol/17_08.html). Для этого промытую мембрану в течение 1 минуты выдерживали в свежеприготовленном растворе, содержащем 0,02% люминола, 0,01% о-кумаровой кислоты и 0,03% перекиси водорода, рН 8,8 (на 1 мл 0,02% люминола в 0,1М Трис-HCl, рН 8,8 добавляли 100 μл 1%-ной п-кумаровой кислоты в ДМСО и 100 μл 3%-ной перекиси водорода), заворачивали в тонкую пищевую полиэтиленовую пленку и накладывали на рентгеновскую пленку при темно-красном освещении (время экспозиции ~1 мин.) с последующим проявлением рентгеновской пленки способом, известным специалистам.

В результате на рентгеновской пленке в каждой электрофоретической дорожке проявлялось по несколько электрофоретических зон, соответствующих мономерному белку BASP1, его неполнодлинным изоформам и олигомерным агрегатам (Mosevitsky MI, Capony JP, Skladchikova GYu, Novitskaya VA, Plekhanov AYu, Zakharov VV. The BASP1 family of myristoylated proteins abundant in axonal termini. Primary structure analysis and physico-chemical properties. // Biochimie, 1997, 79 (6): 373-84. doi:10.1016/S0300-9084(97)80032-6), однако в абсолютном большинстве случаев наблюдаемые зоны были едва различимы. При этом в 3 из 14 образцов крови, взятых у крыс со спонтанной гипертензией (SHR), выявляемый уровень BASP1 был многократно выше. Ни в одном образце крови, взятом у крыс линии WKY, настолько повышенного уровня BASP1 не наблюдалось.

Рентгеновские пленки далее сканировали, и плотность изображений оценивали с помощью программы ScanDens (Hyrix Technologies). В трех вышеуказанных случаях многократно повышенного уровня белка BASP1 у крыс SHR цифровой анализ выявил повышение плотности зоны, соответствующей мономерной полнодлинной форме белка, в 9-10 раз, а также повышение плотности части электрофореграммы от старта до наименьшей из неполнодлинных форм в 2,9-4,5 раза. В то же время в единственном случае заметного повышения уровня белка BASP1 среди крыс WKY таковые показатели составляли лишь 1,1 и 1,6.

Отметим, что из всех крыс в опыте лишь крысы линии WKY, не испытывавшие ни недостатка потребления кальция, ни избытка потребления натрия, имели нормальное давление. У всех остальных крыс WKY (а также у всех крыс со спонтанной гипертензией) отмечалась артериальная гипертензия. Несмотря на то, что причина повышенного АД у таких крыс нормотензивной линии WKY очевидна, тем не менее, такие факторы, как недостаток потребления кальция и/или избыток потребления поваренной соли обычно рассматриваются как неспецифические факторы образа жизни и вызываемая ими гипертензия рассматривается как эссенциальная.

Напротив, эссенциальная гипертензия у спонтанно-гипертензивных крыс носит наследственно обусловленный и наследуемый характер, и рассматриваемые здесь примеры неспецифических факторов образа жизни в этом случае практически не ведут к дальнейшему повышению АД у крыс спонтанно-гипертензивной линии (хотя и влияют на обмен веществ - Альдекеева А.С., Плеханов А.Ю., Клюева Н.З. Уровни экспрессии мРНК NAP-22 и MARCKS в почках крыс со спонтанной гипертензией при потреблении воды с различным содержанием кальция).

Итак, приведенный пример показывает, что многократно повышенный уровень BASP1 свидетельствует о наследственно обусловленной эссенциальной гипертензии, хотя низкий уровень этого белка не имеет диагностической ценности. Следовательно, уровень BASP1 как маркер наследственно обусловленной формы эссенциальной гипертензии имеет высокую прогностическую ценность положительного результата (ПЦПР).

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики наследственно обусловленной эссенциальной гипертензии. Осуществляют взятие образца крови пациента и выявление в нем белка BASP1. При превышении уровня белка BASP1 в испытуемом образце крови по сравнению с образцом крови пациента с нормальным артериальным давлением диагностируют наследственно обусловленную эссенциальную гипертензию. Способ обеспечивает диагностику наследственно обусловленной эссенциальной гипертензии за счет определения повышенного уровня белка BASP1 в образце крови. 2 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ диагностики наследственно обусловленной эссенциальной гипертензии, включающий взятие образца крови пациента и выявление в образце белка BASP1, где при превышении уровня белка BASP1 в испытуемом образце крови по сравнению с образцом крови пациента с нормальным артериальным давлением диагностируют наследственно обусловленную эссенциальную гипертензию.

2. Способ по п. 1, где выявление белка BASP1 выполняют с помощью антитела, специфичного для BASP1.

3. Способ по пп. 1, 2, где после взятия образца крови пациента и до выявления белка BASP1 осуществляется подготовка образца крови с помощью процедур, выбранных из неограничивающего списка: экстракция белка BASP1, электрофорез, иммуноблоттинг.